Name: Izolacja jelit od larw danio pręgowanego do sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-11-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 36 s
Description: Poznaj metodę izolacji komórek jelitowych z larw Danio rerio do sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek. Ta technika umożliwia identyfikację różnych typów komórek jelitowych i badanie rozwoju układu pokarmowego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana przez przyjaciół Fundacji Sophia (SSWO WAR-63).

Wszystkie eksperymenty i hodowla danio pręgowanego były prowadzone zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi Erasmusa MC i ustawodawstwa dotyczącego dobrostanu zwierząt. Wykorzystanie larw danio pręgowanego po 5 dniach od zapłodnienia należy do kategorii eksperymentów, które nie wymagają formalnego zatwierdzenia etycznego, zgodnie z holenderskimi przepisami.
1. Uzyskanie larw typu dzikiego i tg(phox2bb:GFP) 5 dni po zapłodnieniu (dpf)
<ol>
	<li>Rozpocznij hodowlę danio pręgowanego typu dzikiego i zbierz 50 jaj na buforowanym przez HEPES podłożu E3 (zwanym dalej E3) na 15-centymetrowej szalce Petriego. Użyj tych ryb jako kontroli negatywnej do sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FAC).</li>
	<li>Rozpocznij hodowlę danio pręgowanego tg(phox2bb:GFP) i zbierz około 300 jaj w E3 na 15-centymetrowej szalce Petriego.</li>
	<li>Przechowywać zapłodnione jaja w E3 (maksymalnie 50 jaj/półkę) w cyklu 14 godzin/10 godzin światła/ciemności, w inkubatorze w temperaturze 28,5 °C.</li>
	<li>Po 1 dpf usuń niezapłodnione jaja i pozwól zapłodnionym rozwinąć się do 5 dpf.</li>
	<li>Wybierz larwy tg(phox2bb:GFP) przy 1 dpf.</li>
</ol>
2. Dysocjacja całych larw typu dzikiego
<ol>
	<li>Znieczulić 5 dpf larw 0,016% trikainą.</li>
	<li>Pokrój 30 danio pręgowanego na małe kawałki za pomocą żyletki na szalce Petriego zawierającej 1 ml 10x roztworu trypsyny-EDTA.</li>
	<li>Przenieś posiekanego danio pręgowanego do probówki mikrowirówkowej o całkowitej objętości 2 ml 10x roztworu trypsyny-EDTA i pozostaw na lodzie na 3 godziny. Pipetuj w górę i w dół pipetą P1000 co godzinę, aby stymulować dysocjację.</li>
</ol>
3. Izolacja jelit
<ol>
	<li>Umieścić 6-10 5 dpf larw znieczulonych 0,016% trikainą w rzędzie, na 1,8% agarozowej płytce (0,45 g agarozy w 25 ml E3), pod mikroskopem preparacyjnym</li>
	<li>Umieść jedną szpilkę owada w głowie danio pręgowanego.</li>
	<li>Usuń cały pozostały E3 za pomocą chusteczki.</li>
	<li>Odizoluj jelito za pomocą innej szpilki do owadów, nie naruszając żadnych innych narządów. Upewnij się, że żółtko zostało usunięte (rysunek uzupełniający S1A).</li>
	<li>Po wyizolowaniu należy sprawdzić jelito i w razie potrzeby usunąć cały materiał niejelitowy (np. skórę, tłuszcz, wątrobę).</li>
	<li>Zbierz jelito pęsetą i umieść je w probówce do mikrowirówki, zawierającej sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) z 10% płodową surowicą cielęcą (FCS), na lodzie. 
	UWAGA: Należy wyizolować co najmniej 244 jelita, utrzymując całkowity czas rozwarstwienia na poziomie 3 godzin. Jest to wykonalne, gdy dwie osoby pracują równolegle.</li>
</ol>
4. Dysocjacja jelit
<ol>
	<li>Bezpośrednio po rozebraniu wszystkich jelit należy odwirować probówkę do mikrowirówki z pełną prędkością (13 800 × g) przez 30 s.</li>
	<li>Usuń PBS/10% FCS, ale pozostaw niewielką ilość (~100 μL), aby zapobiec wysuszeniu jelit. Dodać 500 μl 2,17 mg/ml papainy do HBSS zawierającego CaCl2 i MgCl2, aby dysocjować komórki.</li>
	<li>Aktywuj papainę za pomocą 2,5 μl cysteiny (1 M).</li>
	<li>Inkubować jelita w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C przez 10 minut. Pipetować w górę i w dół do połowy (po 5 minutach) w celu pobudzenia enzymatycznego trawienia tkanek.</li>
	<li>Przenieś komórki do probówki FACS za pomocą sitka do komórek 35 μm, wstępnie zwilżonego 0,5 ml PBS/10% FCS.</li>
	<li>Umyj sitko, dodając łącznie 2 ml PBS/10% FCS w krokach co 0,5 ml.</li>
	<li>Wirować przy 700 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 300 μl PBS/10% FCS.</li>
	<li>Dodać 1 μg/ml 4',6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI) do znakowania martwych komórek (1:1,000) i inkubować przez 5 minut, aby umożliwić ich wykluczenie podczas FACS.</li>
</ol>
5. Wzbogacenie FACS
<ol>
	<li>Użyj próbki typu dzikiego, aby ustawić bramki posortowanej populacji komórek, rejestrując 3 000 komórek na cytometrze przepływowym (rysunek uzupełniający S1B-E).</li>
	<li>Użyj dyszy 100 μm, ustaw precyzję sortowania na czystość i umieść probówkę zbiorczą zawierającą 200 μl PBS/5% FCS w maszynie FACS.</li>
	<li>Załaduj zawiesinę komórkową jelit i posortuj żywe (DAPI-ujemne), pojedyncze komórki do probówki zbiorczej (<silna klasa="xfig">Rysunek 2C), wykluczając dublety (<silna klasa="xfig">Rysunek 2B) i martwe komórki (<silna klasa="xfig">Rysunek 2C). 
	UWAGA: W przypadku danio pręgowanego tg(phox2bb) proporcja komórek GFP+ jest sprawdzana tylko w celach informacyjnych, ponieważ wszystkie pojedyncze żywe komórki są sortowane.</li>
	<li>Trzymaj probówkę zbiorczą na lodzie po sortowaniu komórek.</li>
	<li>Policz zawiesinę komórek za pomocą hemocytometru, łącznie z kontrolą żywotności za pomocą błękitu trypanowego. Jeśli rentowność wynosi co najmniej 80%, przejdź do następnego kroku.</li>
	<li>Komórki są teraz gotowe do przetwarzania na scRNAseq (tj. 10-krotną platformę Genomics Chromium). Użyj około 20 000 komórek na próbkę.</li>
</ol>

Processing Gut Cells from Zebrafish Larvae for Single-Cell RNA Sequencing

<ol><li>Saldana-Morales, F. B., Kim, D. V., Tsai, M. T., Diehl, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Healthy+intestinal+function+relies+on+coordinated+enteric+nervous+system%2C+immune+system%2C+and+epithelium+eesponses%5BTitle%5D)+AND+%22Gut+Microbes%22%5BJournal%5D)">Healthy intestinal function relies on coordinated enteric nervous system, immune system, and epithelium eesponses.</a> Gut Microbes. 13 (1), 1-14 (2021).</li>
<li>Sitrin, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSitrin%2C+M+%22The+Gastrointestinal+System%22">The Gastrointestinal System</a>. , (2014).</li>
<li>Furness, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+organisation+of+the+autonomic+nervous+system%3A+peripheral+connections%5BTitle%5D)+AND+%22Autonomic+Neuroscience%3A+Basic+and+Clinical%22%5BJournal%5D)">The organisation of the autonomic nervous system: peripheral connections.</a> Autonomic Neuroscience: Basic and Clinical. 130 (1-2), 1-5 (2006).</li>
<li>Furness, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+enteric+nervous+system+and+neurogastroenterology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Gastroenterology+%26+Hepatology%22%5BJournal%5D)">The enteric nervous system and neurogastroenterology.</a> Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 9 (5), 286-294 (2012).</li>
<li>Obata, Y., Pachnis, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+microbiota+and+the+immune+system+on+the+development+and+organization+of+the+enteric+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">The effect of microbiota and the immune system on the development and organization of the enteric nervous system.</a> Gastroenterology. 151 (5), 836-844 (2016).</li>
<li>Heuckeroth, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hirschsprung+disease+-+integrating+basic+science+and+clinical+medicine+to+improve+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Gastroenterology+%26+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Hirschsprung disease - integrating basic science and clinical medicine to improve outcomes.</a> Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 15 (3), 152-167 (2018).</li>
<li>Antonucci, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+intestinal+pseudo-obstruction%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Chronic intestinal pseudo-obstruction.</a> World Journal of Gastroenterology. 14 (19), 2953-2961 (2008).</li>
<li>De Giorgio, R., Sarnelli, G., Corinaldesi, R., Stanghellini, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+our+understanding+of+the+pathology+of+chronic+intestinal+pseudo-obstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Advances in our understanding of the pathology of chronic intestinal pseudo-obstruction.</a> Gut. 53 (11), 1549-1552 (2004).</li>
<li>Bianco, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteric+neuromyopathies%3A+highlights+on+genetic+mechanisms+underlying+chronic+intestinal+pseudo-obstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Enteric neuromyopathies: highlights on genetic mechanisms underlying chronic intestinal pseudo-obstruction.</a> Biomolecules. 12 (12), 1849(2022).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).</li>
<li>Lieschke, G. J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+human+disease%3A+zebrafish+swim+into+view%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Genetics%22%5BJournal%5D)">Animal models of human disease: zebrafish swim into view.</a> Nature Reviews. Genetics. 8 (5), 353-367 (2007).</li>
<li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).</li>
<li>Wallace, K. N., Akhter, S., Smith, E. M., Lorent, K., Pack, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+growth+and+differentiation+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Development%22%5BJournal%5D)">Intestinal growth and differentiation in zebrafish.</a> Mechanisms of Development. 122 (2), 157-173 (2005).</li>
<li>Wallace, K. N., Pack, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+and+conserved+aspects+of+gut+development+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Unique and conserved aspects of gut development in zebrafish.</a> Developmental Biology. 255 (1), 12-29 (2003).</li>
<li>Harrison, C., Wabbersen, T., Shepherd, I. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+visualization+of+the+development+of+the+enteric+nervous+system+using+a+Tg%28-8.3bphox2b%3AKaede%29+transgenic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">In vivo visualization of the development of the enteric nervous system using a Tg(-8.3bphox2b:Kaede) transgenic zebrafish.</a> Genesis. 52 (12), 985-990 (2014).</li>
<li>Kuil, L. E., Chauhan, R. K., Cheng, W. W., Hofstra, R. M. W., Alves, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish%3A+a+model+organism+for+studying+enteric+nervous+system+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Zebrafish: a model organism for studying enteric nervous system development and disease.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 629073(2020).</li>
<li>Stuart, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+Integration+of+Single-Cell+Data%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Comprehensive Integration of Single-Cell Data.</a> Cell. 177 (7), 1888-1902 (2019).</li>
<li>Kuil, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unbiased+characterization+of+the+larval+zebrafish+enteric+nervous+system+at+a+single+cell+transcriptomic+level%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Unbiased characterization of the larval zebrafish enteric nervous system at a single cell transcriptomic level.</a> iScience. 26 (7), 107070(2023).</li>
<li>Gao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+differential+transcriptomes+and+cell+types+in+zebrafish+larvae+intestine+and+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Unraveling differential transcriptomes and cell types in zebrafish larvae intestine and liver.</a> Cells. 11 (20), 3290(2022).</li>
<li>Jin, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cdx1b+protects+intestinal+cell+fate+by+repressing+signaling+networks+for+liver+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Genetics+and+Genomics%22%5BJournal%5D)">Cdx1b protects intestinal cell fate by repressing signaling networks for liver specification.</a> Journal of Genetics and Genomics. 49 (12), 1101-1113 (2022).</li>
<li>Willms, R. J., Jones, L. O., Hocking, J. C., Foley, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell+atlas+of+microbe-responsive+processes+in+the+zebrafish+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A cell atlas of microbe-responsive processes in the zebrafish intestine.</a> Cell Reports. 38 (5), 110311(2022).</li>
<li>Kline, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKline%2C+M+%22Fishing+for+answers%3A+Isolating+enteric+neurons+and+identifying+putative+ENS+mutants%22">Fishing for answers: Isolating enteric neurons and identifying putative ENS mutants</a>. , Iowa State University. https://doi.org/10.31274/etd-180810-5368 (2016).</li>
<li>Allan, K., DiCicco, R., Ramos, M., Asosingh, K., Yuan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparing+a+single+cell+suspension+from+zebrafish+retinal+tissue+for+flow+cytometric+cell+sorting+of+Muller+glia%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Preparing a single cell suspension from zebrafish retinal tissue for flow cytometric cell sorting of Muller glia.</a> Cytometry A. 97 (6), 638-646 (2020).</li>
<li>Lopez-Ramirez, M. A., Calvo, C. F., Ristori, E., Thomas, J. L., Nicoli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+adult+zebrafish+brain-derived+neurospheres%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of adult zebrafish brain-derived neurospheres.</a> Journal of Visualized Experiments. 53617 (108), 53617(2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

W tym artykule przedstawiono metodę izolacji i dysocjacji jelita 5 dpf larw danio pręgowanego za pomocą FACS. Dzięki tej metodzie różne typy komórek jelitowych zostały z powodzeniem zebrane i przeanalizowane za pomocą scRNA-seq, przy użyciu platformy 10x Genomics Chromium. Wybraliśmy linię danio pręgowanego tg (phox2bb: GFP), ponieważ chcieliśmy uzyskać wskazówkę, że żywotne komórki ENS również zostaną wyizolowane (Rysunek 2D). Należy jednak zauważyć, że metodę tę można łatwo rozsze...

Przewód pokarmowy (GI) to złożony system, który odgrywa istotną rolę w ogólnym zdrowiu i samopoczuciu. Odpowiada za trawienie i wchłanianie składników odżywczych, a także eliminację produktów przemiany materii1,2. Przewód pokarmowy składa się z wielu typów komórek, w tym komórek nabłonkowych, komórek mięśni gładkich, komórek odpornościowych i jelitowego układu nerwowego (ENS), które ściśle komunikują się ze sobą w celu regulacji i utrzymania prawidłowej funkcji jelit3,4,5. Wady w rozwoju przewodu pokarmowego mogą mieć daleko idące skutki w różnych aspektach, takich jak wchłanianie składników odżywczych, skład mikrobioty, oś jelitowo-mózgowa i ENS, prowadząc do kilku zaburzeń nerwowo-mięśniowych jelit, takich jak choroba Hirschsprunga i przewlekła rzekoma niedrożność jelit6,7. Zaburzenia te charakteryzują się ciężką dysmotoryką jelit spowodowaną zmianami w różnych kluczowych komórkach, takich jak komórki śródmiąższowe Cajal, komórki mięśni gładkich i ENS6,8,9. Jednak mechanizmy molekularne leżące u podstaw rozwoju i dysfunkcji przewodu pokarmowego są nadal słabo poznane.
Danio pręgowany jest cennym organizmem modelowym do badania rozwoju i dysfunkcji przewodu pokarmowego ze względu na szybki rozwój embrionalny, przezroczystość w stadium embrionalnym i larwalnym oraz wykonalność genetyczną10,11,12,13,14. Dostępne są liczne transgeniczne linie danio pręgowanego wykazujące ekspresję białek fluorescencyjnych. Przykładem takiej linii jest tg(phox2bb:GFP) danio pręgowany, powszechnie używany do badania ENS, ponieważ wszystkie komórki phox2bb+, w tym neurony jelitowe, są oznaczone jako 15,16. Tutaj, korzystając z linii zebrywanego tg(phox2bb:GFP), przedstawiamy metodę izolacji jelitowej larw 5 dni po zapłodnieniu (dpf) do analizy sekwencjonowania RNA jednokomórkowego (scRNA-seq) (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1).

<table><tbody><tr><td>10x Trypsyna (0,5%)-EDTA (0,2%)</td><td>Sigma</td><td>59418C</td><td></td></tr><tr><td>5 ml probówka okrągłodenna z nasadką sitka komórkowego</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon Probówka okrągłodenna 5 ml (probówki FACS)</td><td>zatrzask BD Biosciences</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>Cell Ranger v3.0.2</td><td>10X Genomics</td><td>Nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat#D-9542</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop preparacyjny</td><td>Olympus SZX16</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sortownik FACSAria III</td><td>BD Biosciences</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>HBSS z CaCl2 i MgCl2</td><td>Gibco</td><td>14025050</td><td></td></tr><tr><td>Szpilki do owadów</td><td>Fine Science Tools</td><td>26000-25</td><td></td></tr><tr><td>L-Cysteine</td><td>Sigma</td><td>C7352</td><td></td></tr><tr><td>MS-222, Tricaine</td><td>Supelco</td><td>A5040-250G</td><td></td></tr><tr><td>Papain</td><td>Sigma</td><td>P4762</td><td></td></tr><tr><td>Seurat v3</td><td>Stuart et&nbsp;al. (2019)</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>Kot#T8154</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja jelit od larw danio pręgowanego do sekwencjonowania rna pojedynczych komórek

Gut Isolation from Zebrafish Larvae for Single-cell RNA Sequencing

Przewód pokarmowy (GI) pełni szereg funkcji niezbędnych do życia. Wady wrodzone wpływające na jego rozwój mogą prowadzić do zaburzeń nerwowo-mięśniowych jelit, co podkreśla znaczenie zrozumienia mechanizmów molekularnych leżących u podstaw rozwoju i dysfunkcji przewodu pokarmowego. W niniejszej pracy przedstawiono metodę izolacji jelit z larw danio pręgowanego po 5 dniach od zapłodnienia w celu uzyskania żywych, żywotnych komórek, które można wykorzystać do analizy sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki (scRNA-seq). Protokół ten opiera się na ręcznym rozbiorze jelita danio pręgowanego, a następnie dysocjacji enzymatycznej z papainą. Następnie komórki są poddawane sortowaniu komórek aktywowanym fluorescencją, a żywe komórki są zbierane do sekwencjonowania scRNA. Dzięki tej metodzie udało nam się zidentyfikować różne typy komórek jelitowych, w tym komórki nabłonkowe, zrębowe, krwi, mięśniowe i odpornościowe, a także neurony jelitowe i glej. Dlatego uważamy, że jest to cenne źródło do badania składu przewodu pokarmowego w zdrowiu i chorobie przy użyciu danio pręgowanego.

Dzięki zastosowaniu tego protokołu pomyślnie wyizolowano i zdysocjowano całe jelita larw w 5. dniu po zapłodnieniu (5 dpf). Wykorzystanie papainy jako enzymu dysocjującego pozwoliło znacząco zwiększyć żywotność komórek, co umożliwiło zarejestrowanie 46 139 zdarzeń obejmujących pojedyncze, żywe komórki (6,4% wszystkich komórek) z 244 wyizolowanych jelit (Ryc. 2A). W charakterze kontroli wykorzystano całe larwy typu dzikiego, aby upewnić się, że proces sortowania został zoptymalizowany, co umo...

Tutaj opisujemy metodę izolacji jelit od larw danio pręgowanego po 5 dniach od zapłodnienia, do analizy sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki.

Izolacja jelit od larw danio pręgowanego do sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek

The gastrointestinal (GI) tract performs a range of functions essential for life. Congenital defects affecting its development can lead to enteric ...

Nasze badania mają na celu zbadanie wymiany transkryptomu zachodzącej podczas rozwoju i dysfunkcji przewodu pokarmowego u kilku larw ryb. W tym miejscu przedstawiamy nowy protokół, który umożliwia izolację różnych typów komórek w jelicie danio pręgowanego, co ma potencjalne zastosowania w zrozumieniu zdrowia i chorób przewodu pokarmowego. W ostatnich latach wzrosło zainteresowanie badaniem interakcji między przednim układem nerwowym a innymi typami komórek jelitowych podczas rozwoju i choroby.Zrozumienie tej złożonej dynamiki przy użyciu zaawansowanych technik, takich jak sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki, może ujawnić kluczowe informacje na temat neuromiopatii przednich, prowadząc do bardziej precyzyjnej diagnostyki i leczenia. Korzystając z tego protokołu, udało nam się zidentyfikować różne typy komórek jelitowych, w tym komórki nabłonkowe, zrębowe, krwi, mięśniowe, odpornościowe, a nawet zwoje nerwowe jelit, które nie zostały wcześniej wychwycone w tej ilości przy użyciu podobnych metod. W ten sposób zapewniamy niezawodną technikę badania składu przewodu pokarmowego podczas rozwoju i dysfunkcji.Zacznij od uzyskania ikry danio pręgowanego typu dzikiego i transgenicznego z odpowiedniej konfiguracji hodowlanej. Weź 15-centymetrową szalkę Petriego zawierającą buforowane przez HEPES podłoże E2 lub E3 i zbierz odpowiednią ilość zapłodnionych jaj z pożądanego zestawu hodowlanego danio pręgowanego. Wysiaduj zapłodnione jaja w E3 w temperaturze 28 stopni Celsjusza w odpowiednim cyklu światła i ciemności.Jednego dnia po zapłodnieniu lub DPF usuń wszelkie niezapłodnione jaja i pozwól zapłodnionym rozwinąć się do pięciu DPF. Wybierz transgeniczne larwy danio pręgowanego przy jednym DPF. Przed przystąpieniem do dysocjacji całych larw należy znieczulić pięć larw DPF typu dzikiego za pomocą 0,016% trikainy i przenieść 30 znieczulonych larw na szalkę Petriego zawierającą jeden mililitr 10-krotnego roztworu trypsyny-EDTA.Następnie za pomocą żyletki posiekaj larwy na małe kawałki na szalce Petriego. Przenieś posiekane larwy do probówki mikrowirówkowej z dwoma mililitrami 10-krotnego roztworu trypsyny-EDTA i pozostaw probówkę na lodzie na trzy godziny. Pipetować zawartość w górę i w dół za pomocą pipety P1000 co godzinę, aby stymulować dysocjację.Na początek przygotuj 1,8% talerz agarozy z buforowanym przez HEPES podłożem E3 lub E3. Podczas pracy pod mikroskopem preparacyjnym umieść od sześciu do 10 znieczulonych larw w rzędzie na płytce agarozy. Umieść jedną szpilkę owada na głowie każdej larwy. Następnie usuń pozostały E3 z płytki za pomocą chusteczki.Za pomocą innej szpilki do owadów odizoluj jelito od larwy, nie naruszając żadnych innych narządów. Upewnij się, że żółtko jest prawidłowo usunięte. Po odizolowaniu sprawdź jelito i usuń cały materiał niejelitowy, taki jak skóra, tłuszcz lub wątroba.Za pomocą pęsety należy pobrać jelito i przenieść je do PBS zawierającego 10% FCS w probówce mikrowirówkowej umieszczonej na lodzie. Natychmiast po rozebraniu wszystkich jelit należy odwirować probówkę mikrowirówki o temperaturze 13 800G przez 30 sekund. Usuń supernatant, pozostawiając około 100 mikrolitrów w probówce, aby zapobiec wysuszeniu jelit.Dodaj 500 mikrolitrów roztworu papainy do jelit w probówce. Aktywuj papainę, dodając 2,5 mikrolitra jednej molowej cysteiny. Następnie inkubuj probówkę zawierającą jelita w łaźni wodnej w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut.Po pięciu minutach pipetować zawartość w górę i w dół do połowy, aby pobudzić enzymatyczne trawienie tkankowe. Przenieś zdysocjowane komórki do aktywowanej fluorescencją probówki do sortowania komórek lub probówki FACS przez wstępnie zwilżone sitko do komórek o grubości 35 mikronów. Umyj sitko kilka razy, dodając 0,5 mililitra PBS zawierającego 10% FCS do całkowitej objętości prania wynoszącej dwa mililitry.Odwirować zebrany filtrat o sile 700 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i usunąć supernatant. Dodaj jeden mikrogram na mililitr DAPI do 300 mikrolitrów PBS zawierającego 10% FCS. Dodaj tę mieszaninę do osadu i ponownie zawieś, aby oznaczyć martwe komórki.Następnie inkubuj przez pięć minut na lodzie, aby umożliwić ich wykluczenie podczas późniejszej analizy FACS. Aby przeprowadzić sortowanie komórek aktywowane fluorescencją lub FACS na komórkach jelitowych wyizolowanych z larw danio pręgowanego, użyj próbki całych larw typu dzikiego, aby ustawić bramki posortowanej populacji komórek, rejestrując 3 000 komórek na cytometrze przepływowym. Użyj dyszy o średnicy 100 mikronów i ustaw precyzję sortowania na czystość czterokierunkową.Umieść probówkę zawierającą 200 mikrolitrów PBS z 5% płodową surowicą cielęcą do maszyny FACS. Załadować zawiesinę komórkową przygotowaną z wyizolowanych jelit i po wykluczeniu dubletów i martwych komórek, posortować żywe lub DAPI pojedyncze komórki do probówki zbiorczej. Trzymaj probówkę zbiorczą na lodzie po sortowaniu komórek.Przeprowadzając kontrolę żywotności za pomocą błękitu trypanowego, policz liczbę komórek w zawiesinie za pomocą hemocytometru. Komórki są teraz gotowe do przetworzenia do sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki. Użyj około 20 000 komórek na próbkę.

gut-isolation-from-zebrafish-larvae-for-single-cell-rna-sequencing

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Izolacja wysokiej jakości, nienaruszonego RNA jest kluczowym krokiem w wielu protokołach laboratoryjnych. W niniejszej pracy przedstawiamy metodę ekstrakcji RNA z całych embrionów zebrafish oraz syntezę cDNA do późniejszego zastosowania w różnych procedurach eksperymentalnych, w tym w analizie ekspresji genów za pomocą mikromacierzy.

Izolacja RNA z zarodków danio pręgowanego i synteza cDNA do analizy ekspresji genów

Ten film opisuje protokół izolacji neuronów, makrofagów i mikrogleju z mózgów larw danio pręgowanego poprzez mechaniczne niszczenie tkanki mózgowej. Oczyszczone populacje komórek można następnie wykorzystać do analizy genomicznej.

Izolacja komórek mózgowych z larw danio pręgowanego: technika uzyskiwania nienaruszonych neuronów, makrofagów i mikrogleju z tkanki mózgowej danio pręgowanego

Ten protokół opisuje metodę izolowania pojedynczych komórek z zarodków danio pręgowanego, wzbogacania o interesujące komórki, przechwytywania komórek danio pręgowanego w mikroprzepływowych systemach multipleksów jednokomórkowych i oceny ekspresji genów z pojedynczych komórek.

Izolacja i charakterystyka pojedynczych komórek z zarodków danio pręgowanego

Tutaj prezentujemy protokół izolacji tkanki gonad larw danio pręgowanego, który ułatwi badania różnicowania i utrzymania płci danio pręgowanego.

Rozwarstwienie larw tkanki gonad danio pręgowanego

Tutaj opisujemy technikę izolowania komórek populacji bocznej z modelu danio pręgowanego z indukowaną przez myc ostrej białaczki limfoblastycznej limfoblastycznej (T-ALL). Ten boczny test populacyjny jest bardzo czuły i jest opisany dla T-ALL danio pręgowanego, ale może mieć zastosowanie do innych złośliwych i niezłośliwych typów komórek danio pręgowanego.

Izolacja populacji bocznej w ostrej białaczce limfoblastycznej indukowanej przez limfokomórki T indukowanej przez Myc u danio pręgowanego

Ten protokół przedstawia podejście do analizy całego transkryptomu z zarodków danio pręgowanego, larw lub posortowanych komórek. Obejmuje izolację RNA, analizę szlaku danych RNASeq oraz walidację zmian ekspresji genów opartą na qRT-PCR.

Przygotowanie próbki i analiza danych dotyczących ekspresji genów opartych na RNASeq od danio pręgowanego

Przedstawiamy protokół izolowania neuronów, makrofagów i mikrogleju z mózgów larw danio pręgowanego w warunkach fizjologicznych i patologicznych. Po wyizolowaniu RNA jest ekstrahowane z tych komórek w celu analizy ich profilu ekspresji genów. Protokół ten pozwala na zbieranie wysokiej jakości RNA do przeprowadzania dalszych analiz, takich jak qPCR i transkryptomika.

Izolacja i ekstrakcja RNA neuronów, makrofagów i mikrogleju z mózgów larw danio pręgowanego

Opisujemy technikę profilowania mikroRNA we wczesnych zarodkach myszy. Protokół ten pozwala przezwyciężyć wyzwanie związane z niskim wkładem komórek i wzbogaceniem małego RNA. Test ten można wykorzystać do analizy zmian w ekspresji miRNA w czasie w różnych liniach komórkowych wczesnego zarodka myszy.

Przygotowanie małych bibliotek RNA do sekwencjonowania z wczesnych zarodków myszy

Izolacja pojedynczych jąder opiera się na dysocjacji i przenikaniu błony komórkowej za pomocą detergentów, etapach, które wymagają optymalizacji i są podatne na wprowadzanie artefaktów technicznych. Demonstrujemy bezdetergentowy i bezenzymatyczny protokół szybkiej izolacji nienaruszonych jąder bezpośrednio z całej tkanki, uzyskując jądra odpowiednie do sekwencjonowania RNA pojedynczego jądra (snRNA-Seq) lub ATAC-seq.

Izolacja jąder z całej tkanki metodą bezdetergentową i enzymatyczną

Tutaj prezentujemy metodę wyrównywania i kriosekcji wielu próbek larw danio pręgowanego (Danio rerio) i zbierania ich na jednym szkiełku do przestrzennej analizy transkryptomicznej.

Przestrzennie zwarty układ sekcji larw danio pręgowanego do przestrzennej analizy transkryptomicznej

Poznaj metodę izolacji komórek jelitowych z larw Danio rerio do sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek. Ta technika umożliwia identyfikację różnych typów komórek jelitowych i badanie rozwoju układu pokarmowego.

Izolacja jelit od larw danio pręgowanego do sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek

Przeglądaj więcej filmów