Ex vivo Hodowla eksplantatów łożyskowych - naśladowanie dynamicznych warunków w macicy
8 września 2023
Oto protokół hodowli eksplantatów łożyskowych w warunkach stałego przepływu. Podejście to wzmacnia tradycyjne statyczne systemy hodowli kosmków, umożliwiając replikację dynamicznych środowisk fizjologicznych.
Staramy się odkryć, gdzie u niektórych kobiet w ciąży rozwija się stan przedrzucawkowy, a u innych nie. Ten specyficzny dla ciąży zespół powoduje nadciśnienie tętnicze i białkomocz matki i może powodować śmierć matki i dziecka. Dzięki naszym badaniom translacyjnym mamy nadzieję zidentyfikować przyczyny łożyskowe prowadzące do objawów u matki.
Ostatnio metody sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek zostały wykorzystane do identyfikacji różnic między łożyskiem zdrowym a łożyskiem przedrzucawkowym. Teraz nadszedł czas, aby połączyć te dane z oryginalnymi tkankami. Dlatego używamy histologii przestrzennej i sekwencjonowania instytutowego, aby zidentyfikować zmiany na poziomie pojedynczej komórki.
Indywidualna złożoność struktury geometrycznej łożyska stanowi wyzwanie dla określenia dokładnej prędkości przepływu i naprężenia ścinającego dla danego kosmka łożyskowego. Dzięki zastosowaniu tego systemu hodowli przepływowej można zająć się i zbadać znaczenie siły ścinającej dla biologicznych funkcji tkanek łożyska. Na początek umieść wycięte kawałki próbek łożyska w PBS.
Wyrzuć płytkę kosmówkową, matczyne decidua i wszelkie widoczne zawały z próbki. Rozetnij pozostałą próbkę tkanki na kosmki o średnicy przekroju poprzecznego około 0,5 centymetra. Przenieś eksplantaty na szalkę Petriego wypełnioną świeżym PBS.
Za pomocą kleszczy potrząśnij każdym eksplantatem w PBS, aby usunąć całą krew. Pod sterylnym kapturem użyj zamków typu luer, aby połączyć pięć komór z butelką zbiornika. Odwróć komory do góry nogami i zdejmij dno.
Teraz użyj kleszczy, aby umieścić metalowe płytki centralnie w górnych częściach komór z kołkami skierowanymi do góry. Napełnij połowę komór jednym mililitrem podgrzanej pożywki hodowlanej. Dodaj dodatkowe 20 mililitrów pożywki do zbiornika.
Za pomocą kleszczy ostrożnie umieść kosmek eksplantowany na igłach metalowej płytki w komorze. Umieść cztery eksplantaty w jednej komorze. Ponownie przymocuj dno komór, aby je zamknąć.
Następnie podłącz rurkę pompy do pompy, aby połączyć obwód przepływu z pompą perystaltyczną wewnątrz bioreaktora. Napraw to na czwartym etapie. W menu Pompy wybierz tryb ręczny.
Dostosuj prędkość pompy do jednego mililitra na minutę i kliknij URUCHOM, aby rozpocząć pompowanie. Podczas napełniania trzymaj komory pod kątem, aby zapewnić całkowite napełnienie. Po zakończeniu procesu napełniania ponownie odwróć komorę.
Upewnij się, że komory są zabezpieczone i zamknij obie pokrywy bioreaktora. Po zakończeniu inkubacji tkanek kliknij przycisk ABORT, aby zatrzymać pompę. Na raz otwórz dwie pokrywy bioreaktora i jedną komorę przepływową.
Użyj kleszczy, aby ostrożnie usunąć eksplantaty z metalowej płytki w celu dalszej analizy. Immunohistochemicznie barwione eksplantaty wykazały dobrze ustrukturyzowaną i zorganizowaną wizualną prezentację cytoszkieletu w tkance świeżej i hodowlanej przepływowo. Z biegiem czasu agregacja mikrowłókien była coraz częściej obserwowana w statycznych eksplantatach, co oznaczało degradację struktury cytoszkieletu.
Zmniejszająca się integralność tkanek w czasie hodowli została potwierdzona przez barwienie hematoksyliną i eozyną. Świeże tkanki wykazywały gęsty i ciasno upakowany zrąb. Po 48 godzinach hodowli przepływowej zaobserwowano częściowo oderwane fragmenty syncytiotrofoblastu.
Integralność tkanek była nieodpowiednio zachowana już po 24 godzinach w warunkach hodowli statycznej, która uległa dalszemu pogorszeniu po 48 godzinach. Barwienie komórek śródbłonka wykazało wyraźnie zorganizowane komórki w świeżej tkance. Integralność morfologiczna była w dużym stopniu utrzymywana nawet po 48 godzinach w kulturach przepływowych.
Statyczne eksplantaty wykazywały jednak częściowe zapadnięcie się nawet po 24 godzinach, które uległo dalszemu pogorszeniu po 48 godzinach.
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia protokół hodowli eksplantów łożyska w warunkach stałego przepływu, co stanowi usprawnienie tradycyjnych statycznych systemów hodowli. Metoda ta ma na celu odwzorowanie dynamicznych środowisk fizjologicznych w celu lepszej analizy tkanek łożyska.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia
- Zdrowie reprodukcyjne
Wstęp
- Przedtrunawca jest zespołem specyficznym dla ciąży, który wpływa na zdrowie matki.
- Zrozumienie przyczyn łożyskowych przedtrunawcy ma kluczowe znaczenie dla dobrostanu matki i płodu.
- Sekwencjonowanie RNA pojedynczych komórek ujawniło różnice między łożyskami zdrowymi a łożyskami w przebiegu przedtrunawcy.
- Powiązanie danych transkrypcyjnych z analizą tkankową jest niezbędne dla pełnego zrozumienia zagadnienia.
Cel badania
- Identyfikacja przyczyn łożyskowych objawów stanu przedrzucawkowego.
- Badanie wpływu sił ścinających na funkcje tkanki łożyskowej.
- Wykorzystanie systemów hodowli przepływowych w celu poprawy analizy integralności tkanki.
Zastosowane metody
- Wycięte próbki łożyska hodowano w systemie przepływowym.
- Przeprowadzono barwienie immunohistochemiczne w celu oceny struktury tkanek.
- Do oceny integralności tkanek wykorzystano barwienie hematoksyliną i eozyną.
- Warunki hodowli przepływowej porównano w czasie z warunkami hodowli statycznej.
Główne wyniki
- Eksplanty hodowane w przepływie zachowały lepszą integralność morfologiczną niż hodowle statyczne.
- W hodowlach statycznych zaobserwowano degradację struktury cytoszkieletu w czasie.
- Wyraźna organizacja komórek śródbłonka została zauważona w tkankach świeżych oraz hodowanych w przepływie.
- W hodowlach przepływowych po 48 godzinach wystąpiło częściowe odrywanie się fragmentów syncytiotrofoblastu.
Wnioski
- Systemy kultur przepływowych są skuteczne w utrzymywaniu integralności tkanki łożyskowej.
- Naprężenie ścinające odgrywa istotną rolę w funkcjonowaniu tkanki łożyskowej.
- Konieczne są dalsze badania w celu zbadania implikacji dla badań nad preeklampsją.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Dynamiczna hodowla przepływowa eksplantów łożyska ex vivo rozwiązuje kluczowy problem w modelowaniu środowiska fizjologicznego interfejsu matka-płód, umożliwiając prowadzenie bardziej predykcyjnych i istotnych translacyjnie badań nad tkankami. System ten zwiększa wierność modeli przedklinicznych w biologii łożyska, wspierając mechanistyczną redukcję ryzyka oraz walidację celów w badaniach nad zdrowiem matki i płodu. Lepsza konserwacja morfologii tkanki w warunkach przepływu zwiększa wiarygodność późniejszych analiz biomarkerów i szlaków sygnałowych istotnych w kontekście powikłań ciążowych, takich jak preeclampsia.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia badanie reakcji tkanek łożyska pod wpływem fizjologicznie istotnego naprężenia ścinającego.
- Wspiera walidację funkcjonalną celów zaangażowanych w szlaki chorób matczynno-płodowych.
- Ułatwia mechanistyczną redukcję ryzyka poprzez powiązanie danych transkrypcyjnych z fenotypami na poziomie tkankowym.
Przesiew i opracowanie testu
- Zapewnia powtarzalną platformę do ilościowej oceny integralności tkanki i organizacji komórkowej.
- Poprawia standaryzację testu poprzez utrzymanie spójnych warunków natlenienia i przepływu we wszystkich eksplantach.
- Umożliwia wiarygodną ocenę potencjalnych interwencji w dynamicznym systemie odzwierciedlającym stan chorobowy.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia zestawienie wyników ex vivo z biologią łożyska in vivo w celu odkrycia biomarkerów translacyjnych.
- Wspiera ciągłość procesu od odkrycia po walidację przedkliniczną w pipeline'ach dotyczących zdrowia matki i płodu.
- Zmniejsza niejednoznaczność biologiczną w przedklinicznych modelach dysfunkcji łożyska.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ta metoda hodowli przepływowej łączy wczesny etap odkryć z badaniami przedklinicznymi, zapewniając fizjologicznie istotną platformę do testowania hipotez i walidacji celów na granicy macierzyńsko-płodowej.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia badanie wpływu sił ścinających na funkcje i integralność tkanki łożyskowej.
- Przesiewanie: Dostarcza powtarzalnych, ilościowych wyników dotyczących morfologii tkanki i organizacji komórkowej.
- Analityka: Wspiera analizę porównawczą warunków statycznych i przepływowych z wykorzystaniem wyników immunohistochemicznych i histologicznych.
- Badania translacyjne: Ułatwia korelację wyników ex vivo z obserwacjami klinicznymi w przypadku przedewlucji oraz zaburzeń z nią związanych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę wielokrotnego użytku dla różnorodnych inicjatyw badawczych w zakresie zdrowia matki i płodu.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w modelach tkanki łożyskowej i zmniejsza niepewność mechanistyczną.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność i standaryzację procesów hodowli eksplantów.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji w zakresie priorytetyzacji celów oraz rozwoju skorygowanego o ryzyko w portfelach badań nad zdrowiem matki i płodu.
- Wpływ na portfolio: Wspiera skorygowany o ryzyko postęp kandydatów poprzez dostarczanie solidnych, fizjologicznie istotnych danych.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w dyssekcji tkanek łożyska oraz technikach hodowli ex vivo.
- Wymaga dostępu do komór przepływowych, pomp perystaltycznych oraz infrastruktury do kontrolowanego natleniania.
- Wymaga standaryzacji protokołów przygotowania tkanek i analiz pomiędzy zespołami.
- Może wymagać adaptacji dla różnych modeli łożyska lub systemów matczyno-płodowych.
- Ograniczenia obejmują trudności w modelowaniu dokładnych prędkości przepływu in vivo oraz naprężeń ścinających.
