Name: Hodowla organoidów glejaka pochodzącego od pacjenta ex vivo za pomocą rozdrabniacza tkanek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-19T13:35:00.000+00:00
Duration: 5 min 45 s
Description: Poznaj metodę automatycznego rozdrabniania tkanek do hodowli organoidów glejaka pochodzących od pacjenta. Technika skraca czas produkcji o 70% i zwiększa liczbę organoidów przy zachowaniu cech pierwotnego guza.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie zostało sfinansowane przez Interdyscyplinarne Centrum Badań Klinicznych (IZKF, B-450) w Würzburgu, Bawarskie Centrum Badań nad Rakiem (BZKF), a publikacja została wsparta przez Open Access Publishing Fund Uniwersytetu w Würzburgu. Chcielibyśmy podziękować Dagmar Hemmerich i Siglinde Kühnel z Sekcji Neurochirurgii Eksperymentalnej, Oddziału Neurochirurgii Szpitala Uniwersyteckiego w Würzburgu, za wsparcie techniczne. Rysunek 1 został utworzony przy użyciu www.biorender.com.

Wszyscy pacjenci byli leczeni na Wydziale Neurochirurgii Szpitala Uniwersyteckiego w Würzburgu, Niemcy, po wyrażeniu pisemnej świadomej zgody zgodnie z deklaracją Helsinek i zatwierdzoną przez Institutional Review Board Uniwersytetu w Würzburgu (#22/20-me). Materiał tkanki nowotworowej od czterech pacjentów z GBM i jednego gwiaździaka, zmutowanego IDH, pacjentów stopnia 2 OUN WHO (glejak niskiego stopnia, LGG) (Tabela 1) uzyskano z zabiegu chirurgicznego i przetworzono przy użyciu następującego protokołu. Zautomatyzowany proces generowania PDO za pomocą rozdrabniacza tkanek jest określany jako rozdrabniacz (C), a proces ręcznego cięcia tkanki za pomocą dwóch skalpeli pod kontrolą mikroskopową jako ręczny (M). Sześć jednakowej wielkości skrawków (1-2 cm3) wycięto z próbki guza, a następnie każdy z nich przecięto na pół i przetworzono jednorodnie przy użyciu obu metod. Ze względu na wspomnianą heterogeniczność wewnątrznowotworową, od każdego pacjenta wygenerowano jedną 6-dołkową płytkę dla każdego podejścia, przy czym każda studzienka reprezentowała PDO z innego miejsca w pierwotnym guzie. Oba zabiegi odbyły się w komorze z laminarnym przepływem powietrza, a wszystkie używane narzędzia zostały wysterylizowane przed użyciem. Przegląd tego podejścia jest zilustrowany na Rysunek 1.
1. Przygotowanie bloków agarozy (tylko dla podejścia C, opcjonalnie)
<ol>
	<li>Wlać 50 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) do zlewki, dodać jedną tabletkę agarozy (patrz tabela materiałów) i dobrze wymieszać do momentu zawieszenia.</li>
	<li>Podgrzej mieszaninę w kuchence mikrofalowej przez 30-40 sekund, unikając wrzenia. Następnie schłodzić mieszaninę do osiągnięcia temperatury 47 °C.</li>
	<li>Wlej mieszaninę agarozy do szczelnej formy odlewniczej w kształcie cylindra i unikaj tworzenia się pęcherzyków. Natychmiast schłodzić odlew za pomocą zamrożonego (-20 °C) zacisku lub umieszczając go na suchym lodzie na 30 minut.</li>
</ol>
2. Przetwarzanie materiału nowotworowego
<ol>
	<li>Przygotuj pudełko z lodem, aby utrzymać materiał nowotworowy w chłodzie w drodze z sali operacyjnej do laboratorium.</li>
	<li>Przenieś tkankę nowotworową (4-5 cm³) do sterylnej probówki o pojemności 50 ml zawierającej 25 ml hibernatu A (patrz Tabela materiałów) pokrywającej guz i umieść probówkę w pojemniku na lód.</li>
	<li>Pod komorą z laminarnym przepływem powietrza przenieś materiał nowotworowy wraz z hibernacją A na wysterylizowaną szklaną szalkę Petriego.</li>
	<li>Wyeliminuj tkankę martwiczą i ostrożnie wypreparuj naczynia krwionośne za pomocą skalpela i kleszczyków do tkanek pod kontrolą mikroskopową. Zidentyfikuj tkankę martwiczą na podstawie obszarów krwotocznych o brązowawym odcieniu wynikającym z krwawienia lub tkanki wykazującej jaśniejszy lub bielszy wygląd w stosunku do sąsiedniej żywotnej tkanki. Zwróć uwagę, aby nie ściskać ani nie naruszać tkanki.</li>
	<li>Pokrój materiał nowotworowy na sześć kawałków o przybliżonej wielkości 1-2 cm3. Rozłóż kawałki na plastikowych szalkach Petriego (n = 6) wstępnie wypełnionych 3 ml pożywki H-GPSA (Tabela 2), każda22. Ułóż szalki Petriego na lodzie.</li>
</ol>
3. Ustawianie rozdrabniacza tkanek
<ol>
	<li>Ustaw ostrze zgodnie z opisem w instrukcji producenta23.</li>
	<li>Dostosuj grubość plastra do 0,45-0,50 mm. Ustaw siłę ostrza na średnią. Zamocuj pokrętło zwalniania stołu w trybie "start".</li>
</ol>
4. Przetwarzanie fragmentów tkanki nowotworowej
<ol>
	<li>Przetwarzanie tkanki nowotworowej za pomocą rozdrabniacza (metoda C)
	<ol>
		<li>Pokrój bloki agarozy na cylindry o długości 2 cm i przyklej jeden z tych cylindrów do okrągłego plastikowego naczynia rozdrabniacza za pomocą kleju histoakrylowego (patrz Tabela materiałów).</li>
		<li>Stwórz pogłębienie w cylindrze agarozy za pomocą skalpela, a następnie dopasuj tkankę nowotworową z pierwszej studzienki (krok 2.5) do tego dołu. 
		UWAGA: Z materiałem nowotworowym należy obchodzić się ostrożnie i nie należy go ściskać ani wpychać w szczelinę. Szczelina powinna być wystarczająco duża, aby łatwo zmieścić guz, ale wystarczająco mała, aby materiał guza był stabilny podczas procesu cięcia. Kroki 4.1.1. oraz 4.1.2. są opcjonalne.</li>
		<li>Umieść plastikową tarczę na tarczy montażowej stołu do cięcia (patrz Tabela materiałów).</li>
		<li>Włącz chopper i naciśnij przycisk resetowania. Rozdrabniacz rozpocznie teraz cięcie (pierwsza runda). Maszyna zatrzymuje się automatycznie, gdy stół dotrze do końca, a zarówno agaroza, jak i tkanka nowotworowa są cięte na żądaną średnicę.</li>
		<li>Obróć tarczę montażową o 90°, a następnie ustaw pokrętło zwalniające stołu w trybie rozruchu.</li>
		<li>Naciśnij przycisk resetowania i pozwól maszynie ponownie przeciąć tkankę, tworząc tkankę w kształcie prostokąta (druga runda).</li>
		<li>Usuń plastikowy krążek z obrabianym materiałem i ostrożnie obróć tylko tkankę nowotworową o 90° za pomocą szpatułki do tkanek.</li>
		<li>Umieść plastikową tarczę na stole do cięcia, a następnie ustaw pokrętło zwalniające stołu w trybie startowym i naciśnij przycisk resetowania, aby wykonać ostatnią rundę cięcia (trzecią rundę).</li>
		<li>Wyłącz rozdrabniacz i wyjmij plastikowy krążek. Wyczyść rozdrabniacz i ostrza.</li>
		<li>Za pomocą pipety jednokanałowej o pojemności 5 ml odessać przetworzony materiał wraz z pożywką do pipety i przepłukać zawiesinę z powrotem do naczynia.</li>
		<li>Powtórz poprzedni krok 2-3 razy, aby prawidłowo oddzielić tkankę.</li>
		<li>Umieść szalkę Petriego z powrotem na lodzie i powtórz kroki (4.1.1-4.1.12.) z pozostałymi 5 szalkami z każdego guza.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ręczne przetwarzanie tkanki nowotworowej (metoda M)
	<ol>
		<li>Przenieść tkankę nowotworową z pierwszej plastikowej szalki Petriego (krok 2.5) wraz z 3 ml pożywki H-GPSA (Tabela 2) do szklanej szalki Petriego. Ręcznie rozciąć segment pod mikroskopem na odcinki o wielkości 0,5 mm za pomocą dwóch skalpeli.</li>
		<li>Przenieś wypreparowaną tkankę z powrotem na plastikową szalkę Petriego za pomocą pipety o pojemności 2 ml.</li>
		<li>Powtórzyć kroki (4.2.1-4.2.3.) dla sekcji guza na pozostałych pięciu płytkach Petriego (krok 2.5).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Mycie tkanki nowotworowej
<ol>
	<li>Przechyl każdą szalkę Petriego w górę do 45° i odczekaj 30 sekund, aż kawałki guza opadną na dno naczynia.</li>
	<li>Ostrożnie odessać 2,5 ml pożywki H-GPSA (Tabela 2) za pomocą pipety o pojemności 1 ml i pamiętać, aby nie pobrać żadnej tkanki nowotworowej.</li>
	<li>Dodać 2 ml buforu do lizy erytrocytów (patrz tabela materiałów) do każdej próbki. Przetworzone kawałki guza muszą być całkowicie pokryte buforem do lizy.</li>
	<li>Umieść 6 szalek na laboratoryjnej wytrząsarce orbitalnej na niskich obrotach przez 10 minut.</li>
	<li>Ostrożnie odessać 2 ml buforu do lizy, aby nie wchłonąć żadnej tkanki nowotworowej.</li>
	<li>Powtórzyć poprzednie etapy płukania (kroki 5.1-5.5) dwukrotnie, używając za każdym razem 2 ml pożywki H-GPSA (Tabela 2) zamiast buforu do lizy.</li>
</ol>
6. Hodowla tkanki nowotworowej
<ol>
	<li>Odessać pożywkę H-GPSA (Tabela 2) z każdej pożywki i zastąpić ją 4 ml pożywki PDO (Tabela 2).</li>
	<li>Przenieś kawałki tkanki z każdej płytki do jednego odpowiedniego dołka na 6-dołkowej płytce o bardzo niskim nasadce (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Umieścić płytkę na wytrząsarce orbitalnej wewnątrz inkubatora i inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 i 150 obr./min przez 2-4 tygodnie.</li>
	<li>Wykonać połówkową zmianę pożywki co dwa dni, odsysając 2 ml pożywki z każdej studzienki i zastępując ją 2 ml świeżej pożywki ChNP (Tabela 2) wstępnie podgrzanej do temperatury 37 °C.</li>
	<li>Obserwuj tkankę pod mikroskopem (morfologia, wzrost, kolor podłoża) i wytnij rosnące PDO (>0,7 mm) lub tkankę adhezyjną, aby zapobiec niedotlenieniu tkanek.
	<ol>
		<li>W tym celu należy przenieść PDO z dołka o bardzo niskim nasadce na wysterylizowaną szklaną szalkę Petriego i użyć skalpela do cięcia. Alternatywnie, adhezyjne PDO można rozwiązać, odsysając je pipetą o pojemności 1 ml. Uważaj, aby nie ściskać PDO i obchodzić się z nimi delikatnie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oceń powstawanie PDO, licząc PDO co dwa dni i dokładnie sprawdź pożądaną morfologię okrągłą (<silna klasa="xfig">Rysunek 2).</li>
</ol>
7. Naprawianie i osadzanie PDO
<ol>
	<li>Utrwal dwie ChNP z każdej studzienki każdego pacjenta z 4% formaliną przez 24 godziny po 6 tygodniach hodowli.</li>
	<li>Zanurzyć utrwalone ChNP w neutralnie buforowanej (fosforan sodu) formalinie aż do zatopienia.</li>
	<li>Umieść każdą ChNP w kasecie (patrz Tabela materiałów) w celu dalszej obróbki.</li>
	<li>Zainicjuj proces odwadniania, zanurzając kasetę w następujących roztworach, jak wspomniano w PONIŻSZEJ UWAGA: 
	UWAGA: 50% etanol przez 20 min, 70% etanol przez 20 min, 80% etanol przez 20 min, 96% etanol przez 20 min, 100% etanol przez 20 min, 100% etanol przez 30 min, 100% etanol + chloroform (stosunek 1:1) przez 30 min, 100% etanol + chloroform (stosunek 1:1) przez 30 minut, Chloroform bezwzględny przez 30 min, Chloroform bezwzględny przez 30 min, Chloroform bezwzględny przez 30 min, Parafina przez 30 min, Parafina przez 30 min za pomocą STP 120.</li>
	<li>Odwodnione ChNP zanurzyć w wosku parafinowym w temperaturze 58–60 °C.</li>
	<li>Pokrój osadzone PDO o grubości 2,5 μm i zamontuj je na szkiełkach w celu barwienia.</li>
</ol>
8. Barwienie immunofluorescencyjne
<ol>
	<li>Zamontuj ChNP po 6 tygodniach hodowli.</li>
	<li>Następnie należy przeprowadzić podwójne barwienie na kwaśnym białku fibrylarnym gleju (GFAP, rozcieńczenie: 1:100) i marker proliferacji Ki67 (rozcieńczenie: 1:1000) (patrz Tabela materiałów), jak wcześniej podano22.</li>
	<li>Podobnie oceniaj apoptozę przez podwójne barwienie PDO przeciwko GFAP i anty-kaspazie-3 (CC3, rozcieńczenie: 1:400) (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Uchwyć obrazy PDO za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego przy 40-krotnym powiększeniu.</li>
	<li>Przeanalizuj obrazy dla komórek GFAP-, Ki67- i CC3-dodatnich, a także komórek podwójnie dodatnich GFAP/Ki67 i GFAP/CC3.</li>
	<li>Wykorzystaj program typu open source Fiji (ImageJ-win 32) do analizy obrazu.</li>
</ol>
9. Ocena i analiza danych
<ol>
	<li>Rób codzienne zdjęcia mikroskopowe w jasnym polu podczas pierwszego tygodnia hodowli przy standardowych ustawieniach i 5-krotnym powiększeniu.</li>
	<li>Obserwuj zmiany morfologiczne i śledź proces dojrzewania zarówno w ręcznym, jak i zautomatyzowanym podejściu do przetwarzania.</li>
	<li>Przeprowadź analizę morfologiczną przy użyciu mikroskopu w standardowych ustawieniach trybu jasnego pola.</li>
	<li>Oceń liczbę PDO i morfologię w ciągu pierwszych 4 tygodni hodowli w PDO od wszystkich pięciu pacjentów.</li>
	<li>Uzyskaj trzy odczyty każdej liczby PDO od każdego pacjenta, aby obliczyć średnią i błąd standardowy średniej (SEM).</li>
	<li>Zbadaj proliferację i apoptozę w PDO od trzech pacjentów.</li>
	<li>Analizuj dane za pomocą dostępnego na rynku pakietu oprogramowania statystycznego (patrz Spis materiałów).</li>
	<li>Zastosuj testy U Studentsa-T i Manna-Whitneya, aby określić różnice między ręcznym i automatycznym generowaniem PDO pod względem liczby PDO, proliferacji i apoptozy.</li>
</ol>

Derivation of 3D Glioma Organoids from Chopper-Processed Patient Tumors

<ol><li>Gatto, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IDH+inhibitors+and+beyond%3A+the+cornerstone+targeted+glioma+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Diagn+Ther%22%5BJournal%5D)">IDH inhibitors and beyond: the cornerstone targeted glioma treatment.</a> Mol Diagn Ther. 25 (4), 457-473 (2021).</li>
<li>Buckner, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiation+plus+Procarbazine%2C+CCNU%2C+and+Vincristine+in+low-grade+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Radiation plus Procarbazine, CCNU, and Vincristine in low-grade glioma.</a> N Engl J Med. 374 (14), 1344-1355 (2016).</li>
<li>Grochans, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+of+glioblastoma+multiforme-literature+review%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Epidemiology of glioblastoma multiforme-literature review.</a> Cancers (Basel). 14 (10), 2412(2022).</li>
<li>Stupp, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiotherapy+plus+concomitant+and+adjuvant+temozolomide+for+glioblastoma%29%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma).</a> N Engl J Med. 352 (10), 987-996 (2005).</li>
<li>Herrlinger, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lomustine-temozolomide+combination+therapy+versus+standard+temozolomide+therapy+in+patients+with+newly+diagnosed+glioblastoma+with+methylated+MGMT+promoter+%28CeTeG%2FNOA-09%29%3A+a+randomised%2C+open-label%2C+phase+3+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Lomustine-temozolomide combination therapy versus standard temozolomide therapy in patients with newly diagnosed glioblastoma with methylated MGMT promoter (CeTeG/NOA-09): a randomised, open-label, phase 3 trial.</a> Lancet. 393 (10172), 678-688 (2019).</li>
<li>Stupp, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+tumor-treating+fields+plus+maintenance+temozolomide+vs+maintenance+temozolomide+alone+on+survival+in+patients+with+glioblastoma%3A+a+randomized+clinical+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Jama%22%5BJournal%5D)">Effect of tumor-treating fields plus maintenance temozolomide vs maintenance temozolomide alone on survival in patients with glioblastoma: a randomized clinical trial.</a> Jama. 318 (23), 2306-2316 (2017).</li>
<li>Desbaillets, N., Hottinger, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunotherapy+in+glioblastoma%3A+a+clinical+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Immunotherapy in glioblastoma: a clinical perspective.</a> Cancers (Basel). 13 (15), 3721(2021).</li>
<li>Gularyan, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+inter-+and+intratumoral+heterogeneity+of+glioblastoma+using+TOF-SIMS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Investigation of inter- and intratumoral heterogeneity of glioblastoma using TOF-SIMS).</a> Mol Cell Proteomics. 19 (6), 960-970 (2020).</li>
<li>Brennan, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+somatic+genomic+landscape+of+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The somatic genomic landscape of glioblastoma.</a> Cell. 155 (2), 462-477 (2013).</li>
<li>Lathia, J. D., Mack, S. C., Mulkearns-Hubert, E. E., Valentim, C. L., Rich, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells+in+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells in glioblastoma.</a> Genes Dev. 29 (12), 1203-1217 (2015).</li>
<li>Pollard, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioma+stem+cell+lines+expanded+in+adherent+culture+have+tumor-specific+phenotypes+and+are+suitable+for+chemical+and+genetic+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Glioma stem cell lines expanded in adherent culture have tumor-specific phenotypes and are suitable for chemical and genetic screens.</a> Cell Stem Cell. 4 (6), 568-580 (2009).</li>
<li>Timerman, D., Yeung, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identity+confusion+of+glioma+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Identity confusion of glioma cell lines.</a> Gene. 536 (1), 221-222 (2014).</li>
<li>Boj, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+models+of+human+and+mouse+ductal+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer.</a> Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).</li>
<li>Kopper, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+organoid+platform+for+ovarian+cancer+captures+intra-+and+interpatient+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">An organoid platform for ovarian cancer captures intra- and interpatient heterogeneity.</a> Nat Med. 25 (5), 838-849 (2019).</li>
<li>Lee, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+evolution+and+drug+response+in+patient-derived+organoid+models+of+bladder+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Tumor evolution and drug response in patient-derived organoid models of bladder cancer.</a> Cell. 173 (2), 515-528 (2018).</li>
<li>Bian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+engineered+cerebral+organoids+model+brain+tumor+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Genetically engineered cerebral organoids model brain tumor formation.</a> Nat Methods. 15 (8), 631-639 (2018).</li>
<li>Ogawa, J., Pao, G. M., Shokhirev, M. N., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioblastoma+model+using+human+cerebral+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Glioblastoma model using human cerebral organoids.</a> Cell Rep. 23 (4), 1220-1229 (2018).</li>
<li>Linkous, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+patient-derived+glioblastoma+with+cerebral+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Modeling patient-derived glioblastoma with cerebral organoids.</a> Cell Rep. 26 (12), 3203-3211 (2019).</li>
<li>da Silva, B., Mathew, R. K., Polson, E. S., Williams, J., Wurdak, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+glioblastoma+spheroid+infiltration+of+early-stage+cerebral+organoids+models+brain+tumor+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22SLAS+Discov%22%5BJournal%5D)">Spontaneous glioblastoma spheroid infiltration of early-stage cerebral organoids models brain tumor invasion.</a> SLAS Discov. 23 (8), 862-868 (2018).</li>
<li>Hubert, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+three-dimensional+organoid+culture+system+derived+from+human+glioblastomas+recapitulates+the+hypoxic+gradients+and+cancer+stem+cell+heterogeneity+of+tumors+found+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">A three-dimensional organoid culture system derived from human glioblastomas recapitulates the hypoxic gradients and cancer stem cell heterogeneity of tumors found in vivo.</a> Cancer Res. 76 (8), 2465-2477 (2016).</li>
<li>Jacob, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+patient-derived+glioblastoma+organoid+model+and+biobank+recapitulates+inter-+and+intra-tumoral+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A patient-derived glioblastoma organoid model and biobank recapitulates inter- and intra-tumoral heterogeneity.</a> Cell. 180 (1), 188-204 (2020).</li>
<li>Nickl, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioblastoma-derived+three-dimensional+ex+vivo+models+to+evaluate+effects+and+efficacy+of+tumor+treating+fields+%28TTFields%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Glioblastoma-derived three-dimensional ex vivo models to evaluate effects and efficacy of tumor treating fields (TTFields).</a> Cancers (Basel). 14 (21), 5177(2022).</li>
<li>Tissue Chopper. Lafayette Instrument. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://lafayetteinstrument.com">http://lafayetteinstrument.com</a> (2023).</li>
<li>Klein, E., Hau, A. C., Oudin, A., Golebiewska, A., Niclou, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioblastoma+organoids%3A+pre-clinical+applications+and+challenges+in+the+context+of+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Oncol%22%5BJournal%5D)">Glioblastoma organoids: pre-clinical applications and challenges in the context of immunotherapy.</a> Front Oncol. 10, 604121(2020).</li>
<li>Golebiewska, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+organoids+and+orthotopic+xenografts+of+primary+and+recurrent+gliomas+represent+relevant+patient+avatars+for+precision+oncology%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Patient-derived organoids and orthotopic xenografts of primary and recurrent gliomas represent relevant patient avatars for precision oncology.</a> Acta Neuropathol. 140 (6), 919-949 (2020).</li>
<li>Bougnaud, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+crosstalk+between+tumour+and+brain+parenchyma+instructs+histopathological+features+in+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Molecular crosstalk between tumour and brain parenchyma instructs histopathological features in glioblastoma.</a> Oncotarget. 7 (22), 31955-31971 (2016).</li>
<li>Chua, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+luminal+epithelial+progenitors+can+generate+prostate+organoids+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Single luminal epithelial progenitors can generate prostate organoids in culture.</a> Nat Cell Biol. 16 (10), 951-954 (2014).</li>
<li>Collingridge, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+brain+slice+preparation%3A+a+tribute+to+the+pioneer+Henry+McIlwain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">The brain slice preparation: a tribute to the pioneer Henry McIlwain.</a> J Neurosci Methods. 59 (1), 5-9 (1995).</li>
<li>Kato, H., Ogawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+technique+for+preparing+in+vitro+slices+of+cat%27s+visual+cortex+for+electrophysiological+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A technique for preparing in vitro slices of cat's visual cortex for electrophysiological experiments.</a> J Neurosci Methods. 4 (1), 33-38 (1981).</li>
<li>Teyler, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+slice+preparation%3A+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Bull%22%5BJournal%5D)">Brain slice preparation: hippocampus.</a> Brain Res Bull. 5 (4), 391-403 (1980).</li>
<li>Schulz, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+culture+of+organotypic+hippocampal+slices+for+the+analysis+of+brain+metastasis+and+primary+brain+tumor+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Preparation and culture of organotypic hippocampal slices for the analysis of brain metastasis and primary brain tumor growth.</a> Methods Mol Biol. 2294, 59-77 (2021).</li>
<li>Driehuis, E., Gracanin, A., Vries, R. G. J., Clevers, H., Boj, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+pancreatic+organoids+from+normal+tissue+and+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Establishment of pancreatic organoids from normal tissue and tumors.</a> STAR Protoc. 1 (3), 100192(2020).</li>
<li>Driehuis, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+cancer+organoids+recapitulate+disease+and+allow+personalized+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Pancreatic cancer organoids recapitulate disease and allow personalized drug screening.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (52), 26580-26590 (2019).</li>
<li>Neal, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+modeling+of+the+tumor+immune+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Organoid modeling of the tumor immune microenvironment.</a> Cell. 175 (7), 1972-1988 (2018).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncogenic+transformation+of+diverse+gastrointestinal+tissues+in+primary+organoid+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Oncogenic transformation of diverse gastrointestinal tissues in primary organoid culture.</a> Nat Med. 20 (7), 769-777 (2014).</li>
<li>Ootani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sustained+in+vitro+intestinal+epithelial+culture+within+a+Wnt-dependent+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Sustained in vitro intestinal epithelial culture within a Wnt-dependent stem cell niche.</a> Nat Med. 15 (6), 701-706 (2009).</li>
<li>Zhao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Methods+Primers%22%5BJournal%5D)">Organoids.</a> Nat Rev Methods Primers. 2, 94(2022).</li>
<li>Toh, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+3D+mammalian+cell+perfusion-culture+system+in+microfluidic+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A novel 3D mammalian cell perfusion-culture system in microfluidic channels.</a> Lab Chip. 7 (3), 302-309 (2007).</li>
<li>Zhang, C., Zhao, Z., Abdul Rahim, N. A., van Noort, D., Yu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+a+human-on-chip%3A+culturing+multiple+cell+types+on+a+chip+with+compartmentalized+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Towards a human-on-chip: culturing multiple cell types on a chip with compartmentalized microenvironments.</a> Lab Chip. 9 (22), 3185-3192 (2009).</li>
<li>Homan, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-enhanced+vascularization+and+maturation+of+kidney+organoids+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Flow-enhanced vascularization and maturation of kidney organoids in vitro.</a> Nat Methods. 16 (3), 255-262 (2019).</li>
<li>Huh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstituting+organ-level+lung+functions+on+a+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reconstituting organ-level lung functions on a chip.</a> Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).</li>
<li>Kengla, C., Atala, A., Sang Jin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioprinting+of+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Essentials+of+3D+Biofabrication+and+Translation%22%5BJournal%5D)">Bioprinting of organoids.</a> Essentials of 3D Biofabrication and Translation. , 271-282 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W niniejszym opracowaniu przedstawiono szybką i skuteczną metodę generowania ChNP. GBM pozostaje trudnym do leczenia nowotworem, często charakteryzującym się nawrotem choroby i dużym obciążeniem chorobą 3,6. Pilnie potrzebne są innowacyjne podejścia terapeutyczne, ponieważ obiecujące wyniki obserwowane in vitro często nie wykazują skuteczności in vivo podczas badań fazy I. Jedną z przyczyn tej rozbieżności może być ograniczona zdolność nieśmiertelnych linii komórkowych pochodzących od pacjentów, hodowanych w kulturach jednowarstwowych, do odzwierciedlania złożonych interakcji komórka-komórka i właściwości genetycznych guza rodzicielskiego. Biorąc pod uwagę wysoką heterogeniczność między- i wewnątrznowotworową GBM 8,9, preferowane są spersonalizowane terapie celowane, które mogą być obiecujące dla przyszłych zastosowań. W przeciwieństwie do przylegających do 2D linii komórkowych, organoidy mają zdolność zachowywania właściwości tkanki rodzicielskiej21, jednak złożone interakcje komórka-komórka między guzem a normalnym mózgiem mają ogromne znaczenie i mogą być potencjalnie przeoczone przez ten model. Jednak ręczne generowanie ChNP jest procesem czasochłonnym, a uszkodzenia tkanek spowodowane ściskaniem skalpelami podczas cięcia mogą utrudniać pomyślny wzrost PDO. W związku z tym zoptymalizowano zautomatyzowaną metodę wykorzystującą rozdrabniacz do tkanek, aby wygenerować większą liczbę PDO przy zmniejszonym czasie i wysiłku. Ponadto wykazaliśmy, że ogólne wskaźniki proliferacji i apoptozy nie różniły się między tymi dwoma podejściami.
Podejście C jest proste, łatwe do wdrożenia i umożliwia generowanie większej liczby PDO (ilustracja 3). Rotacja tkanki między drugą a trzecią rundą siekania została uznana za krytyczny krok w protokole. Na tym etapie tkanka utraciła już swoją integralność i może łatwo się rozpaść, co skutkuje większymi kawałkami, które wymagają dodatkowego cięcia lub ręcznego wypreparowania pod mikroskopem. Podczas gdy zautomatyzowane podejście rozdrabniacza pozwala na uzyskanie wstępnie ustawionego rozmiaru cięcia z większą dokładnością, podejście ręczne nie jest precyzyjne w określaniu wielkości PDO, co prowadzi do nierównomiernego kształtu i wielkości PDO, co jest wadą dla porównawczych badań przesiewowych leków (rysunek 2). Niemniej jednak, przy proponowanej metodzie, nie udaje się osiągnąć standaryzacji liczby komórek na PDO, co może stanowić wadę dla standardowych protokołów badań przesiewowych leków. Zalety i wady różnych technik generowania organoidów 18,19,20,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36, 
 37,38,39,40,41,42 i ich zastosowania podsumowano w tabeli 3.
Tkanka GBM może mieć różną konsystencję, od twardej (strefa infiltracji) do miękkiej (nekrotyczny rdzeń), co może stanowić wyzwanie dla zautomatyzowanego rozdrabniacza. Jeśli tkanka jest zbyt twarda, siekacz może ją ścisnąć i uszkodzić, podczas gdy zbyt miękka tkanka może zostać zmiażdżona. Wybrana tkanka wykazywała charakterystyczne cechy, w tym pośredni stopień jędrności, sporadycznie charakteryzujący się różowo-szarawym zabarwieniem, a nie brązowymi lub żółtymi przebarwieniami. Tkanka o gąbczastej i łatwo kruchej teksturze wykazała lepsze zachowanie w obrębie bloków agarozy, podczas gdy niezwykle delikatna i upłynniona tkanka nowotworowa została pominięta w procedurze pobierania próbek. Jednak podejście oparte na rozdrabniaczu umożliwiło pomyślne wygenerowanie większej liczby PDO w porównaniu z podejściem ręcznym, nawet w przypadku tkanki o nieoptymalnej konsystencji. Kluczowym rozwiązaniem jest utrzymanie ścisłej interakcji z chirurgiem wykonującym resekcję guza w celu przetworzenia tkanki z różnych obszarów guza. W przypadku nieoptymalnej konsystencji tkanki, ręczna obróbka tkanki pod mikroskopem była pomocnym dodatkiem po rozdrobnieniu. Aby wyjaśnić niejednorodność, tkanka nowotworowa została początkowo podzielona na sześć segmentów, z których każdy został następnie zmniejszony o połowę w przypadku podejścia C lub M. W obrębie tych sześciu odrębnych sekcji przewiduje się znaczny stopień niejednorodności. Co więcej, nawet w obrębie ChNP z tej samej sekcji lub studni prawdopodobna jest obecność odrębnych subpopulacji.
Jako dowód słuszności koncepcji, dane dotyczące proliferacji i apoptozy zostały przedstawione od dwóch pacjentów z GBM i jednego pacjenta z LGG, które nie wykazują istotnych różnic między tymi dwiema metodami. Wytwarzanie PDO nie ogranicza się do wysoce złośliwych guzów mózgu, ale może być również stosowane do LGG. Badanie to podkreśla, że LGG rzadko wykazują wzrost w kulturze 2D, co sprawia, że opracowanie dokładnego modelu dla ich badań jest bardzo cenne. Protokół ten ma na celu zademonstrowanie wszechstronności tego podejścia w szybkim i skutecznym generowaniu PDO z GBM oraz LGG.
Ogólnie rzecz biorąc, PDO mogą być w przyszłości wykorzystywane do zorientowanych na pacjenta testów przedterapeutycznych terapii celowanych w złośliwych guzach mózgu. Zapewnienie szybkiej i skutecznej metody zindywidualizowanych badań przesiewowych leków ma kluczowe znaczenie, ponieważ progresja guza następuje szybko i desperacko potrzebne są opcje leczenia ratunkowego. Kolejnym krokiem będzie ocena modelu PDO przy użyciu różnych podejść immunoterapeutycznych, aby lepiej naśladować rzeczywiste odpowiedzi na leczenie. W przyszłości PDO mogą być wykorzystywane do wyciągania wyrafinowanych wniosków dotyczących potrzeby dalszej eksploracji i oceny terapii w warunkach klinicznych.

Glejaki o niskim stopniu złośliwości (LGG) to grupa stosunkowo rzadkich guzów mózgu, które zazwyczaj prezentują się jako wolno rosnące i mniej agresywne w porównaniu do glejaków o wysokim stopniu złośliwości, takich jak glejak. Mogą wystąpić zarówno u dorosłych, jak i u dzieci, z nieco większą częstością występowania u dorosłych. Dokładna częstość występowania różni się w zależności od regionu i populacji, ale LGG stanowią około 15%-20% wszystkich pierwotnych guzów mózgu1. Strategie leczenia LGG często obejmują połączenie chirurgii, radioterapii i chemioterapii, mając na celu maksymalizację resekcji guza przy jednoczesnym zachowaniu funkcji neurologicznych. Leczenie LGG może być złożone, a wybór terapii może zależeć od takich czynników, jak lokalizacja guza i charakterystyka molekularna2. Postępy w zrozumieniu genetycznych i molekularnych podstaw LGG doprowadziły do opracowania bardziej ukierunkowanych terapii, a trwające badania nadal udoskonalają podejścia do leczenia.
Glejak, typ dziki IDH, stopień 4 (GBM) dla OUN WHO, z drugiej strony, jest najbardziej rozpowszechnionym pierwotnym guzem mózgu występującym u dorosłych, z częstością występowania między 3,19-4,17 przypadków na 100 000 osobolat<klasa sup="xref">3. GBM powoduje objawy takie jak bóle głowy, drgawki, ogniskowe deficyty neurologiczne, zmiany osobowości i zwiększone ciśnienie śródczaszkowe. Standardowe leczenie GBM polega na zmniejszeniu masy guza, jeśli to możliwe, a następnie radioterapii w połączeniu z temozolomidem4. Ponadto połączenie temozolomidu i lomustyny może zwiększyć medianę całkowitego wskaźnika przeżycia u pacjentów z metylacją promotora O-6-metyluganiny (MGMT)-promotora O-6-metyluaniny (MGMT)5. Jednak pomimo tych najnowszych podejść terapeutycznych, GBM pozostaje nieuleczalną chorobą o złym rokowaniu, charakteryzującą się medianą całkowitego przeżycia pacjentów wynoszącą od 16 miesięcy do 20,9 miesiąca po dodaniu pól TTFields3,6. Badano kilka podejść immunoterapeutycznych w GBM, ale wykazano ograniczoną skuteczność in vivo. Co więcej, ograniczenia kliniczne i przedkliniczne utrudniają przełomowe odkrycia terapeutyczne7. Ustalenie odpowiedniego i realistycznego modelu ex vivo było wyzwaniem ze względu na niejednorodność GBM między 8 i intratumoral9.
Konwencjonalne dwuwymiarowe (2D) linie komórkowe pacjentów reprezentują jednorodne populacje komórek i nadają się do wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków. Jednak pochodzące od pacjentów i unieśmiertelnione linie komórkowe nie naśladują odpowiednio GBM ze względu na różnice w warunkach wzrostu i odchylenia w cechach genotypowych i fenotypowych po wielu przejściach10,11,12.
Z drugiej strony, modele organoidów 3D pojawiły się ostatnio jako obiecujące systemy, które replikują fenotypową i molekularną heterogeniczność narządów i różnych typów nowotworów13,14,15,16,17,18. W kontekście GBM, organoidy mózgowe zostały genetycznie zmodyfikowane w celu symulacji cech podobnych do nowotworu16,17 lub współhodowane z GSC lub sferoidami w celu wywołania infiltracji komórek nowotworowych18,19. Podczas gdy organoidy GBM pochodzące od pacjentów hodowane za pomocą Matrigel i EGF/bFGF wykazują cechy charakterystyczne GBM, takie jak heterogeniczność komórek macierzystych i hipoksja20, nie jest pewne, w jakim stopniu model ten może reprezentować kluczowe właściwości molekularne nowotworów pacjentów.
Organoidy GBM (PDO) pochodzące od pacjentów są obiecującymi modelami, które mogą utrzymać dominujące cechy ich analogicznych nowotworów rodzicielskich, w tym cechy histologiczne, różnorodność komórkową, ekspresję genów i profile mutacji. Dodatkowo, są one szybko infiltrowane po implantacji do mózgów dorosłych gryzoni, zapewniając realistyczny model do testowania narkotyków i spersonalizowanej terapii21. Jednak ręczne preparowanie tkanki nowotworowej w celu wygenerowania PDO jest czasochłonne i kosztowne. W związku z tym istnieje pilna potrzeba opracowania szybkiej metody, która może wytworzyć dużą liczbę PDO, umożliwiając kompleksową ocenę różnych podejść terapeutycznych, które są obiecujące dla zindywidualizowanych testów leków. W badaniu tym opisano nową metodę wytwarzania ChNP bezpośrednio ze świeżo wypreparowanej tkanki nowotworowej za pomocą automatycznego rozdrabniacza tkanek. Ponadto PDO wygenerowane tą metodą porównano z ręcznie wypreparowanymi PDO od tych samych pacjentów pod względem liczby PDO, cech morfologicznych, apoptozy i proliferacji komórek nowotworowych.

<table><tbody><tr><td>2-merkaptoetanol (1000x)</td><td>Gibco</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>30% formaldehydu, bez metanolu</td><td>Carl Roth</td><td>4235.1</td><td>Stosowany w stężeniu 4%</td></tr><tr><td>70% roztwór</td><td></td><td></td> etanolu <td>Do sterylizacji&nbsp;</td></tr><tr><td>Agaroza tabletki 0,5 g</td><td>Carl Roth</td><td>HP67.7</td><td></td></tr><tr><td>Amfoterycyna B 250 &mikro; g/mL</td><td>Gibco</td><td>15290018</td><td></td></tr><tr><td>Kleszczyki anatomiczne</td><td>&nbsp; Hartstein</td><td>&nbsp; Nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Szpatułka anatomiczna</td><td>&nbsp; Hartstein</td><td>&nbsp; </td><td></td>Nie dotyczy</tr><tr><td>B-27 Suplement bez witaminy A (50x)</td><td>Gibco</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>Kaseta do biopsji z pokrywą</td><td>Resolab</td><td>37001-b</td><td></td></tr><tr><td>Ostrza do rozdrabniacza tkanek McIlwain</td><td>Instrumenty Campden</td><td>Model TC752-1</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało CC3 (Asp 175)</td><td>Technologia sygnalizacji komórek</td><td>9661</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowy skalpel</td><td>&nbsp; Pióro</td><td>&nbsp; </td><td></td>0200130015</tr><tr><td>Woda destylowana</td><td>Gibco</td><td>15230089</td><td>Aby rozcieńczyć formaldehyd</td></tr><tr><td>Zmodyfikowana mieszanka odżywcza surowicy orła (DMEM) firmy Dulbecco F-12 (1:1) (1x)</td><td>Gibco</td><td>11330032</td><td>Zawiera L-glutaminę i 15 mM HEPES</td></tr> Sól fizjologiczna <tr><td>buforowana fosforanem Dulbecco (PBS)</td><td>Sigma Life Sciences</td><td>D8537-500ML</td><td>Modyfikowany, bez wapnia, chlorku i chlorku magnezu, płynny, sterylnie filtrowany, odpowiedni do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>eBioscience 1x RBC Liza Bufor</td><td>Invitrogen</td><td>433357</td><td></td></tr><tr><td>Falcon probówka 50 ml Cellstar</td><td>Greiner Bio-One</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało GFAP</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc33673</td><td></td></tr><tr><td>Szklana zlewka</td><td>&nbsp; Nie dotyczy</td><td>&nbsp; Nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Szklana szalka Petriego</td><td>N/A</td> N<td>/A</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX (100x)</td><td>Inkubator CO2 Gibco</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Heracell 240i</td><td>Thermo scientific</td><td>51032875</td><td></td></tr><tr><td>Szafa Bezpieczeństwa Biologicznego Herasafe 2025</td><td>Thermo scientific</td><td>5016643</td><td></td></tr><tr><td>Hibernate-A</td><td>Klej Hibco</td><td>A1247501</td><td></td></tr><tr><td>Histoacryl</td><td>B. Braun chirurgiczna</td><td>1050052</td><td></td></tr><tr><td>insulina ludzka, roztwór</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-360248</td><td></td></tr><tr><td>Pojemnik na lód</td><td>&nbsp; Nie dotyczy</td><td>&nbsp; Przeciwciało N/A</td><td></td></tr><tr><td>Ki67</td><td>Abcam</td><td>ab16667</td><td></td></tr><tr><td>McIlwain Tissue</td><td>Chopper Cavey Laboratory Engineering</td><td>51350V</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop Leica DMI 3000B, DMI 4000B, DMI 6000B</td><td>Leica</td><td>DMI6000B</td><td>Do zdjęć w jasnym polu i immunofluorescencji</td></tr><tr><td>Mikroskop stereozoom S9D</td><td>Leica</td><td>W841832</td><td>Do ręcznego cięcia i monitorowania organoidów</td></tr><tr><td>Kuchenka mikrofalowa</td><td>Bosch</td><td>N/A</td><td>Do podgrzewania roztworu agarozy</td></tr><tr><td>Montaż plastikowych dysków</td><td>Cavey Laboratory Engineering</td><td>51354</td><td></td></tr><tr><td>Suplement N-2 (100x)</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>NEM Aminokwasy endogenne (NEAA) (100x)</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Neurobaseal (1x)</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>Orbital wytrząsarka Rotamax120 Heidolph</td><td></td><td>10304491</td><td></td></tr><tr><td>Penicilin Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Plastikowe szalki Petriego Cellstar</td><td>greiner bio-one</td><td>628160</td><td>n = 12</td></tr><tr><td>Pipeta jednokanałowa 1000 &micro; m</td><td>Eppendorf</td><td>4924000010</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta jednokanałowa 5000 &micro; m</td><td>Eppendorf</td><td>EP3123000276</td><td></td></tr><tr><td>Pakiet statystyczny dla nauk społecznych (SPSS) wersja 23.0</td><td>IBM</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Surgipath Paraplast</td><td>Leica</td><td>39601006</td><td>Podłoże do zatapiania</td></tr><tr><td>Ultra-low attachment Nucleon Sphera 6-dołkowa płytka Thermo</td><td>Scientific</td><td>174932</td><td></td></tr></tbody></table>

hodowla organoidów glejaka pochodzącego od pacjenta ex vivo za pomocą rozdrabniacza tkanek

Cultivating Ex Vivo Patient-Derived Glioma Organoids Using a Tissue Chopper

Glejak, typ dziki IDH, CNS WHO stopnia 4 (GBM) jest pierwotnym nowotworem mózgu związanym ze słabym przeżyciem pacjentów pomimo agresywnego leczenia. Opracowanie realistycznych modeli ex vivo pozostaje wyzwaniem. Trójwymiarowe modele organoidowe (PDO) pochodzące od pacjentów oferują innowacyjne platformy, które pozwalają uchwycić fenotypową i molekularną heterogeniczność GBM, zachowując jednocześnie kluczowe cechy oryginalnych guzów. Jednak ręczna sekcja w celu wytworzenia PDO jest czasochłonna, kosztowna i może skutkować powstaniem wielu nieregularnych i nierównych rozmiarów ChNP. W pracy przedstawiono innowacyjną metodę produkcji PDO z wykorzystaniem automatycznego rozdrabniacza tkanek. Próbki guza od czterech pacjentów z GBM i jednym gwiaździakiem, mutacją IDH, OUN WHO stopnia 2 były przetwarzane ręcznie, a także przy użyciu rozdrabniacza tkanek. W podejściu ręcznym materiał nowotworowy został wypreparowany za pomocą skalpeli pod kontrolą mikroskopową, podczas gdy rozdrabniacz tkanek był używany pod trzema różnymi kątami. Po hodowli na wytrząsarce orbitalnej w temperaturze 37 °C, zmiany morfologiczne oceniano za pomocą mikroskopii jasnego pola, podczas gdy proliferację (Ki67) i apoptozę (CC3) oceniano za pomocą immunofluorescencji po 6 tygodniach. Metoda rozdrabniania tkanek skróciła czas produkcji o prawie 70% i spowodowała znacznie wyższą średnią liczbę PDO w porównaniu z tkanką przetwarzaną ręcznie od drugiego tygodnia (tydzień 2: 801 vs. 601, P = 0,018; tydzień 3: 1105 vs. 771, P = 0,032; i tydzień 4: 1195 vs. 784, P < 0,01). Ocena jakości wykazała podobne wskaźniki apoptozy i proliferacji komórek nowotworowych dla obu metod wytwarzania. W związku z tym metoda automatycznego rozdrabniania tkanek oferuje bardziej efektywne podejście pod względem czasu i wydajności PDO. Metoda ta jest obiecująca w badaniach przesiewowych pacjentów z GBM pod kątem farmakoterapii lub immunoterapii.

Do badania włączono czterech pacjentów z GBM i jednego z LGG po potwierdzeniu patologicznym przez doświadczonego neuropatologa (CMM). Większość pacjentów miała niezmetylowany promotor MGMT, a wszyscy pacjenci z GBM wykazali typy dzikie IDH1 i IDH2 (Tabela 1). Średnio proces przygotowania trwał 88,8 min (+/- 6,3 min) w podejściu C i 322 min (+/- 17,2 min) w podejściu M. Ogólny wskaźnik sukcesu po 4 tygodniach hodowli wyniósł 87% w podejściu manualnym i 93% w podejściu z użyciem choppera (n = 5). Ponadto PDO pochodzące z grupy C osiągnęły pożądany zaokrąglony kształt w ciągu 1 tygodnia i były wystarczająco dojrzałe do wykorzystania w eksperymentach in vitro, podczas gdy PDO z grupy M w większości pozostały o ostrych krawędziach i nieokreślonym kształcie (Rysunek 2). Tkanka nowotworowa przetworzona metodą C pozwoliła na uzyskanie łącznie 281 PDO (średnio na pacjenta = 56 +/- 43) po pierwszym tygodniu hodowli, natomiast metodą M rozwinęło się 250 PDO (średnio na pacjenta = 50 +/- 41). W drugim tygodniu hodowli tkanki wszystkich pięciu pacjentów dały wyższą liczbę PDO przy zastosowaniu podejścia C (801; średnio na pacjenta = 130 +/- 38) w porównaniu do podejścia M (601; średnio na pacjenta = 76 +/- 44; P = 0,018). W trzecim tygodniu hodowli w podejściu C zgromadzono łącznie 1105 PDO od wszystkich pacjentów (średnio na pacjenta = 221 +/- 32) w porównaniu do 771 PDO (średnio na pacjenta = 155 +/- 34) w podejściu M (P = 0,032). Co więcej, po czterech tygodniach hodowli uformowało się łącznie 1195 PDO (średnio na pacjenta = 239 +/- 50) przy generowaniu metodą C w porównaniu do 784 (średnio na pacjenta = 157 +/- 36) przy użyciu metody M (P &lt; 0,01). Zatem metoda C wykazała znacznie wyższą liczbę PDO począwszy od drugiego tygodnia (Rysunek 3). Ponadto oceniono względne wahania liczby PDO, aby zbadać dynamiczne trendy między kolejnymi tygodniami. Analiza ujawniła imponujący wzrost liczby PDO podczas początkowego przejścia z pierwszego do drugiego tygodnia w podejściu C (265%), co wskazywało na szybki postęp. Następnie w trzecim tygodniu odnotowano mniejszy wzrost liczby PDO (75%), co odzwierciedlało tymczasową stabilizację. W przeciwieństwie do tego, podejście M wykazało stały i stopniowy wzrost liczby PDO (92% w drugim tygodniu, odpowiednio 67% w trzecim tygodniu), co przyczyniło się do zauważalnej stabilności liczby PDO w czwartym tygodniu. Ten konsekwentny trend wzrostowy liczby PDO podkreśla niezawodność i odporność podejścia C w całym okresie obserwacji.
Do analizy liczby astrocytów (GFAP) w obrębie PDO, proliferacji komórek PDO (Ki67) oraz apoptozy (CC3) włączono dwóch pacjentów z GBM i jednego pacjenta z LGG. Wyznaczona liczba astrocytów nie wykazała istotnych różnic między dwiema metodami przetwarzania, wynosząc średnio 43% w podejściu C i 45% w podejściu M (Rycina 4 i Rycina 5, Rycina uzupełniająca 1 i Rycina uzupełniająca 2). Podobnie wskaźniki proliferacji w obrębie PDO były porównywalne między podejściem C (3%) a podejściem M (1%). Tylko PDO wygenerowane podejściem C u pacjenta 5 wykazały wskaźnik proliferacji na poziomie 26% w porównaniu do 1% przy podejściu M (P = 0.001; Rycina 4C). Ogólnie wykryto niskie wskaźniki apoptozy w PDO przetwarzanych podejściem C (3%) w porównaniu do 2% przy podejściu M u wszystkich pacjentów, co nie stanowiło istotnej różnicy (Rycina 5C). Ponadto nie stwierdzono istotnej różnicy między dwiema metodami w odniesieniu do liczby astrocytów ulegających apoptozie (Rycina 5D).
<img alt="Przebieg przetwarzania tkanki mózgowej; siekacz, mikroskop; hodowla komórkowa; schemat eksperymentu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65952/65952fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Graficzny przegląd procesu wytwarzania organoidów pochodzących od pacjenta (PDO) przy użyciu automatycznego siekacza w porównaniu do metody manualnej. Ilustracja przedstawia poszczególne etapy, w tym (A) pobieranie próbek, (B) dyssekcję materiału nowotworowego, (C) płukanie oraz (D) inkubację. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65952/65952fig01large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Mikroskopia tkanki mózgu, GBM vs LGG, metody z użyciem siekacza i metody ręczne, analiza porównawcza struktury komórkowej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65952/65952fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Morfologia PDO w pierwszym tygodniu hodowli. Porównanie tworzenia PDO po rozdrobnieniu z wykorzystaniem automatycznego siekacza oraz metody ręcznej. Paski skali = 1000 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65952/65952fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres porównawczy wzrostu liczby PDO; analiza statystyczna, metoda z użyciem rozdrabniacza vs metoda ręczna, przedstawione wartości p." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65952/65952fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Liczba PDO podczas pierwszych czterech tygodni hodowli. Oś x przedstawia czas w tygodniach (W), a oś y liczbę PDO dla podejścia C (niebieski) i M (czerwony) (n = 5). Każdy punkt danych reprezentuje średnią liczbę, a słupki błędów wskazują błąd standardowy średniej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65952/65952fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza próbek tkanek, wykresy markerów GFAP i Ki67, glejak wielopostaciowy, metoda z użyciem siekacza (chopper) vs metoda manualna." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65952/65952fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Tempo proliferacji komórek w PDO. (A) Reprezentatywne obrazy immunofluorescencji (n = 3) komórek GFAP-dodatnich (zielone), komórek Ki67-dodatnich (czerwone) oraz DAPI (niebieskie) w PDO od pacjentów 3, 4 i 5 (Tabela 1). Wszystkie PDO zostały przetworzone metodą z użyciem siekacza (C) oraz metodą manualną (M). Paski skali = 100 µm. (B) Porównanie dwóch metod pod kątem względnej liczby komórek GFAP-dodatnich, (C) komórek Ki67-dodatnich oraz (D) komórek podwójnie dodatnich Ki67/GFAP. Wyniki nieistotne statystycznie oznaczono jako „ns”. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65952/65952fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza tkanek pacjentów z glejakiem; obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej i wykresy słupkowe; markery GFAP, CC3." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65952/65952fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Wskaźniki apoptozy w PDO. (A) Reprezentatywne obrazy immunofluorescencyjne (n = 3) komórek GFAP-dodatnich (zielone), komórek CC3-dodatnich (czerwone) oraz DAPI (niebieskie) w PDO od pacjentów 3, 4 i 5 (Tabela 1). Wszystkie PDO zostały przetworzone przy użyciu metody z rozdrabniaczem (C) oraz metody manualnej (M). Paski skali = 100 µm. (B) Porównanie dwóch metod pod kątem względnej liczby komórek GFAP-dodatnich, (C) komórek CC3-dodatnich oraz (D) komórek podwójnie dodatnich CC3/GFAP. Wyniki nieistotne statystycznie oznaczono jako „ns”. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65952/65952fig05large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.</a>
Tabela 1: Charakterystyka i parametry kliniczne pacjentów. GBM = glejak wielopostaciowy, typ dziki IDH, stopień 4 według CNS WHO; LGG = glejak o niskim stopniu złośliwości; KPS = skala sprawności Karnofsky'ego; MGMT = O6-metyloguanino-DNA metylotransferaza; IDH1 = dehydrogenaza izocytrynianowa 1, IDH2 = dehydrogenaza izocytrynianowa 2, ATRX = gen α-talasemii/opóźnienia umysłowego sprzężony z chromosomem X; M = morfologia; CC = liczba komórek; p = proliferacja; A = apoptoza. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65952/65952_Table%201.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Tabela 2: Składy pożywek. H-GPSA = Hibernate A-Glutamax penicylina streptomycyna amfoterycyna B. PDO = organoidy pochodzące od pacjentów. DMEM: DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium). NEAA: nieessentialne aminokwasy. Pen Strep: penicylina/streptomycyna <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65952/65952_Table%202_updated.zip" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Tabela 3: Przegląd technik wykorzystanych do generowania modeli hodowli komórkowych. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65952/Table%203_updated.zip" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Rycina uzupełniająca 1: Poszczególne kanały barwienia proliferacji w PDO. (A) DAPI (niebieski), (B) komórki GFAP-dodatnie (zielone), (C) komórki Ki67-dodatnie (czerwone) oraz (D) kanał nałożony w PDO od pacjentów 3, 4 i 5. Paski skali = 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65952/Supplementary%20figure1.pdf" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Rysunek uzupełniający 2: Poszczególne kanały barwienia na apoptozę w PDO. (A) DAPI (niebieski), (B) komórki GFAP-dodatnie (zielone), (C) komórki CC3-dodatnie (czerwone) i (D) kanał nałożony w PDO od pacjentów 3, 4 i 5. Paski skali = 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65952/Supplementary%20figure2.pdf" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

To badanie wprowadza zautomatyzowaną metodę generowania trójwymiarowych organoidów glejaka pochodzących od pacjenta za pomocą rozdrabniacza tkanek. Metoda zapewnia odpowiednie i skuteczne podejście do pozyskiwania takich organoidów do badań terapeutycznych.

Hodowla organoidów glejaka pochodzącego od pacjenta ex vivo za pomocą rozdrabniacza tkanek

Glioblastoma, IDH-wild type, CNS WHO grade 4 (GBM) is a primary brain tumor associated with poor patient survival despite aggressive treatment. Developing ...

Dlatego nasze badania koncentrują się na poprawie generowania organoidów pochodzących od pacjentów z glejakiem. Nasze kluczowe pytania koncentrują się wokół tego, czy takie podejście może skutecznie wyprodukować więcej organoidów, skrócić czas produkcji, a jednocześnie zachować cechy oryginalnego guza. Wykorzystamy to do skutecznego badania przesiewowego leków i immunoterapii u pacjentów z glejakiem.Ostatnie osiągnięcia w dziedzinie glejaka obejmują postęp w zrozumieniu aspektów genetycznych i molekularnych, prowadzący do rozpoznania nowych celów. Ponadto kładzie się duży nacisk na wykorzystanie organoidów 3D, aby lepiej odtworzyć złożoność nowotworów i umożliwić testowanie leków. Obecnie technologie takie jak ręczna sekcja, dysocjacja enzymatyczna, narząd na chipie i biodruk są szeroko stosowane do przygotowywania organoidów.Z drugiej strony, mechaniczne siekanie zapewnia metabolicznie aktywne wycinki mózgu w różnych badaniach, ale brakuje badań metabolicznych dotyczących przygotowania organoidów. Nasze badania wprowadziły innowacyjną metodę generowania organoidów 3D pochodzących od pacjentów za pomocą zautomatyzowanej maszyny do krojenia. Wykazaliśmy prawie 70% skrócenie czasu produkcji i znacznie wyższą liczbę organoidów w porównaniu z ręcznym preparowaniem.Oferowanie skuteczniejszej metody badań przesiewowych leków i immunoterapii u pacjentów z glejakiem. Zaawansowanie naszego badania znacznie przyspiesza proces produkcji organoidów, a jednocześnie jest w stanie utrzymać główne cechy pierwotnych nowotworów. Skracając czas i zasoby potrzebne do generowania organoidów, nasze podejście zwiększa wykonalność badań przesiewowych leków i immunoterapii na dużą skalę u pacjentów z glejakiem.Na początek przenieś tkankę nowotworową zanurzoną w 25 mililitrach hibernacji A na wysterylizowaną szklaną szalkę Petriego pod komorą z przepływem laminarnym. Za pomocą mikroskopu ostrożnie wyeliminuj całą martwiczą tkankę, a następnie użyj skalpela i kleszczyków do tkanek, aby wypreparować naczynia krwionośne. Pokrój tkankę nowotworową na jeden do dwóch centymetrów sześciennych kawałków.Przenieś je na plastikową szalkę Petriego zawierającą trzy mililitry pożywki H-GPSA i umieść naczynie na lodzie. Aby ręcznie przetworzyć guz, przenieś fragment guza na świeżą szklaną szalkę Petriego. Za pomocą dwóch skalpeli rozetnij segment na odcinki o wielkości 0,5 mililitra pod mikroskopem.Aby mechanicznie przetworzyć guz, najpierw odpowiednio ustaw ostrze, a następnie dostosuj grubość plastra do 0,45 do 0,50 milimetra i zamocuj pokrętło zwalniające stół, aby uruchomić tryb. Pokrój blok Angros w dwucentymetrowy cylinder i przyklej go do okrągłej plastikowej miseczki rozdrabniacza. Za pomocą skalpela utwórz jamę w cylindrze Angros i umieść w niej tkankę nowotworową.Następnie umieść plastikową tarczę na tarczy montażowej stołu do cięcia i naciśnij przycisk resetowania, aby rozpocząć proces siekania. Po pierwszej rundzie obróć tarczę montażową o 90 stopni i powtórz ponownie, aby pokroić tkankę na prostokątne kawałki. Usuń plastikowy dysk, a następnie za pomocą szpatułki do tkanek obróć tylko tkankę nowotworową o 90 stopni.Umieść plastikową tarczę z powrotem na stole do cięcia i naciśnij reset, aby kontynuować cięcie. Następnie za pomocą pięciomililitrowej pipety przenieś przetworzony materiał wraz z pożywką na szalkę Petriego. Umieść naczynie natychmiast na lodzie.Aby rozpocząć, pobierz tkankę nowotworową od pacjentów i przetwórz ją za pomocą rozdrabniacza. Przechyl szalkę Petriego zawierającą posiekany guz w górę do 45 stopni i ostrożnie usuń 2,5 mililitra pożywki H-GPSA. Aby umyć kawałki guza, dodaj dwa mililitry buforu do lizy RBC i inkubuj w wytrząsarce orbitalnej z małą prędkością.Następnie całkowicie wyrzuć bufor do lizy. Następnie dodaj cztery mililitry pożywki organoidowej pochodzącej od pacjenta do kawałków tkanek i przenieś kawałki tkanki na sześciodołkową płytkę o bardzo niskim mocowaniu. Inkubować płytkę w wytrząsarce orbitalnej przez dwa do czterech tygodni.Co dwa dni zmieniaj połowę zużytej pożywki na podgrzaną, świeżą pożywkę organoidową pochodzącą od pacjenta. Aby zapobiec niedotlenieniu tkanek, przenieś organoidy pochodzące od pacjenta na sterylną szklaną szalkę Petriego i obserwuj morfologię tkanek pod mikroskopem. Następnie za pomocą skalpela przetnij tkankę adhezyjną.Organoidy pochodzące od pacjenta, uzyskane metodą rozdrabniacza, osiągnęły pożądany zaokrąglony kształt w ciągu jednego tygodnia w porównaniu z organoidami siekanymi ręcznie. A liczba utworzonych organoidów była znacznie wyższa przy użyciu tej metody.

cultivating-ex-vivo-patient-derived-glioma-organoids-using-tissue

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Wideo pokazuje tworzenie i utrzymywanie organtypowych kultur warstwowych z tkanki glejaka. Wyizolowaną tkankę osadza się w matrycy agarozowej, a cienkie skrawki uzyskuje się za pomocą wibratomu. Sekcje te są następnie umieszczane na przepuszczalnych wkładkach membranowych w mikropłytce i hodowane w pożywce do hodowli warstwowej w celu długotrwałej konserwacji.

Generowanie i utrzymywanie kultur plastrów z ludzkiej tkanki glejaka wielopostaciowego

Ten film opisuje przygotowanie i hodowlę organoidów guza mózgu z zawiesiny pojedynczej komórki. Wykorzystując bogatą w lamininę macierz zewnątrzkomórkową jako rusztowanie i pożywkę hodowlaną dla składników odżywczych, komórki mają ułatwione namnażanie się i samoorganizację w organoidzie. W związku z tym generowane są organoidy ex vivo, naśladujące różnorodność komórkową i mikrośrodowisko guzów mózgu.

Generowanie kultury organoidów z zawiesiny komórek guza mózgu

Protokół rozmnażania zdysocjowanych próbek chirurgicznych glejaka wysokiego stopnia w pożywce neurosfery wolnej od surowicy do selekcji komórek o fenotypie rakowych komórek macierzystych. W przypadku próbek, które nie rosną jako neurosfery, sugerowany jest alternatywny protokół. Opisano technikę zatapiania parafiny w celu utrzymania architektury neurosfery 3D dla immunocytochemii.

Optymalizacja hodowli komórek glejaka o wysokim stopniu złośliwości z próbek chirurgicznych do zastosowania w klinicznie istotnych modelach zwierzęcych i immunochemii 3D

Obecne modele ex vivo glejaka (GBM) nie są zoptymalizowane pod kątem fizjologicznie istotnych badań nad inwazją nowotworów u ludzi. W tym miejscu przedstawiamy protokół generowania i utrzymywania organotypowych kultur warstwowych ze świeżej tkanki ludzkiej GBM. Przedstawiono opis technik mikroskopii poklatkowej i ilościowej analizy migracji komórek.

Organotypowy model hodowli warstwowej glejaka ludzkiego do badania migracji komórek nowotworowych i specyficznych dla pacjenta skutków leków przeciwinwazyjnych

To badanie przedstawia i opisuje protokoły do uzyskania dwóch specyficznych ludzkich organoidów nerwowych jako odpowiedniego i dokładnego modelu do badania: 1) rozwoju glejaka u człowieka w obrębie ludzkich organoidów nerwowych wyłącznie u ludzi oraz 2) różnicowania dopaminergicznego neuronów generującego trójwymiarowy organoid.

Ludzkie organoidy nerwowe do badania raka mózgu i chorób neurodegeneracyjnych

Tutaj opisujemy metodę generowania organoidów glejaka (GBM) z pierwotnych próbek pacjentów lub hodowli komórkowych pochodzących od pacjentów i utrzymywania ich do dojrzałości. Te organoidy GBM zawierają fenotypowo zróżnicowane populacje komórek i odtwarzają mikrośrodowiska guza ex vivo.

Utrzymanie różnorodności komórkowej ludzkiego glejaka wielopostaciowego ex vivo przy użyciu trójwymiarowej hodowli organoidów

Organoidy pochodzące od pacjentów (PDO) to trójwymiarowa (3D) hodowla, która może naśladować środowisko guza in vitro. W surowiczym raku jajnika o wysokim stopniu złośliwości PDO stanowią model do badania nowych biomarkerów i środków terapeutycznych.

Wytwarzanie i hodowla organoidów surowiczego raka jajnika o wysokim stopniu złośliwości pochodzących od pacjentów

Organoidy nowotworowe zrewolucjonizowały badania nad rakiem i podejście do medycyny spersonalizowanej. Reprezentują one klinicznie istotny model guza, który pozwala naukowcom być o krok przed guzem w klinice. Protokół ten ustanawia organoidy nowotworowe ze świeżych próbek tkanki guza trzustki i ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów pochodzących od gruczolakoraka trzustki.

Tworzenie organoidów nowotworowych i fibroblastów pochodzących z raka trzustki ze świeżych tkanek

Zmutowane IDH1 rozlane glejaki o niskim stopniu złośliwości to rzadkie nowotwory, które są trudne do hodowli. Wprowadzamy prostą, nieenzymatyczną metodę eksplantacji, która zachowuje ekspresję białka z mutacją IDH1 i utrzymuje kultury przez wiele miesięcy. Co ważne, technika ta działa w przypadku kriokonserwowanych guzów, oferując cenne źródło informacji do badań nad glejakiem.

Protokół dla eksplantatów rozlanych glejaków o niskim stopniu złośliwości z mutacją IDH1

Tutaj przedstawiamy kompleksowy protokół generowania i wykorzystywania laboratoryjnie zaprojektowanych organoidów glejaka (LEGO) do badania zależności genotyp-fenotyp i badania potencjalnych leków do leczenia glejaka.

Laboratoryjnie zmodyfikowana hodowla organoidów glejaka wielopostaciowego i badania przesiewowe leków

Poznaj metodę automatycznego rozdrabniania tkanek do hodowli organoidów glejaka pochodzących od pacjenta. Technika skraca czas produkcji o 70% i zwiększa liczbę organoidów przy zachowaniu cech pierwotnego guza.

Hodowla organoidów glejaka pochodzącego od pacjenta ex vivo za pomocą rozdrabniacza tkanek

Przeglądaj więcej filmów