Name: Ocena mikroarchitektury kości beleczkowej w mysim modelu osteoporozy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-08T14:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 59 s
Description: Poznaj metodę mikro-CT do oceny mikroarchitektury kości w mysim modelu osteoporozy. Technika ta dostarcza szczegółowych danych o strukturze kostnej, wspierając badania nad skutecznością terapii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Administrację Tradycyjnej Medycyny Chińskiej prowincji Syczuan (2021YJ0175) oraz Graduate Research Innovation Project Szkoły Medycyny Klinicznej (LCYJSKT2023-11), Chengdu University of Traditional Chinese Medicine.

Protokół dotyczący zwierząt został zatwierdzony przez Komitet Etyki Zwierząt Uniwersytetu Tradycyjnej Medycyny Chińskiej w Chengdu (numer rekordu: 2020-34). Samice myszy C57BL/6J (12-tygodniowe, n = 14) zostały losowo podzielone na dwie grupy, grupę pozorowaną (grupa pozorowana, n = 7) i grupę modelową (grupa OVX, n = 7). Zwierzęta zostały zakupione od komercyjnego dostawcy (patrz tabela materiałów). Wszystkie myszy trzymano w indywidualnych klatkach w temperaturze 22-26 °C przy wilgotności 45%-55%, pozwolono im przystosować się do nowego środowiska przez 1 tydzień i zapewniono im swobodny dostęp do wody i diety. Wszystkie badania eksperymentalne na zwierzętach przeprowadzono na Uniwersytecie Tradycyjnej Medycyny Chińskiej w Chengdu i dołożono wszelkich starań, aby zminimalizować cierpienie zwierząt.
1. Przygotowanie modelu zwierzęcego
<ol>
	<li>Znieczulić 12-tygodniową mysz przez wstrzyknięcie dootrzewnowe 1,25% Avertin (tribromoetanol w alkoholu tert-amylowym, patrz tabela materiałów) w dawce 0,02 ml / g. Umieść mysz leżącą na sterylnym stole operacyjnym i unieruchamij jej kończyny, bezpiecznie je przyklejając taśmą.</li>
	<li>Użyj nożyczek (patrz Tabela materiałów), aby przyciąć włosy, które mogą mieć wpływ na operację chirurgiczną. 
	UWAGA: Zaleca się unikanie uszkodzeń skóry podczas przygotowania pola operacyjnego.</li>
	<li>Dokładnie umyj ręce i załóż rękawice chirurgiczne. Trzykrotnie zdezynfekuj grzbiet myszy jodonem powidonu (patrz Tabela materiałów) i użyj gazy medycznej (patrz Tabela materiałów), aby go wysuszyć. 
	UWAGA: Zachowaj ostrożność; Zbyt mocne zamoczenie włosów podczas dezynfekcji może prowadzić do hipotermii pooperacyjnej u myszy.</li>
	<li>Wykonaj nacięcie o długości około 0,5-1,0 cm, znajdujące się w odległości 1 cm od jednej trzeciej linii środkowej grzbietu myszy, za pomocą skalpela (patrz Tabela materiałów). Delikatnie oddziel powięź i przetnij mięsień nożyczkami do tkanek (patrz Tabela materiałów), aż jajnik będzie widoczny. Podwiązać otaczające naczynia krwionośne niewchłanialnymi szwami (patrz Tabela materiałów) i usunąć jajnik.</li>
	<li>Przepłucz jamę 0,9% roztworem soli fizjologicznej, a następnie zszyj osobno skórę, mięśnie i powięź (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Powtórz tę samą sekwencję kroków po drugiej stronie.</li>
	<li>Usuń tłuszcz okołojajnikowy o tej samej wielkości co jajnik i wykonaj tę samą procedurę chirurgiczną, o której mowa powyżej, dla pozostałych kroków w celu ustalenia pozorowanego modelu operowanego.</li>
	<li>Odczekaj okres rekonwalescencji wynoszący 1 tydzień po zabiegu. Po 8 tygodniach osteoporotyczne modele myszy zostaną pomyślnie ustanowione9,10.</li>
</ol>
2. Mikrotomografia komputerowa
<ol>
	<li>Poddaj mysz eutanazji przez nadmierne wdychanie CO2 . Po eutanazji należy usunąć jak najwięcej tkanki miękkiej z kości udowej myszy i uzyskać świeżą próbkę do skanowania. 
	UWAGA: Chociaż nie ma idealnego rozwiązania do konserwacji próbek, można podjąć pewne kroki, aby zmaksymalizować jakość wyników skanowania Micro-CT. Przed utrwaleniem należy pamiętać o usunięciu jak największej ilości otaczającej tkanki. Formalina lub buforowana formalina jest najbardziej preferowaną metodą utrwalania z przechowywaniem w PBS11,12.</li>
	<li>Kliknij dwukrotnie ikonę oprogramowania systemu obrazowania mikro-CT na pulpicie, aby uruchomić system (patrz tabela materiałów). Wybrać łóżko do pobierania próbek zgodne z polem widzenia próbki (FOV) o wymiarach 18 mm x 18 mm. Załadować odpowiednie łoże próbki do maszyny i zamknąć właz.</li>
	<li>Kliknij przycisk Rozgrzewka w Panelu sterowania. 
	UWAGA: Wymagany był krótki czas nagrzewania. Nie próbuj otwierać włazu, gdy generowane są promienie rentgenowskie. Sprawdź kontrolkę X-Ray On na panelu przednim i monitorze komputera, aby potwierdzić, czy generowane są promienie rentgenowskie.</li>
	<li>Kliknij przycisk Menu, aby ustawić nową bazę danych, a następnie utwórz nową próbkę i badanie.</li>
	<li>Wybierz opcję Ręcznie z listy rozwijanej Menu i wprowadź niestandardowe wartości napięcia i prądu w Panelu sterowania. Ustaw napięcie (kV) na 90, prąd (μA) na 80, tryb skanowania na wysoką rozdzielczość, 14 min i FOV (mm) na 18 mm x 18 mm. 
	UWAGA: Zapoznaj się z instrukcją dla różnych systemów mikro CT, aby ustawić odpowiednie parametry.</li>
	<li>Umieść kość bezpiecznie za pomocą folii z tworzywa sztucznego w łożu próbki. Zamknij właz. Upewnij się, że obiekt jest dokładnie wyśrodkowany w oknie X-capture, naciskając przyciski regulacji na urządzeniu. 
	UWAGA: Regulacja sample musi być powolna i delikatna, aby uniknąć przypadkowego wpadnięcia do maszyny.</li>
	<li>Kliknij przycisk Start, aby rozpocząć tomografię komputerową.</li>
</ol>
3. Analiza danych CT
<ol>
	<li>Wejdź do oprogramowania (patrz Tabela materiałów) i wybierz dane do analizy. Kliknij opcję Sub (Podrzędny) i ustaw Pixel Size (Rozmiar piksela) na 10 μm. Przesuń i zmień rozmiar obszaru zainteresowania (ROI), aby uwzględnić dystalną część kości udowej powyżej płytki wzrostu. Kliknij na Start (patrz Rysunek 1). 
	UWAGA: Rozmiar piksela rekonstrukcji podobjętości został wybrany na 10 μm, ponieważ grubość beleczek obrazowych oszacowano na około 20-30 μm na podstawie danych histologicznych z poprzednich badań13. Jeśli stosunek sygnału do szumu jest niewystarczający do przetworzenia danych, należy wykonać skanowanie w wysokiej rozdzielczości w ciągu 1 godziny.</li>
	<li>Kliknij przycisk Analiza 3D, aby uzyskać wynikową rekonstrukcję 3D.</li>
	<li>Eksport danych z systemu mikro-CT do komputera w celu analizy.</li>
	<li>Zaimportuj zrekonstruowane dane CT. Kliknij opcję Process > Image Calculator (Przetwarzaj Kalkulator obrazów), a następnie kliknij opcję Region Pad > Interactive. Dostosuj żółte pole wyboru do odpowiedniego ROI. 
	UWAGA: Obszar zainteresowania (ROI) zaczyna się około 540 μm proksymalnie do płytki wzrostowej i rozciąga się 1600 μm proksymalnie, aby ocenić rzeczywisty metabolizm i przebudowę kości.</li>
	<li>Wybierz rozszerzenie Analiza mikroarchitektury kości (BMA) (patrz Tabela materiałów). Kliknij pozycję Segment Cortex, a następnie pozycję Segment Trabeculae. 
	UWAGA: Zarówno kość beleczkowa, jak i korowa są wybierane automatycznie. Zwykle nie jest wymagana ręczna regulacja.</li>
	<li>Kliknij Zapisz końcową mapę obiektów, a następnie kliknij Zmierz kość, aby obliczyć wskaźniki morfometryczne kości. 
	UWAGA: Obliczono tutaj tylko względną gęstość mineralną kości (BMD), ponieważ nie dodano żadnej kontroli.</li>
</ol>
4. Odwapnienie tkanki kostnej
<ol>
	<li>Utrwalić próbki kości w 4% paraformaldehydzie (patrz Tabela Materiałów) przez 24 godziny. Umyj próbki trzykrotnie PBS (patrz Tabela Materiałów) przez 20 minut za każdym razem.</li>
	<li>Chusteczkę płukać trzykrotnie wodą destylowaną przez 20 minut za każdym razem. Przenieść tkankę do roztworu odwapniającego zawierającego EDTA (patrz tabela materiałów) i odkamieniać przez 30 dni z cotygodniową wymianą roztworu, aż do punktu końcowego. 
	UWAGA: Nakłuwanie igłą, szczypanie ręką i zaciskanie służy do zakończenia odwapnienia, gdy tkanka kostna staje się miękka lub nie ma poczucia oporu podczas igłowania. Fizyczna metoda wykrywania może spowodować pewne uszkodzenie struktury tkanki, dlatego staraj się unikać nadmiernej siły lub wielokrotnych testów.</li>
	<li>Wyjmij tkankę z utrwalacza i za pomocą skalpela przyciąć tkankę do okapu wyciągowego. Umieść przyciętą chusteczkę i odpowiednią etykietę w pudełku do odwadniania.</li>
	<li>Umieść pudełko do odwadniania w koszu i odwodnij je w rozdrabniaczu tkanek (patrz Tabela materiałów) alkoholem gradientowym (75% etanolu przez 4 godziny, 85% etanolu przez 2 godziny, 90% etanolu przez 2 godziny, 95% etanolu przez 1 godzinę, etanolu bezwodnego przez 30 min, etanolu bezwodnego II przez 30 minut, ksylenu I przez 5-10 min, ksylen II przez 5-10 min, wosk I przez 1 h, wosk II przez 1 h, wosk III przez 1 h).</li>
	<li>Użyj maszyny do zatapiania (patrz Tabela materiałów), aby zatopić tkankę nasączoną woskiem. Wlej stopiony wosk do pudełka do zatapiania i umieść chusteczkę z pudełka do odwadniania, zanim wosk stwardnieje.</li>
	<li>Ustaw tkankę zgodnie z powierzchnią zatapiania i przymocuj odpowiednią etykietę. Schłodzić na stole do zamrażania w temperaturze -20 °C (patrz Tabela Materiałów). Po zestaleniu wyjmij blok wosku z pudełka do zatapiania i przytnij blok wosku w razie potrzeby (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Pokrój przycięty blok wosku na szkiełka o grubości 3 μm na mikrotomie (patrz Tabela materiałów). Zanurzyć szkiełka w ciepłej wodzie o temperaturze 40 °C na maszynie do rozprowadzania chusteczek higienicznych (patrz Tabela Materiałów), aby spłaszczyć chusteczkę i nabrać ją za pomocą szkiełka.</li>
	<li>Piec w piekarniku o temperaturze 60 °C (patrz tabela materiałów), aż woda odparuje, a wosk się rozpuści. Wyjąć i przechowywać w temperaturze pokojowej (RT) do późniejszego wykorzystania.</li>
</ol>
5. Barwienie HE
<ol>
	<li>Umieść szkiełka w ksylenie I na 20 minut, a następnie w ksylenie II na 20 minut. Następnie umieść szkiełka w bezwodnym etanolu I i bezwodnym etanolu II na 5 minut każdy, 75% alkoholu na 5 minut, a następnie umyj szkiełka wodą z kranu (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Inkubować w hematoksylinie (patrz tabela materiałów) przez 3-5 minut. Rozróżnić próbki roztworem kwasu solnego (patrz tabela materiałów). Potraktuj szkiełka roztworem amoniaku (patrz Tabela materiałów) w celu zniebieszczenia, a następnie umyj szkiełka wodą.</li>
	<li>Umieść szkiełka w 85%, 95% alkoholu gradientowym w celu odwodnienia i zabarwij roztworem eozyny (patrz Tabela materiałów) na 5 minut.</li>
	<li>Umieść szkiełka w bezwodnym etanolu I na 5 minut, bezwodnym etanolu II na 5 minut i bezwodnym etanolu III na 5 minut. Potraktuj szkiełka ksylenem I przez 5 minut, ksylenem II przez 5 minut i zamontuj neutralnym balsamem (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Zbadaj każde szkiełko pod mikroskopem. Następnie wybierz reprezentatywne warstwy do skanowania panoramicznego (patrz Tabela materiałów). 
	UWAGA: Dla każdej próbki wymagane są co najmniej trzy kolejne plasterki. Przed skanowaniem panoramicznym plastry należy zbadać pod mikroskopem, aby upewnić się, że są kompletne i wyraźne. Upewnij się, że jama szpiku kostnego, kość korowa i kość gąbczasta są w pełni widoczne i że widoczne są różne typy komórek kostnych.</li>
</ol>
6. Analiza obrazu HE
<ol>
	<li>Otwórz obrazy HE za pomocą oprogramowania CaseViewer (patrz Spis materiałów). Wybierz obszar zainteresowania (ROI) na slajdzie i zapisz go jako obraz kolorowy. 
	UWAGA: Wybór ROI jest zgodny z wyżej wymienionym oprogramowaniem.</li>
	<li>Otwórz obraz w ImageJ (patrz Spis materiałów). Wybierz narzędzie Różdżka z paska narzędzi. Kliknij na kość beleczkową.</li>
	<li>W razie potrzeby dostosuj ustawienia tolerancji i ciągłych elementów. Przejdź do opcji Image > Adjustment (Dopasowania obrazu > czerni i bieli) i kliknij przycisk OK. Powtórz te kroki dla innych obszarów kości.</li>
	<li>Odwróć zaznaczenie i wypełnij je białym kolorem. Zapisz obraz jako maskę do analizy (patrz Rysunek 2). 
	UWAGA: Szczegółową metodologię można znaleźć w poprzednio opublikowanej książce work14.</li>
	<li>Otwórz maskę w oprogramowaniu do analizy15,16 (patrz Tabela materiałów). Uruchom polecenie Process > Binary > Make Binary, aby przekonwertować obraz kolorowy na obraz binarny.</li>
	<li>Użyj plugin17 (patrz Tabela materiałów) w oprogramowaniu, aby przeanalizować parametry konstrukcyjne: Uruchom Ułamek powierzchni/objętości, aby obliczyć objętość kości do całkowitej objętości kości (BV/TV [%])18,19. 
	UWAGA: Ta metoda ma zastosowanie do beleczków kostnych i szpiku kostnego, wypełniając cały zwrot z inwestycji na obrazach HE.</li>
</ol>

HE Staining and Micro-CT to Evaluate Murine Trabecular Bone Microarchitecture

<ol><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+prevalence+of+osteoporosis+in+China%2C+a+community+based+cohort+study+of+osteoporosis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Public+Health%22%5BJournal%5D)">The prevalence of osteoporosis in China, a community based cohort study of osteoporosis.</a> Frontiers in Public Health. 11, 1084005(2023).</li>
<li>Stein, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+animal+experiments+are+still+indispensable+in+bone+research%3A+A+statement+by+the+European+Calcified+Tissue+Society%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Why animal experiments are still indispensable in bone research: A statement by the European Calcified Tissue Society.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 38 (8), 1045-1061 (2023).</li>
<li>Kerschan-Schindl, K., Papageorgiou, M., Föger-Samwald, U., Butylina, M., Weber, M., Pietschmann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+bone+microstructure+by+micro+CT+in+C57BL%2F6J+mice+for+sex-specific+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Assessment of bone microstructure by micro CT in C57BL/6J mice for sex-specific differentiation.</a> International Journal of Molecular Sciences. 23 (23), 14585(2022).</li>
<li>Fonseca, H., Moreira-Gonçalves, D., Coriolano, H. J. A., Duarte, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+quality%3A+the+determinants+of+bone+strength+and+fragility%5BTitle%5D)+AND+%22Sports+Medicine%22%5BJournal%5D)">Bone quality: the determinants of bone strength and fragility.</a> Sports Medicine. 44, 37-53 (2014).</li>
<li>Bouxsein, M. L., Boyd, S. K., Christiansen, B. A., Guldberg, R. E., Jepsen, K. J., Müller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+assessment+of+bone+microstructure+in+rodents+using+micro-computed+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Guidelines for assessment of bone microstructure in rodents using micro-computed tomography.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 25 (7), 1468-1486 (2010).</li>
<li>Akhter, M. P., Recker, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+imaging+in+bone+tissue+research-review%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">High resolution imaging in bone tissue research-review.</a> Bone. 143, 115620(2021).</li>
<li>Mys, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+3D+microstructural+parameters+of+trabecular+bone+is+affected+by+the+analysis+software%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Quantification of 3D microstructural parameters of trabecular bone is affected by the analysis software.</a> Bone. 142, 115653(2021).</li>
<li>Chavassieux, P., Chapurlat, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interest+of+bone+histomorphometry+in+bone+pathophysiology+investigation%3A+Foundation%2C+present%2C+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Interest of bone histomorphometry in bone pathophysiology investigation: Foundation, present, and future.</a> Frontiers in Endocrinology. 13, 907914(2022).</li>
<li>Komori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+for+osteoporosis%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Animal models for osteoporosis.</a> European Journal of Pharmacology. 759, 287-294 (2015).</li>
<li>Zhu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovariectomy-induced+bone+loss+in+TNF%CE%B1+and+IL6+gene+knockout+mice+is+regulated+by+different+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Ovariectomy-induced bone loss in TNFα and IL6 gene knockout mice is regulated by different mechanisms.</a> Journal of Molecular Endocrinology. 60 (3), 185-198 (2018).</li>
<li>Baum, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoporosis+imaging%3A+effects+of+bone+preservation+on+MDCT-based+trabecular+bone+microstructure+parameters+and+finite+element+models%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Medical+Imaging%22%5BJournal%5D)">Osteoporosis imaging: effects of bone preservation on MDCT-based trabecular bone microstructure parameters and finite element models.</a> BMC Medical Imaging. 15, 22(2015).</li>
<li>Nazarian, A., Hermannsson, B. J., Muller, J., Zurakowski, D., Snyder, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+tissue+preservation+on+murine+bone+mechanical+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanics%22%5BJournal%5D)">Effects of tissue preservation on murine bone mechanical properties.</a> Journal of Biomechanics. 42 (1), 82-86 (2009).</li>
<li>Martín-Badosa, E., Amblard, D., Nuzzo, S., Elmoutaouakkil, A., Vico, L., Peyrin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excised+bone+structures+in+mice%3A+imaging+at+three-dimensional+synchrotron+radiation+micro+CT%5BTitle%5D)+AND+%22Radiology%22%5BJournal%5D)">Excised bone structures in mice: imaging at three-dimensional synchrotron radiation micro CT.</a> Radiology. 229 (3), 921-928 (2003).</li>
<li>Egan, K. P., Brennan, T. A., Pignolo, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+histomorphometry+using+free+and+commonly+available+software%5BTitle%5D)+AND+%22Histopathology%22%5BJournal%5D)">Bone histomorphometry using free and commonly available software.</a> Histopathology. 61 (6), 1168-1173 (2012).</li>
<li>Brandi, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarchitecture%2C+the+key+to+bone+quality%5BTitle%5D)+AND+%22Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Microarchitecture, the key to bone quality.</a> Rheumatology. 48 (suppl_4), iv3-iv8 (2009).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Domander, R., Felder, A. A., Doube, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BoneJ2-refactoring+established+research+software%5BTitle%5D)+AND+%22Wellcome+Open+Research%22%5BJournal%5D)">BoneJ2-refactoring established research software.</a> Wellcome Open Research. 6, 37(2021).</li>
<li>Parfitt, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+histomorphometry%3A+standardization+of+nomenclature%2C+symbols%2C+and+units%3A+report+of+the+ASBMR+Histomorphometry+Nomenclature+Committee%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Bone histomorphometry: standardization of nomenclature, symbols, and units: report of the ASBMR Histomorphometry Nomenclature Committee.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 2 (6), 595-610 (1987).</li>
<li>Kazama, J. J., Koda, R., Yamamoto, S., Narita, I., Gejyo, F., Tokumoto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancellous+bone+volume+is+an+indicator+for+trabecular+bone+connectivity+in+dialysis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%3A+CJASN%22%5BJournal%5D)">Cancellous bone volume is an indicator for trabecular bone connectivity in dialysis patients.</a> Clinical Journal of the American Society of Nephrology: CJASN. 5 (2), 292-298 (2010).</li>
<li>Watts, N. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postmenopausal+osteoporosis%3A+A+clinical+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Women%27s+Health%22%5BJournal%5D)">Postmenopausal osteoporosis: A clinical review.</a> Journal of Women's Health. 27 (9), 1093-1096 (2018).</li>
<li>Thompson, D. D., Simmons, H. A., Pirie, C. M., Ke, H. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FDA+Guidelines+and+animal+models+for+osteoporosis%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">FDA Guidelines and animal models for osteoporosis.</a> Bone. 17 (4), S125-S133 (1995).</li>
<li>Iwaniec, U. T., Yuan, D., Power, R. A., Wronski, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strain-dependent+variations+in+the+response+of+cancellous+bone+to+ovariectomy+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Strain-dependent variations in the response of cancellous bone to ovariectomy in mice.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 21 (7), 1068-1074 (2006).</li>
<li>Ferguson, V. L., Ayers, R. A., Bateman, T. A., Simske, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+development+and+age-related+bone+loss+in+male+C57BL%2F6J+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Bone development and age-related bone loss in male C57BL/6J mice.</a> Bone. 33 (3), 387-398 (2003).</li>
<li>Glatt, V., Canalis, E., Stadmeyer, L., Bouxsein, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+changes+in+trabecular+architecture+differ+in+female+and+male+C57BL%2F6J+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Age-related changes in trabecular architecture differ in female and male C57BL/6J mice.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 22 (8), 1197-1207 (2007).</li>
<li>Seeman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structural+and+biomechanical+basis+of+the+gain+and+loss+of+bone+strength+in+women+and+men%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology+and+Metabolism+Clinics%22%5BJournal%5D)">The structural and biomechanical basis of the gain and loss of bone strength in women and men.</a> Endocrinology and Metabolism Clinics. 32 (1), 25-38 (2003).</li>
<li>Ticha, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+cryo-embedding+method+for+in-depth+analysis+of+craniofacial+mini+pig+bone+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A novel cryo-embedding method for in-depth analysis of craniofacial mini pig bone specimens.</a> Scientific Reports. 10 (1), 19510(2020).</li>
<li>Genant, H. K., Engelke, K., Prevrhal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+CT+bone+imaging+in+osteoporosis%5BTitle%5D)+AND+%22Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Advanced CT bone imaging in osteoporosis.</a> Rheumatology. 47 (suppl_4), iv9-iv16 (2008).</li>
<li>Zaw Thin, M., Moore, C., Snoeks, T., Kalber, T., Downward, J., Behrens, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-CT+acquisition+and+image+processing+to+track+and+characterize+pulmonary+nodules+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Micro-CT acquisition and image processing to track and characterize pulmonary nodules in mice.</a> Nature Protocols. 18 (3), 990-1015 (2023).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Osteoporoza może prowadzić do częstych złamań, które są kosztowne, mogą powodować ból, niepełnosprawność, a nawet śmierć i poważnie wpływać na jakość życia pacjentów20. Z biegiem lat model owariektomii został uznany za jedną ze standardowych metod badania osteoporozy21. Najczęstszym przedklinicznym modelem zwierzęcym osteoporozy jest szczur po owariektomii (OVX). Mimo to większość badań nad mechanizmami zaburzeń kości, w tym osteoporozy, przeprowadzono na myszach<sup class=...

Osteoporoza jest powszechną metaboliczną chorobą kości, szczególnie wśród osób starszych, i wiąże się ze zwiększonym ryzykiem złamań łamliwości. Ponieważ osteoporoza staje się coraz bardziej powszechna w Chinach1, będzie rosło zapotrzebowanie na badanie struktur kostnych małych zwierząt2,3. Poprzednie metody pomiaru ubytku kości opierają się na wynikach dwuwymiarowej absorpcjometrii promieniowania rentgenowskiego o podwójnej energii. Nie uwzględnia to jednak zmian w mikrostrukturze architektonicznej kości beleczkowej, która jest kluczowym czynnikiem wpływającym na wytrzymałość szkieletu4. Mikrostruktura kości wpływa na jej wytrzymałość, sztywność i odporność na złamania. Porównując mikroarchitekturę kości w stanach normalnych i patologicznych, można zidentyfikować zmiany w morfologii, strukturze i funkcji tkanki kostnej spowodowane osteoporozą. Informacje te przyczyniają się do zrozumienia rozwoju osteoporozy i jej związku z innymi chorobami. 
Obrazowanie mikrotomografii komputerowej (Micro-CT) stało się ostatnio popularną techniką oceny morfologii kości, gdzie może dostarczyć dokładnych i wyczerpujących danych na temat struktury i parametrów gęstości kości, takich jak objętość kości, grubość i separacja5,6. W tym samym czasie na wyniki Micro-CT może mieć wpływ oprogramowanie analityczne7. Różne metody pozyskiwania, oceny i raportowania obrazów są wykorzystywane przez różne komercyjne systemy mikro-CT. Ta niespójność utrudnia porównywanie i interpretowanie wyników podawanych przez różne badania5. Ponadto nie może obecnie zastąpić histomorfometrii kości w dostarczaniu badaczom informacji na temat parametrów na poziomie komórkowym w układzie kostnym8. Tymczasem techniki histologiczne pozwalają na bezpośrednią obserwację i pomiar mikroskopowej morfologii kości. Barwienie hematoksyliną i eozyną (HE) jest powszechną techniką barwienia stosowaną w histologii do wizualizacji ogólnej struktury komórek i tkanek. Służy do identyfikacji obecności tkanki kostnej i jej mikroarchitektury.
Ten artykuł wykorzystuje Micro-CT w połączeniu z techniką krojenia tkanek (barwienie Hematoxylin-Eosin [HE]) do zbierania obrazów tkanki kostnej i przeprowadzania analizy ilościowej kości beleczkowej w celu oceny zmian mikrostruktury kości w mysim modelu osteoporozy.

<table><tbody><tr><td>4% Paraformaldehyd</td><td>Biosharp</td><td>BL539A</td><td></td></tr><tr><td>Adobe Photoshop</td><td>Adobe Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Roztwór amoniaku</td><td>Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd</td><td>2021070101</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze anatomiczne</td><td>Jinzhong instrument chirurgiczny Co., Ltd</td><td>J3C030</td><td></td></tr><tr><td>Bezwodny etanol</td><td>Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd</td><td>2022070501</td><td></td></tr><tr><td>Automatyczna maszyna do farbowania</td><td>Thermo scientific</td><td>Varistain&trade; </td> Dodatek do analizy mikroarchitektury kości Gemini ES <td></td></tr><tr><td></td><td>AnalyzeDirect, Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Myszy C57BL/6J SPF</td><td>(Pekin) Biotechnology Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Prowadnice nośne</td><td>Nantong mei wei de Experimental Equipment Co., Ltd</td><td>220518001</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe</td><td>Nantong mei wei de Experimental Equipment Co.</td><td></td><td></td>220518001</tr><tr><td>Roztwór do odwapniania</td><td>Wuhan Xavier Biotechnology Co., Ltd</td><td>CR2203047</td><td></td></tr><tr><td>Delikatne nożyczki</td><td>Jinzhong instrument chirurgiczny Co., Ltd</td><td>ZJA010</td><td></td></tr><tr><td>Maszyna do znakowania pudełek do zatapiania</td><td>Thermo scientific</td><td>&nbsp; Maszyna</td> do zatapiania PrintMate AS <td></td></tr><tr><td></td><td>Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd</td><td>JB-P5</td><td></td></tr><tr><td>Fidżi: ImageJ</td><td>National Institutes of Health, USA</td><td></td><td></td>Film</tr><tr><td>Sealer</td><td>Thermo scientific</td><td>Autostainer 360</td><td></td></tr><tr><td>Stół zamrażający</td><td>Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd</td><td>JB-L5</td><td></td></tr><tr><td>H& E Zestaw do barwienia</td><td>Leagene</td><td>DH0020</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór kwasu solnego</td><td>Sichuan Xilong Science Co., Ltd</td><td>210608</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ2 Plugin</td><td></td><td>BoneJ 7.0.16</td><td></td></tr><tr><td>Gaza</td><td>medyczna Shandong Ang Yang Medical Technology Co.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mersilk 3-0 Plecione jedwabne niewchłanialne szwy</td><td>Ethicon, Inc.</td><td>SA84G</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt igły</td><td>Jinzhong instrument chirurgiczny Co., Ltd</td><td>J32010</td><td></td></tr><tr><td>Neutralny balsam</td><td>Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10004160</td><td></td></tr><tr><td>Piekarnik</td><td>Szanghaj Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd</td><td>DHG-9240A Cyfrowe skanery</td><td></td></tr><tr><td>slajdów PANNORAMIC</td><td>3DHISTECH Ltd.&nbsp;</td><td>PANNORAMIC DESK/MIDI/250/1000</td><td></td></tr><tr><td>PBS Bufor</td><td>Biosharp</td><td>G4202</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór jodu powidonu 5%</td> <td>Chengdu Yongan Pharmaceutical Co., Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>System obrazowania mikrotomografii komputerowej Quantum GX2</td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Obrotowy mikrotom</td><td>Thermo naukowy</td><td>skalpel HM325</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Quanzhou Excellence Medical Co., Ltd</td><td>20170022</td><td></td></tr><tr><td>Skanowanie i skanowanie Przeglądaj oprogramowanie</td><td>3DHISTECH Ltd.&nbsp;</td><td>CaseViewer2.4</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowe sterylne gumowe rękawice chirurgiczne</td><td>Guangdong Huitong Latex Products Group Co., Ltd</td><td>22B141EO</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór chlorku sodu 0,9%</td> <td>Sichuan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterylne strzykawki podskórne do jednorazowego użytku</td><td>Shandong Weigao Group Medical Polymer Products&nbsp; Co., Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterylne igły do szwów medycznych</td><td>Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd.&nbsp;</td><td>PW8068</td><td></td></tr><tr><td>Procesor tkanek</td><td>Thermo scientific</td><td>STP420 ES</td><td></td></tr><tr><td>Maszyna do rozprowadzania i pieczenia tkanek</td><td>Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd</td><td>JK-6</td><td></td></tr><tr><td>Tribromoetanol</td><td>Nanjing Aibei Biotechnology Co., Ltd</td><td>M2920</td><td></td></tr><tr><td>Trymer do wosku</td><td>Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd</td><td>JXL-818</td><td></td></tr><tr><td>Ksylen</td><td>Chengdu Kolon Chemical Co., Sp. z o.o</td>. <td>2022051901</td><td></td></tr></tbody></table>

ocena mikroarchitektury kości beleczkowej w mysim modelu osteoporozy

Trabecular Bone Microarchitecture Evaluation in an Osteoporosis Mouse Model

Mikrostruktura kości odnosi się do ułożenia i jakości tkanki kostnej na poziomie mikroskopowym. Zrozumienie mikrostruktury kostnej szkieletu ma kluczowe znaczenie dla uzyskania wglądu w patofizjologię osteoporozy i poprawy jej leczenia. Jednak obchodzenie się z próbkami kości może być skomplikowane ze względu na ich twarde i gęste właściwości. Po drugie, specjalistyczne oprogramowanie utrudnia przetwarzanie i analizę obrazu. W niniejszym protokole przedstawiamy ekonomiczne i łatwe w użyciu rozwiązanie do analizy mikrostruktury kości beleczkowej. Podane są szczegółowe instrukcje i środki ostrożności. Mikrotomografia komputerowa to nieniszcząca technika obrazowania trójwymiarowego (3D), która zapewnia obrazy struktury kości beleczkowej o wysokiej rozdzielczości. Pozwala na obiektywną i ilościową ocenę jakości kości, dlatego jest powszechnie uważana za złoty standard metody oceny jakości kości. Jednak histomorfometria pozostaje niezbędna, ponieważ oferuje kluczowe parametry na poziomie komórkowym, wypełniając lukę między dwuwymiarową (2D) i 3D oceną próbek kości. Jeśli chodzi o techniki histologiczne, zdecydowaliśmy się na odwapnienie tkanki kostnej, a następnie wykonanie tradycyjnego zatapiania parafiny. Podsumowując, połączenie tych dwóch metod może dostarczyć bardziej wszechstronnych i dokładnych informacji na temat mikrostruktury kości.

Analiza mikro-CT 
Zmierzono parametry mikroarchitektoniczne beleczek kostnych u myszy z obu grup, a ich wartości średnie oraz odchylenia standardowe (SD) przedstawiono w Tabeli 1. Rozkład niektórych parametrów (tj. stosunek objętości kości do całkowitej objętości tkanki, grubość beleczek, separacja beleczek) w każdej z grup zilustrowano na Rysunku 3.
Wyniki te wskazują na istot...

Ten protokół przedstawia ekonomiczną i efektywną metodę ilościowej oceny mikroarchitektury kości w mysim modelu osteoporozy poprzez połączenie barwienia Hematoxylin-Eosin (HE) i technik mikrotomografii komputerowej (Micro-CT).

Ocena mikroarchitektury kości beleczkowej w mysim modelu osteoporozy

Bone microstructure refers to the arrangement and quality of bone tissue at the microscopic level. Understanding the bone microstructure of the skeleton ...

Nasze badania koncentrowały się na wpływie tradycyjnej medycyny chińskiej (TCM) na osteoporozę. Staramy się zbadać mechanizm, skuteczność i bezpieczeństwo interwencji TCM w osteoporozie. Obrazowanie mikrotomografią komputerową stało się ostatnio popularną techniką oceny morfologii kości.Może dostarczyć dokładnych i kompleksowych danych na temat struktury i parametrów gęstości kości, takich jak objętość kości, grubość złamania i separacja. Układ kostny jest najbardziej unikalną strukturą tkankową pod względem właściwości fizycznych organizmu. Zawiera nieorganiczny składnik argininę fosforan wapnia, dzięki czemu jest twardy i sztywny.Proces bolesnych objawów kostnych jest żmudny. Dostarczyliśmy badaczom kompletny i szczegółowy proces od modelowania do osteoporozy w ocenie. Wierzymy, że zastosowanie tej technologii bez wątpienia przyniesie ogromne postępy w badaniach nad osteoporozą w kontekście eksploracji etnomedycyny.

trabecular-bone-microarchitecture-evaluation-an-osteoporosis-mouse

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Celem tego protokołu jest wygenerowanie modelu złamania kompresyjnego kręgów związanego z osteoporozą u nagich szczurów, który może być oceniany in vivo za pomocą półautomatycznej ilościowej analizy strukturalnej opartej na mikrotomografii komputerowej.

Półautomatyczna ilościowa analiza strukturalna oparta na mikrotomografii komputerowej nagiego szczura Model złamania kręgów związanego z osteoporozą

Ten manuskrypt opisuje model osteolizy kalwarii mysiej poprzez ekspozycję na cząsteczki CoCrMo, który stanowi idealny model zwierzęcy do oceny interakcji między cząstkami zużycia a różnymi komórkami w aseptycznym rozluźnieniu.

Budowa i ocena mysiego modelu osteolizy kalwarycznej poprzez ekspozycję na cząstki CoCrMo w aseptycznym rozluźnianiu

Ten artykuł instruuje użytkowników skanerów do mikrotomografii komputerowej in vivo (μCT), jak znieczulać, prawidłowo ustawiać i krępować tylną kończynę szczura w celu zminimalizowania ruchu podczas obrazowania kości piszczelowej w wysokiej rozdzielczości. Rezultatem są wysokiej jakości obrazy, które można przetworzyć w celu dokładnego określenia ilościowego mikroarchitektury kości.

Prawidłowe ułożenie i unieruchomienie tylnej kończyny szczura w celu zogniskowanego obrazowania mikroarchitektury kości w wysokiej rozdzielczości za pomocą mikrotomografii komputerowej in vivo

Prezentujemy proces tworzenia segmentacji i kwantyfikacji kości beleczkowych dla obrazów 2D i 3D na podstawie zewnętrznej granicy kości za pomocą wtyczki ImageJ. Podejście to jest bardziej wydajne i dokładne niż obecne podejście do ręcznego ręcznego konturowania i zapewnia kwantyfikację warstwa po warstwie, która nie jest dostępna w obecnym oprogramowaniu komercyjnym.

Segmentacja i kwantyfikacja kości beleczkowych wspomagana granicami zewnętrznymi za pomocą wtyczki Imagej

Obecny protokół ustanawia rygorystyczną i powtarzalną metodę ilościowego oznaczania zmian morfologicznych stawów, które towarzyszą chorobie zwyrodnieniowej stawów. Zastosowanie tego protokołu może być cenne w monitorowaniu postępu choroby i ocenie interwencji terapeutycznych w chorobie zwyrodnieniowej stawów.

Standaryzowana ocena histomorfometryczna choroby zwyrodnieniowej stawów w chirurgicznym modelu myszy

Ten protokół opisuje kanoniczną metodę zrozumienia krytycznych genów kontrolujących aktywność osteoklastów in vivo. Metoda ta wykorzystuje transgeniczny model myszy i niektóre techniki kanoniczne do analizy fenotypu szkieletu.

Analiza fenotypu szkieletowego modelu myszy z warunkową delecją Stat3

Ten protokół opisuje procedurę chirurgiczną mającą na celu wykrycie złamania trzonu w kości udowej myszy, która jest stabilizowana drutem śródszpikowym, do badań nad gojeniem złamań.

Ustalenie modelu złamania kości udowej trzonu u myszy

W tym protokole opisane są dwa podejścia, które ułatwiają jednoosiowe testowanie kompresji kręgów lędźwiowych myszy. W pierwszej kolejności opisano konwersję giętarki trzypunktowej na maszynę do prób ściskania. Po drugie, metoda osadzania w celu przygotowania powierzchni ładunkowej, która wykorzystuje cement kostny, jest dostosowana do kręgów lędźwiowych myszy.

Mysi kręg lędźwiowy Jednoosiowe badanie ściskania z osadzeniem powierzchni ładunkowej

Protokół pokazuje budowanie prostego i opłacalnego modelu treningu szczurów z obciążeniem dla indukowanej steroidami martwicy kości głowy kości udowej za pomocą elastycznej taśmy terapeutycznej.

Beznapięciowy model nośny martwicy kości głowy kości udowej wywołanej steroidami u szczurów

Proponujemy protokół oceny regeneracji kości na różnych poziomach hierarchicznych. To podejście multimodalne umożliwia analizę strukturalną na różnych skalach długości, skutecznie rozwiązując wyzwania związane z przygotowaniem próbek. Zapewnia również wiarygodny sposób oceny skuteczności biomateriałów w wspieraniu regeneracji kości.

Podejście multimodalne do oceny regeneracji kości i wydajności rusztowania

Poznaj metodę mikro-CT do oceny mikroarchitektury kości w mysim modelu osteoporozy. Technika ta dostarcza szczegółowych danych o strukturze kostnej, wspierając badania nad skutecznością terapii.

Ocena mikroarchitektury kości beleczkowej w mysim modelu osteoporozy

Przeglądaj więcej filmów