Zapis integralności funkcjonalnej bariery na komórkach śródbłonka naczyniowego bEnd.3 poprzez transśródbłonkową detekcję oporu elektrycznego

Obecne badania zazwyczaj wykorzystują testy przepuszczalności i związaną z nimi ekspresję białek w celu sprawdzenia dokładności wykrywania TER. Model BBB komórek jednowarstwowych in vitro jest mniej skuteczny w badaniach przesiewowych leków, a użycie większej liczby komórek utrudnia skonstruowanie modelu. Protokół tego badania jest stosunkowo prosty, a nieinwazyjna procedura pozwala na wykorzystanie próbek komórek w innych eksperymentach po wykryciu TER.

Wykrywanie oporności elektrycznej w celu oceny przepuszczalności modeli komórkowych może przyspieszyć badania przesiewowe leków stosowanych w leczeniu i profilaktyce ośrodkowego układu nerwowego, aby zwiększyć wskaźnik powodzenia opracowywania nowych leków. W przyszłości wykryjemy ekspresję białka ścisłego połączenia w komórkach górnego przedziału Aby sprawdzić, czy wyniki testów TER mogą być skutecznie obecne w integralności funkcji bariery BBB. Na początek przygotuj pożywkę do hodowli komórkowych DMEM zawierającą FBS, penicylinę i streptomycynę.

Przygotować również 100 mM roztwór podstawowy chlorku kobaltu, dodając 1,30 mg chlorku kobaltu do 100 l DMSO. Następnie wysiew 1 ml bEnd. 3 komórki w 100 ml naczyniu hodowlanym zawierającym pożywkę DMEM i hodowla w temperaturze 37 C w wilgotnej atmosferze 5% dwutlenku węgla.

Zmieniaj pożywkę co dwa do trzech dni i subkulturuj komórki dwa razy w tygodniu. Po bEnd. 3 komórki rosną do 80% zbiegu, trawią komórki z 0,25% trypsyny przez 30 sekund.

Policz komórki za pomocą licznika komórek i wykonaj zawiesinę o gęstości 7 x 10 ^ 4 komórek na ml. Następnie wysiewaj 100 L tej zawiesiny komórkowej na 96-dołkowej płytce w celu adhezji komórek. Następnie przemyć komórki PBS i dodać 100 l pożywki zawierającej chlorek kobaltu.

Hoduj komórki przez 24 godziny. Po inkubacji usunąć pożywkę i przemyć PBS. Następnie dodaj 100 l roztworu CCK-8.

Inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez jedną godzinę. Następnie zmierzyć absorbancję przy długości fali 450 nm za pomocą czytnika mikropłytek. Oblicz żywotność komórek indukowaną przez chlorek kobaltu zgodnie z tym wzorem.

Wybierz stężenie ze znaczącą różnicą w zmniejszeniu żywotności komórek w porównaniu z grupą kontrolną. Rentowność bEnd. 3 komórki potraktowane różnymi stężeniami chlorku kobaltu analizowano za pomocą testu CCK-8.

Wyniki wykazały, że 300 M chlorku kobaltu wykazało istotną cytotoksyczność in vitro. Na początek przepłucz górną komorę 24-dołkowych płytek PBS. Wymieszaj bEnd.

3 komórki z podłożem DMEM za pomocą mieszalnika wirowego do wytworzenia zawiesiny. Następnie wysiewamy 200 L bEnd. Zawiesina 3-komórkowa na membranie PET w górnej komorze płytki 24-dołkowej.

Dodać 1 200 l kompletnego podłoża do dolnej komory płytki, aby ustabilizować ciśnienie osmotyczne górnej i dolnej komory. Zmień pożywkę, powoli usuwając starą pożywkę z jednej strony za pomocą pipety podciśnieniowej i dodając nową pożywkę wzdłuż ścianki podczas wymiany płynu. Przed pomiarem TEER umieść rezystor 5% roztworu podchlorynu sodu, 75% etanolu i podwójnie destylowanej wody na ultra czystym stole.

Włącz naświetlanie promieniami UV na 30 minut, aby wyeliminować resztki bakterii i patogenów. Umieść elektrody w 5% roztworze podchlorynu sodu, powoli potrząsając przez trzy do pięciu sekund. Następnie zanurz się w 75% etanolu na 15 minut.

Na koniec przenieś do PBS lub wody podwójnie destylowanej do czasu użycia. Następnie włącz przełącznik z tyłu miernika rezystora ogniwa. Kliknij wybierz płytkę, a następnie wybierz płytkę 24-dołkową.

W zależności od operacji wybierz odpowiednią sekwencję wykrywania. Włóż rezystor kiloomowy do prawej wtyczki, aby skalibrować przyrząd. Jeśli wynik kalibracji wynosi 1 000 5 omów, należy uznać przyrząd za dokładny.

Jeśli nie, kliknij jednostki trybu w głównym interfejsie, aby wybrać omy, a następnie kliknij kalibruj. Następnie wyjmij rezystor kiloomowy i zastąp go elektrodą pomiarową za pomocą przewodu połączeniowego. Umieść elektrodę pionowo w 24-dołkowej płytce zawierającej tylko pożywkę i kliknij ślepą nasadę na instrumencie.

Wartość tła rezystancji płytki bez komórek zasiewnych powinna wynosić około 134,4 oma. Następnie włóż dwie elektrody do górnej i dolnej komory płytki z nasionami, tak aby warstwa komórek znajdowała się między nimi. Zapisz wartość oporu, delikatnie naciskając pedał.

Upewnij się, że elektroda nie dotyka ogniw w górnej komorze i na dole dolnej komory. Wartości TEER uzyskaj, mnożąc wartości oporu elektrycznego przez dolną część górnej komory, jak pokazano w równaniu. Narysuj wykres liniowy TEER w funkcji czasu w dniach.

Gdy wartość rezystancji nie wzrasta z czasem, komórki utworzyły barierę. Wykreślone wartości oporu w funkcji czasu dla bEnd. 3 komórki wykazały, że wartości TEER komórek zaczęły się stabilizować w piątym dniu.

Zacznij od hodowli bEnd. 3 komórek, a następnie podziel studzienki na grupę kontrolną i grupę chlorku kobaltu. Dodać 200 l pożywki do górnej komory grupy kontrolnej, a pożywkę zawierającą 300 M chlorek kobaltu do grupy chlorków kobaltu.

Inkubować płytki w temperaturze 37 °C i wykrywać wartości oporu po 12 i 24 godzinach inkubacji przy użyciu metody TEER. Korzystaj z komercyjnego oprogramowania, aby odwzorować trend wartości TEER bariery komórkowej. Użyj oprogramowania do analizy statystycznej, aby przeanalizować różnicę w wartościach oporności między komórkami traktowanymi chlorkiem kobaltu a komórkami kontrolnymi.

Dodanie 300 M chlorku kobaltu spowodowało znaczny spadek wartości TEER w porównaniu z kontrolą zarówno w 12-godzinnym, jak i 24-godzinnym punkcie czasowym. Po 24 godzinach wartość TEER w grupie 300 M chlorku kobaltu zmniejszyła wartość TEER w grupie chlorku kobaltu 300 M zmniejszona w porównaniu z grupą kontrolną, co wskazuje na uszkodzenie bariery komórkowej, które zostało wywołane warunkami niedotlenienia spowodowanymi chlorkiem kobaltu.