Name: Zapis integralności funkcjonalnej bariery na komórkach śródbłonka naczyniowego bEnd.3 poprzez transśródbłonkową detekcję oporu elektrycznego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-29T13:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: Naucz się oceny integralności bariery krew-mózg metodą TER na komórkach śródbłonka bEnd.3. To nieinwazyjne podejście przyspiesza badania przesiewowe leków na choroby układu nerwowego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Doceniamy wsparcie finansowe ze strony Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (82274207 i 82104533), Kluczowego Programu Badawczo-Rozwojowego Ningxia (2023BEG02012) oraz Projektu Promocji Badań Xinglin Scholar Uniwersytetu TCM w Chengdu (XKTD2022013).

UWAGA: Komórki śródbłonka pochodzące z mózgu myszy.3 (bEnd.3) zostały zaszczepione w komorach 24-dołkowej płytki, aby skonstruować prosty model BBB in vitro w określonych warunkach podłoża. TEER normalnych komórek i komórek niedotlenionych mierzono za pomocą miernika TEER (<silna klasa="xfig">Rysunek 1 i <silna klasa="xfig">Rysunek 2).
1. Przygotowanie roztworu
<ol>
	<li>Przygotować pożywkę do hodowli komórkowych DMEM zawierającą FBS (10%, v/v), 100 j./ml penicyliny i 10 mg/ml streptomycyny (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Przygotować 100 mM roztworu podstawowego CoCl2, dodając 1,30 mg CoCl2 do 100 μl roztworu DMSO. 
	UWAGA: Wszystkie powyższe roztwory przechowywano w temperaturze 4 °C, a roztwór podstawowy rozcieńczano zgodnie z pożądanym stężeniem przed użyciem.</li>
	<li>Przygotować 5% roztwór podchlorynu sodu (v/v), dodając 2 ml roztworu podchlorynu sodu do 38 ml podwójnie destylowanej wody.</li>
</ol>
2. Hodowla komórkowa i żywotność komórek
<ol>
	<li>Zasiew: 1 ml komórek bEnd.3 w naczyniu hodowlanym (100 mm) zawierającym pożywkę DMEM o gęstości 1 x 106 komórek/ml i hodowla w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze 5% CO2 . Zmieniaj pożywkę co 2 do 3 dni i subkulturuj komórki 2 razy w tygodniu.</li>
	<li>Po tym, jak komórki bEnd.3 osiągną 80% konfluencji, traw komórki z 0,25% trypsyny przez 30 sekund.</li>
	<li>Wykonać zawiesinę komórek bEnd.3 o gęstości 7 x 104 komórek/ml za pomocą pożywki DMEM przez licznik komórek. Następnie wysiewaj 100 μl zawiesiny komórek bEnd.3 na 96-dołkowej płytce.</li>
	<li>Po adhezji komórek oczyścić komórki PBS i wyhodować komórki za pomocą 100 μl pożywki hodowlanej lub pożywki zawierającej lek (100 μM, 200 μM, 300 μM, 400 μM, 500 μM CoCl2) przez 24 godziny w tych samych warunkach. Po wyjęciu pożywki z płytki studzienki i oczyszczeniu jej PBS, dodać 100 μl roztworu CCK-8. 
	UWAGA: Nie generuj pęcherzyków w studni, które wpłyną na wartości gęstości optycznej (OD).</li>
	<li>Umieścić 96-dołkowe płytki w temperaturze 37 °C i inkubować przez 1 godzinę. Zmierzyć absorbancję 96-dołkowych płytek przy 450 nm za pomocą czytnika mikropłytek. 
	UWAGA: Aby uniknąć różnic wewnątrzgrupowych, płytki studzienki zostały schłodzone do temperatury pokojowej przed wykryciem.</li>
	<li>Obliczyć żywotność komórek indukowaną różnymi stężeniami CoCl2 zgodnie ze wzorem [Lek OD- Ślepa próba OD] / [Kontrola OD-Ślepa próba OD] x 100%. Wybierz stężenie CoCl2 ze znaczącą różnicą w zmniejszeniu żywotności komórek w porównaniu z grupą kontrolną do następnego eksperymentu.</li>
</ol>
3. Montaż modelu
<ol>
	<li>Przepłukać górną komorę płytek 24-dołkowych roztworem PBS. 
	UWAGA: Komórki rosły i łączyły się na dnie górnej komory 24-dołkowej płytki, a ciasne połączenia między komórkami stopniowo się tworzyły, aby odgrywać rolę bariery. Jeśli komórki śródbłonka użyte w niektórych badaniach nie są w stanie samodzielnie utworzyć pełnej bariery na błonach PET, przed inokulacją komórek wymagane jest pokrycie błon roztworem kolagenu dożylnie.</li>
	<li>Wymieszaj komórki bEnd.3 z podłożem DMEM, aby uzyskać zawiesinę o gęstości 5 x 105 komórek/ml za pomocą mieszalnika wirowego. Następnie wysiewaj 200 μl zawiesiny komórek bEnd.3 na membranie PET w górnej komorze 24-dołkowej płytki (0,33 cm2, wielkość porów membrany 0,4 μm). 
	UWAGA: Badanie pilotażowe tego protokołu nie wykazało różnicy w wynikach przy użyciu od 5 do 10 pasaży komórek bEnd.3 do eksperymentów. Aby zapewnić prawdopodobieństwo pomyślnego modelowania, należy zapoznać się z interwałem liczby komórek w tym protokole.</li>
	<li>Dodać 1200 μl kompletnego podłoża do dolnej komory płytki, aby upewnić się, że ciśnienie osmotyczne górnej i dolnej komory ma tendencję do stabilizacji. Istnieją różnice w objętości dodawanego podłoża w zależności od rodzaju; Upewnij się, że poziom cieczy w górnej i dolnej komorze jest spłukiwany.</li>
	<li>Zmieniaj medium w górnej i dolnej komorze o stałej porze każdego dnia i jednocześnie monitoruj wartość rezystancji.
	<ol>
		<li>Podczas zmiany pożywki integralność warstwy komórkowej zostanie uszkodzona przez sztuczny dotyk lub nadmierny ruch. Aby uniknąć powyższej sytuacji, powoli usuń stare medium z jednej strony za pomocą pipety podciśnieniowej i powoli dodaj nowe medium wzdłuż ścianki podczas wymiany płynu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Pomiar TEER
<ol>
	<li>Przed rozpoczęciem pracy umieść rezystor, 5% roztwór podchlorynu sodu, 75% etanol i podwójnie destylowany roztwór wody w ultra czystym stole. Włącz naświetlanie promieniami UV na 30 minut, aby wyeliminować resztki bakterii i patogenów.</li>
	<li>Umieść elektrody w 5% roztworze podchlorynu sodu, powoli wstrząsając przez 3 s do 5 s, a następnie zanurz w 75% etanolu na 15 minut. Na koniec przenieś do PBS lub roztworu wody podwójnie destylowanej do momentu użycia.</li>
	<li>Włącz przełącznik z tyłu miernika rezystora komórkowego, kliknij Wybierz płytkę zgodnie z parametrami w tabeli 1 i wybierz płytkę 24-dołkową.</li>
	<li>W zależności od potrzeb operacji wybierz odpowiednią sekwencję wykrywania. W tym badaniu wybraliśmy procedurę A1.</li>
	<li>Włóż rezystor kΩ do prawej wtyczki, aby skalibrować przyrząd. Jeśli wynik kalibracji wynosi 1000 ± 5 Ω, należy uznać dokładność przyrządu za normalną.
	<ol>
		<li>Jeśli wynik kalibracji nie wynosi 1000 Ω, kliknij Jednostki trybu w głównym interfejsie, aby wybrać OHMS, a następnie kliknij Kalibruj na ekranie głównym, aby ponownie skalibrować przyrząd.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyciągnij rezystor kΩ po prawej stronie i zastąp elektrodę pomiarową przewodem połączeniowym.</li>
	<li>Umieść elektrodę na 24-dołkowej płytce bez wysiewu komórek pionowo i kliknij Blank Handling na głównym ekranie urządzenia. Wartość tła oporu płytki bez komórek zasiewanych wynosi około 134,4 Ω.</li>
	<li>Włóż dwie elektrody do górnej i dolnej komory płytki zasiewanej z komórkami tak, aby warstwa ogniw znajdowała się między nimi, a następnie zapisz wartość rezystancji, delikatnie naciskając pedał.
	<ol>
		<li>Upewnij się, że elektroda nie dotyka ogniw w górnej komorze i na dole dolnej komory. Czas namaczania elektrody w roztworze nie ma wpływu na wartość rezystancji, a jedynie należy upewnić się, że elektroda znajduje się we właściwej pozycji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wartości TEER (Ωcm2) obliczyć mnożąc wartości oporu elektrycznego (omy) przez dolną powierzchnię (cm2) górnej komory, jak w równaniu: 
	TEER (Ωcm2) = Rezystancja (Ω) xwkładka S (cm2)</li>
	<li>Narysuj wykres liniowy czasu TEER (w dniach). Gdy wartość rezystancji nie wzrasta dalej w czasie (mierzona w dniach), należy wziąć pod uwagę, że ogniwo utworzyło barierę. 
	NOTW: Jednowarstwowy model BBB komórek bEnd.3 zostanie z powodzeniem skonstruowany poprzez hodowlę komórek bEND.3 z parametrami w tym badaniu przez około 6 dni. TEER jednowarstwowego modelu komórkowego bEnd.3 wynosił od 16,49 ± 2,12 Ωcm2 do 27,59 ± 1,50 Ωcm2 w ciągu 6 dni (n=8, średnia ± SD).</li>
</ol>
5. Niszczenie barier i analiza statystyczna
<ol>
	<li>Zgodnie z krzywą TEER - czas należy wybrać studzienki z funkcją bariery i podzielić je na grupę kontrolną i grupę CoCl2 (n = 4).</li>
	<li>Dodać pożywkę hodowlaną i pożywkę zawierającą 300 μM CoCl2 (200 μL) odpowiednio do grupy kontrolnej i górnej komory grupy CoCl2.</li>
	<li>Wykryć wartości oporności grupy kontrolnej i grupy CoCl2 po 12 godzinach i 24 godzinach inkubacji w temperaturze 37 °C, stosując procedurę opisaną w kroku 4.</li>
	<li>Użyj komercyjnego oprogramowania, aby zmapować trend wartości TEER bariery komórek hodowanych z lub bez 300 μM CoCl2</li>.
	<li>Użyj oprogramowania do analizy statystycznej, aby przeanalizować różnicę w wartościach oporności między komórkami traktowanymi CoCl2 a normalnymi komórkami (n = 4, *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001).</li>
</ol>

Transendothelial Resistance Measurement to Assess Cell Barrier Integrity

<ol><li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CLEC14A+deficiency+exacerbates+neuronal+loss+by+increasing+blood-brain+barrier+permeability+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">CLEC14A deficiency exacerbates neuronal loss by increasing blood-brain barrier permeability and inflammation.</a> J Neuroinflammation. 17 (1), 48(2020).</li>
<li>Bagchi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-vitro+blood-brain+barrier+models+for+drug+screening+and+permeation+studies%3A+an+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Des+Devel+Ther%22%5BJournal%5D)">In-vitro blood-brain barrier models for drug screening and permeation studies: an overview.</a> Drug Des Devel Ther. 13, 3591-3605 (2019).</li>
<li>Daneman, R., Prat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">The blood-brain barrier.</a> Cold Spring Harb perspect Biol. 7 (1), 020412(2015).</li>
<li>Profaci, C. P., Munji, R. N., Pulido, R. S., Daneman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+blood-brain+barrier+in+health+and+disease%3A+Important+unanswered+questions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">The blood-brain barrier in health and disease: Important unanswered questions.</a> J Exp Med. 217 (4), 20190062(2020).</li>
<li>Pardridge, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain+barrier+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov+Today%22%5BJournal%5D)">Blood-brain barrier delivery.</a> Drug Discov Today. 12 (1-2), 54-56 (2007).</li>
<li>Eigenmann, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+of+four+immortalized+human+brain+capillary+endothelial+cell+lines%2C+hCMEC%2FD3%2C+hBMEC%2C+TY10%2C+and+BB19%2C+and+optimization+of+culture+conditions%2C+for+an+in+vitro+blood-brain+barrier+model+for+drug+permeability+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Fluids+Barriers+CNS%22%5BJournal%5D)">Comparative study of four immortalized human brain capillary endothelial cell lines, hCMEC/D3, hBMEC, TY10, and BB19, and optimization of culture conditions, for an in vitro blood-brain barrier model for drug permeability studies.</a> Fluids Barriers CNS. 10 (1), 33(2013).</li>
<li>Gajdács, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+concept+of+an+ideal+antibiotic%3A+Implications+for+drug+design%5BTitle%5D)+AND+%22Molecule%22%5BJournal%5D)">The concept of an ideal antibiotic: Implications for drug design.</a> Molecule. 24 (5), 892(2019).</li>
<li>Stanimirovic, D. B., Bani-Yaghoub, M., Perkins, M., Haqqani, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain+barrier+models%3A+in+vitro+to+in+vivo+translation+in+preclinical+development+of+CNS-targeting+biotherapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Blood-brain barrier models: in vitro to in vivo translation in preclinical development of CNS-targeting biotherapeutics.</a> Expert Opin Drug Discov. 10 (2), 141-155 (2015).</li>
<li>Helms, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+models+of+the+blood-brain+barrier%3A+An+overview+of+commonly+used+brain+endothelial+cell+culture+models+and+guidelines+for+their+use%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 36 (5), 862-890 (2016).</li>
<li>Özyurt, M. G., Bayir, E., DoĞan, Ş, ÖztÜrk, Ş, Şendemİr, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coculture+model+of+blood-brain+barrier+on+electrospun+nanofibers%5BTitle%5D)+AND+%22Turk+J+Biol%22%5BJournal%5D)">Coculture model of blood-brain barrier on electrospun nanofibers.</a> Turk J Biol. 44 (4), 121-132 (2020).</li>
<li>Kim, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+validation+of+the+simplified+in+vitro+3D+Co-culture+based+BBB+model%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Functional validation of the simplified in vitro 3D Co-culture based BBB model.</a> Biochem Biophys Res Commun. 625, 128-133 (2022).</li>
<li>Aazmi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascularizing+the+brain+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Vascularizing the brain in vitro.</a> iScience. 25 (4), 104110(2022).</li>
<li>Burkhart, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+of+brain+capillary+endothelial+cells+in+primary+culture+with+defined+blood-brain+barrier+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Fluids+Barriers+CNS%22%5BJournal%5D)">Transfection of brain capillary endothelial cells in primary culture with defined blood-brain barrier properties.</a> Fluids Barriers CNS. 12, 19(2015).</li>
<li>Campisi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+self-organized+microvascular+model+of+the+human+blood-brain+barrier+with+endothelial+cells%2C+pericytes+and+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">3D self-organized microvascular model of the human blood-brain barrier with endothelial cells, pericytes and astrocytes.</a> Biomaterials. 180, 117-129 (2018).</li>
<li>Peng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroinflammatory+in+vitro+cell+culture+models+and+the+potential+applications+for+neurological+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Neuroinflammatory in vitro cell culture models and the potential applications for neurological disorders.</a> Front Pharmacol. 12, 671734(2021).</li>
<li>Secker, P. F., Schlichenmaier, N., Beilmann, M., Deschl, U., Dietrich, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+transepithelial+transport+measurements+to+detect+nephrotoxicity+in+vitro+using+the+RPTEC%2FTERT1+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Functional transepithelial transport measurements to detect nephrotoxicity in vitro using the RPTEC/TERT1 cell line.</a> Arch Toxicol. 93 (7), 1965-1978 (2019).</li>
<li>Nazari, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+TEER+measurements+of+biological+barriers+in+microphysiological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Advances in TEER measurements of biological barriers in microphysiological systems.</a> Biosens Bioelectron. 234, 115355(2023).</li>
<li>Nicolas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+transepithelial+electrical+resistance+%28TEER%29+measurements+on+perfused+membrane-free+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">High throughput transepithelial electrical resistance (TEER) measurements on perfused membrane-free epithelia.</a> Lab Chip. 21 (9), 1676-1685 (2021).</li>
<li>Yang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+alleviates+hypoxia-induced+blood-brain+barrier+injury+via+regulation+of+CLDN5+%28claudin+5%29%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Autophagy alleviates hypoxia-induced blood-brain barrier injury via regulation of CLDN5 (claudin 5).</a> Autophagy. 17 (10), 3048-3067 (2021).</li>
<li>Feng, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RhoA%2FROCK-2+pathway+inhibition+and+tight+junction+protein+upregulation+by+catalpol+suppresses+lipopolysaccaride-induced+disruption+of+blood-brain+barrier+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">RhoA/ROCK-2 pathway inhibition and tight junction protein upregulation by catalpol suppresses lipopolysaccaride-induced disruption of blood-brain barrier permeability.</a> Molecules. 23 (9), (2018).</li>
<li>Sulhan, S., Lyon, K. A., Shapiro, L. A., Huang, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroinflammation+and+blood-brain+barrier+disruption+following+traumatic+brain+injury%3A+Pathophysiology+and+potential+therapeutic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Neuroinflammation and blood-brain barrier disruption following traumatic brain injury: Pathophysiology and potential therapeutic targets.</a> J Neurosci Res. 98 (1), 19-28 (2020).</li>
<li>Liu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notoginsenoside+R1+intervenes+degradation+and+redistribution+of+tight+junctions+to+ameliorate+blood-brain+barrier+permeability+by+Caveolin-1%2FMMP2%2F9+pathway+after+acute+ischemic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Phytomedicine%22%5BJournal%5D)">Notoginsenoside R1 intervenes degradation and redistribution of tight junctions to ameliorate blood-brain barrier permeability by Caveolin-1/MMP2/9 pathway after acute ischemic stroke.</a> Phytomedicine. 90, 153660(2021).</li>
<li>Hou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salidroside+intensifies+mitochondrial+function+of+CoCl2-damaged+HT22+cells+by+stimulating+PI3K-AKT-MAPK+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Phytomedicine%22%5BJournal%5D)">Salidroside intensifies mitochondrial function of CoCl2-damaged HT22 cells by stimulating PI3K-AKT-MAPK signaling pathway.</a> Phytomedicine. 109, 154568(2023).</li>
<li>Muñoz-Sánchez, J., Chánez-Cárdenas, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+cobalt+chloride+as+a+chemical+hypoxia+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Toxicol%22%5BJournal%5D)">The use of cobalt chloride as a chemical hypoxia model.</a> J Appl Toxicol. 39 (4), 556-570 (2019).</li>
<li>Jiang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salidroside+attenuates+high+altitude+hypobaric+hypoxia-induced+brain+injury+in+mice+via+inhibiting+NF-%CE%BAB%2FNLRP3+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Salidroside attenuates high altitude hypobaric hypoxia-induced brain injury in mice via inhibiting NF-κB/NLRP3 pathway.</a> Eur J Pharmacol. 925, 175015(2022).</li>
<li>Xie, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhodiola+crenulate+alleviates+hypobaric+hypoxia-induced+brain+injury+via+adjusting+NF-%CE%BAB%2FNLRP3-mediated+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Phytomedicine%22%5BJournal%5D)">Rhodiola crenulate alleviates hypobaric hypoxia-induced brain injury via adjusting NF-κB/NLRP3-mediated inflammation.</a> Phytomedicine. 103, 154240(2022).</li>
<li>Thiebaut de Schotten, M., Forkel, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emergent+properties+of+the+connected+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The emergent properties of the connected brain.</a> Science. 378 (6619), 505-510 (2022).</li>
<li>Tu, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimated+burden+of+stroke+in+China+in+2020%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA+Netw+Open%22%5BJournal%5D)">Estimated burden of stroke in China in 2020.</a> JAMA Netw Open. 6 (3), 231455(2023).</li>
<li>Alzheimers Dement. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alzheimer%27s+disease+facts+and+figures%5BTitle%5D)+AND+%22Alzheimers+Dement%22%5BJournal%5D)">Alzheimer's disease facts and figures.</a> Alzheimers Dement. 17 (3), 327-406 (2021).</li>
<li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+promote+tPA-induced+brain+hemorrhage+via+cGAS+in+mice+with+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps promote tPA-induced brain hemorrhage via cGAS in mice with stroke.</a> Blood. 138 (1), 91-103 (2021).</li>
<li>Liu, X. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+Cdk5+deficit+leads+to+the+development+of+spontaneous+epilepsy+through+CXCL1%2FCXCR2-mediated+reactive+astrogliosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Endothelial Cdk5 deficit leads to the development of spontaneous epilepsy through CXCL1/CXCR2-mediated reactive astrogliosis.</a> J Exp Med. 217 (1), 20180992(2020).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+Sporadic+Alzheimer%27s+Disease+in+Human+Brain+Organoids+under+Serum+Exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Sci+%28Weinh%29%22%5BJournal%5D)">Modeling Sporadic Alzheimer's Disease in Human Brain Organoids under Serum Exposure.</a> Adv Sci (Weinh). 8 (18), 2101462(2021).</li>
<li>Qi, D., Lin, H., Hu, B., Wei, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+on+in+vitro+model+of+the+blood-brain+barrier+%28BBB%29+based+on+hCMEC%2FD3+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Control+Release%22%5BJournal%5D)">A review on in vitro model of the blood-brain barrier (BBB) based on hCMEC/D3 cells.</a> J Control Release. 358, 78-97 (2023).</li>
<li>Artus, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Wnt%2Fplanar+cell+polarity+signaling+pathway+contributes+to+the+integrity+of+tight+junctions+in+brain+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">The Wnt/planar cell polarity signaling pathway contributes to the integrity of tight junctions in brain endothelial cells.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 34 (3), 433-440 (2014).</li>
<li>Sivandzade, F., Cucullo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-vitro+blood-brain+barrier+modeling%3A+A+review+of+modern+and+fast-advancing+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">In-vitro blood-brain barrier modeling: A review of modern and fast-advancing technologies.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 38 (10), 1667-1681 (2018).</li>
<li>Galla, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocultures+of+primary+porcine+brain+capillary+endothelial+cells%3A+Still+a+functional+in+vitro+model+for+the+blood-brain-barrier%5BTitle%5D)+AND+%22J+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Monocultures of primary porcine brain capillary endothelial cells: Still a functional in vitro model for the blood-brain-barrier.</a> J Control Release. 285, 172-177 (2018).</li>
<li>Srinivasan, B., Kolli, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transepithelial%2Ftransendothelial+electrical+resistance+%28TEER%29+to+measure+the+integrity+of+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Blood-Brain+Barrier%22%5BJournal%5D)">Transepithelial/transendothelial electrical resistance (TEER) to measure the integrity of blood-brain barrier.</a> Blood-Brain Barrier. 142, 99-114 (2019).</li>
<li>Liang, Y., Yoon, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+sensors+for+blood-brain+barrier+%28BBB%29+on+a+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Sens+Actuators+Rep%22%5BJournal%5D)">In situ sensors for blood-brain barrier (BBB) on a chip.</a> Sens Actuators Rep. 3, 100031(2021).</li>
<li>Ozgür, B., Helms, H. C. C., Tornabene, E., Brodin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+increases+expression+of+selected+blood-brain+barrier+transporters+GLUT-1%2C+P-gp%2C+SLC7A5+and+TFRC%2C+while+maintaining+barrier+integrity%2C+in+brain+capillary+endothelial+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Fluids+Barriers+CNS%22%5BJournal%5D)">Hypoxia increases expression of selected blood-brain barrier transporters GLUT-1, P-gp, SLC7A5 and TFRC, while maintaining barrier integrity, in brain capillary endothelial monolayers.</a> Fluids Barriers CNS. 19 (1), (2022).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Mózg, jeden z najbardziej rozwiniętych narządów ciała, kontroluje szeroki zakres skomplikowanych procesów fizjologicznych, w tym pamięć, funkcje poznawcze, słuch, węchi ruch. Mózg jest jednocześnie jednym z najbardziej skomplikowanych i chorych narządów ludzkiego ciała. Występowanie wielu zaburzeń ośrodkowego układu nerwowego wykazuje tendencję wzrostową z roku na rok ze względu na takie czynniki, jak zanieczyszczenie powietrza, nieregularne wzorce żywieniowe i inne czynniki 27,28,29.<sup class="x...

BBB to unikalny biologiczny interfejs między krążeniem krwi a tkanką nerwową, która składa się z komórek śródbłonka naczyń krwionośnych, perycytów, astrocytów, neuronów i innych struktur komórkowych1. Przepływ jonów, substancji chemicznych i komórek między krwią a mózgiem jest ściśle regulowany przez tę barierę. Ta homeostaza chroni tkanki nerwowe przed toksynami i patogenami, a jednocześnie umożliwia prawidłowe działanie nerwów mózgu2,3. Utrzymanie integralności bariery krew-mózg może skutecznie zapobiegać rozwojowi i postępowi zaburzeń wpływających na ośrodkowy układ nerwowy, takich jak dysfunkcja neuronów, obrzęk i zapalenie nerwów4. Jednak unikalne właściwości fizjologiczne bariery krew-mózg zapobiegają przedostawaniu się ponad 98% leków małocząsteczkowych i 100% farmaceutyków wielkocząsteczkowych do ośrodkowego układu nerwowego5. W związku z tym zwiększenie przenikania leków przez barierę krew-mózg podczas opracowywania leków na ośrodkowy układ nerwowy jest niezbędne do osiągnięcia skuteczności terapeutycznej6,7. Mimo że symulacje komputerowe substratów znacznie zwiększyły prawdopodobieństwo przekroczenia bariery krew-mózg przez kandydatów na leki, nadal potrzebne są wiarygodne i niedrogie modele BBB in vitro/in vivo, aby sprostać potrzebom badań naukowych8.
Szybką i przystępną techniką wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków jest model in vitro9. Aby rzucić światło na podstawowe procesy wpływu leków na czynność bariery krew-mózg oraz ich rolę w rozwoju i progresji choroby, stworzono serię uproszczonych modeli BBB in vitro. Obecnie powszechnymi modelami BBB in vitro są modele jednowarstwowe, kokulturowe, dynamiczne i mikroprzepływowe10,11,12, zbudowane z komórek śródbłonka naczyń krwionośnych i astrocytów, perycytów lub mikrogleju13,14. Chociaż hodowle komórkowe 3D są bardziej zgodne z fizjologiczną strukturą BBB15, ich zastosowanie jako metody badań przesiewowych leków w kierunku BBB jest nadal ograniczone przez ich skomplikowany projekt i słabą odtwarzalność. Natomiast monowarstwowy model in vitro jest najczęściej wykorzystywany do badań BBB i ma zastosowanie do określania ekspresji transporterów błonowych i białek połączeń ścisłych w poszczególnych komórkach.
Transmembranowy pomiar oporu elektrycznego (TEER) jest techniką oceny i monitorowania warstwy komórek w poprzek oporu oraz oceny integralności komórek i przepuszczalności bariery. Poprzez jednoczesne wprowadzenie dwóch elektrod do pożywki wzrostowej lub roztworu buforowego po obu stronach monowarstwy, możliwe jest zmierzenie prądu przemiennego lub impedancji elektrycznej przez zwartą warstwę ogniwa16,17. W celu określenia, czy model BBB in vitro został prawidłowo utworzony, pomiar TEER będzie zwykle stosowany jako złoty standard18. Z drugiej strony, trend działania leków na przepuszczalność BBB można dokładnie przewidzieć, mierząc zmianę oporu elektrycznego warstwy komórkowej po włączeniu leku19. Na przykład Feng i in. odkryli, że katalpol (główny aktywny monomer rehmanniae) może skutecznie odwrócić indukowaną lipopolisacharydem regulację w dół białek połączeń ścisłych w BBB i podnieść wartość TEER warstwy komórek śródbłonka mózgu myszy20.
Reakcja neurozapalna jest zazwyczaj główną przyczyną braku równowagi homeostazy BBB21. Leczenie niedotlenienia w celu wywołania uszkodzenia neurozapalnego jest główną metodą niszczenia bariery krew-mózg, obejmującą głównie metody fizyczne i metody odczynników chemicznych. Pierwszy z nich wykorzystuje przede wszystkim inkubator składający się z trzech gazów do zmiany zawartości tlenu w środowisku wzrostu komórek w celu symulacji warunków niedotlenienia22, podczas gdy drugi osiąga się poprzez sztuczne wprowadzenie odczynników deoksy, takich jak CoCl2, do pożywki do hodowli komórkowej23. Komórki pozostaną w stanie odtlenionym, jeśli Fe2+ zostanie podstawiony przez Co2+ w hemie. Jeśli Fe2 + zostanie podstawiony przez Co2 + w grupie katalitycznej, aktywność hydroksylazy proliny i hydroksylazy asparaginianowej zostanie zahamowana, co spowoduje akumulację czynnika indukowanego hipoksją-1α (HIF-1α) 24. W przypadku uporczywego niedotlenienia defosforylacja HIF-1α w cytoplazmie wyzwala śmierć komórki i aktywuje czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego, co ostatecznie zwiększa przepuszczalność naczyń. W poprzednich badaniach25,26, wykazano, że niedotlenienie może znacznie zmniejszyć ekspresję białek ścisłego połączenia śródbłonka, aby zwiększyć przepuszczalność BBB. W tym badaniu zmierzono krzywą czasowo-oporności komórek bEnd.3 wysianych na 24-dołkowych płytkach w celu stworzenia prostego modelu BBB. Korzystając z tego modelu, scharakteryzowaliśmy zmiany w TEER komórek po interwencji CoCl2 w celu skonstruowania modelu komórkowego, który można wykorzystać do badań przesiewowych leków pod kątem ochrony BBB.

<table><tbody><tr><td>24-dołkowa płytka transwell</td><td>Corning (Corning 3470, 0.33 cm2, 0.4 &micro; m)</td><td>10522023</td><td></td></tr><tr><td>75 % etanolu</td><td>ChengDu Chron Chemicals Co,. Ltd</td><td>2023052901</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa płytka</td><td>Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd</td><td>220412-078-B</td><td></td></tr><tr><td>bEnd.3 komórki</td><td>Hunan Fenghui Biotechnology Co., Ltd</td><td>CL0049</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do liczenia komórek-8 (CCK-8)</td> <td>Boster Biological Technology Co., Ltd</td><td>BG0025</td><td></td></tr><tr><td>Naczynie do hodowli komórkowych (100 mm)</td> <td>Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd</td><td>1192022</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek kobaltu (CoCl2)</td><td>Sigma</td><td>15862</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Boster Biological Technology Co., Ltd</td><td>PYG0040</td> Zmodyfikowane podłoże orła firmy Dulbecco <td></td></tr><tr><td>(1x)</td><td>Gibco ThermoFisher Scientific</td><td>8121587</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu Oprogramowanie Gibco ThermoFisher Scientific</td><td>2166090RP</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism</td><td>Oprogramowanie GraphPad</td><td>9.0.0(121)</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel (zawiera kolagen IV)</td><td>MedChemexpress</td><td>HY-K6002</td><td></td></tr><tr><td>Czytnik mikropłytek</td><td>Urządzenia molekularne</td><td>SpectraMax iD5</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie OriginPro 8</td><td>OriginLab Corporation</td><td>v8.0724(B724)</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna (100x)</td><td>Boster Biological Technology Co., Ltd</td><td>17C18B16</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS, 1x)</td><td>Gibco ThermoFisher Scientific</td><td>8120485</td><td></td></tr><tr><td>Podchloryn sodu</td><td>ChengDu Chron Chemicals Co,. Ltd</td><td>2022091501</td><td></td></tr><tr><td>Miernik rezystancji transbłonowej</td><td>World Precision Instruments LLC</td><td>VOM3 (wersja 1.6)</td><td></td></tr></tbody></table>

zapis integralności funkcjonalnej bariery na komórkach śródbłonka naczyniowego bend.3 poprzez transśródbłonkową detekcję oporu elektrycznego

Barrier Functional Integrity Recording on bEnd.3 Vascular Endothelial Cells via Transendothelial Electrical Resistance Detection

Bariera krew-mózg (BBB) to dynamiczna struktura fizjologiczna złożona z komórek śródbłonka mikronaczyniowego, astrocytów i perycytów. Koordynując interakcję między ograniczonym transportem szkodliwych substancji, wchłanianiem składników odżywczych i usuwaniem metabolitów w mózgu, bariera krew-mózg jest niezbędna do utrzymania homeostazy ośrodkowego układu nerwowego. Budowanie modeli in vitro bariery krew-mózg jest cennym narzędziem do badania patofizjologii zaburzeń neurologicznych i tworzenia terapii farmakologicznych. W badaniu tym opisano procedurę tworzenia monowarstwowego modelu komórkowego BBB in vitro poprzez wysiewanie komórek bEnd.3 do górnej komory 24-dołkowej płytki. Aby ocenić integralność funkcji bariery komórkowej, konwencjonalny woltomierz komórek nabłonkowych użyto do rejestrowania transbłonowego oporu elektrycznego normalnych komórek i komórek niedotlenionych wywołanych przez CoCl2 w czasie rzeczywistym. Przewidujemy, że powyższe eksperymenty dostarczą skutecznych pomysłów na stworzenie modeli in vitro choroby krew-mózg oraz leków stosowanych w leczeniu zaburzeń chorób ośrodkowego układu nerwowego.

Niniejszy protokół umożliwił rejestrację zmian wartości oporu komórek zgodnie z parametrami ustawionymi w mierniku oporu transepithelialnego. Żywotność komórek bEnd.3 (liczba żywych komórek) traktowanych różnymi stężeniami CoCl2 oceniono za pomocą testu CCK-8. Większe uszkodzenie komórek wywołane przez CoCl2 objawiało się niższą żywotnością komórek. Stwierdzono, że stężenie 300 µM CoCl2 było istotnie cytotoksyczne in vitro, i stężenie to zastosowano w kolejnych eksperymentach (<s...

Ten protokół opisuje niezawodny i skuteczny model in vitro bariery mózgowo-krwiennej. Metoda wykorzystuje mysie komórki śródbłonka naczyniowego mózgu bEnd.3 i mierzy transbłonowy opór elektryczny.

Zapis integralności funkcjonalnej bariery na komórkach śródbłonka naczyniowego bEnd.3 poprzez transśródbłonkową detekcję oporu elektrycznego

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic physiological structure composed of microvascular endothelial cells, astrocytes, and pericytes. By coordinating ...

Obecne badania zazwyczaj wykorzystują testy przepuszczalności i związaną z nimi ekspresję białek w celu sprawdzenia dokładności wykrywania TER. Model BBB komórek jednowarstwowych in vitro jest mniej skuteczny w badaniach przesiewowych leków, a użycie większej liczby komórek utrudnia skonstruowanie modelu. Protokół tego badania jest stosunkowo prosty, a nieinwazyjna procedura pozwala na wykorzystanie próbek komórek w innych eksperymentach po wykryciu TER.Wykrywanie oporności elektrycznej w celu oceny przepuszczalności modeli komórkowych może przyspieszyć badania przesiewowe leków stosowanych w leczeniu i profilaktyce ośrodkowego układu nerwowego, aby zwiększyć wskaźnik powodzenia opracowywania nowych leków. W przyszłości wykryjemy ekspresję białka ścisłego połączenia w komórkach górnego przedziału Aby sprawdzić, czy wyniki testów TER mogą być skutecznie obecne w integralności funkcji bariery BBB. Na początek przygotuj pożywkę do hodowli komórkowych DMEM zawierającą FBS, penicylinę i streptomycynę.Przygotować również 100 mM roztwór podstawowy chlorku kobaltu, dodając 1,30 mg chlorku kobaltu do 100 l DMSO. Następnie wysiew 1 ml bEnd. 3 komórki w 100 ml naczyniu hodowlanym zawierającym pożywkę DMEM i hodowla w temperaturze 37 C w wilgotnej atmosferze 5% dwutlenku węgla.Zmieniaj pożywkę co dwa do trzech dni i subkulturuj komórki dwa razy w tygodniu. Po bEnd. 3 komórki rosną do 80% zbiegu, trawią komórki z 0,25% trypsyny przez 30 sekund.Policz komórki za pomocą licznika komórek i wykonaj zawiesinę o gęstości 7 x 10 ^ 4 komórek na ml. Następnie wysiewaj 100 L tej zawiesiny komórkowej na 96-dołkowej płytce w celu adhezji komórek. Następnie przemyć komórki PBS i dodać 100 l pożywki zawierającej chlorek kobaltu.Hoduj komórki przez 24 godziny. Po inkubacji usunąć pożywkę i przemyć PBS. Następnie dodaj 100 l roztworu CCK-8.Inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez jedną godzinę. Następnie zmierzyć absorbancję przy długości fali 450 nm za pomocą czytnika mikropłytek. Oblicz żywotność komórek indukowaną przez chlorek kobaltu zgodnie z tym wzorem.Wybierz stężenie ze znaczącą różnicą w zmniejszeniu żywotności komórek w porównaniu z grupą kontrolną. Rentowność bEnd. 3 komórki potraktowane różnymi stężeniami chlorku kobaltu analizowano za pomocą testu CCK-8.Wyniki wykazały, że 300 M chlorku kobaltu wykazało istotną cytotoksyczność in vitro. Na początek przepłucz górną komorę 24-dołkowych płytek PBS. Wymieszaj bEnd.3 komórki z podłożem DMEM za pomocą mieszalnika wirowego do wytworzenia zawiesiny. Następnie wysiewamy 200 L bEnd. Zawiesina 3-komórkowa na membranie PET w górnej komorze płytki 24-dołkowej.Dodać 1 200 l kompletnego podłoża do dolnej komory płytki, aby ustabilizować ciśnienie osmotyczne górnej i dolnej komory. Zmień pożywkę, powoli usuwając starą pożywkę z jednej strony za pomocą pipety podciśnieniowej i dodając nową pożywkę wzdłuż ścianki podczas wymiany płynu. Przed pomiarem TEER umieść rezystor 5% roztworu podchlorynu sodu, 75% etanolu i podwójnie destylowanej wody na ultra czystym stole.Włącz naświetlanie promieniami UV na 30 minut, aby wyeliminować resztki bakterii i patogenów. Umieść elektrody w 5% roztworze podchlorynu sodu, powoli potrząsając przez trzy do pięciu sekund. Następnie zanurz się w 75% etanolu na 15 minut.Na koniec przenieś do PBS lub wody podwójnie destylowanej do czasu użycia. Następnie włącz przełącznik z tyłu miernika rezystora ogniwa. Kliknij wybierz płytkę, a następnie wybierz płytkę 24-dołkową.W zależności od operacji wybierz odpowiednią sekwencję wykrywania. Włóż rezystor kiloomowy do prawej wtyczki, aby skalibrować przyrząd. Jeśli wynik kalibracji wynosi 1 000 5 omów, należy uznać przyrząd za dokładny.Jeśli nie, kliknij jednostki trybu w głównym interfejsie, aby wybrać omy, a następnie kliknij kalibruj. Następnie wyjmij rezystor kiloomowy i zastąp go elektrodą pomiarową za pomocą przewodu połączeniowego. Umieść elektrodę pionowo w 24-dołkowej płytce zawierającej tylko pożywkę i kliknij ślepą nasadę na instrumencie.Wartość tła rezystancji płytki bez komórek zasiewnych powinna wynosić około 134,4 oma. Następnie włóż dwie elektrody do górnej i dolnej komory płytki z nasionami, tak aby warstwa komórek znajdowała się między nimi. Zapisz wartość oporu, delikatnie naciskając pedał.Upewnij się, że elektroda nie dotyka ogniw w górnej komorze i na dole dolnej komory. Wartości TEER uzyskaj, mnożąc wartości oporu elektrycznego przez dolną część górnej komory, jak pokazano w równaniu. Narysuj wykres liniowy TEER w funkcji czasu w dniach.Gdy wartość rezystancji nie wzrasta z czasem, komórki utworzyły barierę. Wykreślone wartości oporu w funkcji czasu dla bEnd. 3 komórki wykazały, że wartości TEER komórek zaczęły się stabilizować w piątym dniu.Zacznij od hodowli bEnd. 3 komórek, a następnie podziel studzienki na grupę kontrolną i grupę chlorku kobaltu. Dodać 200 l pożywki do górnej komory grupy kontrolnej, a pożywkę zawierającą 300 M chlorek kobaltu do grupy chlorków kobaltu.Inkubować płytki w temperaturze 37 °C i wykrywać wartości oporu po 12 i 24 godzinach inkubacji przy użyciu metody TEER. Korzystaj z komercyjnego oprogramowania, aby odwzorować trend wartości TEER bariery komórkowej. Użyj oprogramowania do analizy statystycznej, aby przeanalizować różnicę w wartościach oporności między komórkami traktowanymi chlorkiem kobaltu a komórkami kontrolnymi.Dodanie 300 M chlorku kobaltu spowodowało znaczny spadek wartości TEER w porównaniu z kontrolą zarówno w 12-godzinnym, jak i 24-godzinnym punkcie czasowym. Po 24 godzinach wartość TEER w grupie 300 M chlorku kobaltu zmniejszyła wartość TEER w grupie chlorku kobaltu 300 M zmniejszona w porównaniu z grupą kontrolną, co wskazuje na uszkodzenie bariery komórkowej, które zostało wywołane warunkami niedotlenienia spowodowanymi chlorkiem kobaltu.

barrier-functional-integrity-recording-on-bend3-vascular-endothelial

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Niniejszy artykuł opisuje technikę in vitro służącą do monitorowania naciekania komórek nowotworowych przez monowarstwę komórek śródbłonka. Dane są pozyskiwane w czasie rzeczywistym jako funkcja zmian impedancji na powierzchni elektrod znajdujących się na dnie studzienki.

Technika oparta na pomiarze impedancji elektrycznej w czasie rzeczywistym do pomiaru inwazji monowarstwy komórek śródbłonka przez komórki nowotworowe

Ten film przedstawia metodę oceny przezśródbłonkowego oporu elektrycznego (TEER) w komórkach śródbłonka mikronaczyniowego mózgu myszy in vitro. Wysoka wartość TEER wskazuje na nienaruszone połączenia komórek śródbłonka, podczas gdy dodanie aktywowanych limfocytów T obniża wartość TEER, odzwierciedlając przerwanie bariery połączeniowej.

Ocena przezśródbłonkowej oporności elektrycznej w modelu bariery krew-mózg in vitro

Organiczny tranzystor elektrochemiczny jest zintegrowany z żywymi komórkami i służy do monitorowania przepływu jonów przez barierę nabłonkową przewodu pokarmowego. W tym badaniu mierzony jest wzrost strumienia jonów, związany z rozerwaniem połączeń ścisłych, wywołany obecnością chelatora wapnia EGTA (glikol etylenowy-bis(beta-aminoetylowy eter)-N,N,N',N'-tetraoctowy kwas).

Wykrywanie przerwania tkanki barierowej za pomocą organicznego tranzystora elektrochemicznego

Ten protokół omawia Wykrywanie Impedancji Elektrycznej Komórki, metodę rejestrowania i analizy widma impedancji przylegających komórek do ilościowego określenia przyczepienia, proliferacji, ruchliwości i reakcji komórkowych na bodźce farmakologiczne i toksyczne. Położono nacisk na wykrywanie przepuszczalności śródbłonka oraz ocenę kontaktów komórka-komórka i komórka-substrat.

Wykrywanie impedancji substratu elektrycznego podłoża komórkowego w celu ilościowego określenia proliferacji śródbłonka, funkcji bariery i ruchliwości

Tutaj opisujemy mysi model bariery krew-mózg in vitro, który wykorzystuje impedancję spektroskopii komórek, koncentrując się na konsekwencjach dla integralności i przepuszczalności komórek śródbłonka po interakcji z aktywowanymi limfocytami T.

Model in vitro bariery krew-mózg przy użyciu spektroskopii impedancyjnej: skupienie się na interakcji limfocytów T z komórkami śródbłonka

Ta publikacja opisuje produkcję urządzenia typu organ-on-chip ze zintegrowanymi elektrodami do bezpośredniego oznaczania oporu elektrycznego przezśródbłonka (TEER). W celu walidacji bariera krew-mózg została naśladowana wewnątrz tego urządzenia mikroprzepływowego i monitorowano jego funkcję bariery. Przedstawione metody integracji elektrod i bezpośredniego oznaczania ilościowego TEER mają ogólne zastosowanie.

Produkcja i walidacja systemu Organ-on-chip ze zintegrowanymi elektrodami do bezpośredniego ilościowego określania przezśródbłonkowej rezystancji elektrycznej

Tutaj pokazujemy, jak skonfigurować tani woltoamperomierz z programowalną częstotliwością wyjściową, który może być używany z dostępnymi na rynku elektrodami pałeczkowymi do pomiarów przezprzeznabłonkowego/śródbłonkowego oporu elektrycznego.

Proste podejście do wykonywania pomiarów TEER za pomocą samodzielnie wykonanego woltoamperomierza z programowalną częstotliwością wyjściową

Ten protokół ilustruje test transcytozy komórek śródbłonka in vitro jako model do oceny przepuszczalności wewnętrznej bariery krew-siatkówka poprzez pomiar zdolności ludzkich komórek śródbłonka mikronaczyniowego siatkówki do transportu peroksydazy chrzanowej przez komórki w procesach transportu transkomórkowego, w których pośredniczą kaweole.

Test transcytozy komórek śródbłonka jako model in vitro do oceny przepuszczalności wewnętrznej bariery krew-siatkówka

Tutaj demonstrujemy technikę korzystania z biosensorów opartych na impedancji: ECIS i cellZscope, do pomiaru siły bariery śródbłonka mózgu. Szczegółowo opisujemy przygotowanie i technikę dodawania różnych bodźców do modelu śródbłonka mózgu in vitro. Mierzymy, rejestrujemy i przedstawiamy reprezentatywną analizę wyników.

Pomiar zmian w integralności bariery śródbłonka mózgu za pomocą dwóch bioczujników opartych na impedancji w odpowiedzi na komórki nowotworowe i cytokiny

Przedstawiamy metodę pozyskiwania sygnałów elektrokortykograficznych do celów badawczych u ludzi poddawanych inwazyjnemu monitorowaniu epilepsji. Pokazujemy, jak wykorzystać platformę programową BCI2000 do zbierania danych, przetwarzania sygnałów oraz prezentacji bodźców. W szczególności prezentujemy SIGFRIED, narzędzie oparte na BCI2000 służące do funkcjonalnego mapowania mózgu w czasie rzeczywistym.

Rejestracja ludzkich sygnałów elektrokortykograficznych (ECoG) w badaniach neuronaukowych i funkcjonalnym mapowaniu kory mózgowej w czasie rzeczywistym

Naucz się oceny integralności bariery krew-mózg metodą TER na komórkach śródbłonka bEnd.3. To nieinwazyjne podejście przyspiesza badania przesiewowe leków na choroby układu nerwowego.

Zapis integralności funkcjonalnej bariery na komórkach śródbłonka naczyniowego bEnd.3 poprzez transśródbłonkową detekcję oporu elektrycznego (Wideo) | JoVE Journal

Zapis integralności funkcjonalnej bariery na komórkach śródbłonka naczyniowego bEnd.3 poprzez transśródbłonkową detekcję oporu elektrycznego

Przeglądaj więcej filmów