Uproszczone iniekcje doudowe przy użyciu żywych myszy pozwalają na ciągłą analizę szpiku kostnego

Technika ta ma na celu pomóc nam lepiej zrozumieć biologię prawidłowej hematopoezy i choroby szpiku kostnego poprzez bezpieczne wstrzykiwanie i przeszczepianie cennych próbek pacjentów myszom śródustnie, a następnie aspirację szpiku kostnego. Od dawna wiadomo, że bardziej efektywne jest przeszczepianie niewielkich ilości cennych próbek bezpośrednio do szpiku kostnego myszy w celu przeprowadzenia eksperymentów przez wstrzyknięcie dożylne. Nie ma jednak rzeczywistych filmów technicznych, więc ogólnie uważano, że jest to technika z wysokimi przeszkodami.

Nasz protokół umożliwia łatwe i bezpieczne wszczepienie każdej cennej próbki myszy z niewielką liczbą komórek. Istnieje duże zapotrzebowanie na tę technologię, a dzięki temu filmowi każdy może się jej szybko nauczyć. Mamy nadzieję, że każdy może opanować tę technologię i znacząco przyczynić się do postępu nauki.

Aby rozpocząć, przygotuj zawiesiny komórek z maksymalnie 3 milionami komórek próbnych przy użyciu 20 mikrolitrów buforu FACS lub pożywki do rozmrażania. Przechowywać je na lodzie przed wstrzyknięciem. Zdezynfekować nogę, w której znajduje się kość udowa, która ma być wstrzyknięta, trzema zestawami naprzemiennych peelingów, używając peelingu z jodonu lub chlorheksydyny i gąbek z gazy nasączonej 70% etanolem.

Ustabilizuj nogę, ściskając kość udową kciukiem i palcem wskazującym. Popchnij kość piszczelową pierścieniem lub piątym palcem, aby kość piszczelowa była zgięta od kości udowej. Należy upewnić się, że w celu wykonania wstrzyknięcia należy wykonać odpowiednie umieszczenie.

Użyj krawędzi pustej, sterylnej igły 27G, aby dziobać ścięgno rzepki na górze kości udowej. Aby zapewnić najlepszy punkt wkłucia, należy wprowadzić igłę 27G z dołączoną strzykawką tuż pod ścięgnem rzepki. Umieszczając ją bezpiecznie między dwoma kłykciami kości udowej, obróć igłę na zewnątrz i do góry, aby ustawić ją równolegle do trzonu kości udowej.

Obracaj igłę w kółko, jednocześnie wsuwając ją do jamy szpiku udowego. Wbijać igłę, aż zauważalne będzie zmniejszenie oporu. Potwierdzić prawidłowe ustawienie igły poprzez ruch boczny.

Wytwarzanie podciśnienia poprzez odciągnięcie tłoka igły do tyłu, jednocześnie przesuwając igłę w jamie szpiku kostnego. Sprawdzić, czy w strzykawce nie ma krwi lub szpiku, aby upewnić się, że igła znajduje się w jamie szpiku kostnego. Po upewnieniu się, że igła jest prawidłowo umieszczona, należy ją powoli wyjąć i wprowadzić komórkę zawierającą strzykawkę przez ten sam korzeń.

Ważne jest, aby pamiętać o korzeniu i kącie pierwszego wstrzyknięcia podczas zmiany igły na nową. Po pomyślnym wstrzyknięciu komórek do kości udowej ostrożnie wyjmij igłę i strzykawkę, utrzymując nacisk na strzykawkę. Następnie zdejmij mysz ze stożka nosowego i połóż ją na czystym ręczniku papierowym, aby zapobiec zachłyśnięciu się pościeli.

W celu odzyskania sprawności trzymaj mysz na poduszce grzewczej lub innej kontrolowanej powierzchni. Upewnij się, że pacjent wyzdrowiał ze znieczulenia przed umieszczeniem go z powrotem na stojaku na mysz. Obserwuj myszy pod kątem oznak niepokoju lub infekcji przez następne 24 godziny.

Zacznij od przygotowania się do zabiegu przed aspiracją szpiku kostnego, zwilż 0,5 mililitrową strzykawkę 27G CSM, wypełniając i wydalając CSM dwa do trzech razy. Następnie delikatnie odessać szpik kostny od znieczulonej myszy, uzyskując od 20 do 50 mikrolitrów szpiku kostnego. Następnie całkowicie wyjmij igłę z kości udowej i zawieś zasysaną próbkę w 500 mikrolitrach CSM.

Wyjmij mysz ze stożka nosowego i połóż ją na czystym ręczniku papierowym, aby zapobiec zachłyśnięciu się pościeli podczas rekonwalescencji. Monitoruj wszystkie myszy, aby sprawdzić, czy wyzdrowieje ze znieczulenia przed umieszczeniem ich z tyłu stojaka na myszy. Osad komórek ze szpiku kostnego z pięciominutowym wirowaniem w temperaturze 300G w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Odessać supernatant i dodać bufor do lizy ACK do każdej probówki. Zwiruj komórki w celu ich ponownego wymieszania i umieść je na lodzie na 5 do 10 minut. Przefiltruj zawiesinę komórek przez siatkę nylonową do nowej probówki.

Przepłucz oryginalną probówkę buforem FACS i przepuść ją przez nylonową siatkę, ponownie granuluj komórki, wirując przez pięć minut w temperaturze 300G w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Odessać supernatant z granulowanych komórek i dodać roztwór barwiący zawierający pożądane przeciwciała. Trzymaj probówki na lodzie przez 20 minut.

Umyj komórki i przystąp do ich analizy zgodnie z konfiguracją eksperymentalną. Techniki przeszczepu można łatwo ocenić przy minimalnej inwazji myszy za pomocą obrazu bioluminescencyjnego. W tym przypadku zaobserwowano przeszczep ludzkiej linii komórkowej K562 z Acalook w mysim modelu ksenoprzeszczepu po stronie wstrzykniętej kości udowej.

Przeszczepienie CD34-dodatnich HSPC spowodowało ponad 10 do 20% wszczepienia komórek ludzkich w ciągu ośmiu tygodni po przeszczepie. Podobnie, przeszczepienie HSC pochodzących z krwi pępowinowej skutkowało do 10% przeszczepem człowieka po ośmiu tygodniach od przeszczepu. Dzięki tej procedurze osiągnięto dalsze udane przeszczepy HSPC pochodzących ze szpiku kostnego dorosłych, komórek macierzystych białaczki, HSPC pochodzących z krwi pępowinowej edytowanych przez CRISPR Cas9 oraz iPSC AML pochodzących od pacjentów.