Name: Ex vivo Hodowla eksplantatów łożyskowych - naśladowanie dynamicznych warunków w macicy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-08T14:05:00.000+00:00
Duration: 4 min 17 s
Description: Poznaj metodę hodowli eksplantatów łożyskowych w warunkach przepływu, naśladującą dynamiczne środowisko w macicy. Technika ta pozwala badać przyczyny stanu przedrzucawkowego i zachować integralność tkanek lepiej niż w kulturze statycznej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują za doskonałe wsparcie techniczne Bettiny Amtmann i Petry Winkler przy pobieraniu próbek tkanek. Badania te zostały sfinansowane przez Austriacki Fundusz Naukowy FWF (DOC 31-B26) oraz Uniwersytet Medyczny w Grazu w Austrii w ramach programu doktoranckiego Zaburzenia zapalne w ciąży (DP-iDP).

Komisja bioetyczna Uniwersytetu Medycznego w Grazu zatwierdziła to badanie (31-019 ex 18/19 wersja 1.2 i 29-319 ex 16/17). Uzyskano świadomą zgodę od wszystkich uczestników biorących udział w badaniu.
1. Przygotowanie do eksperymentu z przepływem
UWAGA: Eksperymenty są przeprowadzane w bioreaktorze ze zintegrowanymi pompami perystaltycznymi (zobacz Tabelę Materiałów). Wilgotność, temperaturę i poziom gazu wewnątrz bioreaktora można regulować.
<ol>
	<li>Włącz bioreaktor i dokonaj wszystkich wstępnych ustaleń (np. kalibracji pomp, podgrzewania wstępnego, warunków gazowych i wilgotności) do eksperymentu zgodnie z instrukcją obsługi bioreaktora. Przed rozpoczęciem eksperymentu wymagane ustawienia (temperatura, zawartość gazu, wilgotność) należy ustabilizować na kilka godzin lub na noc. Aby to zrobić, uruchom bioreaktor i oprogramowanie, a następnie kliknij Zmień nastawy w punkcie menu "Inkubator".</li>
	<li>Wstępnie podgrzany PBS i wymagana pożywka (pożywka do wzrostu komórek śródbłonka uzupełniona dostarczonymi suplementami hEGF-5, HC-500, a także 5% zubożonej w egzosomy płodowej surowicy bydlęcej, 1% penicyliny/streptomycyny) (patrz tabela materiałów) do 37 °C. 
	</li>
</ol>
2. Sekcja próbki łożyskowej
<ol>
	<li>Natychmiast po podaniu należy pociąć trzykrotnie 2 cm3 próbki łożyska ze środkowej części łożyska, jak opisano w Kupper et al.3 Krótko mówiąc, przechowuj próbki w PBS. Wyrzucić płytkę kosmówkową, matczyne decidua i obszary widocznych zawałów z próbki.</li>
	<li>Pozostałą próbkę tkanki rozciąć na kosmkowe eksplantaty o średnicy przekroju poprzecznego około 0,5 cm (mokra masa około 7,5 mg). Przełóż je na szalkę Petriego ze świeżym PBS.</li>
	<li>Umyj eksplantaty w PBS, delikatnie potrząsając nimi w płynie pęsetą, aby usunąć pozostałości krwi. 
	UWAGA: Wypreparować próbki na szalce Petriego za pomocą PBS w celu wstępnego umycia i zapobieżenia ich wysychaniu oraz użyć wysterylizowanych/autoklawowanych narzędzi do przetwarzania tkanki.</li>
</ol>
3. Eksperyment z przepływem
<ol>
	<li>Pod sterylnym kapturem podłącz pięć komór szeregowo do butelki ze zbiornikiem za pomocą zamków typu luer zgodnie z instrukcją obsługi komór przepływowych (patrz tabela materiałów). 
	UWAGA: Przed użyciem wysterylizuj i/lub sterylizuj w autoklawie wszystkie materiały, zgodnie z odpowiednią instrukcją. Użyj filtra powietrza na butelce ze zbiornikiem do sterylnej wymiany gazu. Aby otworzyć i zamknąć komory, delikatnie ściśnij ucha komór. Krok 3.1. mogą być również przygotowane wcześniej.</li>
	<li>Odwróć komory do góry nogami i otwórz je, zdejmując dno. Za pomocą kleszczy przenieś metalowe płytki centralnie w górnej części komór z kołkami skierowanymi do góry.</li>
	<li>Napełnić komory 1 ml wstępnie podgrzanego podłoża (37 °C). Następnie napełnij zbiornik dodatkowymi 20 ml. Obwód wymaga łącznie 25 ml, w tym objętość w każdej komorze przepływowej, w probówkach i butelce ze zbiornikiem. Pod przepływem końcowa objętość pożywki w napełnionej komorze wynosi 2 ml.</li>
	<li>Użyj kleszczy i przenieś jeden kosmek po drugim między igłami metalowej płytki w komorze. Pozwól igłom wsunąć się między kosmki łożyskowe, aby uniknąć nakłucia tkanki. Przenieś cztery eksplantaty do jednej komory. Zamknij komory, ostrożnie zakładając dno. Kompletny obwód zawiera w sumie 20 eksplantatów. Komory muszą pozostać w pozycji odwróconej do góry nogami. 
	UWAGA: Chwyć delikatnie eksplantaty kleszczami; Staraj się ich nie ściskać. Upewnij się, że komory i obwód są całkowicie uszczelnione, aby zapobiec wyciekom. Komory są zawsze używane do góry nogami. Liczba eksplantatów w komorze i liczba samych komór są zmienne. Procedura dla tkanki w pierwszym trymestrze ciąży jest podobna do tej w przypadku tkanki w trzecim trymestrze z niewielkim dodatkiem: aby utrwalić kosmki, lekko zegnij igły nad eksplantatami po przeniesieniu tkanki na metalową płytkę (komunikacja osobista Brugger i wsp.). To mocuje delikatną tkankę na metalowej płytce i zapobiega ześlizgiwaniu się próbek.</li>
	<li>Przenieś zespół przepływowy do bioreaktora.</li>
	<li>Podłączyć obwód przepływu do pompy perystaltycznej w bioreaktorze, podłączając rurkę pompy do pompy. Napraw go na 4 etapie (usłyszysz kliknięcie cztery razy).</li>
	<li>Jeśli wymagana jest kontrola statyczna, należy również umieścić płytkę studzienki w bioreaktorze. 
	UWAGA: W przypadku hodowli statycznej pięć studzienek na płytce sześciodołkowej wypełnia się 4 ml pożywki na studzienkę i 4 kosmkowe eksplantaty na studzienkę. Napełnioną płytkę studzienkową umieszcza się również w bioreaktorze i hoduje w tej samej atmosferze, co eksplantaty z kultur przepływowych. Więcej szczegółów opisano w Kupper et al.3</li>
	<li>Ustaw tryb pompy na Ręczny w punkcie menu "Pompy". Następnie ustaw prędkość pompy na 1 ml/min i rozpocznij pompowanie medium do rurki, klikając Uruchom. Podczas napełniania obwodu medium należy trzymać komory pod kątem, tak aby były całkowicie wypełnione medium. 
	UWAGA: Patrz Tabela Uzupełniająca 1 dla warunków eksperymentalnych dla przepływu kosmków łożyskowych i hodowli statycznej. Specyfikacje systemu przepływu i statycznego znajdują się w tabeli uzupełniającej 2. 
	UWAGA: Ostrożnie przechyl komorę podczas napełniania, aby zapobiec ześlizgiwaniu się próbek z igieł.</li>
	<li>Po zakończeniu napełniania komory pozostają w pozycji odwróconej. Upewnij się, że komory stoją bezpiecznie i pionowo, a następnie zamknij obie pokrywy bioreaktora. 
	UWAGA: Końcowa objętość pożywki w napełnionej komorze przepływowej wynosi 2 ml. Ustawienia doświadczalne i specyfikacje komór przepływowych i płytek studzienkowych używanych w eksperymentach są opisane w Kupper et al.3</li>
	<li>Inkubuj tkankę przez żądany czas. 
	UWAGA: Temperaturę, poziom gazu i natężenie przepływu można monitorować na komputerze bez ponownego otwierania pokrywy bioreaktora.</li>
	<li>Zatrzymaj pompę po inkubacji tkanki na żądany czas, klikając przycisk Przerwij w pozycji menu "Pompy". Otwórz dwie pokrywy bioreaktora, a następnie po jednej komorze przepływowej na raz. Ostrożnie usuń eksplantaty z metalowej płytki za pomocą kleszczy.</li>
	<li>Przetwarzać tkankę i supernatant zgodnie z wybraną analizą dalszą. W tym przypadku przeprowadzono barwienie immunohistochemiczne i mikroskopię elektronową3. Patrz Tabela Uzupełniająca 3 w celu uzyskania szczegółowych informacji na temat przeciwciał stosowanych w immunohistochemii i immunofluorescencji. 
	UWAGA: Po wyjęciu chusteczki spuść medium z obwodu, obracając pompę w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara.</li>
	<li>Zdemontuj i wyczyść obwód przepływu zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi komór przepływowych i przewodów.</li>
</ol>

Improving Ex Vivo Placental Explant Culture Using a Flow-Based Approach

<ol><li>Villee, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+metabolism+of+human+placenta+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The metabolism of human placenta in vitro.</a> Journal of Biological Chemistry. 205 (1), 113-123 (1953).</li>
<li>Miller, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+placental+explants+in+culture%3A+Approaches+and+assessments%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Human placental explants in culture: Approaches and assessments.</a> Placenta. 26 (6), 439-448 (2005).</li>
<li>Kupper, N., Pritz, E., Siwetz, M., Guettler, J., Huppertz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Placental+villous+explant+culture+2.0%3A+flow+culture+allows+studies+closer+to+the+in+vivo+situation%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Placental villous explant culture 2.0: flow culture allows studies closer to the in vivo situation.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (14), 7464(2021).</li>
<li>Reti, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+high+oxygen+on+placental+function+in+short-term+explant+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Effect of high oxygen on placental function in short-term explant cultures.</a> Cell and Tissue Research. 328 (3), 607-616 (2007).</li>
<li>Simán, C. M., Sibley, C. P., Jones, C. J. P., Turner, M. A., Greenwood, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functional+regeneration+of+syncytiotrophoblast+in+cultured+explants+of+term+placenta%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Regulatory%2C+Integrative+and+Comparative+Physiology%22%5BJournal%5D)">The functional regeneration of syncytiotrophoblast in cultured explants of term placenta.</a> American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 280 (4), R1116-R1122 (2001).</li>
<li>Toro, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leptin+is+an+anti-apoptotic+effector+in+placental+cells+involving+p53+downregulation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Leptin is an anti-apoptotic effector in placental cells involving p53 downregulation.</a> PLoS ONE. 9 (6), e99187(2014).</li>
<li>Morley, L. C., Debant, M., Walker, J. J., Beech, D. J., Simpson, N. A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Placental+blood+flow+sensing+and+regulation+in+fetal+growth+restriction%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Placental blood flow sensing and regulation in fetal growth restriction.</a> Placenta. 113, 23-28 (2021).</li>
<li>Wang, Y. Z. S., Wang, Y., Zhao, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Placental+blood+circulation%5BTitle%5D)+AND+%22Vascular+biology+of+the+placenta%22%5BJournal%5D)">Placental blood circulation.</a> Vascular biology of the placenta. Chapter 2, (2010).</li>
<li>Huppertz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+anatomy+of+the+normal+placenta%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Pathology%22%5BJournal%5D)">The anatomy of the normal placenta.</a> Journal of Clinical Pathology. 61 (12), 1296-1302 (2008).</li>
<li>Weiss, G., Sundl, M., Glasner, A., Huppertz, B., Moser, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+trophoblast+plug+during+early+pregnancy%3A+a+deeper+insight%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The trophoblast plug during early pregnancy: a deeper insight.</a> Histochemistry and Cell Biology. 146 (6), 749-756 (2016).</li>
<li>Burton, G. J., Woods, A. W., Jauniaux, E., Kingdom, J. C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rheological+and+physiological+consequences+of+conversion+of+the+maternal+spiral+arteries+for+uteroplacental+blood+flow+during+human+pregnancy%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Rheological and physiological consequences of conversion of the maternal spiral arteries for uteroplacental blood flow during human pregnancy.</a> Placenta. 30 (6), 473-482 (2009).</li>
<li>Gude, N. M., Roberts, C. T., Kalionis, B., King, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+function+of+the+normal+human+placenta%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+Research%22%5BJournal%5D)">Growth and function of the normal human placenta.</a> Thrombosis Research. 114 (5-6), 397-407 (2004).</li>
<li>Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+biology+of+the+placenta%5BTitle%5D)+AND+%22Colloquium+Series+on+Integrated+Systems+Physiology%3A+From+Molecule+to+Function%22%5BJournal%5D)">Vascular biology of the placenta.</a> Colloquium Series on Integrated Systems Physiology: From Molecule to Function. 2 (1), 1-98 (2010).</li>
<li>Moser, G., Windsperger, K., Pollheimer, J., de Sousa Lopes, S. C., Huppertz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+trophoblast+invasion%3A+new+and+unexpected+routes+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Human trophoblast invasion: new and unexpected routes and functions.</a> Histochemistry and Cell Biology. 150 (4), 361-370 (2018).</li>
<li>Kupper, N., Huppertz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+endogenous+exposome+of+the+pregnant+mother%3A+Placental+extracellular+vesicles+and+their+effect+on+the+maternal+system%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Aspects+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">The endogenous exposome of the pregnant mother: Placental extracellular vesicles and their effect on the maternal system.</a> Molecular Aspects of Medicine. 87 (October 2020), 100955(2022).</li>
<li>Huppertz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IFPA+award+in+placentology+lecture%3A+biology+of+the+placental+syncytiotrophoblast+-+myths+and+facts%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">IFPA award in placentology lecture: biology of the placental syncytiotrophoblast - myths and facts.</a> Placenta. 31 (SUPPL), S75-S81 (2010).</li>
<li>Gauster, M., Moser, G., Wernitznig, S., Kupper, N., Huppertz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+human+trophoblast+development%3A+from+morphology+to+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Early human trophoblast development: from morphology to function.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 79 (6), 345(2022).</li>
<li>Lecarpentier, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluid+shear+stress+promotes+placental+growth+factor+upregulation+in+human+syncytiotrophoblast+through+the+cAMP-pKA+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Fluid shear stress promotes placental growth factor upregulation in human syncytiotrophoblast through the cAMP-pKA signaling pathway.</a> Hypertension. 68 (6), 1438-1446 (2016).</li>
<li>Lecarpentier, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+fluid+dynamic+simulations+of+maternal+circulation%3A+wall+shear+stress+in+the+human+placenta+and+its+biological+implications%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Computational fluid dynamic simulations of maternal circulation: wall shear stress in the human placenta and its biological implications.</a> PLOS ONE. 11 (1), e0147262(2016).</li>
<li>Miura, S., Sato, K., Kato-Negishi, M., Teshima, T., Takeuchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluid+shear+triggers+microvilli+formation+via+mechanosensitive+activation+of+TRPV6%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Fluid shear triggers microvilli formation via mechanosensitive activation of TRPV6.</a> Nature Communications. 6 (1), 8871(2015).</li>
<li>Jauniaux, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Onset+of+maternal+arterial+blood+flow+and+placental+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Onset of maternal arterial blood flow and placental oxidative stress.</a> The American Journal of Pathology. 157 (6), 2111-2122 (2000).</li>
<li>Sodha, R. J., Proegler, M., Schneider, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+and+metabolism+of+norepinephrine+studied+from+maternal-to-fetal+and+fetal-to-maternal+sides+in+the+in+vitro+perfused+human+placental+lobe%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Obstetrics+and+Gynecology%22%5BJournal%5D)">Transfer and metabolism of norepinephrine studied from maternal-to-fetal and fetal-to-maternal sides in the in vitro perfused human placental lobe.</a> American Journal of Obstetrics and Gynecology. 148 (4), 474-481 (1984).</li>
<li>Kupper, N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Extracellular+vesicles+from+advanced+placental+explant+flow+culture+and+their+role+in+preeclampsia+%5B%5D%22">Extracellular vesicles from advanced placental explant flow culture and their role in preeclampsia [Dissertation]</a>. , Medical University of Graz, Austria. (2022).</li>
<li>Burton, G. J., Fowden, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+placenta%3A+a+multifaceted%2C+transient+organ%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+B%3A+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">The placenta: a multifaceted, transient organ.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 370 (1663), 20140066(2015).</li>
<li>Arora, N., Sadovsky, Y., Dermody, T. S., Coyne, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+vertical+transmission+during+human+pregnancy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">Microbial vertical transmission during human pregnancy.</a> Cell Host & Microbe. 21 (5), 561-567 (2017).</li>
<li>Cheong, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Positive+feedback+loop+between+glial+cells+missing+1+and+human+chorionic+gonadotropin+%28hCG%29+regulates+placental+hCG%CE%B2+expression+and+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">A Positive feedback loop between glial cells missing 1 and human chorionic gonadotropin (hCG) regulates placental hCGβ expression and cell differentiation.</a> Molecular and Cellular Biology. 36 (1), 197-209 (2016).</li>
<li>Heisenberg, C. P., Bellaïche, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forces+in+tissue+morphogenesis+and+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Forces in tissue morphogenesis and patterning.</a> Cell. 153 (5), 948-962 (2013).</li>
<li>Lee, T. C., Moulvi, A., James, J. L., Clark, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-scale+modelling+of+shear+stress+on+the+syncytiotrophoblast%3A+could+maternal+blood+flow+impact+placental+function+across+gestation%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Multi-scale modelling of shear stress on the syncytiotrophoblast: could maternal blood flow impact placental function across gestation.</a> Annals of Biomedical Engineering. 51 (6), 1256-1269 (2023).</li>
<li>Kamkin, A., Kiseleva, I. Mechanosensitivity in Cells and Tissues. Mechanosensitivity in Cells and Tissues. 49 (0), Academia. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21290773 (2005).</li>
<li>Kluge, M. A., Fetterman, J. L., Vita, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+and+endothelial+function%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Mitochondria and endothelial function.</a> Circulation Research. 112 (8), 1171-1188 (2013).</li>
<li>Boren, J., Brindle, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis-induced+mitochondrial+dysfunction+causes+cytoplasmic+lipid+droplet+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Apoptosis-induced mitochondrial dysfunction causes cytoplasmic lipid droplet formation.</a> Cell Death & Differentiation. 19 (9), 1561-1570 (2012).</li>
<li>Chernyavsky, I. L., Jensen, O. E., Leach, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Mathematical+model+of+intervillous+blood+flow+in+the+human+placentone%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">A Mathematical model of intervillous blood flow in the human placentone.</a> Placenta. 31 (1), 44-52 (2010).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Badanie to wprowadza unikalną perspektywę na technikę hodowli przepływowej dla eksplantatów łożyskowych, zaprojektowaną w celu odtworzenia dynamicznego środowiska w macicy 3,23. Wyniki pokazują, że morfologia tkanek hodowanych w warunkach przepływu jest lepiej zachowana w porównaniu z tradycyjną metodą uprawy statycznej3. Warto zauważyć, że mimo że ani warunki hodowli statycznej, ani przepływowej nie ułatwiają perfuzji naczyń łożyskowych, zniszczenie naczyń krwionośnych płodu i łożyska wewnątrz zrębu kosmków obserwowano głównie w hodowli statycznej, podczas gdy integralność naczyń krwionośnych wydawała się być lepiej zachowana przez dłuższy czas w hodowli przepływowej3.
Jedno z możliwych wyjaśnień tej obserwacji może być związane z kluczową ochronną i hormonalną rolą syncytiotrofoblastu, funkcją dobrze udokumentowaną w literaturze 12,24,25,26. Biorąc to pod uwagę, można sobie wyobrazić, że ogólna integralność zewnętrznej warstwy kosmków znacząco przyczynia się do utrzymania leżącego poniżej zrębu, w tym naczyń krwionośnych. W związku z tym utrzymującą się integralność komórkową naczyń krwionośnych w warunkach przepływu można przypisać ciągłemu przepływowi pożywki. Ruch ten wspomaga bierny ruch eksplantatów, ułatwiając wymianę gazów, składników odżywczych i nanocząstek (takich jak pęcherzyki zewnątrzkomórkowe) przez barierę łożyskową. To z kolei może pozytywnie wpłynąć na zachowanie morfologii naczyń krwionośnych. Ponadto zjawisko mechanosensacji odgrywa rolę w morfogenezie tkanek w różnych tkankach27,28. Badania wykazały, że wrażliwość mechanogeniczna wpływa na procesy komórkowe na wielu poziomach, wywołując szereg reakcji biochemicznych, które ostatecznie wpływająna funkcjonalność tkanek i narządów. Warto zauważyć, że białka mechanowrażliwe ulegają ekspresji przez syncytiotrofoblast przez cały okres ciąży28. Co więcej, badanie sugeruje, że w tym kontekście mogą być zaangażowane mikrokosmki na powierzchni tkanki28.
Dodatkową perspektywą, którą warto rozważyć, jest potencjalna rola mitochondriów w odpowiedzi komórkowej na przepływ. Na przykład w komórkach śródbłonka mitochondria służą jako przetworniki sygnału dla odpowiedzi komórkowych na bodźce środowiskowe30. Zwiększona akumulacja kropelek lipidów, obserwowana w statycznie hodowanej tkance za pomocą TEM3, była związana z indukcją apoptozy z powodu dysfunkcji mitochondriów31. Konieczne są dalsze badania, aby odkryć mechanizmy leżące u podstaw i kluczowe czynniki, łącząc je z dalszymi szlakami sygnałowymi. To badanie może poszerzyć naszą wiedzę na temat tego, w jaki sposób tkanka postrzega i reaguje na naprężenia ścinające, co przekłada się na poprawę żywotności i integralności eksplantatów kosmków w hodowli23.
Kilka krytycznych kroków protokołu należy powtórzyć i wykonać z ostrożnością. Po dostarczeniu łożyskowym tkanka powinna zostać wyhodowana tak szybko, jak to możliwe. Podczas przygotowania eksplantatu kluczowe znaczenie ma unikanie obszarów z widocznymi zawałami. Ważne jest, aby delikatnie obchodzić się z eksplantatami za pomocą kleszczy, aby zapobiec ściskaniu. Zaleca się utrzymywanie tkanki pokrytej płynem przez cały czas trwania zabiegu i szybkie jego przeprowadzenie.
Ważne jest, aby przyznać, że badanie to nie jest w stanie określić dokładnego naprężenia ścinającego w prezentowanym układzie przepływu, co powinno być traktowane jako ograniczenie w przyszłych badaniach 3,23. Niemniej jednak ważne jest, aby zdać sobie sprawę, że na precyzyjną prędkość przepływu i naprężenie ścinające dla konkretnego kosmku łożyskowego in vivo wpływa wiele parametrów, takich jak charakterystyka geometryczna przestrzeni międzykosmkowej, lokalizacja kosmków w tej przestrzeni oraz jej bliskość i kąt względem matczynych tętnic spiralnych i żył macicznych3, 19,23,32. Należy również wziąć pod uwagę złożoność struktury geometrycznej łożyska, która różni się u poszczególnych osób23,32. Istnieją już modele matematyczne szacujące przepływ krwi w przestrzeni międzykosmkowej32 oraz obliczenia naprężeń ścinających ścian syncytiotrofoblastu 19,28. Co ciekawe, jedno z badań przewidywało, że naprężenie ścinające na syncytiotrofoblast jest niższe w trzecim trymestrze ciąży w porównaniu z pierwszym trymestrem28, podczas gdy inne wykazało przestrzennie niejednorodne naprężenie ścinające ściany na syncytiotrofoblastach19. Określenie dokładnej prędkości przepływu i naprężenia ścinającego dla określonego kosmka łożyskowego pozostaje wyzwaniem 3,19,23,32. Takie obliczenia oferują przybliżenie zakresu naprężeń ścinających dla przyszłych badań, ale mogą wymagać ciągłych korekt anatomicznych i optymalizacji23. Co więcej, przyszłe badania mogą opracować nowe i udoskonalone techniki hodowli przepływowej, które uwzględniają skomplikowaną geometrię przestrzeni międzykosmkowej i strategie zwiększania liczby próbek w eksperymencie3. Przewiduje się ciągły postęp i rozwój systemu przepływowego, potencjalnie wykorzystującego alternatywne komory przepływowe (Brugger i in., dane niepublikowane, 2023).
Podsumowując, badanie to stanowi solidne podstawy, demonstrując łatwą do wdrożenia technikę hodowli przepływowej ex vivo, która podtrzymuje integralność strukturalną hodowanych eksplantatów kosmków. Podkreśla znaczenie technik dynamicznych w badaniach biologii funkcjonalnej łożyska, torując drogę do dalszych postępów w systemach hodowli przepływowych oraz generowania nowych pomysłów i hipotez 3,23.

Od lat sześćdziesiątych XX wieku, hodowla eksplantacji łożyskowej na dnie płytki studzienkowej jest wykorzystywana do badania interfejsu między płodem a matką1,2,3. Ta metoda jest dobrze ugruntowana i prosta, umożliwiając wykorzystanie tkanki ludzkiej do różnych badań, oprócz hodowli pojedynczych komórek2,3. Z biegiem czasu eksperymentalne projekty hodowli eksplantatów łożyskowych zostały zmodyfikowane pod względem stężenia tlenu4 oraz aby zapobiec osadzaniu się tkanki na dnie płytki studziennej2,5,6. Jednak metoda ta nie została dostosowana do warunków in vivo w macicy, w szczególności do obecności stałego przepływu3.
Powodzenie ciąży zależy od odpowiedniego i konsekwentnego przenikania przestrzeni międzykosmkowej krwią matki, ustanawiając dynamiczny obwód z ciągłym napływem i odpływem krwi i substancji krwiopochodnych7,8,9,10,11,12. Łożysko posiada dwa odrębne systemy zaopatrzenia w krew, jeden dla krwi matki i jeden dla krwi płodu, co skutkuje podwójną perfuzją zarówno przez układ płodowy, jak i matczyny13. Krew matki zaczyna przenikać przez przestrzeń międzykosmkową łożyska pod koniec pierwszego trymestru, powoli przepływając przez poszerzone tętnice spiralne macicy10,11,14. W związku z tym kosmki łożyskowe są kąpane we krwi matki, dostarczając płód składników odżywczych i tlenu. Ta matczyna krew przepływa przez przestrzeń międzykosmkową, zanim powróci do krążenia matczynego przez żyły maciczno-łożyskowe. Podczas przechodzenia przez przestrzeń międzykosmkową, dyfuzja i aktywny pobór tlenu i składników odżywczych do krwi płodu prowadzą do obniżenia poziomu tlenu i składników odżywczych we krwi matki12,15. Jednak krew w przestrzeni międzykosmkowej jest całkowicie zastępowana świeżą, bogatą w tlen krwią około dwa do trzech razy na minutę, zapewniając ciągły dopływ składników odżywczych i gazów13. Warto zauważyć, że syncytiotrofoblast, najbardziej zewnętrzna część bariery łożyskowej, jest jedynym składnikiem kosmków łożyskowych bezpośrednio narażonych na krew matki15,16,17. W związku z tym syncytiotrofoblast doświadcza stałego łagodnego naprężenia ścinającego powodowanego przez płynącą krew matki3,14.
Aktualna wiedza naukowa na temat środowiska przepływu łożyskowego oraz nowoczesne osiągnięcia techniczne pozwalają teraz na dostosowaną i fizjologicznie przybliżoną uprawę eksplantatów łożyskowych w warunkach przepływu. Co więcej, dowody sugerują, że siły ścinające wpływają na funkcje biologiczne syncytiotroblastu18,19,20,21. Dobrze znanym podejściem, które odpowiada za przepływ krwi, jest łożyskowy system perfuzji dwupłatowej22. Eksperymenty te wymagają jednak znacznej wiedzy specjalistycznej, są ograniczone czasowo (trwają tylko kilka godzin) i są możliwe do wykonania tylko w przypadku próbek łożyska z trzeciego trymestru ciąży3,23. W przeciwieństwie do tego, opracowaliśmy prostą i nieinwazyjną technikę hodowli eksplantatów kosmków łożyskowych ex vivo w stałych warunkach przepływu, uwzględniając zarówno tkanki łożyska w pierwszym, jak i trzecim trymestrze ciąży3. W tej konfiguracji eksplantaty łożyskowe są uprawiane w pięciu połączonych szeregowo komorach przepływowych. Kosmkowe eksplantaty są mocowane do dna komory za pomocą igiełkowatych wzniesień na cienkich metalowych płytkach. Zbudowany obwód przepływu jest następnie przenoszony do bioreaktora, gdzie regulowane jest zarówno stężenie tlenu, jak i natężenie przepływu3. Wyniki hodowli przepływowej pokazują, że integralność tkanek jest lepiej zachowana w porównaniu z typowo stosowaną metodą statyczną3. Co więcej, to dynamiczne podejście umożliwia nowatorskie i dostosowane projekty eksperymentalne do hodowli eksplantacji tkanek, umożliwiając eksperymenty in vitro, które bardziej naśladują środowisko naturalne3.

<table><tbody><tr><td>Płytki 6-dołkowe</td><td>NUNC, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, Stany Zjednoczone</td><td>140675</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 kozioł anty-mysz</td><td>ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>A21422</td><td>Rozcieńczony w PBS, 1:200</td></tr><tr><td>rozcieńczalnik przeciwciał</td><td>Dako, Santa Clara, CA, USA</td><td>S3022</td><td></td></tr><tr><td>anty-&beta;-aktyna (AC-15)</td><td>Abcam, Cambridge, Wielka Brytania</td><td>ab6276</td><td>Stężenie podstawowe: 2,1 mg/ml, rozcieńczone w rozcieńczalniku przeciwciał, 1:10 000</td></tr><tr><td>Bioreaktor TEB500</td><td>TEB500, EBERS Medical Technology SL, Saragossa, Hiszpania</td><td></td><td>Numer seryjny: TEB505 / 1000EW / 117</td></tr><tr><td>CD34 Klasa II (QBEnd-10)</td> <td>Dako, Santa Clara, CA, USA</td><td>M7165</td><td>Stężenie podstawowe: 12 mg/l, rozcieńczony w rozcieńczalniku przeciwciał, 1:500</td></tr><tr><td>CPD 030 suszarka punktu krytycznego</td><td>Bal-Tec, Balzers, Liechtenstein)</td><td></td><td>Suszarka punktu krytycznego</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>D21490</td><td>Rozcieńczony w PBS, 1:1000</td></tr><tr><td>Oprogramowanie serii Ebers TEB505</td><td>TEB500, EBERS Medical Technology SL, Saragossa, Hiszpania</td><td></td><td>&nbsp; Seria Software 1.4</td></tr><tr><td>Endothelial Cell Growth Medium MV</td><td>PromoCell PC-C-22120, Heidelberg, Niemcy; &nbsp;</td><td>C-22120</td><td>Używany bez EGCS/h i FCS, można użyć dowolnego innego podłoża odpowiedniego dla tkanki</td></tr><tr><td>Excelsior AS Tissue Processor&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, Stany Zjednoczone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zubożona w egzosomy płodowa surowica bydlęca</td><td>Gibco firmy Life Technologies, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>A2720803</td><td></td></tr><tr><td>Histolab Clear</td><td>Histolab, Askim, Szwecja</td> Blok nadtlenku wodoru <td>14250-TY</td><td></td></tr><tr><td></td><td>ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>TA125H202Q</td><td></td></tr><tr><td>Kaiser' s Gliceryna Żelatyna</td><td>Merck, Darmstadt, Niemcy</td><td>1092420100</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop Leica DM 6000 B</td><td>Leica, Wetzlar, Niemcy</td><td></td><td>Wyposażony w aparat Olympus DP 72</td></tr><tr><td>Ultramikrotom Leica UC7</td><td>Leica Microsystems, Wiedeń, Austria)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metalowa płytka z igłami</td><td>Własna konstrukcja</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikrotom&nbsp;</td><td>Microtome Microm HM 355 S, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kuchenka mikrofalowa</td><td>Miele, Guetersloh, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop Olympus&nbsp; (BX63)</td><td>Olympus, Hamburg, Niemcy</td><td></td><td>Numer seryjny: 1A52421</td></tr><tr><td>PBS</td><td>ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>10010015</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna&nbsp;</td><td>Gibco by Life Technologies, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>2585627</td><td></td></tr><tr><td>Wzmacniacz przeciwciał pierwotnych</td><td>ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>TL-125-PB</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Odczynnik przeciwblaknięcia</td><td>ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>Rurka pompująca</td><td>Tygon, Bartelt, Graz, Austria</td><td>6.078 175</td><td>&nbsp; Średnica 1,02 mm&nbsp;</td></tr><tr><td>Komory przepływowe QV500</td><td>Kirkstall Ltd., Quasi Vivo, North Yorkshire, Wielka Brytania</td><td>QV500&nbsp;</td><td>Inne komory też by się sprawdziły</td></tr><tr><td>SCD 500, powlekarka napylająca</td><td>Bal-Tec, Balzers, Liechtenstein</td><td></td><td>Powlekarka napylająca</td></tr><tr><td>Podłoże amino-etylowo-karbazolowe, zestaw podłoży AEC</td><td>Abcam, Cambridge, Wielka Brytania</td><td>ab64252</td><td></td></tr><tr><td>Prowadnice Superfrost Plus&nbsp;</td><td>Menzel-Glaeser, Brunszwik, Niemcy</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>Filtr strzykawkowy</td><td>Corning Incorporated, NY, USA</td><td>431219</td><td>0,2 i mikro; m Pore SFCA Membrana, filtr powietrza do butelki zbiornika&nbsp;</td></tr><tr><td>Żywica epoksydowa TAAB</td><td>Agar Scientific, Stansted, Essex, Wielka Brytania</td><td>T001</td><td></td></tr><tr><td>System detekcji UltraVision LP HRP-Polymer&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, Stany Zjednoczone</td><td>TL-125-HL</td><td></td></tr><tr><td>Blok białkowy UltraVision</td><td>ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, Stany Zjednoczone</td><td>TA125BPQ</td><td></td></tr><tr><td>Transmisyjny mikroskop elektronowy Zeiss EM 900</td><td>Zeiss, Oberkochen, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Skaningowy mikroskop elektronowy Zeiss Sigma 500 z emisją polową</td><td>Zeiss, Cambridge, Wielka Brytania</td><td></td><td>Używany z detektorem elektronów rozpraszanych wstecznie przy napięciu przyspieszenia 5 kV</td></tr></tbody></table>

ex vivo hodowla eksplantatów łożyskowych - naśladowanie dynamicznych warunków w macicy

Ex Vivo Placental Explant Flow Culture - Mimicking the Dynamic Conditions In Utero

Istniejące modele hodowli eksplantatów łożyskowych ex vivo opierają się głównie na statycznych systemach hodowli wykorzystujących płytki studzienkowe. Jednak modele te nieodpowiednio odzwierciedlają dynamikę w warunkach macicy, w których łożysko doświadcza stałego lekkiego naprężenia ścinającego z powodu przepływu osocza lub krwi. Aby zaradzić temu ograniczeniu, opracowano system hodowli przepływowej, który przybliża uprawę eksplant ex vivo łożyska do warunków przepływu in utero występujących w ciele matki. W ramach tego podejścia eksplantaty łożyskowe są uprawiane w sekwencji pięciu połączonych ze sobą komór przepływowych. To ustawienie utrzymuje fizjologiczne stężenie tlenu i stałe natężenie przepływu. Zebrane dane pokazują, że w warunkach przepływu zachowanie morfologii tkanek wykazuje znaczną poprawę w porównaniu z konwencjonalnymi metodami statycznymi. Ta innowacyjna technika wprowadza prosty sposób hodowli eksplantatów łożyskowych ex vivo, oferując wierniejsze odwzorowanie dynamicznego środowiska in vivo. Co więcej, badania te wprowadzają nowe możliwości badania dynamiki funkcjonalnej interfejsu płód-matka. Przyjęcie wykonalnych metodologii dynamicznych ułatwia głębsze zrozumienie biologii łożyska, co podkreśla jej znaczenie dla zdrowia matki i płodu.

Oto protokół hodowli eksplantatów łożyskowych w warunkach stałego przepływu. Podejście to wzmacnia tradycyjne statyczne systemy hodowli kosmków, umożliwiając replikację dynamicznych środowisk fizjologicznych.

Ex vivo Hodowla eksplantatów łożyskowych - naśladowanie dynamicznych warunków w macicy

The existing ex vivo placental explant culture models are primarily grounded in static culture systems using well plates. However, these models ...

Staramy się odkryć, gdzie u niektórych kobiet w ciąży rozwija się stan przedrzucawkowy, a u innych nie. Ten specyficzny dla ciąży zespół powoduje nadciśnienie tętnicze i białkomocz matki i może powodować śmierć matki i dziecka. Dzięki naszym badaniom translacyjnym mamy nadzieję zidentyfikować przyczyny łożyskowe prowadzące do objawów u matki.Ostatnio metody sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek zostały wykorzystane do identyfikacji różnic między łożyskiem zdrowym a łożyskiem przedrzucawkowym. Teraz nadszedł czas, aby połączyć te dane z oryginalnymi tkankami. Dlatego używamy histologii przestrzennej i sekwencjonowania instytutowego, aby zidentyfikować zmiany na poziomie pojedynczej komórki.Indywidualna złożoność struktury geometrycznej łożyska stanowi wyzwanie dla określenia dokładnej prędkości przepływu i naprężenia ścinającego dla danego kosmka łożyskowego. Dzięki zastosowaniu tego systemu hodowli przepływowej można zająć się i zbadać znaczenie siły ścinającej dla biologicznych funkcji tkanek łożyska. Na początek umieść wycięte kawałki próbek łożyska w PBS.Wyrzuć płytkę kosmówkową, matczyne decidua i wszelkie widoczne zawały z próbki. Rozetnij pozostałą próbkę tkanki na kosmki o średnicy przekroju poprzecznego około 0,5 centymetra. Przenieś eksplantaty na szalkę Petriego wypełnioną świeżym PBS.Za pomocą kleszczy potrząśnij każdym eksplantatem w PBS, aby usunąć całą krew. Pod sterylnym kapturem użyj zamków typu luer, aby połączyć pięć komór z butelką zbiornika. Odwróć komory do góry nogami i zdejmij dno.Teraz użyj kleszczy, aby umieścić metalowe płytki centralnie w górnych częściach komór z kołkami skierowanymi do góry. Napełnij połowę komór jednym mililitrem podgrzanej pożywki hodowlanej. Dodaj dodatkowe 20 mililitrów pożywki do zbiornika.Za pomocą kleszczy ostrożnie umieść kosmek eksplantowany na igłach metalowej płytki w komorze. Umieść cztery eksplantaty w jednej komorze. Ponownie przymocuj dno komór, aby je zamknąć.Następnie podłącz rurkę pompy do pompy, aby połączyć obwód przepływu z pompą perystaltyczną wewnątrz bioreaktora. Napraw to na czwartym etapie. W menu Pompy wybierz tryb ręczny.Dostosuj prędkość pompy do jednego mililitra na minutę i kliknij URUCHOM, aby rozpocząć pompowanie. Podczas napełniania trzymaj komory pod kątem, aby zapewnić całkowite napełnienie. Po zakończeniu procesu napełniania ponownie odwróć komorę.Upewnij się, że komory są zabezpieczone i zamknij obie pokrywy bioreaktora. Po zakończeniu inkubacji tkanek kliknij przycisk ABORT, aby zatrzymać pompę. Na raz otwórz dwie pokrywy bioreaktora i jedną komorę przepływową.Użyj kleszczy, aby ostrożnie usunąć eksplantaty z metalowej płytki w celu dalszej analizy. Immunohistochemicznie barwione eksplantaty wykazały dobrze ustrukturyzowaną i zorganizowaną wizualną prezentację cytoszkieletu w tkance świeżej i hodowlanej przepływowo. Z biegiem czasu agregacja mikrowłókien była coraz częściej obserwowana w statycznych eksplantatach, co oznaczało degradację struktury cytoszkieletu.Zmniejszająca się integralność tkanek w czasie hodowli została potwierdzona przez barwienie hematoksyliną i eozyną. Świeże tkanki wykazywały gęsty i ciasno upakowany zrąb. Po 48 godzinach hodowli przepływowej zaobserwowano częściowo oderwane fragmenty syncytiotrofoblastu.Integralność tkanek była nieodpowiednio zachowana już po 24 godzinach w warunkach hodowli statycznej, która uległa dalszemu pogorszeniu po 48 godzinach. Barwienie komórek śródbłonka wykazało wyraźnie zorganizowane komórki w świeżej tkance. Integralność morfologiczna była w dużym stopniu utrzymywana nawet po 48 godzinach w kulturach przepływowych.Statyczne eksplantaty wykazywały jednak częściowe zapadnięcie się nawet po 24 godzinach, które uległo dalszemu pogorszeniu po 48 godzinach.

ex-vivo-placental-explant-flow-culture-mimicking-dynamic-conditions

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Ten film pokazuje tworzenie pierwotnych hodowli ludzkich kosmków łożyskowych i narządów dziesiętnych w warunkach ex vivo. Modele te doskonale nadają się do badania patogenezy na styku człowieka z matką i płodem.

Ustanowienie kultur kosmków i narządów dziesiętnych jako modeli ex vivo ludzkiej granicy matczyno-płodowej

Hodowla pionowych kropelek ex vivo jest alternatywą dla obecnych technik eksperymentalnych in vitro i in vivo. Protokół ten jest łatwy do wykonania i wymaga mniejszych ilości odczynnika, a jednocześnie umożliwia manipulowanie i badanie unaczynienia, morfogenezy i organogenezy płodu.

Wykorzystanie ex vivo pionowych kultur kropelkowych całych narządów płodu do badania procesów rozwojowych podczas organogenezy myszy

Opisana jest prosta metoda ustalania pierwotnych ludzkich hodowli łożyskowych (kosmków) i narządów dziesiętnych. Hodowle kosmków i narządów dziesiętnych są nieocenionymi narzędziami do badania patogenezy na styku człowieka z matką i płodem. Wykazano zakażenie fakultatywną bakterią wewnątrzkomórkową Listeria monocytogenes.

Ludzkie posiewy łożyska i narządów dziesiętnych w celu zbadania zakażeń na granicy matczyno-płodowej

Tutaj przedstawiono protokół perfuzji naczyniowej ex vivo matczyno-płodowej, który umożliwia podanie artykułu testowego do układu naczyniowego matki i ocenę transferu przez łożysko cząsteczek ksenobiotycznych lub środków farmakologicznych oprócz zmian w fizjologii łożyska.

Perfuzja ex vivo łożyska gryzonia

Tutaj opisujemy metodę ogrzewania zeszklonych ludzkich blastocyst, hodowli ich przez okres implantacji in vitro, trawienia ich do pojedynczych komórek i zbierania wczesnych komórek trofoblastu do dalszych badań.

Jednokomórkowy zbiór komórek trofoblastu w zarodkach ludzkich w okresie okołoimplantacyjnym

Ulepszona platforma do hodowli całych zarodków umożliwia ciągły i solidny rozwój ex utero zarodków myszy po implantacji przez okres do sześciu dni, od etapów pregastrulacji do zaawansowanej organogenezy. W tym protokole szczegółowo opisujemy standardową procedurę udanej hodowli zarodków przy użyciu statycznych płytek i systemów obrotowych butelek.

Ex Utero Hodowla zarodków myszy od pregastrulacji do zaawansowanej organogenezy

Protokół ten opisuje przygotowanie roślin tkanki łożyskowej ludzkich hodowanych na styku powietrze-ciecz do badania infekcji wirusowych.

Ex vivo Hodowla ludzkich implantów łożyskowych do badania transmisji wirusa na styku matka-płod

Hodowle embrionalnych komórek siatkówki kurcząt stanowią cenne narzędzia do badania biologii fotoreceptorów. Opracowaliśmy skuteczną technikę transferu genów opartą na elektroporacji plazmidowej siatkówki ex ovo przed hodowlą. Technika ta znacznie zwiększa wydajność transfekcji w porównaniu z obecnie dostępnymi protokołami, dzięki czemu manipulacja genetyczna jest możliwa dla tego systemu.

Efektywny transfer genów w siatkówkach piskląt w badaniach pierwotnych hodowli komórkowych: podejście do elektroporacji ex-ovo

Ten manuskrypt opisuje technikę wizualizacji rozwijającego się układu naczyniowego. Tutaj zastosowaliśmy in utero, wewnątrzsercowe mikrozastrzyki lektyny pomidorowej znakowanej FITC na zarodki myszy. Za pomocą tej techniki wyznaczamy naczynia perfundowane i nieperfundowane w całej nerce embrionalnej.

In Utero (w macicy) Dosercowe wstrzyknięcia pomidoro-lektyny na zarodki myszy w celu oceny przepływu krwi w nerkach

Tutaj prezentujemy protokół dostarczający narzędzie do badania mechanizmów regulacyjnych określonych genów podczas rozwoju hipokampa. Zastosowanie elektroporacji ex utero i organotypowej hodowli plastrów pozwala na regulację w górę i w dół ekspresji interesujących genów w pojedynczych komórkach i śledzenie ich losów podczas rozwoju.

Ex Utero Elektroporacja i organotypowa hodowla warstwowa tkanki hipokampa myszy

Poznaj metodę hodowli eksplantatów łożyskowych w warunkach przepływu, naśladującą dynamiczne środowisko w macicy. Technika ta pozwala badać przyczyny stanu przedrzucawkowego i zachować integralność tkanek lepiej niż w kulturze statycznej.

Ex vivo Hodowla eksplantatów łożyskowych - naśladowanie dynamicznych warunków w macicy

Przeglądaj więcej filmów