In-vivo (in vivo) Obrazowanie wapnia neuronów czuciowych w zwoju trójdzielnym szczura
9 lutego 2024
Genetycznie kodowane wskaźniki wapnia (GECI) umożliwiają solidną analizę na poziomie populacji sygnalizacji neuronów czuciowych. W tym miejscu opracowaliśmy nowatorskie podejście, które pozwala na wizualizację in vivo GECI aktywności neuronów zwojów nerwu trójdzielnego szczurów.
Ogólnym celem naszego laboratorium jest zrozumienie obwodowych mechanizmów bólu. Mój projekt skupia się na bólu związanym z uszkodzeniem nerwu trójdzielnego. Preparat, który dzisiaj pokazuję, pozwala nam scharakteryzować zmiany w kodowaniu sensorycznym i zidentyfikować subpopulacje aferentne przyczyniające się do bólu neuropatycznego.
Wykazaliśmy więc, że istnieją różnice między aferentami trójdzielnymi i somatycznymi w odpowiedzi na uszkodzenie nerwów. W szczególności Nav 1.1 jest preferencyjnie regulowany w górę w nerwie trójdzielnym, co sugeruje, że selektywne blokery dla Nav 1.1 mogą być stosowane do identyfikacji różnych subpopulacji aferentnych, które przyczyniają się do bólu neuropatycznego. Tak więc myszy transgeniczne są obecnie najszerzej stosowane w połączeniu z różnymi strategiami obrazowania i opartymi na omii.
Tłumaczenie danych generowanych u myszy na inne gatunki, jeśli nie ludzi. Myszy są naprawdę małe, trudno je wytresować, a lista różnic między myszami, szczurami i ludźmi rośnie. Tak więc wykorzystanie szczurów może pomóc w rozwiązaniu kilku z tych problemów.
Mechanizmy bólu i potencjalne cele terapeutyczne różnią się w strukturach twarzoczaszki, takich jak te nad szyją oraz inne struktury somatyczne i trzewne, tj. te poniżej szyi. Wyniki uzyskane dzięki temu preparatowi sugerują, że istnieje składnik bólu neuropatycznego, który wcześniej uważano, że odzwierciedla zmiany w ośrodkowym układzie nerwowym, ale w rzeczywistości może również odzwierciedlać zmiany w obwodowym układzie nerwowym.
Na początek użyj 25-mikrolitrowej strzykawki Hamiltona, aby dootrzewnowo wstrzyknąć znieczulonym szczeniętom szczurów 15 mikrolitrów agenu. Następnie zgol włosy i wąsy znieczulonych sześcio- lub ośmiotygodniowych szczeniąt, zamontuj szczura na stereotaktycznej ramie z nausznikami i umieść pod spodem poduszkę grzewczą, aby utrzymać temperaturę ciała zwierzęcia. Następnie umieść gazę zanurzoną w lodowatej soli fizjologicznej na głowie szczura, aby zminimalizować krwawienie.
Za pomocą skalpela w rozmiarze 15 wykonaj nacięcie na linii środkowej skóry i mięśnia nad czaszką. Odciągnij skórę i mięśnie, aby odsłonić czaszkę za pomocą okrągłego wiertła jeden na cztery, ostrożnie przebij nasadkę czaszki, aby odsłonić przodomózgowie. Następnie użyj rongeurs, aby przeciąć czaszkę.
Za pomocą skalpela w rozmiarze 15 wykonaj nacięcie w mózgu i opuszki węchowej. Użyj szpatułki, aby ostrożnie odłączyć oponę twardą od czaszki. Następnie delikatnie podnieś odcięty mózg, aby wyświetlić zwój nerwu trójdzielnego i podstawę czaszki.
Kauteryzuj wszelkie krwawienia za pomocą długopisu do kauteryzacji. Aby zobrazować GCaMP6s, umieść jamę czaszki pod obiektywem mikroskopu. Następnie ustaw ostrość na zwoju końcowym.
Następnie nałóż bodźce mechaniczne na jeden centymetr kwadratowy twarzy. Użyj obiektywu 20x, aby zwizualizować neurony zwoju nerwu trójdzielnego, które reagują na bodziec. Aby zebrać stato fluorescencyjne w czasie za pomocą oprogramowania do akwizycji, naciśnij przycisk akwizycji strumienia w menu akwizycji, a następnie ustaw liczbę klatek na 300 i czas akwizycji na 90 sekund.
Ustaw parametry aparatu, aby rejestrować obrazy z szybkością klatek. Uzyskano stabilne zapisy linii bazowej przez trzy minuty. Większa objętość miana wirusa powodowała zwiększoną infekcję neuronalną młodych szczurów.
Lekka symulacja mechaniczna aktywowała tylko obszar V2 zwoju nerwu trójdzielnego. Fluorescencja spoczynkowa była stosunkowo niska w większości neuronów, z niewielkimi spontanicznymi wzrostami. Naturalne bodźce, w szczególności stymulacja punktowa, wywoływały najsilniejsze reakcje neuronalne.
Bodźce szczotkowe w modelach przewlekłych urazów zwężonych wywołały dwukrotny wzrost wielkości szczytowej odpowiedzi po stronie zranionej w porównaniu ze stroną przeciwległą. Gdy dwa bodźce zostały zastosowane szeregowo, nastąpiło znaczne wzmocnienie w odpowiedzi na drugi bodziec.
Przegląd
W niniejszym badaniu zastosowano nowatorskie podejście do wizualizacji in vivo genetycznie kodowanych wskaźników wapnia (GECI) w celu analizy sygnalizacji neuronów czuciowych w zwojach trójdzielnych szczura. Badania koncentrują się na charakterystyce zmian w kodowaniu sensorycznym oraz subpopulacjach aferentnych w związku z bólem neuropatycznym po uszkodzeniu nerwu trójdzielnego.
Kluczowe komponenty badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia bólu
- Ból neuropatyczny
Wstęp
- Zrozumienie obwodowych mechanizmów bólu jest kluczowe dla opracowania lepszych strategii terapeutycznych.
- Badania nad uszkodzeniem nerwu trójdzielnego ujawniają różnice w odpowiedzi aferentów trójdzielnych w porównaniu z somatycznymi.
- Dotychczasowe założenia dotyczące bólu neuropatycznego skupiały się głównie na zmianach w ośrodkowym układzie nerwowym.
- Istnieje potencjalna rola obwodowego układu nerwowego, która wymaga dalszych badań.
Cel badania
- Charakterystyka odpowiedzi neuronów sensorycznych w szczurzych modelach uszkodzenia nerwu trójdzielnego.
- Identyfikacja specyficznych subpopulacji aferentnych przyczyniających się do powstawania bólu neuropatycznego.
- Badanie potencjalnych celów terapeutycznych w leczeniu bólu.
Zastosowane metody
- Obrazowanie in vivo z wykorzystaniem genetycznie kodowanych wskaźników wapnia (GECI) w zwojach trójdzielnych szczura.
- Szczury zostały poddane znieczuleniu, a następnie wykonano specyficzne procedury chirurgiczne w celu odsłonięcia zwojów trójdzielnych.
- W celu oceny odpowiedzi neuronalnych podczas obrazowania zastosowano bodźce mechaniczne.
- Przeprowadzono fluorescencyjne obrazowanie aktywności neuronalnej w określonych ramach czasowych.
- Badanie podkreśla różnice w wzorcach odpowiedzi w zależności od rodzaju urazu i bodźca.
Główne wyniki
- Po uszkodzeniu nerwu zaobserwowano istotne różnice w odpowiedziach aferentnych trójdzielnych i somatycznych.
- Wzrost ekspresji Nav 1.1 w nerwach trójdzielnych wskazuje na jego znaczenie w bólu neuropatycznym.
- Specyficzne bodźce wywołały odmienne odpowiedzi neuronalne, co podkreśla potencjalny obwodowy wkład w powstawanie bólu neuropatycznego.
- Obrazowanie ujawniło znaczące zmiany w pobudliwości neuronalnej i amplitudach odpowiedzi w zależności od zastosowanego bodźca.
Wnioski
- Niniejsze badanie wykazuje użyteczność GECI w analizie aktywności neuronalnej i mechanizmów bólu w obwodowym układzie nerwowym.
- Podkreśla ono złożoność bólu neuropatycznego, sugerując konieczność dalszego badania udziału komponentów obwodowych.
- Wyniki te mogą przyczynić się do opracowania lepszych strategii rozumienia i leczenia bólu neuropatycznego u ludzi.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Obrazowanie wapnia in vivo na poziomie populacji w neuronach zwoju trójdzielnego szczura umożliwia bezpośrednią kwantyfikację aktywności neuronów sensorycznych w odpowiedzi na określone bodźce, co wspiera mechanistyczne ograniczanie ryzyka w procesie odkrywania celów terapeutycznych w leczeniu bólu. Podejście to zapewnia pewność prognostyczną w walidacji celów w szlakach bólu neuropatycznego, szczególnie tam, gdzie różnice międzygatunkowe mogą wpływać na ciągłość translacyjną. Metoda ta wzmacnia wczesne punkty zwrotne w procesie odkrywania poprzez umożliwienie funkcjonalnej charakterystyki subpopulacji aferentnych istotnych dla zespołów bólu twarzowo-żuchwowego.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia funkcjonalną analizę subpopulacji neuronów czuciowych zaangażowanych w ból neuropatyczny.
- Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez rozróżnienie odpowiedzi aferentnych trójdzielnych od somatycznych w odpowiedzi na uraz.
- Ułatwia identyfikację kanałów jonowych, takich jak Nav 1.1, jako celów selektywnej modulacji.
- Dostarcza ilościowych dowodów na oddziaływanie z celem oraz istotność szlaków sygnałowych in vivo.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Ustanawia zwalidowany system in vivo do pomiaru aktywności neuronalnej wywołanej bodźcem.
- Zapewnia powtarzalne, ilościowe odczyty fluorescencji w celu standaryzacji testu.
- Umożliwia skalowalną ocenę interwencji farmakologicznych ukierunkowanych na pobudliwość neuronów sensorycznych.
- Wspiera rzetelny screening potencjalnych modulatorów w kontekście istotnym dla danej jednostki chorobowej.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Uzgadnia modele przedkliniczne z mechanizmami bólu kraniofacialnego istotnymi dla ludzi.
- Łączy wyniki odkryć z modeli mysich i szczurzych, niwelując translacyjne luki specyficzne dla gatunków.
- Umożliwia optymalizację ryzyka w procesie rozwoju celów terapeutycznych w leczeniu bólu dzięki funkcjonalnej walidacji in vivo.
- Wspiera rozwój biomarkerów poprzez korelację aktywności neuronalnej z fenotypami indukowanymi urazem.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ten schemat obrazowania in vivo integruje etapy od wczesnego odkrywania po walidację przedkliniczną, umożliwiając testowanie hipotez, redukcję ryzyka związanego z celami terapeutycznymi oraz dostosowanie translacyjne dla portfolio badań nad bólem.
- Biologia odkrywcza: Ilościowe określanie aktywności wywołanej bodźcem w celu wyjaśnienia obwodowych mechanizmów bólu i walidacji potencjalnych celów terapeutycznych.
- Przesiewanie: Dostarczanie zestandaryzowanych, powtarzalnych odczytów do oceny związków w populacjach neuronów sensorycznych.
- Analityka: Generowanie ilościowych danych fluorescencyjnych umożliwiających statystyczne porównanie odpowiedzi neuronalnych w różnych warunkach.
- Badania translacyjne: Zwiększenie ciągłości poprzez modelowanie bólu kraniofacjalnego u gatunku o większym znaczeniu translacyjnym niż myszy.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferowanie platformy wielokrotnego użytku do funkcjonalnej oceny różnych celów i interwencji w obszarze bólu.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celu oraz redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w szlakach bólowych.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje protokoły obrazowania in vivo w celu zapewnienia powtarzalności i skalowalności w różnych zespołach badawczych.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go poprzez dostarczenie rzetelnych danych funkcjonalnych na temat zaangażowania celu i istotności szlaku.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów bólowych z uwzględnieniem ryzyka i wspiera decyzje o dalszym rozwoju dzięki danym spójnym z badaniami translacyjnymi.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w obrazowaniu in vivo, chirurgicznym odsłanianiu zwojów trójdzielnych oraz dostarczaniu wektorów wirusowych.
- Wymaga dostępu do wysokoczułej mikroskopii fluorescencyjnej i oprogramowania do ilościowego obrazowania.
- Konieczna jest standaryzacja protokołów stymulacji i potoków analizy danych pomiędzy zespołami.
- Może wymagać adaptacji dla różnych gatunków lub modeli bólu w celu zapewnienia istotności translacyjnej.
- Potencjalne ograniczenia obejmują złożoność techniczną oraz konieczność przeprowadzenia rygorystycznej analizy statystycznej danych na poziomie populacyjnym.
