Name: In-vivo (in vivo) Obrazowanie wapnia neuronów czuciowych w zwoju trójdzielnym szczura (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-09T13:35:00.000+00:00
Duration: 4 min 39 s
Description: Poznaj metodę obrazowania wapnia w zwoju trójdzielnym szczura za pomocą wskaźników GECI. Ta technika pozwala analizować sygnalizację neuronów czuciowych i identyfikować podpopulacje aferentów związane z bólem neuropatycznym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować doktorom Kathy Albers i Brianowi Davisowi za korzystanie z ich programu Leica Microscope and Metamorph, Charlesowi Warwickowi za pomoc w budowie naszego termicznego urządzenia Peltiera, oraz dr Raymondowi Sekuli za pomoc w rozwiązywaniu problemów związanych z przygotowaniem chirurgicznym. Prace te były wspierane przez granty z National Institutes of Health: F31NS125993 (JYG), T32NS073548 (JYG) i R01NS122784 (MSG i RS).

Wszystkie eksperymenty z wykorzystaniem zwierząt w badaniach zostały przeprowadzone zgodnie ze standardami określonymi przez National Institutes of Health oraz International Association for the Study of Pain i zostały zatwierdzone przez University of Pittsburgh Institutional Animal Care and Use Committee (protokół #22051100). Pod koniec każdego eksperymentu szczury były poddawane eutanazji poprzez wykrwawianie z sercową perfuzją lodowatego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), podejście zatwierdzone przez Amerykańskie Stowarzyszenie Lekarzy Weterynaryjnych i IACUC Uniwersytetu w Pittsburghu.
1. Indukcja GCaMP
<ol>
	<li>Zamów szczury Sprague Dawley w ciąży w ciąży, aby młode mogły otrzymać zastrzyk w odpowiednim czasie po urodzeniu.</li>
	<li>Spryskaj rękawice 70% EtOH przed kontaktem z każdym szczeniakiem szczura. To zniechęci tamę do kanibalizacji młodych.</li>
	<li>Wymaz ze szczeniąt szczura (P1-2) z 70% EtOH i znieczulenie na lodzie przez 3 min.</li>
	<li>Wstrzyknąć 15 μl AAV9-CAG-WPRE-GCaMP6s-SV40 (Addgene) dootrzewnowo za pomocą sterylnej, gazoszczelnej strzykawki Hamilton o pojemności 25 μl.</li>
</ol>
2. Operacja odsłonięcia zwoju nerwu trójdzielnego
<ol>
	<li>Podawać koktajl znieczulający (55 mg/kg ketaminy, 5,5 mg/kg ksylazyny, 1 mg/kg acepromazyny) dootrzewnowo w przeliczeniu na masę ciała 6-8 tygodniowym szczurom (około 150-200 g). 
	UWAGA: Jest to na ogół wystarczające do utrzymania chirurgicznej płaszczyzny znieczulenia, ocenianej na podstawie braku odruchu wycofania na szkodliwe szczypanie tylnej łapy. Należy jednak uzupełnić izofluranem przez stożek nosowy, jeśli zwierzęta stają się lekkie.</li>
	<li>Po całkowitym znieczuleniu zgol włosy i wąsy głowy i twarzy.</li>
	<li>Zamontuj szczura na ramie stereotaktycznej z nausznikami i umieść pod nią poduszkę grzewczą (~37 oC), aby utrzymać temperaturę ciała.</li>
	<li>Monitoruj parametry życiowe (tętno, częstość oddechów, nasycenie krwi tlenem) za pomocą pulsoksymetru myszy lub porównywalnego. 
	UWAGA: Temperatura ciała jest monitorowana za pomocą sondy doodbytniczej i utrzymywana poprzez umieszczenie szczurów na sterowanym sprzężeniem zwrotnym krążącym kocu wodnym.</li>
	<li>Umieść gazę zanurzoną w lodowatej soli fizjologicznej na głowie, aby zwęzić naczynia krwionośne i zminimalizować krwawienie. Używając skalpela w rozmiarze 15, wykonaj nacięcie w linii środkowej skóry i mięśnia nad czaszką.</li>
	<li>Użyj cięcia skóry i mięśni, aby odsłonić czaszkę.</li>
	<li>Za pomocą okrągłego wiertła 1/4 ostrożnie przedziurawić nasadkę czaszki, aby odsłonić przodomózgowie. Następnie użyj rongeurs (miseczka 2,5 mm), aby ostrożnie przeciąć czaszkę.</li>
	<li>Za pomocą skalpela w rozmiarze 15 wykonaj nacięcie w mózgu (Bregma: -3,80) i opuszki węchowej. 
	UWAGA: Przecięcie bardziej doogonowo poza ten punkt spowoduje śmierć szczura</li>
	<li>Użyj szpatułki, aby ostrożnie odłączyć oponę twardą od czaszki i delikatnie podnieś odcięty mózg, aby odsłonić TG i podstawę czaszki. 
	UWAGA: Dodatkowe zastosowanie lodowatej perfuzji soli fizjologicznej podczas ekstrakcji zminimalizuje krwawienie i zoptymalizuje następujące pole preparacji.</li>
	<li>Za pomocą wstrzykiwacza kauterycznego zatamować wszelkie krwawienia wynikające z ekstrakcji. 
	UWAGA: Przecięcie opony twardej spowoduje nieuniknione krwawienie. Najlepiej jest przygotować lodowaty aCSF (119 mM NaCl, 26,2 mM NaHCO3, 2,5 mM KCl, 1 mM NaH2PO4, 1,3 mM MgCl2, 10 mM glukozy, 2,5 mM CaCl2) do kąpieli jamy czaszki, aby pomóc zwęzić naczynia krwionośne przy jednoczesnym utrzymaniu zdrowia neuronów.</li>
</ol>
3. Obrazowanie GCaMP6s
UWAGA: Biorąc pod uwagę rozmiar i gęstość tych neuronów, używany system obrazowania i akwizycji danych (obiektyw, mikroskop, źródło światła, kamera) określi liczbę wizualizowanych komórek GECI+. Źródło światła, obiektyw i aparat będą również określać parametry używane do pozyskiwania obrazu, w tym czas ekspozycji i szybkość przechwytywania obrazu. Podczas gdy techniki wielofotonowe i konfokalne mogą być stosowane w zależności od parametrów eksperymentu, mikroskopia epifluorescencyjna może być wystarczająca do rozdzielenia wielu komórek. Można użyć dowolnego pakietu do akwizycji obrazu. Idealnie byłoby, gdyby aplikacja stymulująca była zablokowana czasowo z pakietem oprogramowania do akwizycji obrazu.
<ol>
	<li>Umieść jamę czaszki pod obiektywem i ustaw ostrość TG za pomocą światła widzialnego.</li>
	<li>Długość fali wzbudzenia GCaMP6s wynosi 496 nm, a długość fali emisji wynosi 513 nm, dlatego należy użyć odpowiednich kostek dichroicznych i filtrujących, aby zlokalizować komórki GCaMP+. Dostosuj ostrość, aby zlokalizować i rozwiązać obszar zwojów, w którym neurony reagują na bodźce zastosowane do recepcyjnego pola zainteresowania.</li>
	<li>Użyj celu 10x, aby umożliwić wizualizację większości neuronów w TG reagujących na bodźce mechaniczne zastosowane do obszaru twarzy o powierzchni 1cm2 16. Użyj suchego obiektywu 20x o dużej odległości roboczej (10,8 mm), aby zwiększyć rozdzielczość.</li>
	<li>Użyj oprogramowania do akwizycji (np. Metamorph) do zbierania danych fluorescencyjnych w czasie i w odpowiedzi na zastosowanie bodźca.
	<ol>
		<li>Aby zminimalizować fotobielenie neuronów, należy stosować jak najkrótszy czas ekspozycji, aby wykryć wyjściowy i wywołany wzrost fluorescencji. Dzięki obiektywowi powietrznemu 20x, 0,40 NA, źródłu światła halogenku rtęci o mocy 120 W i komplementarnej kamerze metalowo-tlenkowo-półprzewodnikowej (CMOS) użytej w niniejszym badaniu, czasowi naświetlania 300 ms i szybkości akwizycji obrazu 3 Hz, uzyskaj stabilne nagrania podstawowe przez >90 min. 
		UWAGA: 1) Te parametry akwizycji obrazu muszą być określone empirycznie. 2) Mechaniczne (szczotka, punktacja, wibracje, szczypanie), termiczne (ciepło i zimno) i chemiczne (kapsaicyna, mentol, mediatory stanu zapalnego) mogą być stosowane do pola recepcyjnego. Stosunkowo niedrogim podejściem subiektywnym jest ręczne stosowanie bodźców. Zalecane są jednak bardziej obiektywne i powtarzalne podejścia, w których siłowniki sterowane sprzężeniem zwrotnym mogą być używane do wielokrotnego stosowania ze znaną siłą. Podczas gdy urządzenia Peltiera sterowane sprzężeniem zwrotnym są przydatne do kontrolowanego ogrzewania i chłodzenia, nie są idealne do stymulacji termicznej zakrzywionej twarzy. Źródła światła podczerwonego sterowane sprzężeniem zwrotnym są alternatywą dla ogrzewania, a zimny natrysk jest mniej niż idealną alternatywą dla chłodzenia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

In Vivo Visualization of the Rat Trigeminal Ganglion With Calcium Indicators

<ol><li>Gold, M. S., Gebhart, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nociceptor+sensitization+in+pain+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Nociceptor sensitization in pain pathogenesis.</a> Nat Med. 16 (11), 1248-1257 (2010).</li>
<li>Gold, M. S., Caterina, M. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGold%2C+MS+%22The+Senses%3A+A+Comprehensive+Reference%22">The Senses: A Comprehensive Reference</a>. , Academic Press. (2008).</li>
<li>Lawson, S. N., Fang, X., Djouhri, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nociceptor+subtypes+and+their+incidence+in+rat+lumbar+dorsal+root+ganglia+%28DRGs%29%3A+focussing+on+C-polymodal+nociceptors%2C+A%CE%B2-nociceptors%2C+moderate+pressure+receptors+and+their+receptive+field+depths%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Physiol%22%5BJournal%5D)">Nociceptor subtypes and their incidence in rat lumbar dorsal root ganglia (DRGs): focussing on C-polymodal nociceptors, Aβ-nociceptors, moderate pressure receptors and their receptive field depths.</a> Curr Opin Physiol. 11, 125-146 (2019).</li>
<li>Handler, A., Ginty, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanosensory+neurons+of+touch+and+their+mechanisms+of+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The mechanosensory neurons of touch and their mechanisms of activation.</a> Nat Rev Neurosci. 22 (9), 521-537 (2021).</li>
<li>Jankowski, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutaneous+neurturin+overexpression+alters+mechanical%2C+thermal%2C+and+cold+responsiveness+in+physiologically+identified+primary+afferents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Cutaneous neurturin overexpression alters mechanical, thermal, and cold responsiveness in physiologically identified primary afferents.</a> J Neurophysiol. 117 (3), 1258-1265 (2017).</li>
<li>Shannonhouse, J., Gomez, R., Son, H., Zhang, Y., Kim, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+calcium+imaging+of+neuronal+ensembles+in+networks+of+primary+sensory+neurons+in+intact+dorsal+root+ganglia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In vivo calcium imaging of neuronal ensembles in networks of primary sensory neurons in intact dorsal root ganglia.</a> J Vis Exp. 192, 64826(2023).</li>
<li>Anderson, M., Zheng, Q., Dong, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+pain+mechanisms+by+calcium+imaging+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Bull%22%5BJournal%5D)">Investigation of pain mechanisms by calcium imaging approaches.</a> Neurosci Bull. 34 (1), 194-199 (2018).</li>
<li>Grienberger, C., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+calcium+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging calcium in neurons.</a> Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).</li>
<li>Iseppon, F., Linley, J. E., Wood, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+imaging+for+analgesic+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Pain%22%5BJournal%5D)">Calcium imaging for analgesic drug discovery.</a> Neurobiol Pain. 11, 100083(2022).</li>
<li>Tada, M., Takeuchi, A., Hashizume, M., Kitamura, K., Kano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+sensitive+fluorescent+indicator+dye+for+calcium+imaging+of+neural+activity+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A highly sensitive fluorescent indicator dye for calcium imaging of neural activity in vitro and in vivo.</a> Eur J Neurosci. 39 (11), 1720-1728 (2014).</li>
<li>Lu, S. G., Zhang, X., Gold, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+calcium+regulation+among+subpopulations+of+rat+dorsal+root+ganglion+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Intracellular calcium regulation among subpopulations of rat dorsal root ganglion neurons.</a> J Physiol. 577 (Pt 1), 169-190 (2006).</li>
<li>Warwick, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type-specific+calcium+imaging+of+central+sensitization+in+mouse+dorsal+horn%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Cell type-specific calcium imaging of central sensitization in mouse dorsal horn.</a> Nat Commun. 13 (1), 5199(2022).</li>
<li>Scheff, N. N., Yilmaz, E., Gold, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+properties%2C+distribution+and+function+of+Na%28%2B%29-Ca%282%2B%29+exchanger+isoforms+in+rat+cutaneous+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">The properties, distribution and function of Na(+)-Ca(2+) exchanger isoforms in rat cutaneous sensory neurons.</a> J Physiol. 592 (Pt 22), 4969-4993 (2014).</li>
<li>Scheff, N. N., Gold, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trafficking+of+na%2B%2Fca2%2B+exchanger+to+the+site+of+persistent+inflammation+in+nociceptive+afferents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Trafficking of na+/ca2+ exchanger to the site of persistent inflammation in nociceptive afferents.</a> J Neurosci. 35 (22), 8423-8432 (2015).</li>
<li>Hartung, J. E., Gold, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GCaMP+as+an+indirect+measure+of+electrical+activity+in+rat+trigeminal+ganglion+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">GCaMP as an indirect measure of electrical activity in rat trigeminal ganglion neurons.</a> Cell Calcium. 89, 102225(2020).</li>
<li>Ghitani, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specialized+mechanosensory+nociceptors+mediating+rapid+responses+to+hair+pull%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Specialized mechanosensory nociceptors mediating rapid responses to hair pull.</a> Neuron. 95 (4), 944-954 (2017).</li>
<li>Cichon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neuronal+activity+in+the+central+and+peripheral+nervous+systems+using+new+Thy1.2-GCaMP6+transgenic+mouse+lines%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging neuronal activity in the central and peripheral nervous systems using new Thy1.2-GCaMP6 transgenic mouse lines.</a> J Neurosci Methods. 334, 108535(2020).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotine+evoked+currents+in+human+primary+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pain%22%5BJournal%5D)">Nicotine evoked currents in human primary sensory neurons.</a> J Pain. 20 (7), 810-818 (2019).</li>
<li>Devor, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unexplained+peculiarities+of+the+dorsal+root+ganglion%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Unexplained peculiarities of the dorsal root ganglion.</a> Pain. Suppl 6, S27-S35 (1999).</li>
<li>Amir, R., Devor, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+excitability+of+the+soma+of+sensory+neurons+is+required+for+spike+invasion+of+the+soma%2C+but+not+for+through-conduction%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Electrical excitability of the soma of sensory neurons is required for spike invasion of the soma, but not for through-conduction.</a> Biophys J. 84 (4), 2181-2191 (2003).</li>
<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory+afferents+use+different+coding+strategies+for+heat+and+cold%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Sensory afferents use different coding strategies for heat and cold.</a> Cell Rep. 23 (7), 2001-2013 (2018).</li>
<li>Gregg, J. M., Dixon, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatotopic+organization+of+the+trigeminal+ganglion+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Oral+Biol%22%5BJournal%5D)">Somatotopic organization of the trigeminal ganglion in the rat.</a> Arch Oral Biol. 18 (4), 487-498 (1973).</li>
<li>Dessem, D., Moritani, M., Ambalavanar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nociceptive+craniofacial+muscle+primary+afferent+neurons+synapse+in+both+the+rostral+and+caudal+brain+stem%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Nociceptive craniofacial muscle primary afferent neurons synapse in both the rostral and caudal brain stem.</a> J Neurophysiol. 98 (1), 214-223 (2007).</li>
<li>Dessem, D., Luo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Jaw-muscle+spindle+afferent+feedback+to+the+cervical+spinal+cord+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Jaw-muscle spindle afferent feedback to the cervical spinal cord in the rat.</a> Exp Brain Res. 128 (4), 451-459 (1999).</li>
<li>Sessle, B. J., Dubner, R., Greenwood, L. F., Lucier, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Descending+influences+of+periaqueductal+gray+matter+and+somatosensory+cerebral+cortex+on+neurones+in+trigeminal+brain+stem+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22Can+J+Physiol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Descending influences of periaqueductal gray matter and somatosensory cerebral cortex on neurones in trigeminal brain stem nuclei.</a> Can J Physiol Pharmacol. 54 (1), 66-69 (1976).</li>
<li>Shammah-Lagnado, S. J., Negrão, N., Silva, B. A., Ricardo, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Afferent+connections+of+the+nuclei+reticularis+pontis+oralis+and+caudalis%3A+a+horseradish+peroxidase+study+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Afferent connections of the nuclei reticularis pontis oralis and caudalis: a horseradish peroxidase study in the rat.</a> Neuroscience. 20 (3), 961-989 (1987).</li>
<li>Korczeniewska, O. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+gene+expression+changes+in+the+dorsal+root+versus+trigeminal+ganglia+following+peripheral+nerve+injury+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Pain%22%5BJournal%5D)">Differential gene expression changes in the dorsal root versus trigeminal ganglia following peripheral nerve injury in rats.</a> Eur J Pain. 24 (5), 967-982 (2020).</li>
<li>Megat, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+between+dorsal+root+and+trigeminal+ganglion+nociceptors+in+mice+revealed+by+translational+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Differences between dorsal root and trigeminal ganglion nociceptors in mice revealed by translational profiling.</a> J Neurosci. 39 (35), 6829-6847 (2019).</li>
<li>Pineda-Farias, J. B., Loeza-Alcocer, E., Nagarajan, V., Gold, M. S., Sekula, R. F. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+underlying+the+selective+therapeutic+efficacy+of+carbamazepine+for+attenuation+of+trigeminal+nerve+injury+pain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mechanisms underlying the selective therapeutic efficacy of carbamazepine for attenuation of trigeminal nerve injury pain.</a> J Neurosci. 41 (43), 8991-9007 (2021).</li>
<li>Burchiel, K. J., Baumann, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiology+of+trigeminal+neuralgia%3A+new+evidence+from+a+trigeminal+ganglion+intraoperative+microneurographic+recording.+Case+report%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosurg%22%5BJournal%5D)">Pathophysiology of trigeminal neuralgia: new evidence from a trigeminal ganglion intraoperative microneurographic recording. Case report.</a> J Neurosurg. 101 (5), 872-873 (2004).</li>
<li>Jääskeläinen, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+burning+mouth+syndrome+a+neuropathic+pain+condition%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Is burning mouth syndrome a neuropathic pain condition.</a> Pain. 159 (3), 610-613 (2018).</li>
<li>Ashina, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migraine+and+the+trigeminovascular+system-40+years+and+counting%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurol%22%5BJournal%5D)">Migraine and the trigeminovascular system-40 years and counting.</a> Lancet Neurol. 18 (8), 795-804 (2019).</li>
<li>Yang, O. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+the+transduction+efficiency+of+systemically+delivered+AAV+vectors+in+the+rat+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Evaluating the transduction efficiency of systemically delivered AAV vectors in the rat nervous system.</a> Front Neurosci. 17, 1001007(2023).</li>
<li>Gemes, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signaling+in+intact+dorsalroot+ganglia%3A+New+observations+and+the+effect+of+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">Calcium signaling in intact dorsalroot ganglia: New observations and the effect of injury.</a> Anesthesiology. 113 (1), 134-146 (2010).</li>
<li>Xu, Q., Dong, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+imaging+approaches+in+investigation+of+pain+mechanism+in+the+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Calcium imaging approaches in investigation of pain mechanism in the spinal cord.</a> Exp Neurol. 317, 129-132 (2019).</li>
<li>Wu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+in+vivo+imaging+of+mouse+spinal+cord+through+an+optically+cleared+intervertebral+window%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Long-term in vivo imaging of mouse spinal cord through an optically cleared intervertebral window.</a> Nat Commun. 13 (1), 1959(2022).</li>
<li>Cantu, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EZcalcium%3A+Open-source+toolbox+for+analysis+of+calcium+imaging+data%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">EZcalcium: Open-source toolbox for analysis of calcium imaging data.</a> Front Neural Circuits. 14, 25(2020).</li>
<li>Romano, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+calcium+imaging+processing+toolbox+for+the+analysis+of+neuronal+population+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Comput+Biol%22%5BJournal%5D)">An integrated calcium imaging processing toolbox for the analysis of neuronal population dynamics.</a> PLoS Comput Biol. 13 (6), e1005526(2017).</li>
<li>Mason, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+AAV+serotypes+for+gene+delivery+to+dorsal+root+ganglion+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Comparison of AAV serotypes for gene delivery to dorsal root ganglion neurons.</a> Mol Ther. 18 (4), 715-724 (2010).</li>
<li>Sharma, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emergence+of+transcriptional+identity+in+somatosensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The emergence of transcriptional identity in somatosensory neurons.</a> Nature. 577 (7790), 392-398 (2020).</li>
<li>Matsuka, Y., Neubert, J. K., Maidment, N. T., Spigelman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concurrent+release+of+ATP+and+substance+P+within+guinea+pig+trigeminal+ganglia+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Concurrent release of ATP and substance P within guinea pig trigeminal ganglia in vivo.</a> Brain Res. 915 (2), 248-255 (2001).</li>
<li>Hu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+trigeminal+ganglion+neuronal+activities+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+.Biol%22%5BJournal%5D)">Visualization of trigeminal ganglion neuronal activities in mice.</a> Curr Protoc Cell .Biol. 83 (1), e84(2019).</li>
<li>von Buchholtz, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoding+cellular+mechanisms+for+mechanosensory+discrimination%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Decoding cellular mechanisms for mechanosensory discrimination.</a> Neuron. 109 (2), 285-298 (2021).</li>
<li>Giovannucci, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CaImAn+an+open+source+tool+for+scalable+calcium+imaging+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22elife%22%5BJournal%5D)">CaImAn an open source tool for scalable calcium imaging data analysis.</a> elife. 8, e38173(2019).</li>
</ol>

Dr Gold otrzymywał wsparcie grantowe od Grunenthala podczas opracowywania tego preparatu. Tematyka badań Grunenthala i preparatu opisanego w tym manuskrypcie nie pokrywały się. Żaden z pozostałych autorów nie ma do ujawnienia żadnych innych potencjalnych konfliktów interesów.

Tutaj demonstrujemy szybki, nieinwazyjny sposób generowania szczura GECI do obrazowania TG. Wybraliśmy promotor CAG, aby napędzać i utrzymywać wysoki poziom ekspresji genów. Podczas gdy poprzednie badania sugerują, że inne serotypy AAV mogą skutecznie napędzać ekspresję genów w neuronach DRG39, nasze wyniki są zgodne z niedawnym badaniem obejmującym dootrzewnowe wstrzyknięcie AAV u noworodków32, co wskazuje, że serotyp AAV9 jest wysoce skuteczny w infekcji neuronów czuciowych noworodków szczurów.
Rozwiązując problemy z tą techniką, warto zwrócić uwagę na kilka pułapek, które mogą uniemożliwić optymalną infekcję. Główną zmienną, o której należy pamiętać, jest wiek szczeniąt. Układ nerwowy szczura rozwija się szybko w ciągu pierwszych 7 dni po urodzeniu40. Próbowaliśmy infekcji w późniejszych punktach czasowych (np. p4-7), co skutkowało zmienną i słabą skutecznością. Wcześniejsze punkty czasowe (p1-4) zapewniają bardziej solidną i stałą skuteczność, przy czym p1-2 zapewnia najwyższe wskaźniki infekcji. Drugą zmienną jest objętość wstrzyknięcia. Niezależnie od wieku, wymagane było minimum 15 μl, aby uzyskać ponad 70% sprawność w TG lub DRG przy mianie 2,5 x 1014. Odkryliśmy, że nawet przy p2 wstrzyknięcia dootrzewnowe o wielkości mniejszej niż 10 μl powodują bardzo małą ekspresję u osoby dorosłej. Możliwe jest, że bardziej zlokalizowane wstrzyknięcia, tj. bezpośrednio w pole recepcyjne zainteresowania, przy mniejszych objętościach wywołałyby podobne efekty. Jednak takie podejście wymagałoby pełnego znieczulenia szczeniąt i może spowodować uraz tkanki będącej przedmiotem zainteresowania. Wreszcie, możliwe jest, że mniejsze objętości mogą być używane z wyższymi mianami.
Eksponowanie TG do obrazowania GECI zostało wcześniej przeprowadzone na myszach16. Przełożenie tego podejścia na szczura ujawniło jednak kilka kwestii wartych rozważenia. Po pierwsze, grubość czaszki i opony twardej u szczura jest znacznie większa niż u myszy. Dlatego zdjęcie czapki z czaszką może stanowić wyzwanie. Odkryliśmy, że małe wiertło jest skutecznym sposobem na perforację czapki czaszki, którą można następnie usunąć za pomocą rongeurs. Drugim problemem jest krwawienie po usunięciu mózgu. Może to być ciągły problem zarówno dla długowieczności preparatu, jak i klarowności obrazowania, jeśli nie właściwości neuronów. Gaza zanurzona w lodowatym płynie mózgowo-rdzeniowym może być nakładana na odsłoniętą powierzchnię mózgu, aby pomóc zamknąć główne tętnice. Użycie małego wstrzykiwacza kauterycznego może być również skuteczne w zatamowaniu dalszego krwawienia. Wreszcie, pianka żelowa znajdująca się po przeciwnej stronie okienka obrazowania może również pomóc w zapobieganiu problemom z obrazowaniem we krwi i płynie mózgowo-rdzeniowym. Trzecią kwestią jest ilość mózgu, która ma zostać usunięta. Odkryliśmy, że usunięcie ogona mózgu do ~Bregma -3,80 spowoduje śmierć w ciągu godziny od usunięcia. Dlatego mózg powinien być usuwany w małych sekcjach, zachowując jak najwięcej, jednocześnie odsłaniając jak najwięcej TG.
Jak zauważono we Wprowadzeniu, [Ca2+]i jest pośrednią miarą aktywności neuronalnej, a zatem wzrost [Ca2+]i niekoniecznie oznacza wzrost aktywności neuronalnej. Dlatego eksperymenty kontrolne mają kluczowe znaczenie dla potwierdzenia, że to, co uważa się za aktywność wywołaną, jest w rzeczywistości aktywnością per se. Na przykład, bodźce wywołane elektrycznie powinny wytwarzać ograniczony w czasie wzrost [Ca2+]i, który jest na podobnej skali jak w przypadku bodźców wywołanych naturalnie. Co ważne, czynność ta powinna zostać wyeliminowana za pomocą blokady nerwu (tj. TTX). Jednak ważne jest również, aby zauważyć, że pomimo tych ważnych kontroli, nadal możliwe jest, że niektóre z pozornie wywołanych wzrostów [Ca2 +] i są spowodowane sygnalizacją w obrębie zwojów, na przykład z powodu uwolnienia nadajnika w obrębie zwojów41, a nie z powodu potencjału czynnościowego zainicjowanego na obwodzie, który zaatakował somę komórkową.
Podczas gdy nasze wyniki potwierdzają to poprzednich badaczy 16,42,43 wskazujące, że stosunek sygnału do szumu związany ze zmianami fluorescencji GCaMP w somatach czuciowych jest wystarczający do użycia ze standardowym mikroskopem epifluorescencyjnym, manipulacje, takie jak uszkodzenie nerwu użyte w niniejszym badaniu, mogą być związane z tak dramatycznymi zmianami w aktywności neuronalnej i sygnalizacji Ca 2 + 34, że reakcje w obrębie zwojów mogą być związane z tak dużym wzrostem pozornego tła, że odpowiedzi poszczególnych neuronów mogą być sztucznie osłabione. Chociaż opracowano metody przetwarzania obrazowania, które mogą pomóc w rozwiązaniu tego ograniczenia44, do najskuteczniejszego rozwiązania tego problemu może być potrzebne obrazowanie konfokalne lub wielofotonowe.
Podsumowując, technika ta zapewnia podejście do badania właściwości neuronów TG w zakresie bodźców-reakcji u szczurów na poziomie populacji. Nasze wyniki z CCI ION potwierdzają możliwość wykrycia zmian w tych właściwościach bodziec-odpowiedź. Chociaż w niniejszym badaniu wykorzystano wyłącznie bodźce mechaniczne i termiczne, preparat ten powinien być podatny na zastosowanie bodźców chemicznych w celu pełnego zdefiniowania właściwości bodźca-odpowiedzi neuronów TG. Podobnie, podczas gdy skupiliśmy się na właściwościach bodziec-odpowiedź skórnych aferentów, ze względu na pojawienie się takich zjawisk, jak dynamiczna allodynia mechaniczna po urazowym uszkodzeniu nerwu skórnego, powinno być również możliwe wykrycie zmian we właściwościach aferentów unerwiających inne struktury twarzoczaszki, takie jak staw skroniowo-żuchwowy (w odpowiedzi na nieszkodliwe vs. szkodliwe ruchy szczęki), rogówka lub język. Obwodowe wstrzyknięcie serotypu AAV9 pozwala na specyficzną dla neuronów indukcję GCaMP, która jest specyficzna dla PNS. Główną zaletą tej strategii jest to, że znakowanie wirusa zapewnia solidną, trwałą ekspresję w komórkach postmitotycznych (tj. neuronach), ale nie w komórkach mitotycznych (np. Komórkach nabłonkowych). Ponadto wstępne badania przesiewowe różnych tkanek PNS wskazują, że ta strategia wirusowa może być również wykorzystana do badania zwojów przy/współczulnych, DRG i jelitowego układu nerwowego (dane nie pokazane).
To przygotowanie in vivo stanowi również podstawę do zbadania wielu porównań, których brakuje w obecnej literaturze. Badania populacyjne in vivo między TG szczurów a DRG, TG szczurów i myszy, nie zostały jeszcze przeprowadzone. Przedstawione tutaj dane ilustrują nową wykonalność tych ważnych eksperymentów, które zostaną przeprowadzone.

Somatosensacja, neuronalne kodowanie bodźców mechanicznych, termicznych i chemicznych uderzających w skórę lub inne struktury ciała, w tym mięśnie, kości i wnętrzności, zaczyna się od aktywności w pierwotnych neuronach doprowadzających, które unerwiają te struktury1. Podejścia elektrofizjologiczne oparte na pojedynczych jednostkach dostarczyły wielu informacji na temat podtypów aferentnych biorących udział w tym procesie, a także tego, jak ich właściwości bodźca-odpowiedzi mogą zmieniać się w czasie1,2,3. Jednakże, chociaż istnieją mocne dowody na poparcie teorii znakowanej linii, która sugeruje, że określone modalności sensoryczne są przenoszone przez określone subpopulacje neuronów, zdolność wielu subpopulacji neuronów do reagowania na te same typy bodźców mechanicznych, termicznych i chemicznych sugeruje, że większość bodźców somatosensorycznych jest kodowana przez wiele subpopulacji neuronów4, 5. Tak więc lepsze zrozumienie somatosensacji przyjdzie tylko dzięki możliwości badania aktywności 10, jeśli nie setek neuronów jednocześnie.
Postępy w podejściu optycznym wraz ze stosunkowo niedawnym pojawieniem się technik obrazowania konfokalnego, a następnie wielofotonowego i cyfrowego, umożliwiły wykonywanie stosunkowo nieinwazyjnych analiz aktywności neuronalnej na poziomie populacji6,7. Jedną z ostatnich przeszkód w zastosowaniu tej technologii było opracowanie narzędzi umożliwiających optyczną ocenę aktywności neuronalnej. Biorąc pod uwagę prędkość potencjału czynnościowego, który może rozpocząć się i zakończyć w czasie krótszym niż milisekunda, barwnik wrażliwy na napięcie, zdolny do śledzenia zmian potencjału błonowego z prędkością potencjału czynnościowego, byłby idealnym narzędziem do tego celu. Ale chociaż nastąpił ogromny postęp w tej dziedzinie7,8,9,10, stosunek sygnału do szumu dla wielu z tych barwników nadal nie jest wystarczająco wysoki, aby umożliwić analizę populacji setek neuronów na poziomie pojedynczej komórki. Jako alternatywne podejście badacze zwrócili się ku monitorowaniu zmian wewnątrzkomórkowego stężenia Ca2 + ([Ca2 + ]i). Ograniczenia tej strategii były jasne od samego początku i obejmują fakt, że wzrost [Ca2+]i jest pośrednią miarą aktywności neuronalnej11; że wzrost [Ca2+]i może wystąpić niezależnie od napływu Ca2+ związanego z aktywacją kanałów Ca2+ bramkowanych napięciem (VGCCs)12,13; że wielkość i czas trwania stanu przejściowego Ca2+ mogą być kontrolowane przez procesy niezależne od aktywności VGCC11,12,14; i że przebieg czasowy stanów nieustalonych Ca2+ znacznie przekracza przebieg potencjału czynnościowego15. Niemniej jednak istnieje szereg istotnych zalet związanych ze stosowaniem Ca2+ jako pośredniej miary aktywności neuronalnej. Nie mniej ważny jest stosunek sygnału do szumu związany z większością wskaźników Ca2 +, odzwierciedlający zarówno wielkość zmiany w wewnątrzkomórkowym Ca2 +, jak i fakt, że sygnał powstaje z trójwymiarowej przestrzeni cytozolu, a nie z dwuwymiarowej przestrzeni błony komórkowej. Ponadto, wraz z rozwojem genetycznie kodowanych wskaźników Ca2+ (GECI), możliwe jest wykorzystanie strategii genetycznych do kierowania ekspresją wskaźników Ca2+ w określonych subpopulacjach komórek, ułatwiając analizy na poziomie populacji w nienaruszonych preparatach (np. patrz16).
Biorąc pod uwagę ilość narzędzi genetycznych dostępnych obecnie u myszy, nie powinno dziwić, że GECI były najczęściej stosowane u tego gatunku. Opracowano linie myszy z konstytutywną ekspresją GECI w subpopulacjach neuronów czuciowych7,16,17. Wraz z rozwojem linii myszy wyrażających rekombinazy w określonych typach komórek, możliwe jest zastosowanie jeszcze bardziej wyrafinowanych strategii do kontrolowania ekspresji GECI15. Jednak, chociaż narzędzia te są coraz potężniejsze, istnieje wiele powodów, dla których inne gatunki, takie jak szczury, mogą być bardziej odpowiednie do niektórych pytań eksperymentalnych. Należą do nich większy rozmiar, ułatwiający szereg eksperymentalnych manipulacji, które są trudne, jeśli nie niemożliwe, w przypadku mniejszej myszy; łatwość szkolenia szczurów w stosunkowo złożonych zadaniach behawioralnych; i przynajmniej kilka dowodów na to, że właściwości biofizyczne i wzorce ekspresji kilku kanałów jonowych w neuronach czuciowych szczurów mogą być bardziej podobne do tych obserwowanych w ludzkich neuronach czuciowych niż te same kanały u myszy w stosunku do klasy human<sup="xref">18.
Podczas gdy transdukcja bodźców somatosensorycznych zazwyczaj odbywa się w peryferyjnych końcach pierwotnych aferentów, potencjał czynnościowy zainicjowany na peryferiach musi przejść przez strukturę, w której mieści się pierwotna somata aferentna, określana jako korzeń grzbietowy (DRG) lub zwoje nerwu trójdzielnego (TG), zanim dotrze do ośrodkowego układu nerwowego19. Chociaż istnieją dowody na to, że nie każdy potencjał czynnościowy rozchodzący się wzdłuż pierwszorzędowego aksonu aferentnego zaatakuje ciało komórki20, co jest konsekwencją faktu, że pierwotne somaty aferentne są połączone z głównym aksonem aferentnym za pomocą złącza T19, większość potencjałów czynnościowych zainicjowanych na peryferiach wydaje się atakować soma21. Daje to trzy korzyści eksperymentalne przy użyciu GECI do oceny kodowania populacji w pierwotnych aferentach: duży rozmiar ciała komórki w stosunku do aksonów dodatkowo zwiększa sygnał do szumu przy użyciu [Ca2 + ]i jako pośredniej miary aktywności aferentnej; DRG są na ogół łatwo dostępne; Ocena aktywności w miejscu, które jest przestrzennie odległe od końcówek doprowadzających, minimalizuje potencjalny wpływ operacji potrzebnej do odsłonięcia zwojów na właściwości bodziec-odpowiedź końcówek doprowadzających. Ponieważ jednak TG znajdują się pod mózgiem (lub nad paletą), są znacznie trudniej dostępne niż DRG. Co więcej, chociaż istnieje wiele podobieństw między neuronami DRG i TG, istnieje również rosnąca lista różnic. Obejmuje to z grubsza somatotopową organizację neuronów w klasie TG<sup="xref">22, unikalne struktury unerwione, różne wzorce zakończenia centralnego końca23,24,25,26, a teraz rosnąca lista różnic zarówno w ekspresji genów27,28 i funkcjonalnym wyrażeniu receptora29. Ponadto, ponieważ jesteśmy zainteresowani identyfikacją obwodowych mechanizmów bólu, stosunkowo duża liczba zespołów bólowych, które wydają się być unikalne dla układu trójdzielnego (np. migrena, neuralgia nerwu trójdzielnego, zespół pieczenia jamy ustnej), które wydają się wiązać z nieprawidłową aktywnością u pierwotnych aferentów30,31,32, sugeruje, że TG musi być badany bezpośrednio. 
Tak więc, podczas gdy właściwości bodźców-odpowiedzi neuronów TG były badane za pomocą GECI w klasie mouse<sup="xref">16, ponieważ powody wymienione powyżej sugerują, że szczur może być bardziej odpowiednim gatunkiem do odpowiedzi na różnorodne pytania eksperymentalne, celem obecnego badania było opracowanie podejścia do wykorzystania GECI do badania neuronów TG u szczura. Aby to osiągnąć, zastosowaliśmy podejście wirusowe do kierowania ekspresją GECI GCaMP6s w obwodowym układzie nerwowym. Następnie usunęliśmy przodomózgowie, aby umożliwić dostęp do TG. Na koniec na twarz nałożono bodźce mechaniczne i termiczne, podczas gdy odpowiedzi neuronalne oceniano pod mikroskopią fluorescencyjną. Razem dane te wspierają rolę wykorzystania szczura do badania zmian w TG w wielu stanach, rozszerzając zestaw narzędzi dla badaczy zainteresowanych kodowaniem sensorycznym w układzie trójdzielnym.

<table><tbody><tr><td>AAV9-CAG-WPRE-GCaMP6s-SV40&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>100844-AAV9</td><td>Wirus AAV9-GCaMP6s</td></tr><tr><td>Maleinian ACEpromazine</td><td>Covetrus</td><td>11695-0095-5</td><td>10 mg/ml</td></tr><tr><td>AnaSed (ksylazyna) do wstrzykiwań</td><td>AKORN Animal Health</td><td>23076-35-9</td><td>20 mg/ml</td></tr><tr><td>CTR5500 Skrzynka elektroniczna</td><td>Leica</td><td>11 888 820</td><td>Zasilacz</td></tr><tr><td>Wiertło do zadziorów</td><td>Cutwell Ransom & Randolph</td><td></td><td>&frac14; okrągły</td></tr><tr><td>DM 6000 FS</td><td>Leica</td><td>11 888 928</td><td>Podstawka</td></tr><tr><td>EL6000</td><td>Leica</td><td>EL6000</td><td>Źródło światła z żarówką rtęciową 120 W</td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td>FST</td><td>11252-00</td><td>Dumont No. 05</td></tr><tr><td>Friedman rongeurs</td><td>FST</td><td>16000-14</td><td>Rozmiar miseczki 2,5 mm</td></tr><tr><td>Friedman-Pearson rongeurs</td><td>FST</td><td>16021-14</td><td>1 mm rozmiar miseczki</td></tr><tr><td>Poduszka grzewcza (podkładka do terapii temperaturowej)</td><td>STRYKER</td><td>8002-062-022</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek ketaminy</td><td>Covetrus</td><td>1695-0703-1</td><td>100 mg/ml</td></tr><tr><td>Plan Fluor 20x/0,40</td><td>Obiektyw Leica</td><td>MRH00105</td><td>20x, 0,4 NA10,8 mm</td></tr><tr><td>Długopis kauteryzacyjny WD Power z uchwytem wysokotemperaturowym</td> Długopis kauteryzacyjny <td>Bovie</td><td>HIT1</td><td>Ręczny długopis kauteryzacyjny Change-A-Tip</td></tr><tr><td>Prime 95B</td><td>Fotometria</td><td>Aparat CMOS Prime 95B</td><td>Saline</td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0291799</td><td>0,9% sterylne ostrze skalpela z soli fizjologicznej</td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>22-079-701</td><td>rozmiar 15 jednorazowe ostrze</td></tr><tr><td>Szpatułka Szpatułka</td><td>BRI</td><td>48-1460</td><td>szpatułka do mózgu</td></tr><tr><td>Nożyczki sprężynowe</td><td>FST</td><td>91500-09</td><td>Student Vannas, krawędź tnąca 5 mm</td></tr><tr><td>Nożyczki sprężynowe</td><td>FST</td><td>15012-12</td><td>Noyes, krawędź tnąca 14 mm</td></tr><tr><td>STP6000 Inteligentny panel dotykowy</td><td>Leica</td><td>11 501 255</td><td>Panel sterowania</td></tr><tr><td>Strzykawka</td><td>Hamilton</td><td>80201</td><td>25 &mu; L Model 1702 Strzykawka Luer Tip</td></tr><tr><td>Podgrzewacz wody</td><td>Adroit</td><td>HTP-1500</td><td></td></tr></tbody></table>

in-vivo (in vivo) obrazowanie wapnia neuronów czuciowych w zwoju trójdzielnym szczura

In-Vivo Calcium Imaging of Sensory Neurons in the Rat Trigeminal Ganglion

Genetycznie kodowane wskaźniki wapnia (GECI) umożliwiają technikom obrazowania monitorowanie zmian wewnątrzkomórkowego wapnia w docelowych populacjach komórek. Ich duży stosunek sygnału do szumu sprawia, że GECI są potężnym narzędziem do wykrywania aktywności wywołanej bodźcem w neuronach czuciowych. GECI ułatwiają analizę kodowania bodźców na poziomie populacji z liczbą neuronów, które mogą być badane jednocześnie. To kodowanie populacji jest najodpowiedniejsze dla porównania in vivo. Zwoje korzenia grzbietowego (DRG), w których znajduje się soma neuronów czuciowych unerwiających struktury somatyczne i trzewne poniżej szyi, są najczęściej wykorzystywane do obrazowania in vivo, ponieważ dostęp do tych struktur jest stosunkowo łatwy. Niedawno technika ta została wykorzystana u myszy do badania neuronów czuciowych w zwoju nerwu trójdzielnego (TG), który unerwia struktury jamy ustnej i twarzoczaszki. Istnieje wiele powodów, dla których warto badać TG oprócz DRG, w tym długą listę zespołów bólowych specyficznych dla struktur jamy ustnej i twarzoczaszki, które wydają się odzwierciedlać zmiany w aktywności neuronów czuciowych, takich jak neuralgia nerwu trójdzielnego. Myszy są najszerzej wykorzystywane w badaniach neuronów DRG i TG ze względu na dostępność narzędzi genetycznych. Jednak ze względu na różnice w wielkości, łatwości obsługi i potencjalnie ważne różnice gatunkowe, istnieją powody, aby badać neurony TG szczurów, a nie myszy. W związku z tym opracowaliśmy podejście do obrazowania neuronów TG szczurów in vivo. Wstrzyknęliśmy nowonarodzonym szczeniętom (p2) dootrzewnowo AAV kodujący GCaMP6s, co spowodowało >90% zakażenie neuronów TG i DRG. TG uwidoczniono u osoby dorosłej po kraniotomii i peeltyce, a zmiany fluorescencji GCaMP6s monitorowano w neuronach TG po stymulacji okolic żuchwy i szczęki twarzy. Potwierdziliśmy, że wzrost fluorescencji był wywołany bodźcem za pomocą blokady nerwów obwodowych. Chociaż podejście to ma wiele potencjalnych zastosowań, używamy go do scharakteryzowania subpopulacji neuronów TG zmienionych w wyniku uszkodzenia nerwów obwodowych.

Ponieważ wcześniej odnieśliśmy sukces w zastosowaniu serotypu AAV9 do infekcji neuronów sensorycznych szczura15, wykorzystaliśmy ten serotyp do ekspresji GCaMP6s w neuronach zwoju szyjnego (TG) szczura. W związku z tym najpierw postanowiliśmy ocenić wydajność infekcji neuronów sensorycznych za pomocą AAV9-CAG-GCaMP6s-WPRE-SV40 (AAV9-GCaMP), gdy wirus ten został podany noworodkom szczurów20. Wirus ten wykorzystuje promotor CAG, który indukuje i utrzymuje wysokie poziomy ekspresji genów. Co więcej, wykazano, że AAV9 efektywnie infekuje neurony sensoryczne po podaniu noworodkom szczurów33. Pierwsze iniekcje obejmowały 5 µL u młodych szczurów w 5. dobie po urodzeniu (p5), co skutkowało wydajnością na poziomie około 51,66% ± 14,33% (Rycina 1A). Aby zwiększyć wskaźnik infekcji, ostatecznie zastosowaliśmy większą objętość wirusa (15 µL) u młodszych szczurów (p2), zachowując ten sam miano wirusa wynoszące 2,4 x 1014. Strategia ta doprowadziła do zainfekowania 91,84% ± 3,18% (n = 8) neuronów (Rycina 1B).
Aby zwizualizować neurony TG unerwiające poduszkę wibrysową, opracowaliśmy następnie strategię chirurgiczną w celu odsłonięcia TG in-vivo. Około 60% przedmózgowia można usunąć bez wpływu na główne ośrodki oddechowe. Odpowiada to tkance mózgowej położonej rostralnie do Bregma -3.80. Schemat odsłoniętego TG (po lewej) oraz obszar unerwienia nerwu podocznego (ION, po prawej) przedstawiono na Rysunku 2. Obszar TG odpowiedzialny za unerwienie poduszki wibrysowej określono poprzez zastosowanie lekkiej stymulacji mechanicznej (pędzelkiem) poduszki wibrysowej przy jednoczesnym monitorowaniu zmian fluorescencji przy 20x. Zgodnie z przewidywaniami, jedynym aktywowanym obszarem był region V2 TG, który unerwia gałąź szczękową twarzy. Oznacza to, że choć nie badano tego systematycznie, nie wykryto zmian fluorescencji w odpowiedzi na bodźce przyłożone do obszarów V1 (skóra czoła) lub V3 (skóra żuchwy), podczas gdy neurony poddawane badaniu mogły być aktywowane bodźcami przyłożonymi do poduszki wibrysowej. Następnie monitorowano zmiany fluorescencji w stanie spoczynku oraz w odpowiedzi na bodźce przyłożone do poduszki wibrysowej. Obszar zainteresowania (V2) zaznaczono na Rysunku 3A. Zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami o stosunkowo niskim poziomie aktywności spoczynkowej w neuronach sensorycznych34, fluorescencja spoczynkowa była stosunkowo niska w większości neuronów i stwierdzono niewiele dowodów na spontaniczne wzrosty fluorescencji (Rysunek 3B). Kryteria stosowane do identyfikacji aktywności wywołanej bodźcem w neuronach obwodowych6,16,21 oraz ośrodkowego układu nerwowego (CNS)12,35,36 stanowią rozwijającą się dziedzinę z kilkoma zaawansowanymi pakietami analizy danych, które zostały udostępnione bezpłatnie37,38. Pełna dyskusja nad zaletami i wadami różnych zastosowanych podejść wykracza poza zakres niniejszego opracowania. Ponieważ nie był to główny cel niniejszego badania, zastosowano stosunkowo arbitralne i subiektywne kryteria oparte na maksymalnej odpowiedzi zaobserwowanej w regionach zwojów, w których nie było wyraźnie wykrywalnych neuronów (na podstawie możliwości dostrzeżenia jądra), tak aby neuron uznano za odpowiadający na bodziec, jeśli wzrost fluorescencji był zsynchronizowany czasowo z aplikacją bodźca (wzrost fluorescencji wykryty w ciągu 1 s od aplikacji bodźca (w oparciu o założenie, że potencjał czynnościowy zainicjowany w najwolniej przewodzących aksonach (0.2 m/s), zapoczątkowany w miejscu oddalonym o nie więcej niż 3 cm od ciała komórki, powinien dotrzeć do ciała komórki w czasie krótszym niż sekunda) i był &gt;6 razy większy od odchylenia standardowego maksymalnej odpowiedzi (ΔF/F) wykrytej w punkcie kontrolnym (Rysunek 3C). Następnie scharakteryzowano właściwości odpowiedzi tych neuronów na bodźce naturalne: dotyk pędzelkiem, bodziec punktowy, ciepło oraz zimno. Przykłady odpowiedzi na każdy z tych bodźców przedstawiono na Rysunku 4. Warto zauważyć, że odpowiedź na stymulację punktową, najczęściej stosowaną w badaniach nad bólem, jest najbardziej wyraźna (Rysunek 4B,F).
Naszym celem przy opracowywaniu tej techniki była możliwość oceny zmian w kodowaniu populacyjnym neuronów TG. W związku z tym zastosowaliśmy model przewlekłego ucisku nerwu ocznego (CCI-ION), wykorzystany wcześniej29, aby badać szczury 2 tygodnie po uszkodzeniu nerwu. Po indukowaniu modelu odsłoniliśmy TG i oceniliśmy aktywność spoczynkową oraz wywołaną w TG po stronie ipsilateralnej i kontralateralnej względem miejsca uszkodzenia. Co ciekawe, amplituda szczytowej odpowiedzi wywołanej przez bodziec szczoteczkowy była około 2-krotnie wyższa po stronie uszkodzonego nerwu w porównaniu do odpowiedzi szczytowej na ten sam bodziec zastosowany po stronie przeciwległej (Rysunek 5A-C). Ponadto, gdy dwa bodźce szczoteczkowe były stosowane szeregowo (z odstępem między bodźcami wynoszącym 10 s), zaobserwowano znaczną amplifikację amplitudy odpowiedzi na drugi bodziec po stronie uszkodzonej, czego nie stwierdzono po stronie nieuszkodzonej (Rysunek 5D).
W ramach końcowego eksperymentu kontrolnego, mającego na celu potwierdzenie, że wywołany bodźcem wzrost fluorescencji wynikał z potencjałów czynnościowych zainicjowanych w obwodzie, oceniono wpływ tetrodotoksyny (1 µM) na odpowiedzi wywołane bodźcem. TTX wstrzyknięto w objętości 200 µL przezskórnie, zgodnie z wcześniejszym opisem28, tak aby objąć nerw podoczodołowy. Jak pokazano na Rysunku 6, aktywność wywołana została niemal całkowicie wyeliminowana. Podsumowując, wyniki te demonstrują przydatność zastosowania AAV9-GCaMP do badania odpowiedzi populacyjnych zwoju trójdzielnego in-vivo.
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna neuronów, markery AAV9 GCaMP6s i NeuN, wykres procentowy GCaMP6s+." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65978/65978fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Wysoka wydajność infekcji GCaMP6s w neuronach TG po noworodkowym wstrzyknięciu AAV. (A) Szczurzęta w wieku P5 otrzymały domięśniowo 5 µL wirusa pAAV9-CAG-GCaMP6s-WPRE-Sv40 (miano: 2,4 x 1014): ekspresję GCaMP6s wykryto w 51,7 ± 14,3% neuronów TG (n = 3 skrawki na zwierzę, 7 szczurów). (B) Zwiększenie objętości wstrzykniętej dawki do 15 µL u młodszych zwierząt (p2) poprawiło wydajność infekcji: ekspresję GCaMP6s wykryto w 91,8 ± 3,2% neuronów TG (n = 3 skrawki na zwierzę, 8 szczurów). Panele po lewej stronie barwiono pod kątem GCaMP6s. Panele w środku barwiono NeuN, markerem swoistym dla neuronów. Panele po prawej to obraz scalony paneli GCaMP6s i NeuN. Pasek skali na pierwszym panelu jest taki sam dla wszystkich kolejnych paneli. Wykres po prawej przedstawia ekspresję GCaMP6s (średnia ± SEM) jako procent całkowitej liczby neuronów na skrawku na zwierzę, gdzie poszczególne punkty reprezentują dane dla każdego zwierzęcia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65978/65978fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat zwoju trójdzielnego (TG); głowa myszy, obszar stymulacji, zaznaczony nerw podoczodołowy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65978/65978fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Lokalizacja zwoju trójdzielnego (TG), nerwu podoczodołowego (ION) oraz stymulowanego obszaru twarzy (poduszeczka wibris); (A) Przedmózowie zostało usunięte, aby umożliwić dostęp do TG. (B) Obszar twarzy, w którym stosowano bodźce naturalne, w odniesieniu do ION i TG. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65978/65978fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Odpowiedź kory wzrokowej, analiza obrazowania wapniowego, linia bazowa vs stymulacja pędzlem, wykres zmiany fluorescencji." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65978/65978fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Wywołany bodźcem wzrost fluorescencji GCaMP6s. (A) Całe pole widzenia przy 20-krotnym powiększeniu. Wskazano gałąź oczną (V1) i szczękową (V2) zwoju trójdzielnego (TG). (B,C) Obszar zaznaczony ramką przedstawiono na panelach B oraz C, które są odpowiednio obrazami fluorescencji przed i po stymulacji pędzlem poduszki wibrysowej. Białe koła to porównawcze obszary zainteresowania (ROI). Neurony uznano za reagujące na bodziec na podstawie szczytowej zmiany fluorescencji zaobserwowanej w porównawczych obszarach zainteresowania, zgodnie z opisem w tekście. Pasek skali na pierwszym panelu jest taki sam dla obu paneli. (D) Reprezentatywne zmiany fluorescencji neuronów pokazanych na panelach B i C w odpowiedzi na stymulację pędzlem zastosowaną na pysk. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65978/65978fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Obrazy mikroskopowe stanu podstawowego i stymulacji wraz z wykresami odpowiedzi; analiza aktywności neuronów sensorycznych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65978/65978fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Klasyfikacja neuronów na podstawie ich odpowiedzi na bodźce przyłożone do pyska. Reprezentatywne obrazy neuronów TG przed (panele górne – Baseline) i po (panel środkowy – Stimulation) odpowiedziach na stymulację pędzlem z wielbłądziej sierści 1 cm (A – Brush), siatką monofilamentów 1 cm2 (B – Punctate), ogrzewaniem (C – Heat) i chłodzeniem (D – Cold) w tym samym obszarze pyska. Pasek skali w pierwszym panelu jest taki sam dla wszystkich kolejnych paneli. Pomarańczowe okręgi oznaczają przykład neuronu reagującego. Białe okręgi to porównawcze obszary zainteresowania (ROI). (E-H) Reprezentatywne zapisy każdej odpowiedzi na dany bodziec. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65978/65978fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres odpowiedzi neuronalnej i wykres słupkowy; analiza ΔF/F; strona przeciwległa vs. ta sama; porównanie danych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65978/65978fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Uszkodzenie nerwu zwiększa odpowiedzi wywołane pędzlem w neuronach zwoju trójdzielnego (TG). Typowe odpowiedzi neuronów TG na dwukrotne przykładanie pędzla do pyska szczura po stronie przeciwległej do przewlekłego ucisku nerwu podocznego (A, Contra) lub po stronie tej samej co uszkodzenie nerwu (B, Ipsi). (C) Analiza zbiorczych danych z neuronów reagujących u sześciu szczurów (naniesione dane dotyczą pojedynczego szczura) potwierdziła, że różnica w wielkości pierwszej odpowiedzi na pędzel była istotna (test t-studenta dla prób zależnych). (D) Po przeanalizowaniu szczytowej odpowiedzi na pierwszy i drugi bodziec jako stosunku (R2/R1), analiza zbiorczych danych potwierdziła, że wzrost stosunku odpowiedzi po stronie z uszkodzonym nerwem był istotny. ** p &lt; 0,01 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65978/65978fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Intensywność fluorescencji (ΔF/F) w czasie na wykresie A; porównanie odpowiedzi szczytowej na wykresie słupkowym B." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65978/65978fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6: Blokowanie aktywności wywołanej w neuronach zwoju TG za pomocą tetrodotoksyny (TTX). (A) Dane fluorescencyjne z neuronów TG po stronie ipsilateralnej do uszkodzenia nerwu po wstrzyknięciu TTX (200 µL, 1 µM) w sąsiedztwie nerwu podoczodołowego po zastosowaniu bodźca szczoteczkowego (niebieski pasek). (B) Połączone dane odpowiedzi szczytowej od trzech szczurów. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65978/65978fig06large.jpg" target="_blank">Aby zobaczyć większą wersję tego rysunku, kliknij tutaj.</a>

Genetycznie kodowane wskaźniki wapnia (GECI) umożliwiają solidną analizę na poziomie populacji sygnalizacji neuronów czuciowych. W tym miejscu opracowaliśmy nowatorskie podejście, które pozwala na wizualizację in vivo GECI aktywności neuronów zwojów nerwu trójdzielnego szczurów.

In-vivo (in vivo) Obrazowanie wapnia neuronów czuciowych w zwoju trójdzielnym szczura

Genetically encoded calcium indicators (GECIs) enable imaging techniques to monitor changes in intracellular calcium in targeted cell populations. Their ...

Ogólnym celem naszego laboratorium jest zrozumienie obwodowych mechanizmów bólu. Mój projekt skupia się na bólu związanym z uszkodzeniem nerwu trójdzielnego. Preparat, który dzisiaj pokazuję, pozwala nam scharakteryzować zmiany w kodowaniu sensorycznym i zidentyfikować subpopulacje aferentne przyczyniające się do bólu neuropatycznego.Wykazaliśmy więc, że istnieją różnice między aferentami trójdzielnymi i somatycznymi w odpowiedzi na uszkodzenie nerwów. W szczególności Nav 1.1 jest preferencyjnie regulowany w górę w nerwie trójdzielnym, co sugeruje, że selektywne blokery dla Nav 1.1 mogą być stosowane do identyfikacji różnych subpopulacji aferentnych, które przyczyniają się do bólu neuropatycznego. Tak więc myszy transgeniczne są obecnie najszerzej stosowane w połączeniu z różnymi strategiami obrazowania i opartymi na omii.Tłumaczenie danych generowanych u myszy na inne gatunki, jeśli nie ludzi. Myszy są naprawdę małe, trudno je wytresować, a lista różnic między myszami, szczurami i ludźmi rośnie. Tak więc wykorzystanie szczurów może pomóc w rozwiązaniu kilku z tych problemów.Mechanizmy bólu i potencjalne cele terapeutyczne różnią się w strukturach twarzoczaszki, takich jak te nad szyją oraz inne struktury somatyczne i trzewne, tj. te poniżej szyi. Wyniki uzyskane dzięki temu preparatowi sugerują, że istnieje składnik bólu neuropatycznego, który wcześniej uważano, że odzwierciedla zmiany w ośrodkowym układzie nerwowym, ale w rzeczywistości może również odzwierciedlać zmiany w obwodowym układzie nerwowym.Na początek użyj 25-mikrolitrowej strzykawki Hamiltona, aby dootrzewnowo wstrzyknąć znieczulonym szczeniętom szczurów 15 mikrolitrów agenu. Następnie zgol włosy i wąsy znieczulonych sześcio- lub ośmiotygodniowych szczeniąt, zamontuj szczura na stereotaktycznej ramie z nausznikami i umieść pod spodem poduszkę grzewczą, aby utrzymać temperaturę ciała zwierzęcia. Następnie umieść gazę zanurzoną w lodowatej soli fizjologicznej na głowie szczura, aby zminimalizować krwawienie.Za pomocą skalpela w rozmiarze 15 wykonaj nacięcie na linii środkowej skóry i mięśnia nad czaszką. Odciągnij skórę i mięśnie, aby odsłonić czaszkę za pomocą okrągłego wiertła jeden na cztery, ostrożnie przebij nasadkę czaszki, aby odsłonić przodomózgowie. Następnie użyj rongeurs, aby przeciąć czaszkę.Za pomocą skalpela w rozmiarze 15 wykonaj nacięcie w mózgu i opuszki węchowej. Użyj szpatułki, aby ostrożnie odłączyć oponę twardą od czaszki. Następnie delikatnie podnieś odcięty mózg, aby wyświetlić zwój nerwu trójdzielnego i podstawę czaszki.Kauteryzuj wszelkie krwawienia za pomocą długopisu do kauteryzacji. Aby zobrazować GCaMP6s, umieść jamę czaszki pod obiektywem mikroskopu. Następnie ustaw ostrość na zwoju końcowym.Następnie nałóż bodźce mechaniczne na jeden centymetr kwadratowy twarzy. Użyj obiektywu 20x, aby zwizualizować neurony zwoju nerwu trójdzielnego, które reagują na bodziec. Aby zebrać stato fluorescencyjne w czasie za pomocą oprogramowania do akwizycji, naciśnij przycisk akwizycji strumienia w menu akwizycji, a następnie ustaw liczbę klatek na 300 i czas akwizycji na 90 sekund.Ustaw parametry aparatu, aby rejestrować obrazy z szybkością klatek. Uzyskano stabilne zapisy linii bazowej przez trzy minuty. Większa objętość miana wirusa powodowała zwiększoną infekcję neuronalną młodych szczurów.Lekka symulacja mechaniczna aktywowała tylko obszar V2 zwoju nerwu trójdzielnego. Fluorescencja spoczynkowa była stosunkowo niska w większości neuronów, z niewielkimi spontanicznymi wzrostami. Naturalne bodźce, w szczególności stymulacja punktowa, wywoływały najsilniejsze reakcje neuronalne.Bodźce szczotkowe w modelach przewlekłych urazów zwężonych wywołały dwukrotny wzrost wielkości szczytowej odpowiedzi po stronie zranionej w porównaniu ze stroną przeciwległą. Gdy dwa bodźce zostały zastosowane szeregowo, nastąpiło znaczne wzmocnienie w odpowiedzi na drugi bodziec.

in-vivo-calcium-imaging-sensory-neurons-rat-trigeminal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Źródło: Shannonhouse, J., et al. In vivo Obrazowanie wapniowe zespołów neuronalnych w sieciach pierwotnych neuronów czuciowych w nienaruszonych zwojach korzenia grzbietowego. J. Vis. Exp. (2023). Film przedstawia technikę obrazowania wapnia in vivo w celu monitorowania aktywności neuronalnej w zwojach korzenia grzbietowego (DRG) myszy transgenicznej. Neurony DRG wyrażają wskaźnik wapnia, który zwiększa intensywność fluorescencji po związaniu się z wapniem. Bodźce mechaniczne lub termiczne...

Obrazowanie in vivo wapnia zespołów neuronalnych w nienaruszonych zwojach korzenia grzbietowego myszy

Tutaj prezentujemy, jak odsłonić kolankowaty ganglion żywej, znieczulonej myszy laboratoryjnej i jak wykorzystać obrazowanie wapnia do pomiaru reakcji zespołów tych neuronów na bodźce smakowe, co pozwala na wielokrotne próby z różnymi stymulantami. Pozwala to na dogłębne porównania, które neurony reagują na które degustacje.

Obrazowanie wapnia in vivo reakcji neuronów zwojowych układu nerwowego myszy na bodźce smakowe

Ten protokół opisuje chirurgiczną ekspozycję zwoju korzenia grzbietowego (DRG), a następnie GCaMP3 (genetycznie kodowany wskaźnik Ca2+; Białko zielonej fluorescencji-białko kalmoduliny-M13 3) Ca2 + obrazowanie zespołów neuronalnych przy użyciu myszy Pirt-GCaMP3 przy jednoczesnym stosowaniu różnych bodźców do ipsilateralnej tylnej łapy.

In vivo (in vivo) Obrazowanie wapniowe zespołów neuronalnych w sieciach pierwotnych neuronów czuciowych w nienaruszonych zwojach korzenia grzbietowego

Obecny protokół opisuje obrazowanie wapnia in vivo do pomiaru odpowiedzi zespołów neuronów DRG lędźwiowych-6 na bodźce somatyczne i trzewne. Można dokonać dokładnych porównań między neuronami reagującymi na różne bodźce. Protokół ten jest cenny w badaniu mechanizmów bólu trzewnego i stymulacji somatycznej, takich jak akupunktura.

In vivo (in vivo) Obrazowanie wapniowe reakcji neuronów zwojów korzenia grzbietowego na bodźce somatyczne i trzewne

Protokół ten opisuje obrazowanie wapnia in vivo GCaMP nienaruszonych neuronów zwoju trójdzielnego (TG). Opis ten obejmuje chirurgię ekspozycji na TG, obrazowanie neuronów TG za pomocą mikroskopii konfokalnej in vivo , zastosowanie bodźców somatycznych podczas obrazowania mikroskopowego neuronów TG oraz analizę danych obrazowania wapnia GCaMP in vivo .

In vivo (in vivo ) Obrazowanie wapniowe zespołów neuronalnych w sieciach pierwotnych neuronów czuciowych w nienaruszonych zwojach nerwu trójdzielnego

W niniejszej pracy przedstawiamy metodologię szybkiego obrazowania fluorescencyjnego z wysoką rozdzielczością przy użyciu barwników wrażliwych na napięcie w celu analizy szczegółowej aktywności neuronów w zwoju stomatogastrycznym kraba.

Obrazowanie optyczne neuronów w zwoju stomatogastrycznym kraba z wykorzystaniem barwników napięciowo-czułych

Prezentujemy protokół elektroporacji in vivo do transfekcji pojedynczych komórek lub małych skupisk komórek zwojowych siatkówki (RGCs) oraz innych typów komórek siatkówki u myszy postnatalnych w szerokim zakresie wieku. Zdolność do znakowania i genetycznej manipulacji postnatalnymi RGCs in vivo stanowi potężne narzędzie w badaniach nad rozwojem.

Transfekcja komórek zwojowych siatkówki myszy za pomocą elektroporacji in vivo

Przedstawiamy technikę lentiwirusową służącą do manipulacji genetycznej i wizualizacji pojedynczego aksonu neuronu sensorycznego węchu oraz jego arboryzacji terminalnej in vivo.

Lentiwirusowa manipulacja genetyczna i wizualizacja neuronów sensorycznych węchu in vivo

Dzięki małemu, przezroczystemu ciału, dobrze udokumentowanej neuroanatomii i mnóstwu podatnych technik genetycznych i odczynników, C. elegans stanowi idealny organizm modelowy do obrazowania neuronów in vivo przy użyciu stosunkowo prostych, tanich technik. Tutaj opisujemy obrazowanie pojedynczego neuronu u nienaruszonych dorosłych zwierząt przy użyciu genetycznie kodowanych fluorescencyjnych wskaźników wapnia.

In vivo (in vivo) Obrazowanie wapnia neuronów u C. elegans

Ten manuskrypt opisuje protokół obrazowania in vivo siatkówki myszy za pomocą optycznej koherentnej tomografii spektralnej o wysokiej rozdzielczości (SD-OCT). Koncentruje się na komórkach zwojowych siatkówki (RGC) w okolicy okołobrodawkowatej, z opisanymi kilkoma podejściami do skanowania i kwantyfikacji.

Optyczna tomografia koherentna: obrazowanie komórek zwojowych siatkówki myszy in vivo

Poznaj metodę obrazowania wapnia w zwoju trójdzielnym szczura za pomocą wskaźników GECI. Ta technika pozwala analizować sygnalizację neuronów czuciowych i identyfikować podpopulacje aferentów związane z bólem neuropatycznym.

In-vivo (in vivo) Obrazowanie wapnia neuronów czuciowych w zwoju trójdzielnym szczura

Przeglądaj więcej filmów