Rekonstrukcja bariery krew-mózg in vitro w celu modelowania i terapeutycznego ukierunkowania choroby neurologicznej

Naszym celem jest określenie mechanizmów molekularnych i komórkowych, które pośredniczą w patogenezie choroby Alzheimera, aby odkryć możliwości terapeutyczne i diagnostyczne. Obecnie szlaki i mechanizmy molekularne zaangażowane w wystąpienie i rozwój choroby Alzheimera są słabo poznane. Wynika to z faktu, że modele mysie i inne modele choroby Alzheimera in vitro nie są w stanie odtworzyć unikalnej biologii człowieka, która ma kluczowe znaczenie dla rozwoju choroby.

Opracowaliśmy model in vitro bariery krew-mózg, który można zastosować do badania patologii naczyń mózgowych związanych z chorobą Alzheimera, demencją i innymi formami neurodegeneracji. Model ten został wykorzystany do wykazania, że APOE4, najsilniejszy czynnik ryzyka choroby Alzheimera, działa częściowo poprzez szlak specyficzny dla pasożyta, aby zwiększyć obciążenie patogennym amyloidem. Korzystając z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych, możemy skonstruować ludzką tkankę mózgową in vitro, która może być wykorzystana do badania patologii choroby i badań przesiewowych leków.

Taki model bariery krew-mózg in vitro umożliwia spersonalizowane podejście terapeutyczne i diagnostyczne. Nasz model bariery krew-mózg in vitro in vitro demonstruje fizjologicznie istotne interakcje, w tym tworzenie cewy naczyniowej i lokalizację stóp końcowych astrocytów z naczyniami krwionośnymi. Jest również zdolny do modelowania fenotypów istotnych dla choroby, w tym patologii amyloidu.

Wreszcie, zastosowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych pochodzących od pacjenta pozwala na badanie dowolnego pożądanego tła genetycznego. Korzystając z modelu bariery krew-mózg in vitro, odkryliśmy szlaki, które pośredniczą w patologicznej akumulacji amyloidu naczyniowo-mózgowego. To skłoniło nas do zbadania strategii terapeutycznych, które mogą odwrócić tę patologię u starzejących się myszy APOE4, nad którymi obecnie pracujemy.

Zacznij od przygotowania zróżnicowanych komórek śródbłonka, pasożytów i astrocytów do złożenia modelu iBBB. Po odessaniu pożywki do hodowli komórkowej ze zróżnicowanych komórek śródbłonka, przemyj komórki raz PBS, a następnie dodaj mieszaninę kolagenazy proteazy do umytych komórek i dysocjuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut. Przenieś mieszaninę kolagenazy proteazy ze zdysocjowanymi komórkami do stożkowej probówki zawierającej hECSR, zachowując stosunek mieszaniny do hECSR jeden do trzech.

Następnie odwirować komórki pod ciśnieniem 300 G przez trzy minuty i odessać supernatant przed ponownym zawieszeniem powstałego osadu komórkowego w hECSR. Zdysocjuj zróżnicowane pasożyty za pomocą mieszaniny kolagenazy proteazy w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut. Dodaj odpowiednią ilość N2B27 do stożkowej probówki i przenieś do niej zdysocjowane komórki w mieszaninie kolagenazy proteazy, zachowując stosunek jeden do trzech mieszaniny do N2B27.

Wiruj komórki w temperaturze 300 G przez trzy minuty. Po odessaniu supernatantu ponownie zawiesić osad komórkowy w N2B27. Oddziel zróżnicowane astrocyty od mieszaniny kolagenazy proteazy w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut.

Przenieś zdysocjowane komórki w mieszaninie kolagenazy proteazy do stożkowej probówki zawierającej kompletną pożywkę astrocytów w stosunku jeden do trzech mieszaniny do pożywki. Po odwirowaniu komórek w stężeniu 300 G przez trzy minuty, odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w kompletnym pożywce dla astrocytów. Ogniwa są teraz gotowe do montażu iBBB.

Złóż ludzką pluripotencjalną barierę krew-mózg pochodzącą z komórek macierzystych lub iBBB, używając zdysocjowanych komórek śródbłonka, pasożytów i astrocytów. Połącz trzy typy komórek w stożkowej probówce, dodając o 10% więcej niż obliczona liczba komórek, aby uwzględnić błędy pipetowania. Wirować mieszaninę komórek o masie 300 G przez trzy minuty.

Odessać supernatant, pozostawiając osad komórkowy z około 50 mikrolitrami pożywki. Za pomocą pipety P200 delikatnie ponownie zawieś osad komórek w pozostałym podłożu, aby utworzyć zawiesinę jednokomórkową. Umieścić probówkę zawierającą powstałą zawiesinę komórkową na lodzie i dodać do niej wystarczającą ilość zredukowanej macierzy błony podstawnej GF na żądaną liczbę iBBB.

Wymieszaj komórki jednorodnie, nie wprowadzając żadnych pęcherzyków powietrza. Odpipetować 50 mikrolitrów powstałej mieszaniny macierzy komórkowej do dołka 48-dołkowego lub 96-dołkowego naczynia do hodowli ze szklanym dnem i równomiernie rozprowadzić na dnie naczynia. Inkubuj naczynie w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 do 40 minut, aby spolimeryzować matrycę podczas zamykania komórek.

Na koniec dodaj 500 mikrolitrów uzupełnionej pożywki astrocytowej do studzienki i utrzymuj iBBB w hodowli. W przypadku płytki 96-dołkowej dodaj od 100 do 150 mikrolitrów pożywki do studzienki, aż będą wystarczająco rozwinięte do dalszych testów, co zwykle trwa dwa tygodnie. Prawidłowo uformowany iBBB pojawił się jako zestalony, pojedynczy, półprzezroczysty dysk pod mikroskopem jasnego pola.

Po 24 godzinach zidentyfikowano równomiernie rozmieszczone pojedyncze komórki. Po dwóch tygodniach widoczne były bardziej wyraźne struktury, choć trudne do zdefiniowania.