Kriokonserwacja pierwotnych komórek rozrodczych i ożywienie szczepów Drosophila

Szczep Drosophila musi być utrzymywany poprzez częste przenoszenie dorosłych much do nowych fiolek. Stwarza to niebezpieczeństwo pogorszenia się sytuacji mutacyjnej i zmian genetycznych. Naszym celem jest opracowanie alternatywnej metody długoterminowego zachowania szczepów Drosophila bez takich zmian.

W porównaniu z edycją in vivo, edycja genomu pierwotnych komórek rozrodczych (PGC) może zwiększyć nieefektywność efektu dominacji i spowodować bardziej skomplikowane zmiany genomowe. Tym samym szerokie zastosowanie manipulacji PGC ułatwia inżynierię genetyczną w wielu dziedzinach. Teraz skupimy się na ksenotransplantacji.

Wykorzystując Drosophila melanogaster jako zastępczego gospodarza, udało nam się ożywić zasoby gatunków komórek w podgrupie gatunków melanogaster. Odnosząc się do barier ksenotransplantacji i znajdując możliwe rozwiązania, chcielibyśmy zbadać potencjalne zastosowanie przeszczepu PGC i krioprezerwacji. Przystąp do pobierania pierwotnych komórek rozrodczych lub PGC z zarodków Drosophila po złożeniu systemu mikromanipulatora.

Podczas pracy pod mikroskopem stereoskopowym użyj kleszczy do transferu zarodków. Ułóż zarodki z odciętą kosmówką w dwóch rzędach na szkiełku podstawowym do pobierania PGC wzdłuż dwóch linii odniesienia. Ustaw zarodki przodem do prawej i brzuszną stroną do góry.

Delikatnie przesunąć końcówkę igły do przeszczepu do przedniego końca zarodka. Penetruj zarodek, przesuwając stolik mikroskopu i lekko cofnij igłę, gdy końcówka dotrze do tylnego końca. Wypuścić żółtko z igły do wnętrza warstwy komórek somatycznych.

Przesunąć końcówkę igły do tylnego bieguna i delikatnie załadować PGC do igły, nie zajmując dużo czasu. Szybko wyciągnij igłę z zarodka. Usunąć żółtko i inne zanieczyszczenia z igły, zachowując PGC.

Załaduj czysty olej silikonowy z basenu do igły. Przed pobraniem PGC z nowego zarodka należy zdeponować jak najwięcej oleju silikonowego w warstwie komórek somatycznych, jednocześnie utrzymując załadowane PGC w igle. Po zebraniu PGC ze wszystkich zarodków z rzędu, umieść PGC na powierzchni zarodka i wyładuj żółtko lub inne zanieczyszczenia na inny sąsiedni zarodek.

W podobny sposób zbierz i połącz PGC z zarodków w drugim rzędzie. Przystąp do kriokonserwacji pierwotnych komórek rozrodczych lub PGC. Po pobraniu i zdeponowaniu PGC z zarodków dawcy na powierzchni zarodka.

Umyj igłę do przeszczepu środkiem krioprotekcyjnym lub CPA i załaduj do igły świeży CPA. Dodaj załadowany CPA do PGC zdeponowanych na zarodku, upewniając się, że objętość CPA jest równoważna objętości PGC. Usuń nadmiar CPA z grupy PGC od jednej do dwóch sekund po dodaniu CPA.

Następnie opróżnij igłę i załaduj ją olejem silikonowym na pięć sekund lub dłużej. Załaduj wszystkie zebrane PGC do igły, a następnie ponownie załaduj olej silikonowy na pięć sekund lub dłużej. Upewnij się, że PGC są umieszczone między dwiema warstwami oleju silikonowego.

Odłączyć igłę od mikromanipulatora. Za pomocą miękkiej bibuły zetrzyj olej z powierzchni igły, nie dotykając końcówki igły chusteczką. Przymocuj igłę do uchwytu na igłę i za pomocą taśmy winylowej zablokuj ją w miejscu u podstawy.

Błyskawicznie zamroź uchwyt z igłą skierowaną w dół, zanurzając go w ciekłym azocie. Nie zwalniaj uchwytu, dopóki płyn nie przestanie musować z rusztu. Przechowywać uchwyt w zbiorniku magazynującym ciekły azot w obszarze fazy ciekłej.

Aby rozpocząć, wyrównaj zarodki gospodarza Drosophila w stadium pięciu na szkiełku transplantacyjnym. Ustawiając ich tył w prawo i brzusznie do góry, ustaw około 30 zarodków w dwóch rzędach w ciągu 20 minut. Rozmrozić kriokonserwowane PGC w igle, zanurzając uchwyt z igłą skierowaną w dół w roztworze EBR o temperaturze pokojowej.

Trzymaj go zanurzonego przez 10 sekund. Umieść szkiełko do przeszczepu na stoliku mikroskopowym. Przymocuj rozmrożoną igłę do uchwytu kapilary i umieść pierwszy zarodek w lewym rzędzie, a końcówkę igły w tej samej płaszczyźnie ogniskowej.

Używając soczewki obiektywowej 20X, delikatnie umieść końcówkę igły na powierzchni tylnego końca zarodka. Delikatnie szturchaj zewnętrzną stronę każdego zarodka i upewnij się, że powoli wracają do swojego pierwotnego kształtu. Penetruj zarodek od tylnego bieguna za pomocą igły.

Delikatnie umieść około 10 do 20 PGC wewnątrz tylnego bieguna, szczególnie między błoną witeliny a warstwą komórek somatycznych i wycofaj igłę z zarodka przed powtórzeniem tego samego dla kolejnych zarodków. Wreszcie, aby ożywić szczep, krzyżuj nowo pojawiające się samice i samce.