Izolacja jelit od larw danio pręgowanego do sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek
10 listopada 2023
Tutaj opisujemy metodę izolacji jelit od larw danio pręgowanego po 5 dniach od zapłodnienia, do analizy sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki.
Nasze badania mają na celu zbadanie wymiany transkryptomu zachodzącej podczas rozwoju i dysfunkcji przewodu pokarmowego u kilku larw ryb. W tym miejscu przedstawiamy nowy protokół, który umożliwia izolację różnych typów komórek w jelicie danio pręgowanego, co ma potencjalne zastosowania w zrozumieniu zdrowia i chorób przewodu pokarmowego. W ostatnich latach wzrosło zainteresowanie badaniem interakcji między przednim układem nerwowym a innymi typami komórek jelitowych podczas rozwoju i choroby.
Zrozumienie tej złożonej dynamiki przy użyciu zaawansowanych technik, takich jak sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki, może ujawnić kluczowe informacje na temat neuromiopatii przednich, prowadząc do bardziej precyzyjnej diagnostyki i leczenia. Korzystając z tego protokołu, udało nam się zidentyfikować różne typy komórek jelitowych, w tym komórki nabłonkowe, zrębowe, krwi, mięśniowe, odpornościowe, a nawet zwoje nerwowe jelit, które nie zostały wcześniej wychwycone w tej ilości przy użyciu podobnych metod. W ten sposób zapewniamy niezawodną technikę badania składu przewodu pokarmowego podczas rozwoju i dysfunkcji.
Zacznij od uzyskania ikry danio pręgowanego typu dzikiego i transgenicznego z odpowiedniej konfiguracji hodowlanej. Weź 15-centymetrową szalkę Petriego zawierającą buforowane przez HEPES podłoże E2 lub E3 i zbierz odpowiednią ilość zapłodnionych jaj z pożądanego zestawu hodowlanego danio pręgowanego. Wysiaduj zapłodnione jaja w E3 w temperaturze 28 stopni Celsjusza w odpowiednim cyklu światła i ciemności.
Jednego dnia po zapłodnieniu lub DPF usuń wszelkie niezapłodnione jaja i pozwól zapłodnionym rozwinąć się do pięciu DPF. Wybierz transgeniczne larwy danio pręgowanego przy jednym DPF. Przed przystąpieniem do dysocjacji całych larw należy znieczulić pięć larw DPF typu dzikiego za pomocą 0,016% trikainy i przenieść 30 znieczulonych larw na szalkę Petriego zawierającą jeden mililitr 10-krotnego roztworu trypsyny-EDTA.
Następnie za pomocą żyletki posiekaj larwy na małe kawałki na szalce Petriego. Przenieś posiekane larwy do probówki mikrowirówkowej z dwoma mililitrami 10-krotnego roztworu trypsyny-EDTA i pozostaw probówkę na lodzie na trzy godziny. Pipetować zawartość w górę i w dół za pomocą pipety P1000 co godzinę, aby stymulować dysocjację.
Na początek przygotuj 1,8% talerz agarozy z buforowanym przez HEPES podłożem E3 lub E3. Podczas pracy pod mikroskopem preparacyjnym umieść od sześciu do 10 znieczulonych larw w rzędzie na płytce agarozy. Umieść jedną szpilkę owada na głowie każdej larwy. Następnie usuń pozostały E3 z płytki za pomocą chusteczki.
Za pomocą innej szpilki do owadów odizoluj jelito od larwy, nie naruszając żadnych innych narządów. Upewnij się, że żółtko jest prawidłowo usunięte. Po odizolowaniu sprawdź jelito i usuń cały materiał niejelitowy, taki jak skóra, tłuszcz lub wątroba.
Za pomocą pęsety należy pobrać jelito i przenieść je do PBS zawierającego 10% FCS w probówce mikrowirówkowej umieszczonej na lodzie. Natychmiast po rozebraniu wszystkich jelit należy odwirować probówkę mikrowirówki o temperaturze 13 800G przez 30 sekund. Usuń supernatant, pozostawiając około 100 mikrolitrów w probówce, aby zapobiec wysuszeniu jelit.
Dodaj 500 mikrolitrów roztworu papainy do jelit w probówce. Aktywuj papainę, dodając 2,5 mikrolitra jednej molowej cysteiny. Następnie inkubuj probówkę zawierającą jelita w łaźni wodnej w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut.
Po pięciu minutach pipetować zawartość w górę i w dół do połowy, aby pobudzić enzymatyczne trawienie tkankowe. Przenieś zdysocjowane komórki do aktywowanej fluorescencją probówki do sortowania komórek lub probówki FACS przez wstępnie zwilżone sitko do komórek o grubości 35 mikronów. Umyj sitko kilka razy, dodając 0,5 mililitra PBS zawierającego 10% FCS do całkowitej objętości prania wynoszącej dwa mililitry.
Odwirować zebrany filtrat o sile 700 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i usunąć supernatant. Dodaj jeden mikrogram na mililitr DAPI do 300 mikrolitrów PBS zawierającego 10% FCS. Dodaj tę mieszaninę do osadu i ponownie zawieś, aby oznaczyć martwe komórki.
Następnie inkubuj przez pięć minut na lodzie, aby umożliwić ich wykluczenie podczas późniejszej analizy FACS. Aby przeprowadzić sortowanie komórek aktywowane fluorescencją lub FACS na komórkach jelitowych wyizolowanych z larw danio pręgowanego, użyj próbki całych larw typu dzikiego, aby ustawić bramki posortowanej populacji komórek, rejestrując 3 000 komórek na cytometrze przepływowym. Użyj dyszy o średnicy 100 mikronów i ustaw precyzję sortowania na czystość czterokierunkową.
Umieść probówkę zawierającą 200 mikrolitrów PBS z 5% płodową surowicą cielęcą do maszyny FACS. Załadować zawiesinę komórkową przygotowaną z wyizolowanych jelit i po wykluczeniu dubletów i martwych komórek, posortować żywe lub DAPI pojedyncze komórki do probówki zbiorczej. Trzymaj probówkę zbiorczą na lodzie po sortowaniu komórek.
Przeprowadzając kontrolę żywotności za pomocą błękitu trypanowego, policz liczbę komórek w zawiesinie za pomocą hemocytometru. Komórki są teraz gotowe do przetworzenia do sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki. Użyj około 20 000 komórek na próbkę.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten artykuł przedstawia nowy protokół do izolacji komórek jelita z larw rybki zebrafish w 5 dniu po zapłodnieniu, ułatwiając analizę sekwencjonowania RNA z pojedynczych komórek. Metoda ma na celu poprawę rozumienia rozwoju i dysfunkcji przewodu pokarmowego.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Biologia rozwojowa
- Zdrowie przewodu pokarmowego
Tło
- Badanie wymiany transkryptomów podczas rozwoju przewodu pokarmowego.
- Skupienie się na interakcjach między przednimi układami nerwowymi a typami komórek jelitowych.
- Znaczenie zaawansowanych technik w badaniu neuromiopatii.
- Możliwość poprawy diagnostyki i terapii.
Cel badania
- Dostarczenie niezawodnej metody izolacji różnych typów komórek jelitowych.
- Poprawa rozumienia składu przewodu pokarmowego podczas rozwoju.
- Zbadanie implikacji dla zdrowia i chorób przewodu pokarmowego.
Stosowane metody
- Izolacja różnych typów komórek w jelicie rybki zebrafish.
- Zastosowanie sekwencjonowania RNA z pojedynczych komórek.
- Identyfikacja komórek nabłonkowych, stromalnych, krwi, mięśniowych, odpornościowych oraz z zwojów nerwów jelitowych.
- Wykorzystanie nowego protokołu dla zwiększonego chwytania komórek.
Główne wyniki
- Udana identyfikacja różnych typów komórek jelitowych.
- Nowe wglądy w dynamikę zdrowia i chorób przewodu pokarmowego.
- Lepsze zrozumienie przednich neuromiopatii.
- Niezbędna technika do badania składu przewodu pokarmowego.
Wnioski
- Protokół zapewnia znaczący postęp w izolowaniu komórek jelitowych.
- Otwiera możliwości dalszych badań nad zdrowiem przewodu pokarmowego.
- Możliwość poprawy rozumienia procesów rozwojowych i chorobowych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Single-cell RNA sequencing of zebrafish larval gut enables high-resolution mapping of intestinal cell diversity during development and disease modeling. This protocol supports early-stage target validation and mechanistic de-risking for gastrointestinal research portfolios. The approach enhances predictive confidence in disease-relevant system selection and translational biomarker discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of cell-type specific transcriptomes in a vertebrate model.
- Supports functional target validation by isolating enteric neurons, glia, and immune cells.
- Facilitates mechanistic de-risking for neuromuscular and epithelial targets in GI disorders.
Screening & Assay Development
- Provides validated, viable single-cell suspensions for downstream transcriptomic assays.
- Standardizes cell isolation and sorting for reproducible quantitative outputs.
- Enables scalable preparation of gut-derived cells for high-throughput screening platforms.
Translational & Preclinical Research
- Aligns zebrafish gut cell composition with disease-relevant human GI biology.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation of GI targets.
- Enables risk-adjusted advancement of candidate targets based on cell-type specific expression profiles.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling isolation and profiling of gut cell types for target identification, validation, and mechanistic studies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on GI development and dysfunction at single-cell resolution.
- Screening: Delivers reproducible, viable cell populations for transcriptomic and phenotypic assays.
- Analytics: Provides quantitative gene expression data for comparative analysis across cell types and conditions.
- Translational Research: Bridges zebrafish and human GI biology for biomarker alignment and disease modeling.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable workflow for gut cell isolation and single-cell analysis in diverse GI research programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in GI target selection and mechanistic understanding.
- Operational Value: Standardizes cell isolation and sorting for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling cell-type specific transcriptomic insights.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of GI targets and disease models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish handling, dissection, and single-cell workflows.
- Needs access to FACS instrumentation and single-cell RNA sequencing platforms.
- Demands cross-team standardization for reproducible cell isolation and sorting.
- Adaptation may be needed for other developmental stages or model organisms.
- Cell viability and yield depend on precise dissection and enzymatic dissociation steps.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:22
Obtaining Wildtype and Transgenic Zebrafish Larvae and WildType Whole Larvae Dissociation
2:50
Isolation and Dissociation of Gut from Zebrafish Larvae for FACS Enrichment of Gut Cells
5:25
FACS Enrichment of Zebrafish Gut Cell Suspension for scRNAseq
