<em>In-Vivo</em> Calcium Imaging of Sensory Neurons in the Rat Trigeminal Ganglion

Jeremy Y. Gedeon; Jorge Baruch Pineda-Farias; Michael  S. Gold

doi:10.3791/65978

In-vivo (in vivo) Obrazowanie wapnia neuronów czuciowych w zwoju trójdzielnym szczura

JoVE Journal
Neuroscience

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

JoVE Journal Neuroscience

In-Vivo Calcium Imaging of Sensory Neurons in the Rat Trigeminal Ganglion

In-vivo (in vivo) Obrazowanie wapnia neuronów czuciowych w zwoju trójdzielnym szczura

Full Text

3,234 Views

04:39 min

February 9, 2024

DOI: 10.3791/65978-v

Jeremy Y. Gedeon^1,2,3, Jorge Baruch Pineda-Farias^2,3, Michael S. Gold^2,3

¹Center for Neuroscience at the University of Pittsburgh, ²Department of Neurobiology,University of Pittsburgh School of Medicine, ³Pittsburgh Center for Pain Research,University of Pittsburgh

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

Overview

This study uses a novel approach to in vivo visualization of genetically encoded calcium indicators (GECI) to analyze sensory neuron signaling in rat trigeminal ganglia. The research focuses on characterizing changes in sensory coding and afferent subpopulations in relation to neuropathic pain following trigeminal nerve injury.

Key Study Components

Area of Science

Neuroscience
Pain Biology
Neuropathic Pain

Background

Understanding peripheral mechanisms of pain is crucial for developing better therapeutic strategies.
Research on trigeminal nerve injury reveals differences in the response of trigeminal vs. somatic afferents.
Previous assumptions about neuropathic pain focus predominantly on central nervous system changes.
There is a potential role of the peripheral nervous system that requires further investigation.

Purpose of Study

To characterize sensory neuron responses in rat models of trigeminal nerve injury.
To identify specific afferent subpopulations contributing to neuropathic pain.
To explore potential therapeutic targets for pain management.

Methods Used

In vivo imaging using genetically encoded calcium indicators (GECI) in rat trigeminal ganglia.
Rats were anesthetized and specific surgical procedures were performed to expose the trigeminal ganglia.
Mechanical stimuli were applied to assess neuronal responses during imaging.
Fluorescent imaging of neuronal activity was conducted over set timelines.
The study emphasizes differences in response patterns based on injury and stimulus type.

Main Results

Notable differences in trigeminal and somatic afferent responses were observed following nerve injury.
Upregulation of Nav 1.1 in trigeminal nerves indicates its importance in neuropathic pain.
Specific stimuli elicited distinct neuronal responses, highlighting potential peripheral contributions to neuropathic pain.
Imaging revealed significant changes in neuronal excitability and response amplitudes based on stimulus application.

Conclusions

This study demonstrates the utility of GECI for analyzing neuronal activity and pain mechanisms in the peripheral nervous system.
It highlights the complexity of neuropathic pain, suggesting further examination of peripheral contributions is necessary.
The findings may inform improved strategies for understanding and treating neuropathic pain in humans.

Frequently Asked Questions

What are the advantages of using rats over mice for this study?

Rats provide a larger model that can simplify surgical procedures and may more closely represent human pain mechanisms compared to mice.

How is the trigeminal nerve injury model implemented?

The model involves specific surgical techniques to expose and evaluate the trigeminal ganglia in anesthetized rat pups.

What types of data are collected during the imaging procedures?

The study collects data on neuronal responses, including excitability changes and fluorescence imaging of activity in response to mechanical stimuli.

How can the findings be adapted for therapeutic development?

Insights from the study regarding specific ion channels like Nav 1.1 can guide the development of selective therapeutic interventions for neuropathic pain.

Are there any limitations to the GECI method used?

While GECI provides valuable insights into neuronal activity, the method may have challenges related to the resolution and specificity of signals in complex tissues.

What implications do the results have for understanding pain mechanisms?

The study underscores the importance of exploring peripheral nervous system changes, suggesting that pain mechanisms involve more than just central nervous system alterations.

Genetycznie kodowane wskaźniki wapnia (GECI) umożliwiają solidną analizę na poziomie populacji sygnalizacji neuronów czuciowych. W tym miejscu opracowaliśmy nowatorskie podejście, które pozwala na wizualizację in vivo GECI aktywności neuronów zwojów nerwu trójdzielnego szczurów.

Ogólnym celem naszego laboratorium jest zrozumienie obwodowych mechanizmów bólu. Mój projekt skupia się na bólu związanym z uszkodzeniem nerwu trójdzielnego. Preparat, który dzisiaj pokazuję, pozwala nam scharakteryzować zmiany w kodowaniu sensorycznym i zidentyfikować subpopulacje aferentne przyczyniające się do bólu neuropatycznego.

Wykazaliśmy więc, że istnieją różnice między aferentami trójdzielnymi i somatycznymi w odpowiedzi na uszkodzenie nerwów. W szczególności Nav 1.1 jest preferencyjnie regulowany w górę w nerwie trójdzielnym, co sugeruje, że selektywne blokery dla Nav 1.1 mogą być stosowane do identyfikacji różnych subpopulacji aferentnych, które przyczyniają się do bólu neuropatycznego. Tak więc myszy transgeniczne są obecnie najszerzej stosowane w połączeniu z różnymi strategiami obrazowania i opartymi na omii.

Tłumaczenie danych generowanych u myszy na inne gatunki, jeśli nie ludzi. Myszy są naprawdę małe, trudno je wytresować, a lista różnic między myszami, szczurami i ludźmi rośnie. Tak więc wykorzystanie szczurów może pomóc w rozwiązaniu kilku z tych problemów.

Mechanizmy bólu i potencjalne cele terapeutyczne różnią się w strukturach twarzoczaszki, takich jak te nad szyją oraz inne struktury somatyczne i trzewne, tj. te poniżej szyi. Wyniki uzyskane dzięki temu preparatowi sugerują, że istnieje składnik bólu neuropatycznego, który wcześniej uważano, że odzwierciedla zmiany w ośrodkowym układzie nerwowym, ale w rzeczywistości może również odzwierciedlać zmiany w obwodowym układzie nerwowym.

Na początek użyj 25-mikrolitrowej strzykawki Hamiltona, aby dootrzewnowo wstrzyknąć znieczulonym szczeniętom szczurów 15 mikrolitrów agenu. Następnie zgol włosy i wąsy znieczulonych sześcio- lub ośmiotygodniowych szczeniąt, zamontuj szczura na stereotaktycznej ramie z nausznikami i umieść pod spodem poduszkę grzewczą, aby utrzymać temperaturę ciała zwierzęcia. Następnie umieść gazę zanurzoną w lodowatej soli fizjologicznej na głowie szczura, aby zminimalizować krwawienie.

Za pomocą skalpela w rozmiarze 15 wykonaj nacięcie na linii środkowej skóry i mięśnia nad czaszką. Odciągnij skórę i mięśnie, aby odsłonić czaszkę za pomocą okrągłego wiertła jeden na cztery, ostrożnie przebij nasadkę czaszki, aby odsłonić przodomózgowie. Następnie użyj rongeurs, aby przeciąć czaszkę.

Za pomocą skalpela w rozmiarze 15 wykonaj nacięcie w mózgu i opuszki węchowej. Użyj szpatułki, aby ostrożnie odłączyć oponę twardą od czaszki. Następnie delikatnie podnieś odcięty mózg, aby wyświetlić zwój nerwu trójdzielnego i podstawę czaszki.

Kauteryzuj wszelkie krwawienia za pomocą długopisu do kauteryzacji. Aby zobrazować GCaMP6s, umieść jamę czaszki pod obiektywem mikroskopu. Następnie ustaw ostrość na zwoju końcowym.

Następnie nałóż bodźce mechaniczne na jeden centymetr kwadratowy twarzy. Użyj obiektywu 20x, aby zwizualizować neurony zwoju nerwu trójdzielnego, które reagują na bodziec. Aby zebrać stato fluorescencyjne w czasie za pomocą oprogramowania do akwizycji, naciśnij przycisk akwizycji strumienia w menu akwizycji, a następnie ustaw liczbę klatek na 300 i czas akwizycji na 90 sekund.

Ustaw parametry aparatu, aby rejestrować obrazy z szybkością klatek. Uzyskano stabilne zapisy linii bazowej przez trzy minuty. Większa objętość miana wirusa powodowała zwiększoną infekcję neuronalną młodych szczurów.

Lekka symulacja mechaniczna aktywowała tylko obszar V2 zwoju nerwu trójdzielnego. Fluorescencja spoczynkowa była stosunkowo niska w większości neuronów, z niewielkimi spontanicznymi wzrostami. Naturalne bodźce, w szczególności stymulacja punktowa, wywoływały najsilniejsze reakcje neuronalne.

Bodźce szczotkowe w modelach przewlekłych urazów zwężonych wywołały dwukrotny wzrost wielkości szczytowej odpowiedzi po stronie zranionej w porównaniu ze stroną przeciwległą. Gdy dwa bodźce zostały zastosowane szeregowo, nastąpiło znaczne wzmocnienie w odpowiedzi na drugi bodziec.

View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos