Ex vivo Hodowla eksplantatów łożyskowych - naśladowanie dynamicznych warunków w macicy
September 8th, 2023
Oto protokół hodowli eksplantatów łożyskowych w warunkach stałego przepływu. Podejście to wzmacnia tradycyjne statyczne systemy hodowli kosmków, umożliwiając replikację dynamicznych środowisk fizjologicznych.
Staramy się odkryć, gdzie u niektórych kobiet w ciąży rozwija się stan przedrzucawkowy, a u innych nie. Ten specyficzny dla ciąży zespół powoduje nadciśnienie tętnicze i białkomocz matki i może powodować śmierć matki i dziecka. Dzięki naszym badaniom translacyjnym mamy nadzieję zidentyfikować przyczyny łożyskowe prowadzące do objawów u matki.
Ostatnio metody sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek zostały wykorzystane do identyfikacji różnic między łożyskiem zdrowym a łożyskiem przedrzucawkowym. Teraz nadszedł czas, aby połączyć te dane z oryginalnymi tkankami. Dlatego używamy histologii przestrzennej i sekwencjonowania instytutowego, aby zidentyfikować zmiany na poziomie pojedynczej komórki.
Indywidualna złożoność struktury geometrycznej łożyska stanowi wyzwanie dla określenia dokładnej prędkości przepływu i naprężenia ścinającego dla danego kosmka łożyskowego. Dzięki zastosowaniu tego systemu hodowli przepływowej można zająć się i zbadać znaczenie siły ścinającej dla biologicznych funkcji tkanek łożyska. Na początek umieść wycięte kawałki próbek łożyska w PBS.
Wyrzuć płytkę kosmówkową, matczyne decidua i wszelkie widoczne zawały z próbki. Rozetnij pozostałą próbkę tkanki na kosmki o średnicy przekroju poprzecznego około 0,5 centymetra. Przenieś eksplantaty na szalkę Petriego wypełnioną świeżym PBS.
Za pomocą kleszczy potrząśnij każdym eksplantatem w PBS, aby usunąć całą krew. Pod sterylnym kapturem użyj zamków typu luer, aby połączyć pięć komór z butelką zbiornika. Odwróć komory do góry nogami i zdejmij dno.
Teraz użyj kleszczy, aby umieścić metalowe płytki centralnie w górnych częściach komór z kołkami skierowanymi do góry. Napełnij połowę komór jednym mililitrem podgrzanej pożywki hodowlanej. Dodaj dodatkowe 20 mililitrów pożywki do zbiornika.
Za pomocą kleszczy ostrożnie umieść kosmek eksplantowany na igłach metalowej płytki w komorze. Umieść cztery eksplantaty w jednej komorze. Ponownie przymocuj dno komór, aby je zamknąć.
Następnie podłącz rurkę pompy do pompy, aby połączyć obwód przepływu z pompą perystaltyczną wewnątrz bioreaktora. Napraw to na czwartym etapie. W menu Pompy wybierz tryb ręczny.
Dostosuj prędkość pompy do jednego mililitra na minutę i kliknij URUCHOM, aby rozpocząć pompowanie. Podczas napełniania trzymaj komory pod kątem, aby zapewnić całkowite napełnienie. Po zakończeniu procesu napełniania ponownie odwróć komorę.
Upewnij się, że komory są zabezpieczone i zamknij obie pokrywy bioreaktora. Po zakończeniu inkubacji tkanek kliknij przycisk ABORT, aby zatrzymać pompę. Na raz otwórz dwie pokrywy bioreaktora i jedną komorę przepływową.
Użyj kleszczy, aby ostrożnie usunąć eksplantaty z metalowej płytki w celu dalszej analizy. Immunohistochemicznie barwione eksplantaty wykazały dobrze ustrukturyzowaną i zorganizowaną wizualną prezentację cytoszkieletu w tkance świeżej i hodowlanej przepływowo. Z biegiem czasu agregacja mikrowłókien była coraz częściej obserwowana w statycznych eksplantatach, co oznaczało degradację struktury cytoszkieletu.
Zmniejszająca się integralność tkanek w czasie hodowli została potwierdzona przez barwienie hematoksyliną i eozyną. Świeże tkanki wykazywały gęsty i ciasno upakowany zrąb. Po 48 godzinach hodowli przepływowej zaobserwowano częściowo oderwane fragmenty syncytiotrofoblastu.
Integralność tkanek była nieodpowiednio zachowana już po 24 godzinach w warunkach hodowli statycznej, która uległa dalszemu pogorszeniu po 48 godzinach. Barwienie komórek śródbłonka wykazało wyraźnie zorganizowane komórki w świeżej tkance. Integralność morfologiczna była w dużym stopniu utrzymywana nawet po 48 godzinach w kulturach przepływowych.
Statyczne eksplantaty wykazywały jednak częściowe zapadnięcie się nawet po 24 godzinach, które uległo dalszemu pogorszeniu po 48 godzinach.
Przegląd
Ten artykuł przedstawia protokół hodowania wyszczepów łożyska w warunkach stałego przepływu, ulepszając tradycyjne układy kultury statycznej. Metoda ma na celu naśladowanie dynamicznych środowisk fizjologicznych dla lepszej analizy tkanek łożyska.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Biologia
- Zdrowie rozrodcze
Tło
- Rozrost łożyska jest zespołem specyficznym dla ciąży, wpływającym na zdrowie matki.
- Rozumienie przyczyn łożyskowych rozrostu jest kluczowe dla dobrego samopoczucia matki i płodu.
- Sekwencja RNA pojedynczych komórek ujawnił różnice między zdrowym i łożyskowym łożyskiem.
- Łączenie danych transkryptomowych z analizą tkanek jest istotne dla kompleksowego zrozumienia.
Cel badania
- Zidentyfikować przyczyny łożyskowe objawów rozrostu łożyska.
- Zbadać wpływ sił ścinających na funkcje tkanki łożyska.
- Wykorzystać układy hodowli przepływowej do poprawionej analizy integralności tkanek.
Zastosowane metody
- Wyszczepy łożyska były hodowane w układzie przepływowym.
- Wykonano barwienie immunohistochemiczne w celu oceny struktury tkanki.
- Zastosowano barwienie hematoksyliną i eozyną do oceny integralności tkanek.
- Porównano warunki hodowli przepływowej z warunkami hodowli statycznej w czasie.
Główne wyniki
- Wyszczepy hodowane w przepływie zachowywały lepszą integralność morfologiczną niż kultury statyczne.
- Kultury statyczne wykazywały degradację struktury cytoszkieletu w czasie.
- Zaobserwowano wyraźną organizację komórek śródbłonka w świeżych i hodorwanych w przepływie tkankach.
- Częściowe oderwanie fragmentów syncytiotrofoblastów wystąpiło w kulturach przepływowych po 48 godzinach.
Wnioski
- Układy hodowli przepływowej są skuteczne w utrzymaniu integralności tkanek łożyska.
- Stres ścinający odgrywa znaczącą rolę w funkcji tkanek łożyska.
- Potrzebne są dalsze badania, aby zbadać implikacje dla badań nad rozrostem łożyska.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Dynamic ex vivo placental explant flow culture addresses a critical gap in modeling the physiological environment of the maternal-fetal interface, enabling more predictive and translationally relevant tissue studies. This system enhances the fidelity of preclinical models for placental biology, supporting mechanistic de-risking and target validation in maternal-fetal health research. Improved preservation of tissue morphology under flow conditions strengthens confidence in downstream biomarker and pathway analyses relevant to pregnancy complications such as preeclampsia.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of placental tissue responses under physiologically relevant shear stress.
- Supports functional validation of targets implicated in maternal-fetal disease pathways.
- Facilitates mechanistic de-risking by linking transcriptomic data to tissue-level phenotypes.
Screening & Assay Development
- Provides a reproducible platform for quantitative assessment of tissue integrity and cellular organization.
- Improves assay standardization by maintaining consistent oxygen and flow conditions across explants.
- Enables reliable evaluation of candidate interventions in a dynamic, disease-relevant system.
Translational & Preclinical Research
- Aligns ex vivo findings with in vivo placental biology for translational biomarker discovery.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation in maternal-fetal health pipelines.
- Reduces biological ambiguity in preclinical models of placental dysfunction.
Pipeline & Workflow Integration
This flow culture method bridges early discovery and preclinical research by providing a physiologically relevant platform for hypothesis testing and target validation at the maternal-fetal interface.
- Discovery Biology: Enables investigation of shear force effects on placental tissue function and integrity.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative readouts of tissue morphology and cellular organization.
- Analytics: Supports comparative analysis of static versus flow conditions using immunohistochemical and histological outputs.
- Translational Research: Facilitates alignment of ex vivo findings with clinical observations in preeclampsia and related disorders.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for diverse maternal-fetal health research initiatives.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in placental tissue models and reduces mechanistic uncertainty.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization of explant culture workflows.
- Strategic Value: Improves decision-making for target prioritization and risk-adjusted advancement in maternal-fetal health portfolios.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted progression of candidates by providing robust, physiologically relevant data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in placental tissue dissection and ex vivo culture techniques.
- Needs access to flow chambers, peristaltic pumps, and controlled oxygenation infrastructure.
- Demands cross-team standardization of tissue preparation and analytical protocols.
- May require adaptation for different placental or maternal-fetal model systems.
- Limitations include complexity in modeling exact in vivo flow velocities and shear stress.
