Name: Uchwycenie mieszania jądra oocytu myszy na podstawie cytoszkieletu w różnych skalach przestrzennych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-12T13:50:00.000+00:00
Duration: 5 min 43 s
Description: Poznaj dynamikę kształtu jądra w oocytach myszy dzięki zaawansowanym technikom obrazowania cytoszkieletu. Metoda ta pozwala badać mechaniczne siły wpływające na biologię gamet żeńskich.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

A.A.J. i M.A. wspólnie napisali manuskrypt, a wszyscy współautorzy skomentowali manuskrypt. M. A. jest wspierany przez CNRS i "Projet Fondation ARC" (PJA2022070005322).A.A.J. jest wspierany przez Fondation des Treilles, Fonds Saint-Michel i Fondation du Collège de France.

Impact of Cytoskeleton on Nuclear Shape and Condensate Dynamics in Mouse Oocytes

<ol><li>Quinlan, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+Streaming+in+the+Drosophila+Oocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Rev+Cell+Developl+Biol%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic Streaming in the Drosophila Oocyte.</a> Annual Rev Cell Developl Biol. 32, 173-195 (2016).</li>
<li>Goldstein, R. E., van de Meent, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+physical+perspective+on+cytoplasmic+streaming%5BTitle%5D)+AND+%22Interface+Focus%22%5BJournal%5D)">A physical perspective on cytoplasmic streaming.</a> Interface Focus. 5 (4), 20150030(2015).</li>
<li>Gundersen, G. G., Worman, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+positioning%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Nuclear positioning.</a> Cell. 152 (6), 1376-1389 (2013).</li>
<li>Metzger, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAP+and+kinesin-dependent+nuclear+positioning+is+required+for+skeletal+muscle+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">MAP and kinesin-dependent nuclear positioning is required for skeletal muscle function.</a> Nature. 484 (7392), 120-124 (2012).</li>
<li>Roman, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+repair+after+physiological+damage+relies+on+nuclear+migration+for+cellular+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Muscle repair after physiological damage relies on nuclear migration for cellular reconstruction.</a> Science. 374 (6565), 355-359 (2021).</li>
<li>Almonacid, M., Terret, M. E., Verlhac, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+nucleus+positioning+in+mouse+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Develop+Biol%22%5BJournal%5D)">Control of nucleus positioning in mouse oocytes.</a> Semin Cell Develop Biol. 82, 34-40 (2018).</li>
<li>Brunet, S., Maro, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germinal+vesicle+position+and+meiotic+maturation+in+mouse+oocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Germinal vesicle position and meiotic maturation in mouse oocyte.</a> Reproduction. 133 (6), 1069-1072 (2007).</li>
<li>Levi, M., Ghetler, Y., Shulman, A., Shalgi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+and+molecular+markers+are+correlated+with+maturation-competence+of+human+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Reprod%22%5BJournal%5D)">Morphological and molecular markers are correlated with maturation-competence of human oocytes.</a> Hum Reprod. 28 (9), 2482-2489 (2013).</li>
<li>Almonacid, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+diffusion+positions+the+nucleus+in+mouse+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Active diffusion positions the nucleus in mouse oocytes.</a> Nat Cell Biol. 17 (4), 470-479 (2015).</li>
<li>Almonacid, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+fluctuations+of+the+nuclear+envelope+shape+the+transcriptional+dynamics+in+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Active fluctuations of the nuclear envelope shape the transcriptional dynamics in oocytes.</a> Dev Cell. 51 (2), 145-157 (2019).</li>
<li>Al Jord, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+forces+functionally+reorganize+nuclear+condensates+in+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic forces functionally reorganize nuclear condensates in oocytes.</a> Nat Commun. 13 (1), 5070(2022).</li>
<li>Shin, Y., Brangwynne, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid+phase+condensation+in+cell+physiology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Liquid phase condensation in cell physiology and disease.</a> Science. 357 (6357), eaaf4382(2017).</li>
<li>Banani, S. F., Lee, H. O., Hyman, A. A., Rosen, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomolecular+condensates%3A+organizers+of+cellular+biochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev.+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Biomolecular condensates: organizers of cellular biochemistry.</a> Nat Rev. Mol Cell Biol. 18 (5), 285-298 (2017).</li>
<li>Lyon, A. S., Peeples, W. B., Rosen, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+framework+for+understanding+the+functions+of+biomolecular+condensates+across+scales%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev.+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A framework for understanding the functions of biomolecular condensates across scales.</a> Nat Rev. Mol Cell Biol. 22 (3), 215-235 (2021).</li>
<li>Gordon, J. M., Phizicky, D. V., Neugebauer, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+mechanisms+of+gene+expression+control%3A+pre-mRNA+splicing+as+a+life+or+death+decision%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Nuclear mechanisms of gene expression control: pre-mRNA splicing as a life or death decision.</a> Curr Opin Genet Dev. 67, 67-76 (2021).</li>
<li>Barutcu, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+mapping+of+nuclear+domain-associated+transcripts+reveals+speckles+and+lamina+as+hubs+of+functionally+distinct+retained+introns%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Systematic mapping of nuclear domain-associated transcripts reveals speckles and lamina as hubs of functionally distinct retained introns.</a> Mol Cell. 82 (5), 1035-1052.e9 (2022).</li>
<li>Guo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+stochastic%2C+motor-driven+properties+of+the+cytoplasm+using+force+spectrum+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Probing the stochastic, motor-driven properties of the cytoplasm using force spectrum microscopy.</a> Cell. 158 (4), 822-832 (2014).</li>
<li>Verlhac, M. H., Kubiak, J. Z., Clarke, H. J., Maro, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+and+chromatin+behavior+follow+MAP+kinase+activity+but+not+MPF+activity+during+meiosis+in+mouse+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Microtubule and chromatin behavior follow MAP kinase activity but not MPF activity during meiosis in mouse oocytes.</a> Development. 120 (4), 1017-1025 (1994).</li>
<li>Reis, A., Chang, H. Y., Levasseur, M., Jones, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((APCcdh1+activity+in+mouse+oocytes+prevents+entry+into+the+first+meiotic+division%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">APCcdh1 activity in mouse oocytes prevents entry into the first meiotic division.</a> Nat Cell Biol. 8 (5), 539-540 (2006).</li>
<li>El-Hayek, S., Clarke, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+oocyte+growth+and+development+by+intercellular+communication+within+the+follicular+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Results+Probl+Cell+Differ%22%5BJournal%5D)">Control of oocyte growth and development by intercellular communication within the follicular niche.</a> Results Probl Cell Differ. 58, 191-224 (2016).</li>
<li>Dumont, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+centriole-+and+RanGTP-independent+spindle+assembly+pathway+in+meiosis+I+of+vertebrate+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A centriole- and RanGTP-independent spindle assembly pathway in meiosis I of vertebrate oocytes.</a> J Cell Biol. 176 (3), 295-305 (2007).</li>
<li>Kaláb, P., Pralle, A., Isacoff, E. Y., Heald, R., Weis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+a+RanGTP-regulated+gradient+in+mitotic+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Analysis of a RanGTP-regulated gradient in mitotic somatic cells.</a> Nature. 440 (7084), 697-701 (2006).</li>
<li>Lafontaine, D. L. J., Riback, J. A., Bascetin, R., Brangwynne, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nucleolus+as+a+multiphase+liquid+condensate%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev.+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The nucleolus as a multiphase liquid condensate.</a> Nat Rev. Mol Cell Biol. 22 (3), 165-182 (2021).</li>
<li>Terret, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DOC1R%3A+a+MAP+kinase+substrate+that+control+microtubule+organization+of+metaphase+II+mouse+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">DOC1R: a MAP kinase substrate that control microtubule organization of metaphase II mouse oocytes.</a> Development. 130 (21), 5169-5177 (2003).</li>
<li>Dumont, J., Verlhac, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+FRET+to+study+RanGTP+gradients+in+live+mouse+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Using FRET to study RanGTP gradients in live mouse oocytes.</a> Methods Mol Biol. 957, 107-120 (2013).</li>
<li>McSwiggen, D. T., Mir, M., Darzacq, X., Tjian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+phase+separation+in+live+cells%3A+diagnosis%2C+caveats%2C+and+functional+consequences%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Develop%22%5BJournal%5D)">Evaluating phase separation in live cells: diagnosis, caveats, and functional consequences.</a> Gene Develop. 33 (23-24), 1619-1634 (2019).</li>
<li>OOCytes. , https://github.com/Carreau/OOCytes (2014).</li>
<li>Thévenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+transactions+on+image+processing%22%5BJournal%5D)">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE transactions on image processing. 7 (1), 27-41 (1998).</li>
<li>ImageJ. , https://imagej.github.io/update-sites/big-epfl (2023).</li>
<li>Hebert, B., Costantino, S., Wiseman, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+image+correlation+spectroscopy+%28STICS%29+theory%2C+verification%2C+and+application+to+protein+velocity+mapping+in+living+CHO+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal image correlation spectroscopy (STICS) theory, verification, and application to protein velocity mapping in living CHO cells.</a> Biophys J. 88 (5), 3601-3614 (2005).</li>
<li>Yi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+maintenance+of+asymmetric+meiotic+spindle+position+through+Arp2%2F3-complex-driven+cytoplasmic+streaming+in+mouse+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Dynamic maintenance of asymmetric meiotic spindle position through Arp2/3-complex-driven cytoplasmic streaming in mouse oocytes.</a> Nat Cell Biol. 13 (10), 1252-1258 (2011).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9, 676-682 (2012).</li>
<li>Stowers ImageJ Plugins. , https://research.stowers.org/imagejplugins/ (2023).</li>
<li>Luisier, F., Vonesch, C., Blu, T., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+interscale+wavelet+denoising+of+Poisson-corrupted+images%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Process%22%5BJournal%5D)">Fast interscale wavelet denoising of Poisson-corrupted images.</a> Signal Process. 90 (2), 415-427 (2010).</li>
<li>Ovocyte_Nucleus. , https://github.com/orion-cirb/Ovocyte_Nucleus (2023).</li>
<li>Letort, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLetort%2C+G+%22gletort%2FImageJFiles%3A+GLijplugs_v0.2.0%22">gletort/ImageJFiles: GLijplugs_v0.2.0</a>. , doi: 10.5281/zenodo.6854802 (2022).</li>
<li>ImageJFiles. , https://github.com/gletort/ImageJFiles/tree/master/radioak (2023).</li>
<li>Chu, F. Y., Haley, S. C., Zidovska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+origin+of+shape+fluctuations+of+the+cell+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">On the origin of shape fluctuations of the cell nucleus.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (39), 10338-10343 (2017).</li>
<li>Caragine, C. M., Haley, S. C., Zidovska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+fluctuations+and+coalescence+of+nucleolar+droplets+in+the+human+cell+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Rev+Lett%22%5BJournal%5D)">Surface fluctuations and coalescence of nucleolar droplets in the human cell nucleus.</a> Phys Rev Lett. 121 (14), 148101(2018).</li>
<li>Introini, V., Kidiyoor, G. R., Porcella, G., Cicuta, P., Cosentino Lagomarsino, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centripetal+nuclear+shape+fluctuations+associate+with+chromatin+condensation+in+early+prophase%5BTitle%5D)+AND+%22Commun+Biol%22%5BJournal%5D)">Centripetal nuclear shape fluctuations associate with chromatin condensation in early prophase.</a> Commun Biol. 6 (1), 1-11 (2023).</li>
<li>Boija, A., Klein, I. A., Young, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomolecular+condensates+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Biomolecular condensates and cancer.</a> Cancer Cell. 39 (2), 174-192 (2021).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Kluczowe kroki w tym protokole obejmują prawidłową mikroiniekcję oocytów bez wpływu na ich przeżycie lub normalne funkcjonowanie 9,10,11, a także mikroiniekcję predefiniowanych ilości cRNA, które umożliwiłyby prawidłową wizualizację odpowiednich struktur, takich jak plamki jądrowe.
Ustalenie związku między dynamiką cytoplazmatyczną i (wewnątrz)jądrową jest niezbędne podczas badania, w jaki sposób cytoszkielet porusza jądro lub jego wnętrze. Protokół ten, z niewielkimi modyfikacjami, pozwala na to poprzez korelację intensywności mieszania cytoplazmatycznego z dynamiką kropel jądrowych YFP-Rango lub SRSF2-GFP (jak w11). Aby kontynuować, oocyty powinny być najpierw filmowane przez 120 s w trybie jasnego pola, aby uchwycić mieszanie cytoplazmatyczne, a następnie natychmiast filmowane przez 120 s laserem o długości fali 491 nm w celu uchwycenia konturu jądra lub dynamiki kropel. W przypadku kropel jądrowych SRSF2-GFP korelację można po prostu ocenić, porównując ich efektywne współczynniki dyfuzji (patrz krok 7 w niniejszym protokole) z odwróconymi maksymalnymi wartościami intensywności mieszania cytoplazmatycznego uzyskanymi za pomocą analiz korelacji obrazu (patrz krok 4 w niniejszym protokole). Kolejną ważną kwestią jest wielkość kondensatów wybieranych do analiz fluktuacji powierzchni kropel. Krople o podobnej średnicy powinny być wybierane do analiz porównawczych, aby zapobiec odchyleniu, ponieważ rozmiar moduluje intensywność fluktuacji powierzchni.
Istnieją pewne ograniczenia dotyczące tego protokołu. Analizy fluktuacji konturów jądrowych opierają się na pełnym barwieniu wewnątrzjądrowym, takim jak YFP-Rango lub NLS-GFP. W przypadku analiz plamek jądrowych, mikroiniekcja nadmiernych ilości cRNA SRSF2-GFP może prowadzić do pozornych zmian we właściwościach separacji faz tego markera kondensatu (Figura 3C), jak wcześniej analizowane przez innych26. Sprawdzenie, czy profile ekspresji białek egzogennych są porównywalne z endogennymi, ma zatem kluczowe znaczenie. Ponadto stosunkowo małe kropelki (promień <2 μm) powinny być wyłączone z procesów analizy fluktuacji powierzchni ze względu na ograniczenia rozdzielczości przestrzennej za pomocą zdefiniowanych tutaj narzędzi. Ten problem rozdzielczości można zwykle rozwiązać za pomocą bardziej rozdzielczych mikroskopów, które na przykład mogą być niezbędne do zbadania fluktuacji powierzchni mniejszych kondensatów w jądrze oocytu lub w znacznie mniejszym jądrze komórek somatycznych.
Ogólnie rzecz biorąc, protokół ten umożliwia wychwytywanie mieszania jądra oocytu myszy za pomocą aktyny i cytoszkieletu mikrotubul w różnych skalach. W szczególności umożliwia dokumentowanie mobilizacji cytoplazmy opartej na cytoszkielecie, fluktuacji konturów jądrowych, wraz z podobnymi do cieczy przemieszczeniami plamek jądrowych i fluktuacjami powierzchni. Chociaż niektóre badania nad innymi typami komórek zajmują się niektórymi z tych kwestii 38,39,40 za pomocą odrębnych protokołów o różnej złożoności w indywidualnych skalach przestrzennych, ten prosty protokół zapewnia narzędzia niezbędne do rozwiązania wspomnianej dynamiki komórkowej w wielu skalach w jednym potoku roboczym po raz pierwszy. Co więcej, dane uzyskane w wyniku tego podejścia, uzupełnione o modelowanie biofizyczne, jak w10,11, umożliwiają minimalnie inwazyjną ocenę: i) zmian w mechanice jądrowej10; ii) przenoszenie sił czynnych opartych na cytoszkielecie w cytoplazmie do kondensatów w jądrze11; oraz iii) rozpraszanie tej aktywnej energii przez różne przedziały komórkowe 10,11. Co ważne, protokół ten jest wszechstronny, ponieważ można go dostosować nie tylko do innych kondensatów jądrowych, takich jak jąderko23, ale także do innych typów komórek, takich jak komórki rakowe, w których udokumentowano zmiany zarówno w zachowaniu cytoszkieletu, jak i kondensatu jądrowego 17,41.

Pozycjonowanie jądrowe jest niezbędne dla wielu funkcji komórkowych i rozwojowych1,2,3,4,5. Samice komórek rozrodczych ssaków zwane oocytami przebudowują swoją cytoplazmę, aby umieścić jądro w środku komórki, pomimo przejścia asymetrycznego podziału wielkości, który opiera się na późniejszym przesunięciu chromosomu poza centrum6 (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). To wyśrodkowanie jądra przewiduje pomyślny rozwój oocytów u myszy i ludzi7, 8, a tym samym ich potencjał embriogenny (<silna klasa="xfig">Rysunek 1).
Przebudowa cytoplazmatyczna w oocytach myszy jest napędzana głównie przez cytoszkielet aktomiozyny9 (<silna klasa="xfig">Rysunek 2). Jego aktywność generuje siły mechaniczne, które poruszają, przemieszczają i przenikają do jądra10 (Rysunek 2). W związku z tym ta transmisja siły cytoplazmatycznej do nukleoplazmy dostraja dynamikę organelli przetwarzających RNA przekaźnika jądrowego zwanych plamkami jądrowymi11, jeden z kilku bezbłonowych organelli w jądrze znanych jako kondensaty biomolekularne12,13,14,15,16 (Rysunek 2).
Obrazowanie na żywo miało decydujące znaczenie w rozszyfrowaniu funkcjonalnych implikacji mieszania jądrowego. Filmy przedstawiające wielogodzinną migrację jądrową, a także filmy o wysokiej rozdzielczości czasowej siatki aktynowej i cytoplazmy masowej, w dużej mierze przyczyniły się do opracowania teoretycznego modelu pozycjonowania jądra atomowego, łączącego różne skale czasowe9. Również filmy o wysokiej rozdzielczości czasowej cytoplazmy, zarysu jądra i składników jądrowych, takich jak chromatyna i kondensaty jądrowe, podkreśliły rolę mieszania jądra za pomocą cytoszkieletu w przetwarzaniu RNA i ekspresji genów w oocytach myszy, łącząc różne skale czasoprzestrzenne w komórce10,11. Podsumowując, takie podejście oparte na krzyżowaniu skal oparte na obrazowaniu w czasie rzeczywistym dostarczyło pierwszego uzasadnienia łączącego pobudzenie cytoszkieletu jądra z sukcesem rozwojowym oocytów.
Protokół dostarcza potok obrazowania i analizy obrazów używany do badania transmisji sił cytoplazmatycznych (generowanych głównie przez F-aktynę, a częściowo przez mikrotubule) do jądra i jego wewnętrznych składników w oocytach myszy. Wynikiem tych eksperymentów jest uchwycenie kontinuum sił w różnych skalach przestrzennych, od cytoszkieletu w cytoplazmie do wnętrza jądra za pomocą filmów o wysokiej rozdzielczości czasowej, jak pokazano w dwóch ostatnich badaniach10,11, które ustaliły związek między aktywnymi ruchami cytoplazmatycznymi, fluktuacjami konturu jądrowego, a także ruchami i fluktuacjami powierzchni jednego typu jądrowych kondensatów biomolekularnych: plamki jądrowe. To samo podejście można zastosować do innych systemów modelowych, w których oczekuje się, że siły cytoplazmatyczne ulegną zmianie, na przykład w kontekście złośliwych komórek nowotworowych17.

<table><tbody><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>A3311</td><td></td></tr><tr><td>CSU-X1-M1 Mikroskop DMI6000B z wirującym dyskiem</td><td>Yokogawa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Mikrowtryskiwacz Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Femtojet</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fidżi</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Koło filtrów</td><td>Sutter Instruments Roper Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluorodish</td><td>World Precision Instruments</td><td>FD35-100</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie Metamorph&nbsp;</td><td>Obrazowanie uniwersalne,&nbsp;</td><td></td><td>wersja 7.7.9.0</td></tr><tr><td>Olej mineralny</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8410-1L</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000&nbsp;</td><td>Myszy Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OF1 i C57BL/6&nbsp;</td><td>Charles River Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Poly(A) Zestaw do usuwania odpadów&nbsp;</td><td>Kamera CCD Thermo Fisher</td><td>AM1350</td><td></td></tr><tr><td>Retiga 3&nbsp;</td><td>Zestaw QImaging</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNAeasy&nbsp;</td><td>Przeciwciało Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>SC35</td><td>Abcam</td><td>ab11826</td><td>Przeciwciało w postaci plamki jądrowej; mysi anty-SRSF2/SC35 (1:400)</td></tr><tr><td>Plazmid SRSF2-GFP&nbsp;</td><td>&nbsp; OriGene Technologies</td><td>MG202528</td><td></td></tr><tr><td>NM_011358 mikropipeta do strippera</td><td>&nbsp; XLAB Solutions</td><td></td><td>specjalizuje się w pobieraniu oocytów</td></tr><tr><td>T3 mMessage mMachine</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM1384&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>T7 mMessage mMachine&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM13344</td><td></td></tr><tr><td>Termostatyczna komora</td><td>Usługa</td><td></td><td></td>obrazowania żywotności</tr><tr><td>Windows Excel</td><td>Windows</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

uchwycenie mieszania jądra oocytu myszy na podstawie cytoszkieletu w różnych skalach przestrzennych

Capturing Cytoskeleton-Based Agitation of the Mouse Oocyte Nucleus Across Spatial Scales

Głównym wyzwaniem w zrozumieniu przyczyn kobiecej niepłodności jest wyjaśnienie mechanizmów rządzących rozwojem żeńskich komórek rozrodczych, zwanych oocytami. Ich rozwój charakteryzuje się wzrostem komórek i późniejszymi podziałami, dwiema krytycznymi fazami, które przygotowują oocyt do fuzji z plemnikiem w celu zainicjowania embriogenezy. Podczas wzrostu oocyty reorganizują swoją cytoplazmę, aby umieścić jądro w środku komórki, co jest zdarzeniem predyktorującym pomyślny rozwój oocytów u myszy i ludzi, a tym samym ich potencjał embriogenny. W oocytach myszy wykazano, że ta reorganizacja cytoplazmatyczna jest napędzana przez cytoszkielet, którego aktywność generuje siły mechaniczne, które poruszają, zmieniają położenie i penetrują jądro. W związku z tym ta transmisja siły cytoplazmatycznej do nukleoplazmatycznej dostraja dynamikę organelli przetwarzających jądrowe RNA, znanych jako kondensaty biomolekularne. Protokół ten zapewnia ramy eksperymentalne do dokumentowania, z wysoką rozdzielczością czasową, wpływu cytoszkieletu na jądro w różnych skalach przestrzennych w oocytach myszy. Szczegółowo opisano w nim etapy i narzędzia do obrazowania i analizy obrazu niezbędne do oceny i) aktywności cytoszkieletu w cytoplazmie oocytów, ii) mieszania jądra oocytu przez cytoszkielet oraz iii) jego wpływu na dynamikę kondensatu biomolekularnego w nukleoplazmie oocytu. Poza biologią oocytów, opracowane tutaj metody można zaadaptować do stosowania w komórkach somatycznych, aby w podobny sposób zająć się dostrajaniem dynamiki jądrowej w różnych skalach za pomocą cytoszkieletu.

Panele obrazów na Rysunku 3 przedstawiają przykłady typowego, w pełni wykształconego oocyta (Rysunek 3A), nukleoplazmę w w pełni wykształconym oocycie wykazującym ekspresję YFP-Rango (Rysunek 3B), nukleoplazmę w w pełni wykształconym oocycie wykazującym ekspresję prawidłowej (lewy panel; Rysunek 3C) lub nadmiernej (prawy panel; Rysunek 3C) dawki cRNA SRSF2-GFP oraz immunobarwienie plamek jądrowych w w pełni wykształconym oocycie z użyciem przeciwciała SC35 (Rysunek 3D). Prawidłowa dawka cRNA SRSF2-GFP do mikroiniekcji została określona na podstawie porównań wizualnych profili ekspresji SRSF2-GFP z endogennymi profilami plamek jądrowych.
Siły mieszania cytoplazmy w oocytach, wykazane w poprzednich pracach laboratorium z wykorzystaniem map wektorowych STICS i analizy korelacji obrazów (patrz 9 oraz 11), mogą być zmniejszone przez zaburzenia cytoszkieletu, zarówno genetyczne (np. mysz z mutacją FMN2), jak i chemiczne (np. cytochalazyna D). Mapy STICS oocytów kontrolnych wykazują liczne wektory, których kolory wskazują na wysokie prędkości przepływu, natomiast mapy oocytów z zaburzonymi siłami cytoszkieletu wykazują mniej wektorów, a kolory wskazują na niskie prędkości przepływu. Podobnie, korelacja obrazu zanika znacznie szybciej w oocytach kontrolnych w porównaniu do oocytów z zaburzonymi siłami cytoszkieletu. Jest to widoczne na krzywych korelacji, gdzie w przypadku oocytów kontrolnych następuje szybszy spadek krzywej w porównaniu do oocytów z zaburzonymi siłami cytoszkieletu9 lub szybszy wzrost w przypadku odwrócenia krzywej11.
Siły cytoszkieletowe pobudzają jądro oraz znajdujące się w jego wnętrzu organelle, w szczególności kondensaty jądrowe, takie jak plamki jądrowe10,11. Na Rysunku 4A jądro oocytów kontrolnych podlega istotnym fluktuacjom peryferyjnym, co jest widoczne dzięki zastosowaniu sondy jądrowej YFP-Rango. Kształt jądra w oocytach z zaburzonymi siłami cytoszkieletowymi pozostaje stabilny w czasie (Rysunek 4C). Analiza fluktuacji obrysu jądra jest kluczowa dla precyzyjnego ilościowego określenia stopnia pobudzenia. Poprzez wyznaczenie wariancji odległości od centroidu jądra do jego peryferii, (r-R)2 (Rysunek 4B), można było skwantyfikować fluktuacje, wykazując, że pobudzenie jądra w oocytach kontrolnych jest 6 razy wyższe niż w oocytach z zaburzonymi siłami cytoszkieletowymi10. Na Rysunku 5A-B przedstawiono plamki jądrowe (kropelki SRSF2-GFP+) w warunkach kontrolnych oraz przy zaburzonych siłach cytoplazmatycznych z wysoką rozdzielczością czasową. W próbkach kontrolnych powierzchnia kropli fluktuuje znacznie bardziej niż powierzchnie kropli w oocytach z zaburzonymi siłami cytoplazmatycznymi, co można zwizualizować i skwantyfikować za pomocą wtyczki Radioak32. Wizualnie kolory zielony i czerwony (wynik działania wtyczki Radioak widoczny na dolnych obrazach na Rysunku 5A-B) wskazują kąty, w których wtyczka wykryła zmiany powierzchni między kolejnymi obrazami, natomiast kolor biały wskazuje brak zmian powierzchni.
<img alt="Schemat etapów rozwoju oocytu; przedstawia etapy wzrostu, podziału, zapłodnienia i embriogenezy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65976/65976fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Ilustracja późnej oogenezy i wczesnej embriogenezy u myszy. Ilustracja centrowania jądra zachodzącego w późnej fazie wzrostu oocytu, przesunięcia chromosomów z centrum zachodzącego podczas podziału oocytu oraz wczesnych etapów (stadia 1-komórkowe i 2-komórkowe) embriogenezy. Genomy żeńskie (jądro oocytu i pronukleus żeński) są zaznaczone na różowo, pronukleus męski na niebiesko. Jądra embrionowe (po fuzji genomów rodzicielskich) są fioletowe. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65976/65976fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat rozwoju oocytu; reorganizacja cytoszkieletu; splicing pre-mRNA; kataliza enzymatyczna." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65976/65976fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Ilustracja przebudowy cytoplazmatycznej i jądrowej w różnych skalach w rosnących oocytach myszy. Rysunek ten podsumowuje kluczowe wyniki z9,10,11. Ilustracja przebudowy cytoplazmy opartej na akto-miozynie, agitacji jądrowej oraz funkcjonalnej przebudowy biomolekularnych kondensatów jądrowych w różnych skalach czasoprzestrzennych. Przebudowa plamek jądrowych w różnych skalach nasila reakcje biomolekularne związane z ich funkcją (tj. splicing pre-mRNA). Należy pamiętać, że protokół ten umożliwia ocenę agitacji jądrowej jedynie w skalach przestrzennych, a nie czasowych, ponieważ wszystkie obrazy są rejestrowane z tą samą rozdzielczością czasową 0,5 s pomiędzy klatkami obrazu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65976/65976fig02large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza chromatyny oocytu; obrazy fluorescencyjne pokazujące barwienie chromatyny, efekty cRNA i przeciwciała SC35." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65976/65976fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Przykładowe obrazy w pełni wykształconego oocytu oraz nukleoplazmy. (A) Obraz w polu jasnym w pełni wykształconego oocytu ukazujący chromatynę (kolor cyjan), która otacza jąderko. Biała przerywana linia obrysowuje jądro. (B) Jądro żywego oocytu wykazujące ekspresję YFP-Rango; zwróć uwagę na brak fluorescencji w jąderku. (C) Przykład jądra żywego oocytu wykazującego ekspresję SRSF2-GFP po mikroiniekcji prawidłowych dawek cRNA (panel lewy) lub wysokich dawek cRNA (panel prawy); zwróć uwagę na fazy skondensowane (kropelkowe) i rozpuszczone po lewej stronie oraz ich brak w warunkach po prawej. (D) Immunobarwienie plamek jądrowych w utrwalonym oocycie; zwróć uwagę na endogenny profil ekspresji, który jest porównywalny do profilu w C (panel lewy). Paski skali = 5 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65976/65976fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza fluktuacji obrysu jądra, obrazy mikroskopowe, schemat dynamiki rotacyjnej, YFP-Rango, maska binarna." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65976/65976fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Wyniki z wtyczki dla fluktuacji obrysu jądra w grupie kontrolnej i grupie z zaburzonym obrysem. (A) Time-lapse jądra oocyta kontrolnego wykazującego ekspresję YFP-Rango (góra) oraz odpowiadająca mu maska binarna wygenerowana przez wtyczkę Ovocyte_nucleus (dół). (B) Zasada pomiarów fluktuacji obrysu jądra w czasie i w określonym kierunku. Kierunki definiowane są przez kąt obrotowy θ z przyrostami 1° od 0° do 360°. Przedstawiono dwa reprezentatywne kształty w t=0 s (żółty) i t=135 s (fioletowy). Kształt niebieski odpowiada średniemu kształtowi w czasie. (C) Fluktuacje obrysu jądra w oocycie z obniżonymi siłami cytoszkieletowymi w wyniku zaburzenia zarówno aktyny F (mysz z mutacją FMN2), jak i mikrotubul (leczenie Nocodazolem; jak w10). Paski skali = 5 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65976/65976fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza fluktuacji powierzchni kropli SRSF2-GFP; kontrola vs. zaburzona; schemat z maską binarną; wyniki wtyczki." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65976/65976fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Wyniki wtyczki dla fluktuacji powierzchni kropli kontrolnych i zaburzonych. (A) Wycinek jądrowej kropli SRSF2-GFP z grupy kontrolnej, obrazowanej z czasem 500 ms na klatkę i przedstawionej w tablicy kolorów (LUT) Ice Look Up Table (góra); maska binarna tej samej kropli wygenerowana przez program Fiji (środek); oraz wyniki wtyczki Radioak po analizie fluktuacji powierzchni kropli (dół), gdzie kolor zielony i czerwony wskazują kąty, w których wtyczka wykryła zmiany powierzchni między kolejnymi obrazami, a kolor biały wskazuje brak zmian powierzchni. (B) Fluktuacje powierzchni kropli jądrowej w oocytach z obniżonymi siłami cytoszkieletowymi z powodu zaburzenia zarówno F-aktyny, jak i mikrotubul (jak w11). Paski skali = 5 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65976/65976fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Tabela uzupełniająca 1: Przykład wyniku analizy z wtyczki Ovocyte_nucleus. Ten sam jądro komórkowe, które zostało przeanalizowane i pokazane na Rysunku 4A. Theta (θ) to kąt w stopniach, a t1 do t600 odpowiadają numerowi klatki, który można przeliczyć na czas. Promienie podano w µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65976/Table%201_Ovocyte_nucleus%20output%20example.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Tabela uzupełniająca 2: Przykładowy arkusz kalkulacyjny użyty do obliczania fluktuacji obrysu jądra. Analizowano to samo jądro, które przedstawiono na Ryc. 4A. Theta (θ) to kąt w stopniach, a t1 do t600 odpowiadają numerom klatek, które można przeliczyć na czas. Zakładka Raw and average: promienie podano w µm. Zakładka r-R: odległości r-R podano w µm. Tabela (r-R)2: wartości fluktuacji podano w µm2. Zakładki x i y odpowiadają współrzędnym kartezjańskim promieni z zakładki Raw and average. Pozwalają one na narysowanie średniego kształtu jądra w czasie w zakładce mean shape. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65976/Table%202_Nuclear%20outline%20fluctuations%20analysis%20example_RE.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Tabela uzupełniająca 3: Przykład wyniku analizy z wtyczki Radioak. Ta sama kropla, co ta przedstawiona na Rysunku 5A. Przedstawiono zmierzone promienie w różnych punktach czasowych i pod różnymi kątami. Promienie podano w µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65976/Table%203_%20Radioak%20output%20example.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Tabela uzupełniająca 4: Przykładowy arkusz kalkulacyjny użyty do obliczenia fluktuacji powierzchni kropel jądrowych.Ta sama kropla, która została przeanalizowana jak ta pokazana na Rysunku 5A. Theta (θ) to kąt w stopniach, a t1 do t600 odpowiadają numerowi klatki, który można przeliczyć na czas. Zakładka Raw i average: Promienie podano w µm. Zakładka r-R: Odległości r-R podano w µm. Tabela (r-R)2: Wartości fluktuacji podano w µm2. Zakładki x i y odpowiadają współrzędnym kartezjańskim promieni z zakładek Raw i average. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65976/Table%204_Droplet%20fluctuations%20analysis%20example_RE.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Ten protokół dostarcza eksperymentalnych ram do dokumentowania fizycznego wpływu cytoszkieletu na kształt jądra i wewnętrzne organelle pozbawione błony w układzie oocytów myszy. Struktura może być dostosowana do użycia w innych typach komórek i kontekstach.

Uchwycenie mieszania jądra oocytu myszy na podstawie cytoszkieletu w różnych skalach przestrzennych

A major challenge in understanding the causes of female infertility is to elucidate mechanisms governing the development of female germ cells, named ...

Laboratorium ma na celu lepsze zrozumienie mechanizmów związanych z pozyskiwaniem ilości gamet żeńskich, które są niezbędne do rozmnażania gatunków płciowych przy użyciu systemu modelowego oocytów myszy. Niedawno zidentyfikowaliśmy nowy proces transdukcji mechanicznej, który sprzyja mieszaniu jądra i jego zawartości, prowadząc do precyzyjnej regulacji matczynego RNA w oocytach myszy. Procedura obrazowania i analizy obrazu przedstawiona w tym protokole pozwala nam podkreślić transmisję sił cytoszkieletu jako kontinuum w różnych skalach od cytoplazmy do jądra i jego składników, w tym jądrowych ciał przetwarzających RNA w oocytach myszy.Protokół ten zapewnia proste narzędzia, które po raz pierwszy pozwalają nam zająć się pierwszą transmisją w wielu skalach komórkowych w jednym potoku. Protokół ten, uzupełniony modelowaniem biofizycznym, stanowi nieinwazyjną technikę rozwiązywania problemów związanych ze zmianami w mechanice jądrowej i rozpraszaniem energii w przedziałach komórkowych. Zacznij od ułożenia wszystkich materiałów potrzebnych do eksperymentu na platformie roboczej.Po pobraniu jajników od myszy umieść je we wstępnie podgrzanym pożywce albuminowej M2 + surowicy bydlęcej uzupełnionej jednym mikromolowym milrynonem. Nakłuć pęcherzyki jajnikowe igłami chirurgicznymi, aby uwolnić rosnące oocyty z pęcherzyków antralnych. Za pomocą mikropipety zbierz oocyty o wielkości potrzebnej do eksperymentów, a następnie przenieś oocyty do naczynia ze świeżą pożywką.Przenieś oocyty z kropli do kropli za pomocą mikropipety. Pozwala to na mechaniczną dysocjację oocytów od antralnych komórek pęcherzykowych. Ustabilizuj oocyt na godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Odwirować powłokę podwielokrotności cRNA dla YFP-Rango i SSF2 GFP. Za pomocą mikroiniektora wstrzyknąć cRNA do cytoplazmy oocytów w ciepłym pożywce M2 + albumina surowicy bydlęcej, uzupełnionej milrynonem. Inkubuj oocyty przez dwie godziny w pożywce hodowlanej w temperaturze 37 stopni Celsjusza w celu translacji cRNA.Następnie umieść oocyty w kropelkach pożywki hodowlanej na 35-milimetrowym naczyniu do hodowli tkankowej z pokrywą szklanej dolnej komory pokrytej olejem mineralnym. Aby rozpocząć, włącz oprogramowanie do obrazowania. Otwórz okno Acquire, ustaw Czas ekspozycji na 500 milisekund, Camera Area (Obszar kamery) na Full Chip (Pełny układ) i Binning (Binning) na 1.Następnie ustaw oświetlenie dla żądanego kanału. Do mieszania cytoplazmatycznego użyj światła przechodzącego, aby skupić się na jąderku oocytu. W przypadku eksperymentów z plamkami jądrowymi skup się na kropelkach SRSF2 GFP.Aby zoptymalizować szybkość akwizycji na karcie Specjalne, ustaw opcję Camera Shutter (Migawka aparatu) na Open for Exposure (Otwarcie) dla Exposure (Ekspozycja) i Clear Mode (Tryb czyszczenia) na CLEAR PRE SEQUENCE (WYCZYŚĆ SEKWENCJĘ WSTĘPNĄ). Następnie otwórz okno Pobieranie strumienia. Na karcie Nabyte ustaw Tryb akwizycji na Strumieniowe przesyłanie do pamięci RAM i liczbę klatek na 480.Ustaw Parametry aparatu na Rejestruj obrazy z szybkością klatek, a Liczba klatek do przeskoczenia na 0. Na karcie Digital Camera Controller Parameters (Parametry kontrolera aparatu cyfrowego) ustaw Camera State (Stan aparatu) na HALT (ZATRZYMANIE), Shutter Mode (Tryb migawki) na OPEN NEVER (OTWÓRZ NIGDY), Clear Mode (Tryb czyszczenia) na CLEAR PRE SEQUENCE (WYCZYŚĆ SEKWENCJĘ WSTĘPNĄ), a Number of frame (Liczba klatek) na average (Liczba klatek) na average (Liczba klatek) na 1. Następnie dopasuj obszar zainteresowania wokół obiektu.W oknie Pobieranie strumienia kliknij przycisk Pobierz, aby uruchomić film. Po pobraniu zapisz film jako plik tiff. Aby przeprowadzić analizę obrazu, otwórz obraz J lub Fidżi.We wtyczkach kliknij CIRB i otwórz menu Verlhac, a następnie wybierz Kształt jądra oocytów. W oknie dialogowym wybierz folder zawierający filmy do analizy. Następnie wybierz kąt Theta i marginesy do przycięcia.Teraz wybierz kalibrację XY i interwał czasowy. Następnie kliknij OK.To wykreślić średni kształt w czasie, w arkuszu kalkulacyjnym oblicz średni promień R nad wszystkimi punktami czasowymi T dla każdego zdefiniowanego kąta theta. Dla każdego T i theta odejmij średni promień R w czasie od promienia małego r.Na koniec oblicz średnią fluktuacji dla wszystkich punktów czasowych T i wszystkich kątów theta dla każdego jądra i wszystkich jąder z jednego warunku. W kontrolnych oocytach jądro wykazywało znaczne fluktuacje obwodowe, co zostało uwidocznione za pomocą sondy jądrowej YFP-Rango. Natomiast jądro w oocytach z zaburzonymi siłami cytoszkieletu pozostaje stabilne w czasie.Zmienność odległości od środka ciężkości jądra do jego obrzeża ujawniła sześciokrotny wzrost oocytów kontrolnych w porównaniu z tymi, w których siły cytoszkieletu były zaburzone. Plamki jądrowe w kontrolnych oocytach wykazywały większe fluktuacje powierzchni kropel w porównaniu z zakłóconymi siłami cytoplazmatycznymi.

capturing-cytoskeleton-based-agitation-mouse-oocyte-nucleus-across

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Oocyty są podatne na aneuploidię z powodu błędów w segregacji chromosomów podczas dojrzewania meiotycznego. Aneuploidne komórki jajowe mogą prowadzić do niepłodności, poronień lub zaburzeń rozwojowych, takich jak zespół Downa. W niniejszej pracy opisujemy metody wprowadzania wybranych materiałów do oocytów oraz metody badania dojrzewania meiotycznego i oceny ploidii.

Mikroiniekcja, dojrzewanie i ocena ploidii oocytów mysich

Tutaj prezentujemy protokół specyficznego zubożenia mRNA za pośrednictwem siRNA, a następnie analizę immunofluorescencyjną w celu oceny montażu i organizacji wrzeciona mejotycznego w oocytach myszy. Protokół ten jest odpowiedni do in vitro zubożenia transkryptów i oceny funkcjonalnej różnych czynników wrzecionowych i/lub MTOC w oocytach.

Ocena wrzeciona mejotycznego w oocytach myszy za pomocą wyciszania za pośrednictwem siRNA

Przedstawiamy protokoły pobierania, przygotowania i obrazowania dojrzałych oocytów Drosophila. Metody te pozwalają na wizualizację zachowania chromosomów oraz składania i funkcji wrzeciona podczas mejozy.

Techniki obrazowania prometafazy i metafazy mejozy I w utrwalonych oocytach Drosophila

Tutaj prezentujemy protokół do nieinwazyjnej oceny kompetencji rozwojowych oocytów przeprowadzanej podczas ich dojrzewania in vitro od pęcherzyka rozrodczego do etapu metafazy II. Metoda ta łączy obrazowanie poklatkowe z prędkością obrazu cząstek (PIV) i analizami sieci neuronowych.

Oparta na sieci neuronowej identyfikacja w pełni rozwiniętych oocytów myszy kompetentnych lub niekompetentnych rozwojowo

W miarę jak warianty genetyczne związane z chorobami ludzkimi zaczynają być odkrywane, coraz ważniejsze staje się opracowanie systemów, za pomocą których można szybko ocenić biologiczne znaczenie tych zidentyfikowanych wariantów. Protokół ten opisuje metody oceny funkcji ludzkich genów podczas mejozy żeńskiej I przy użyciu mysich oocytów.

Wykorzystanie oocytów myszy do oceny funkcji ludzkich genów podczas mejozy I

U Drosophila, jądro oocytu ulega migracji zależnej od mikrotubul podczas oogenezy. W tym miejscu opisujemy protokół, który został opracowany w celu śledzenia migracji poprzez wykonywanie obrazowania na żywo w komorach jajowych ex vivo. Nasza procedura utrzymuje komory jajowe przy życiu przez 12 godzin, aby uzyskać wielopozycyjne filmy poklatkowe 3D za pomocą mikroskopii konfokalnej z wirującym dyskiem.

Migracja jądrowa w oocycie Drosophila

Przedstawiono zoptymalizowany protokół, który umożliwia wyczerpanie cytoplazmatycznych centrów organizowania mikrotubul w oocytach myszy podczas metafazy I za pomocą lasera femtosekundowego bliskiej podczerwieni.

Wielofotonowa ablacja laserowa cytoplazmatycznych centrów organizowania mikrotubul w oocytach myszy

Błąd w segregacji chromosomów jest powszechną cechą oocytów. Dlatego badanie punktu kontrolnego montażu wrzeciona daje ważne wskazówki na temat mechanizmów potrzebnych do produkcji zdrowych jaj. Niniejszy protokół opisuje trzy uzupełniające się testy do oceny integralności punktu kontrolnego montażu wrzeciona w oocytach myszy.

Ocena integralności punktu kontrolnego zespołu wrzeciona w oocytach myszy

Rysunek 1: Ramy end-to-end. Rysunek ilustruje kompleksowe ramy wiedzy multimodalnej Graf VISHAM-KG. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Przygotowanie rozprzestrzeniania chromosomów mejotycznych z oocytów myszy do oceny synapsy i rekombinacji

Ortotopowe modele zwierzęce raka jajnika lepiej odwzorowują przebieg choroby u ludzi, a tym samym zwiększają naszą wiedzę na temat progresji nowotworu i odpowiedzi guza na terapię. W modelu mysim wykonuje się wstrzyknięcie do wnętrza woreczka otrzewnej komórek nowotworu jajnika wykazujących ekspresję lucyferazy. Leczenie podaje się poprzez zgłębnik żołądkowy. Wzrost guza monitoruje się za pomocą systemu obrazowania in vivo.

Obrazowanie in vivo i leczenie terapeutyczne w ortotopowym modelu raka jajnika u myszy

Poznaj dynamikę kształtu jądra w oocytach myszy dzięki zaawansowanym technikom obrazowania cytoszkieletu. Metoda ta pozwala badać mechaniczne siły wpływające na biologię gamet żeńskich.

Uchwycenie mieszania jądra oocytu myszy na podstawie cytoszkieletu w różnych skalach przestrzennych

Przeglądaj więcej filmów