Optyczne oczyszczanie i znakowanie w mikroskopii fluorescencyjnej arkuszy świetlnych w wielkoskalowym obrazowaniu ludzkiego mózgu

Ludzki mózg jest złożonym narządem obejmującym różne skale. Aby zrozumieć jego funkcjonalność, konieczne jest skonstruowanie szczegółowego konsensusu w całym mózgu. Nasz rutynowo wysokoprzepustowy protokół pozwala na analizę architektury leczenia nośników wolumetrycznych ludzkiego mózgu z rozdzielczością mikrometryczną, umożliwiając jego charakterystykę strukturalną.

Rekonstrukcja wolumetryczna dużych obszarów ludzkiego mózgu wiąże się z kilkoma wyzwaniami eksperymentalnymi związanymi z ogromnymi wymiarami próbek mózgu, złożonym składem biologicznym, zmiennymi warunkami utrwalania i przechowywania po śmierci oraz sygnałami autofluorescencyjnymi z pigmentów typu lipofuscyny. Wszystko to może pogorszyć wydajność czyszczenia optycznego i jakość pokazu. W porównaniu z innymi technikami oczyszczania, metoda krótkiej transformacji tkankowej w połączeniu z obrazowaniem mikroskopowym na żywo może być stosowana do szybkiego i jednoczesnego przetwarzania wielu odcinków ludzkiego mózgu.

Powodują one rekonstrukcję mózgu 3D z rozdzielczością subkomórkową. Na początek weź zlewkę zawierającą PBS i dodaj agarozę, aby przygotować 4% roztwór agarozy. Osadź utrwalony w formalinie blok ludzkiej tkanki mózgowej w roztworze agarozy.

Pozwól mu ostygnąć do temperatury pokojowej i przechowuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 24 godziny. W celu precyzyjnego przekrojenia przymocuj próbkę do krążka próbki wibratomu i napełnij tackę zimnym PBS. Dostosuj częstotliwość, amplitudę i prędkość wibratomu w zależności od rodzaju tkanki, która ma być pokrojona.

Po pokrojeniu przenieś wszystkie plastry do roztworu konserwującego składającego się z PBS z 0,01% azydkiem sodu. Zacznij od umieszczenia utrwalonych w formalinie skrawków mózgu zatopionych w parafinie w naczyniach z zakręcanymi pokrywkami. Dołącz roztwór wyłączający do naczyń, przykryj je folią aluminiową i inkubuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza, wstrząsając przez jeden dzień.

Następnego dnia przenieś wszystkie próbki do nowych szalek i inkubuj je z roztworem włączającym, jak pokazano wcześniej. Pod koniec inkubacji umieścić próbki w probówkach i przemyć je trzykrotnie PBS przez dwie godziny, wstrząsając. Następnie dodać roztwór inaktywacyjny do próbek i inkubować przez noc w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Po wykonaniu trzech płukań dodać roztwór klarujący do próbek i inkubować w łaźni wodnej o temperaturze 55 stopni Celsjusza przez trzy do siedmiu dni. Pod koniec inkubacji przemyć próbki PBST w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy godziny w inkubatorze. Następnego dnia dodaj 10 mililitrów 30% nadtlenku wodoru do każdej próbki i umyj próbki trzykrotnie PBS przez 10 minut, wstrząsając w temperaturze pokojowej.

Następnie podgrzej roztwór do pobierania antygenu do 95 stopni Celsjusza w łaźni wodnej. Przenieść próbki do podgrzanego roztworu i inkubować w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez 10 minut, a następnie 40 minut w temperaturze pokojowej na wytrząsarce. Umyj próbki wodą dejonizowaną przez pięć minut, wstrząsając.

Zrównoważyć próbki w PBS. Teraz przenieś próbki do naczyń z zakręcanymi pokrywkami. Po przygotowaniu świeżego roztworu przeciwciał pierwszorzędowych dla wszystkich próbek w zlewce, dodaj go do próbek i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez jeden do siedmiu dni, delikatnie potrząsając w ciemności.

Następnie umieść próbki w probówkach i umyj je za pomocą podgrzanego PBST w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze. Przenieść próbki do naczyń z zakręcanymi pokrywkami i dodać przeciwciała drugorzędowe przygotowane w PBST i 0,01% azydku sodu. Przenieść próbki do probówek i przemyć je trzykrotnie podgrzanym PBST w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie godziny, wstrząsając.

W celu dopasowania współczynnika załamania światła umieść próbki w nowych naczyniach i dodaj 30% roztwór TDE. Następnie zastąp 30% TDE roztworem 68% TDE w próbkach i pozostaw je w temperaturze pokojowej podczas wstrząsania. Po krótkim przetworzeniu uzyskano optymalną i jednorodną przezroczystość wszystkich wycinków tkanki zarówno w istocie szarej, jak i białej.

Na początek weź szkiełko tkanki mózgowej przygotowane przy użyciu techniki krótkiej transformacji tkankowej. Następnie umieść stalową przekładkę na szkiełku mikroskopowym i umieść próbkę na szkiełku mikroskopowym. Ostrożnie umieść kwarcową szkiełko nakrywkowe na próbce i zabezpiecz wszystkie elementy razem.

Teraz przygotuj dwuskładnikową mieszaninę kleju silikonowego w równych proporcjach. Za pomocą strzykawki o pojemności jednego mililitra wypełnij przestrzeń między przekładką a szkiełkiem nakrywkowym dwuskładnikowym klejem silikonowym. Usuń zaciski mocujące zespół razem.

Za pomocą małej igły powoli napełnij całą kanapkę 68%TDE i uszczelnij kanapkę świeżo przygotowanym klejem. Po zobrazowaniu szkiełek użyj ostrza, aby delikatnie otworzyć kanapkę. Przenieś próbki do nowych naczyń z zakrętkami wypełnionymi 30% roztworem TDE na trzy godziny.

Następnie przenieść próbki do probówek i przemyć je PBS trzy razy przez dwie godziny w temperaturze pokojowej, delikatnie wstrząsając. Umieścić próbki w roztworze klarującym i inkubować je w łaźni wodnej o temperaturze 80 stopni Celsjusza przez cztery godziny. Po inkubacji próbek przemyć je PBS, jak pokazano wcześniej.

Ludzki obszar Broki był ko-znakowany dla NeuN, somatostatyny, i wykazywał dwie różne subpopulacje interneuronów. Obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej arkuszy świetlnych wielookrągłych barwień i krótkich przetworzonych plasterków wykazały białą i szarą istotę znakowaną różnymi markerami neuronalnymi. Obrazy projekcyjne o maksymalnej intensywności warstwy o grubości 500 mikrometrów pokazały sygnał z siedmiu różnych przeciwciał użytych w trzech sekwencyjnych rundach barwienia immunologicznego.