Pomiar zmian w integralności bariery śródbłonka mózgu za pomocą dwóch bioczujników opartych na impedancji w odpowiedzi na komórki nowotworowe i cytokiny

Nasze badania koncentrują się na mikrokrążeniu mózgowym i barierze krew-mózg. Komórki śródbłonka mózgu regulują przepływ molekularny do mózgu. Używamy bioczujników opartych na impedancji, aby wspomóc ich integralność bariery w chorobie.

Dzięki jednoczesnej analizie wielu zmiennych leczenia ustaliliśmy już, że kilka linii komórek nowotworowych zakłóci śródbłonek mózgu. Co ważne, ustaliliśmy, że nie jest to głównie pośredniczone przez proteazy lub cytokiny, ale może być funkcją uwalniania ciał pęcherzykowych przez raka. Badamy, w jaki sposób nowotwory z przerzutami zaburzają działanie komórek śródbłonka mózgu, dostają się do mózgu i tworzą guzy wtórne.

Korzystając z bioczujników opartych na impedancji, badamy tę interakcję, aby zrozumieć upośledzenie naczyń mózgowych i chorobę. Naszym celem jest identyfikacja i blokowanie celów, aby chronić komórki śródbłonka mózgu przed zakłóceniem. W tym protokole szczegółowo opisujemy modyfikacje wprowadzone na podstawie pięciu do siedmiu lat doświadczenia, które pomogą zwiększyć odtwarzalność i solidność stosowania obu technologii opartych na impedancji.

W manuskrypcie omówiono zalety i ograniczenia obu systemów w porównaniu z innymi technologiami. Korzystając z tej technologii, możemy badać kilka właściwości komórek śródbłonka mikronaczyniowego mózgu jednocześnie i w czasie rzeczywistym. Ustaliliśmy, że komórki rakowe i cytokiny mogą zaburzać barierę śródbłonka.

Następnie ocenimy, czy blokowanie tych cząsteczek adhezyjnych lub receptorów pomaga chronić barierę śródbłonka mózgu, którą zmierzono za pomocą tych technik. Na początek użyj pipety wielokanałowej, aby odpipetować 100 mikrolitrów 10-milimolowej cysteiny do dołków 96-dołkowej płytki w sterylnym kapturze. Po inkubacji płytki ostrożnie zassaj roztwór ze studzienki i unikaj zarysowania elektrody.

Przepłucz studzienki dwa razy sterylną wodą dejonizowaną. Następnie dodaj 100 mikrolitrów świeżo przygotowanego roztworu kolagenu ze szczurzego ogona 1 do każdej studzienki. Inkubować płytkę przez godzinę w słabym świetle, a następnie dwukrotnie przemyć wodą dejonizowaną.

Następnie przenieś pobrane komórki śródbłonka mózgu do świeżego sterylnego koryta. Za pomocą pipety wielokanałowej dodaj 100 mikrolitrów zawiesiny komórek do każdej studzienki, kończąc wysiew w 30 sekund. Przechowuj jeden odwiert tylko do celów modelowania matematycznego.

W adapterze do płytek 96-dołkowych przesuń czerwone zaciski z każdej strony na zewnątrz, aby umożliwić włożenie płytki. Dokładnie wyrównaj wgłębienie A1 płytki z obszarem A1 adaptera i delikatnie dociśnij górną część płytki, aby utrzymać ją bezpiecznie na miejscu, a następnie zablokuj czerwone klipsy z powrotem. Naciśnij set, aby uruchomić instrument po zamknięciu inkubatora.

Wszystkie prawidłowo wykryte studnie będą oznaczone zielonym kolorem na mapie płytowej. Naciśnij przycisk wyboru, aby uwierzytelnić odczyty impedancji bezwzględnej. Teraz użyj menu rozwijanego pod mapą płyty, aby wybrać typ płyty używanej w eksperymencie.

Wybierz wiele częstotliwości, aby zmierzyć impedancję przy różnych częstotliwościach prądu przemiennego. Na koniec kliknij przycisk Start, aby rozpocząć eksperyment. Pozwól komórkom namnażać się, aż utworzy się monowarstwa o wysokiej rezystancji, na co wskazuje wzrost omów.

Upewnij się, że wzrost komórek osiągnął plateau przed przygotowaniem roztworów leczniczych. Aby przygotować roztwory lecznicze, umieść oznaczone 1,1 mililitra polipropylenowe probówki zbiorcze w płytkach z rurkami paskowymi. Dodaj trzy 50 mikrolitrów cytokin lub komórek terapeutycznych do probówki, postępując zgodnie z wcześniej przygotowaną mapą płytki.

Następnie umieść je w inkubatorze, aby się ogrzały. W oprogramowaniu ECIS kliknij pauzę, aby tymczasowo zatrzymać trwający eksperyment. Po wyświetleniu monitu otwórz inkubator i ostrożnie zwolnij oba czerwone klipsy, trzymając płytkę stabilnie.

Gdy eksperyment nadal jest w stanie wstrzymania, przenieś płytkę do sterylnego kaptura, a następnie wyjmij probówki z paskami leczniczymi z inkubatora. Za pomocą pipety wielokanałowej ostrożnie ponownie zawiesić zawartość probówek z paskami zabiegowymi. Teraz odpipetuj 100 mikrolitrów roztworu z odebranych probówek i przenieś go do odpowiednich studzienek na płytce 96-dołkowej.

Do studzienek bezkomórkowych dodawaj tylko kompletne pożywki. Należy dokończyć pipetowanie w czasie krótszym niż pięć minut, ponieważ nadmierne wychłodzenie płytki może wpłynąć na opór monowarstwy komórek śródbłonka. Ponownie przymocuj obrobioną płytkę do maszyny, a następnie sprawdź, czy ocena impedancji studni elektrody.

Upewnij się, że wybrano prawidłowe ustawienia akwizycji wieloczęstotliwościowej i katalog płyt, a następnie naciśnij przycisk wznów, aby kontynuować eksperyment. Gdy eksperyment przejdzie do żądanego punktu końcowego, naciśnij przycisk Zakończ, aby automatycznie zapisać nagrany plik. Przejdź do pliku i kliknij eksport danych, aby wyeksportować dane jako plik XLS lub CSV do dalszej analizy.

Wzrost oporności obserwowano w ciągu 30 godzin, co wskazuje na fazę wzrostu komórek śródbłonka. W fazie wzrostu komórki ustabilizowały się na różnych poziomach przez 48 godzin. Normalizacja pomiaru pozwoliła na bardziej wiarygodną interpretację zmian rezystancji.

Nieprawidłowa liczba komórek śródbłonka mózgu przed leczeniem powodowała fluktuacyjną fazę wzrostu, która stopniowo spadała do stabilnego plateau oporności. Zoptymalizowana gęstość wysiewu komórek i objętość załadunku zaowocowały optymalną fazą wzrostu. Cytokiny wydawały się mieć przejściowy wpływ na barierę.

Dodanie komórek czerniaka drastycznie zmniejszyło odporność bariery. Bariera parakomórkowa i podstawowy składnik boczny ulegały wahaniom wraz z dodawaniem cytokin. Dodanie komórek czerniaka spowodowało większe zmniejszenie bariery parakomórkowej w stosunku do komponentu podstawno-bocznego.

Aby rozpocząć w sterylnym kapturze, wkręć autoklaw 24 dołki do modułu ogniw sterylizowanych etanolem. Dodaj 900 mikrolitrów podłoża bazowego do każdego garnka. Teraz podłącz elektrody zanurzające autoklaw magnetycznie do pokrywy modułu ogniwa.

Następnie zamknij pokrywę nad studzienkami, tak aby elektrody zanurzeniowe pasowały do dolnych garnków elektrod. Następnie podłącz moduł ogniwa do adaptera w inkubatorze. Następnie uruchom oprogramowanie i kliknij zakładkę układu, aby załadować i opisać eksperymentalną mapę płyt.

Użyj sterylnej 24-dołkowej płytki hodowlanej, aby przytrzymać wkładki membranowe. Tam, gdzie wymagane jest powlekanie, dodaj roztwór macierzy zewnątrzkomórkowej do przecięcia studzienki. Za pomocą pipety jednokanałowej dokładnie obserwuj komórki śródbłonka mózgu w komorze wierzchołkowej każdej studzienki.

Aby stworzyć studzienkę wolną od komórek, pipetuj tylko cały pożywkę do jednej z wkładek. Następnie przenieś moduł komórkowy z inkubatora do sterylnego kaptura. Za pomocą pęsety ostrożnie przenieś przygotowane wkładki do garnków elektrod.

Umieść moduł ogniwa z powrotem w inkubatorze nad adapterem. Następnie zlokalizuj sekcję widma w zakładce kontroli eksperymentu i wybierz start od 1 Hz i zatrzymaj się na 100 KHz, aby uzyskać dane w całym zakresie częstotliwości. Następnie w obszarze Czas oczekiwania wybierz 15 minut, aby umożliwić ciągłe pomiary z najszybszą szybkością.

Naciśnij start, aby rozpocząć zbieranie danych. Po około 48 godzinach, gdy dojdzie do plateau odporności śródbłonka, przygotowane zabiegi należy umieścić w inkubatorze, aby utrzymać optymalną temperaturę. Wyjmij moduł ogniwa o wybranym czasie zabiegu, który rozpoczyna się natychmiast po 15-minutowym pomiarze.

W sterylnym kapturze otwórz moduł komórki, a następnie ostrożnie odpipetuj 70 mikrolitrów leku do komory wierzchołkowej odpowiedniej wkładki. Natychmiast zwróć moduł ogniwa do adaptera przed rozpoczęciem następnego pomiaru. Aby zakończyć eksperyment, naciśnij przycisk zatrzymania, a następnie kliknij plik, a następnie eksportuj, aby wyeksportować dane bezpośrednio do pliku XLS i odpowiednio go nazwać.

Chociaż zaobserwowano pewne różnice między dołkami replikowanymi, normalizacja danych zmniejszyła tę zmienność i pozwoliła na lepsze porównanie leczenia z kontrolą. Zaobserwowano przejściowy spadek oporności elektrycznej śródbłonka trans po dodaniu cytokin. Linie komórkowe czerniaka spowodowały znaczny spadek oporności w ciągu pięciu godzin.