Uchwycenie mieszania jądra oocytu myszy na podstawie cytoszkieletu w różnych skalach przestrzennych
12 stycznia 2024
Ten protokół dostarcza eksperymentalnych ram do dokumentowania fizycznego wpływu cytoszkieletu na kształt jądra i wewnętrzne organelle pozbawione błony w układzie oocytów myszy. Struktura może być dostosowana do użycia w innych typach komórek i kontekstach.
Laboratorium ma na celu lepsze zrozumienie mechanizmów związanych z pozyskiwaniem ilości gamet żeńskich, które są niezbędne do rozmnażania gatunków płciowych przy użyciu systemu modelowego oocytów myszy. Niedawno zidentyfikowaliśmy nowy proces transdukcji mechanicznej, który sprzyja mieszaniu jądra i jego zawartości, prowadząc do precyzyjnej regulacji matczynego RNA w oocytach myszy. Procedura obrazowania i analizy obrazu przedstawiona w tym protokole pozwala nam podkreślić transmisję sił cytoszkieletu jako kontinuum w różnych skalach od cytoplazmy do jądra i jego składników, w tym jądrowych ciał przetwarzających RNA w oocytach myszy.
Protokół ten zapewnia proste narzędzia, które po raz pierwszy pozwalają nam zająć się pierwszą transmisją w wielu skalach komórkowych w jednym potoku. Protokół ten, uzupełniony modelowaniem biofizycznym, stanowi nieinwazyjną technikę rozwiązywania problemów związanych ze zmianami w mechanice jądrowej i rozpraszaniem energii w przedziałach komórkowych. Zacznij od ułożenia wszystkich materiałów potrzebnych do eksperymentu na platformie roboczej.
Po pobraniu jajników od myszy umieść je we wstępnie podgrzanym pożywce albuminowej M2 + surowicy bydlęcej uzupełnionej jednym mikromolowym milrynonem. Nakłuć pęcherzyki jajnikowe igłami chirurgicznymi, aby uwolnić rosnące oocyty z pęcherzyków antralnych. Za pomocą mikropipety zbierz oocyty o wielkości potrzebnej do eksperymentów, a następnie przenieś oocyty do naczynia ze świeżą pożywką.
Przenieś oocyty z kropli do kropli za pomocą mikropipety. Pozwala to na mechaniczną dysocjację oocytów od antralnych komórek pęcherzykowych. Ustabilizuj oocyt na godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza.
Odwirować powłokę podwielokrotności cRNA dla YFP-Rango i SSF2 GFP. Za pomocą mikroiniektora wstrzyknąć cRNA do cytoplazmy oocytów w ciepłym pożywce M2 + albumina surowicy bydlęcej, uzupełnionej milrynonem. Inkubuj oocyty przez dwie godziny w pożywce hodowlanej w temperaturze 37 stopni Celsjusza w celu translacji cRNA.
Następnie umieść oocyty w kropelkach pożywki hodowlanej na 35-milimetrowym naczyniu do hodowli tkankowej z pokrywą szklanej dolnej komory pokrytej olejem mineralnym. Aby rozpocząć, włącz oprogramowanie do obrazowania. Otwórz okno Acquire, ustaw Czas ekspozycji na 500 milisekund, Camera Area (Obszar kamery) na Full Chip (Pełny układ) i Binning (Binning) na 1.
Następnie ustaw oświetlenie dla żądanego kanału. Do mieszania cytoplazmatycznego użyj światła przechodzącego, aby skupić się na jąderku oocytu. W przypadku eksperymentów z plamkami jądrowymi skup się na kropelkach SRSF2 GFP.
Aby zoptymalizować szybkość akwizycji na karcie Specjalne, ustaw opcję Camera Shutter (Migawka aparatu) na Open for Exposure (Otwarcie) dla Exposure (Ekspozycja) i Clear Mode (Tryb czyszczenia) na CLEAR PRE SEQUENCE (WYCZYŚĆ SEKWENCJĘ WSTĘPNĄ). Następnie otwórz okno Pobieranie strumienia. Na karcie Nabyte ustaw Tryb akwizycji na Strumieniowe przesyłanie do pamięci RAM i liczbę klatek na 480.
Ustaw Parametry aparatu na Rejestruj obrazy z szybkością klatek, a Liczba klatek do przeskoczenia na 0. Na karcie Digital Camera Controller Parameters (Parametry kontrolera aparatu cyfrowego) ustaw Camera State (Stan aparatu) na HALT (ZATRZYMANIE), Shutter Mode (Tryb migawki) na OPEN NEVER (OTWÓRZ NIGDY), Clear Mode (Tryb czyszczenia) na CLEAR PRE SEQUENCE (WYCZYŚĆ SEKWENCJĘ WSTĘPNĄ), a Number of frame (Liczba klatek) na average (Liczba klatek) na average (Liczba klatek) na 1. Następnie dopasuj obszar zainteresowania wokół obiektu.
W oknie Pobieranie strumienia kliknij przycisk Pobierz, aby uruchomić film. Po pobraniu zapisz film jako plik tiff. Aby przeprowadzić analizę obrazu, otwórz obraz J lub Fidżi.
We wtyczkach kliknij CIRB i otwórz menu Verlhac, a następnie wybierz Kształt jądra oocytów. W oknie dialogowym wybierz folder zawierający filmy do analizy. Następnie wybierz kąt Theta i marginesy do przycięcia.
Teraz wybierz kalibrację XY i interwał czasowy. Następnie kliknij OK.To wykreślić średni kształt w czasie, w arkuszu kalkulacyjnym oblicz średni promień R nad wszystkimi punktami czasowymi T dla każdego zdefiniowanego kąta theta. Dla każdego T i theta odejmij średni promień R w czasie od promienia małego r.
Na koniec oblicz średnią fluktuacji dla wszystkich punktów czasowych T i wszystkich kątów theta dla każdego jądra i wszystkich jąder z jednego warunku. W kontrolnych oocytach jądro wykazywało znaczne fluktuacje obwodowe, co zostało uwidocznione za pomocą sondy jądrowej YFP-Rango. Natomiast jądro w oocytach z zaburzonymi siłami cytoszkieletu pozostaje stabilne w czasie.
Zmienność odległości od środka ciężkości jądra do jego obrzeża ujawniła sześciokrotny wzrost oocytów kontrolnych w porównaniu z tymi, w których siły cytoszkieletu były zaburzone. Plamki jądrowe w kontrolnych oocytach wykazywały większe fluktuacje powierzchni kropel w porównaniu z zakłóconymi siłami cytoplazmatycznymi.
Przegląd
Niniejsze badanie analizuje siły mechaniczne przekazywane przez cytoškielet do jądra komórkowego w oocytach myszy, co stanowi kluczowy aspekt zrozumienia biologii żeńskich gamet. Poprzez analizę wpływu cytoszkieletu z wykorzystaniem zaawansowanych technik obrazowania, badanie podkreśla dynamikę kształtu jądra oraz organelli wewnętrznych w oocytach.
Kluczowe elementy badania
Obszar badawczy
- Mechanika komórkowa
- Biologia gamet żeńskich
- Architektura jądra komórkowego
Wstęp
- Znaczenie zrozumienia ilości i jakości gamet
- Rola cytoszkieletu w mechanice jądra komórkowego
- Wykorzystanie oocytu mysiego jako systemu modelowego
Zastosowane metody
- Techniki obrazowania i analizy obrazu
- Model oocytów myszy
- Nieinwazyjne metody oceny mechaniki jądra komórkowego
Główne wyniki
- W oocytach kontrolnych zaobserwowano znaczne fluktuacje kształtu jądra, co wskazuje na aktywność cytoszkieletu.
- Zaburzenie sił cytoszkieletowych doprowadziło do zwiększonej stabilności kształtu jądra.
- Wyniki sugerują istnienie związku między dynamiką cytoszkieletu a przetwarzaniem RNA wewnątrz jądra.
Wnioski
- Badanie pokazuje, w jaki sposób siły cytoszkieletowe wpływają na kształt jądra komórkowego oraz dynamikę RNA.
- Wyniki te mogą dostarczyć cennych informacji dla biologii rozrodu oraz badań nad mechaniką komórkową.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Zrozumienie napędzanych przez cytoszkielet drgań jądra w oocytach myszy pozwala na wypełnienie krytycznej luki mechanistycznej w biologii rozrodu i wczesnej kompetencji rozwojowej. Niniejszy protokół umożliwia wysokorozdzielczą kwantyfikację przekazywania sił z cytoplazmy do jądra, co zwiększa pewność prognostyczną w ocenie jakości oocytów. Podejście to oferuje skalowalny model minimalizacji ryzyka mechanistycznego oraz walidacji celów w układach komórkowych istotnych dla portfeli badań nad płodnością i biologią rozwoju.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia badanie przekazywania sił cytoszkieletowych i ich wpływu na dynamikę jądra komórkowego.
- Wspiera mechanistyczne ograniczanie ryzyka poprzez kwantyfikację pobudzenia jądra oraz zachowania kondensatów biomolekularnych.
- Ułatwia funkcjonalną walidację celów dla szlaków regulujących dojrzewanie i jakość oocytów.
Przesiew i opracowywanie testów
- Zapewnia zwalidowany proces obrazowania i analizy do kwantyfikacji aktywności cytoszkieletu oraz odpowiedzi jądrowych.
- Standaryzuje pomiar fluktuacji kształtu jądra oraz dynamiki kondensatów w celu zapewnienia powtarzalności przesiewu.
- Umożliwia uzyskanie wyników ilościowych odpowiednich do porównawczych badań nad wpływem związków lub perturbacjami genetycznymi.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodne z modelami istotnymi dla chorób związanych z kobiecą niepłodnością oraz potencjałem rozwojowym oocytów.
- Wspiera identyfikację biomarkerów translacyjnych poprzez powiązanie mechanicznego wstrząsania z przetwarzaniem RNA jądrowego.
- Ułatwia zachowanie ciągłości procesu od etapu odkryć po walidację przedkliniczną w badaniach nad biologią rozrodu.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z kontinuum od odkryć do badań przedklinicznych, umożliwiając ilościową ocenę oddziaływań cytoplazmatycznych i jądrowych w oocytach oraz w dostosowanych modelach komórek somatycznych.
- Biologia odkrywcza: Ilościowe określanie przekazywania siły i mechaniki jądra komórkowego w celu weryfikacji hipotez i wyjaśnienia szlaków sygnałowych.
- Screening: Dostarcza powtarzalne, ilościowe odczyty pobudzenia jądra i dynamiki kondensatów.
- Analityka: Zapewnia wyniki statystyczne dotyczące wariancji kształtu jądra oraz fluktuacji kondensatów biomolekularnych.
- Badania translacyjne: Łączy parametry pobudzenia mechanicznego z jakością oocytów i biomarkerami rozwojowymi.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Możliwość adaptacji do innych typów komórek w celu szerszych badań mechanistycznych nad oddziaływaniami cytoszkieletu z jądrem.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w ocenie jakości oocytów oraz zrozumienie mechanizmów regulacji jądra komórkowego.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje procesy obrazowania i analizy w celu zapewnienia powtarzalności i skalowalności.
- Wartość strategiczna: Dostarcza informacji niezbędnych do podejmowania decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań w programach dotyczących płodności i biologii rozwoju.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów i modeli w potokach badań nad reprodukcją z uwzględnieniem analizy ryzyka.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna z zakresu zaawansowanego obrazowania, analizy obrazu oraz postępowania z oocytami.
- Wymagany jest dostęp do mikroskopii o wysokiej rozdzielczości oraz kompatybilnego oprogramowania do analizy obrazu (np. Fiji/ImageJ z dedykowanymi wtyczkami).
- Konieczna jest standaryzacja parametrów obrazowania i protokołów analizy pomiędzy zespołami.
- Adaptacja do innych typów komórek może wymagać optymalizacji protokołu pod kątem specyfiki mechaniki danych komórek.
- Nieinwazyjny charakter metody umożliwia wielokrotne pomiary, lecz jest ograniczony do systemów ex vivo lub in vitro.
