Name: Kriokonserwacja pierwotnych komórek rozrodczych i ożywienie szczepów Drosophila (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-01T12:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 22 s
Description: Poznaj metodę kriokonserwacji pierwotnych komórek rozrodczych Drosophila i ich ksenotransplantację w celu ożywienia szczepów. Technika ta umożliwia długoterminowe przechowywananie materiału genetycznego bez ryzyka mutacji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Centrum Hodowli KYOTO Drosophila za szczepy much. Dziękujemy również Pani Wandzie Miyacie za angielskojęzyczną redakcję manuskryptu oraz dr Jeremy'emu Allenowi z Edanz (https://jp.edanz.com/ac) za redakcję szkicu tego rękopisu. Prace te były wspierane przez granty (JP16km0210072, JP17km0210146, JP18km0210146) z Japońskiej Agencji Badań i Rozwoju Medycznego (AMED) dla T.T.-S.-K., granty (JP16km0210073, JP17km0210147, JP18km0210145) od AMED dla S.K., grant (JP20km0210172) od AMED dla T.T.-S.-K. oraz S.K., dotację na badania naukowe (C) (JP19K06780) od Japońskiego Towarzystwa Promocji Nauki (JSPS) na rzecz T.T.-S.-K. oraz dotację na badania naukowe w obszarach innowacyjnych (JP18H05552) od JSPS na rzecz S.K.

1. Przygotowanie sprzętu
<ol>
	<li>System mikromanipulatora: Zmontuj system mikromanipulatora do zbierania i przeszczepiania komórek (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A).</li>
	<li>Szkiełka szklane z kolekcji PGC (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A)
	<ol>
		<li>Aby przygotować klej heptanowy, odetnij dwustronną taśmę o długości około 30 cm i namocz ją przez noc w 7 ml technicznego (zwykłego) roztworu heptanu.</li>
		<li>Narysuj dwie równoległe linie odniesienia do wyrównania zarodków na odwrocie szklanego szkiełka.</li>
		<li>Rozprowadź krople powyższego kleju heptanowego na szkiełku podstawowym (po stronie bez linii) za pomocą pipety Pasteura. Wysusz powierzchnię szkiełka na powietrzu, aż stanie się biała.</li>
		<li>Powtórz dodawanie i rozprowadzanie kropli kleju heptanowego i ponownie wysusz szkiełko. 
		UWAGA: Klej zapobiega rozlewaniu się płynnych roztworów po płaskiej powierzchni i ułatwia ładowanie roztworów wodnych do igły.</li>
		<li>Aby wykonać ramki do puli zarodków, przyklej trzy warstwy standardowej taśmy winylowej o grubości 0,2 mm, takiej jak taśma izolacyjna, na desce do krojenia. Pokrój taśmę na prostokąty o szerokości 1,5 cm. Następnie odetnij wszystkie trzy warstwy taśmy, pozostawiając ramkę o grubości od 2 do 3 mm. 
		UWAGA: Ramka puli zarodków jest mocowana po wyrównaniu zarodków, aby utworzyć pulę dla zarodków.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Igły do przeszczepów 
	UWAGA: Wszystkie dostępne na rynku igły w czasie tego badania były zbyt wąskie lub zbyt szerokie do kriokonserwacji PGC.
	<ol>
		<li>Zrób igłę za pomocą szklanej kapilary i ściągacza. Używamy ściągacza NARISHIGE PN-31 z poziomem grzałki na poziomie 85,0-98,4, poziomem głównym magnesu na 57,8 i poziomem podrzędnym magnesu na 45,0.</li>
		<li>Aby wykonać igłę o przybliżonej grubości ścianki 1 μm i końcówce o długości około 200 μm i średnicy wewnętrznej 10-12 μm, wypoleruj końcówkę igły w następującym trzyetapowym procesie (<silna klasa = "xfig">Rysunek 3). Najpierw zetrzyj końcówkę igły pod kątem 30° z prędkością 780 obr./min, aż końcówka będzie miała średnicę wewnętrzną 10-12 μm. Ten pierwszy etap mielenia trwa około 1 godz. 
		UWAGA: Aby uniknąć złamania końcówki igły, najpierw obróć kamień szlifierski, a następnie delikatnie przesuń igłę w dół na kamień szlifierski.</li>
		<li>Narysuj linię na górze igły, aby śledzić żądany kąt. Obróć igłę w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara o 90° i ponownie wypoleruj ją z prędkością 180 obr./min. Trwa to około 5 minut.</li>
		<li>Obróć igłę zgodnie z ruchem wskazówek zegara o 45° i poleruj ją z prędkością 180 obr./min przez jedną sekundę.</li>
		<li>Umieść szkiełko zbiorcze z kroplą mieszaniny kwasu chromowego (UWAGA: toksyczny) na stoliku mikroskopu. Przymocuj igłę do uchwytu kapilarnego (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1D) pod kątem 10°-13° w stosunku do powierzchni szkiełka, ostrożnie przesuń igłę w dół i zanurz końcówkę w mieszaninie kwasu chromowego.</li>
		<li>Pociągając i popychając tłok (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B), kilkakrotnie mechanicznie załaduj i opróżnij roztwór z igły, aby usunąć szklane zanieczyszczenia z igły. Pamiętaj, aby wyczyścić również ścianę zewnętrzną.</li>
		<li>Umyć igłę dwa razy wewnątrz i na zewnątrz wodą destylowaną, aby całkowicie usunąć kwas chromowy.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Zbieranie i kriokonserwacja PGC
<ol>
	<li>Pobieranie zarodków
	<ol>
		<li>Przenieść odpowiednią liczbę muszek ze szczepu dawcy będącego przedmiotem zainteresowania (około 450 dla każdej płci dla kubka do pobierania zarodków) do kubka do pobierania zarodków z płytką do pobierania zarodków (<silna klasa="xfig">Rysunek 1E) i inkubować je w temperaturze 25 °C. Zwykle używamy 3- do 5-dniowych much rodzicielskich, które są hodowane w mniej zatłoczonych warunkach w temperaturze pokojowej (23-25 °C).</li>
		<li>Wykonaj dwie 30-minutowe zbiórki wstępne i wyrzuć wszystkie złożone jaja. Ponieważ samice mogą zachować zapłodnione jaja, które rozwijają się w jajowodzie, ten krok jest wymagany do synchronizacji składania jaj w kroku 2.1.3 (<silna klasa="xfig">Rysunek 4).</li>
		<li>Po dwóch wstępnych pobraniach należy pobierać zarodki przez 50 minut, a następnie inkubować pobrane zarodki w wilgotnej komorze w temperaturze 25 °C, aby umożliwić zarodkom rozwinięcie się do stadium blastodermy (wczesne stadium 517). Czas inkubacji wynosi zwykle 100 minut, ale może być wydłużony do 120 minut, w zależności od szczepu (<silna klasa="xfig">Rysunek 4). 
		UWAGA: Nawilżaną komorę tworzy się poprzez umieszczenie wilgotnego ręcznika papierowego na dnie plastikowego pudełka i spryskanie go mgiełką wody przed użyciem. We wczesnym stadium 5 zarodki tworzenie PGC jest zakończone, ale cellaryzacja somatyczna nie. Dokładny etap rozwoju zarodka określa się pod mikroskopem złożonym w kroku 2.4.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zarodki dechorionujące
	<ol>
		<li>Umieść kroplę wody destylowanej na sitku ze stali nierdzewnej (oczka 150, otwór 109 μm, średnica drutu 60 μm; <silna klasa="xfig">Rysunek 1F). Za pomocą kleszczy zbierz zarodki z płytki do pobierania zarodków i umieść je w kropli wody.</li>
		<li>Dociśnij bibułę do sitka od spodu, aby wchłonąć wodę. Dodaj kropelki świeżego 5% (jako Cl) roztworu podchlorynu sodu do zarodków i ciągle stukaj w sitko przez 10 sekund.</li>
		<li>Umyj zarodki, spryskując je bezpośrednio wodą destylowaną i dociśnij bibułkę do sitka od spodu, aby wchłonąć wodę. Powtórz ten krok 3 razy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyrównywanie zarodków z odkorzą
	<ol>
		<li>Pod mikroskopem stereoskopowym użyj kleszczy do transferu zarodków. Ustaw zdekorionowane zarodki w dwóch rzędach na szkiełku podstawowym do pobierania PGC wzdłuż dwóch linii odniesienia (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2A). Zarodki są zorientowane przodem do prawej strony (strona, która ma być manipulowana), a brzuszną stroną do góry. 
		UWAGA: Ten etap powinien zostać zakończony w ciągu 20 minut, podczas których zwykle wyrównujemy około 40 zarodków.</li>
		<li>Umieścić ramkę puli zarodków wokół zarodków na szkiełku podstawowym do pobierania PGC. Upuść 1 μl roztworu CPA (1x roztwór Ringera Ephrussi-Beadle'a, EBR, zawierający 20% glikolu etylenowego i 1 M sacharozy; 1x EBR: 130 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2 i 10 mM Hepes przy pH 6,9) w dwóch oddzielnych miejscach w obszarze zamkniętym przez ramę i napełnij basen olejem silikonowym, aby zapobiec wysychaniu zarodków (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A). 
		UWAGA: Aby przygotować roztwór CPA, całkowicie rozpuść 10,26 g sacharozy w około 20 ml destylowanegoH2Ozawierającego 3 ml 10 x roztworu EBR. Dodać 6 ml glikolu etylenowego, a następnie dodać destylowanyH2Odo 30 ml. Po dokładnym wymieszaniu przefiltruj roztwór przez jednorazową membranę o średnicy 0,22 mm.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zbieranie PGC
	<ol>
		<li>Umieścić szkiełko podstawowe z tworzywa sztucznego do pobierania próbek PGC, o którym mowa w kroku 2.3.2, na stoliku mikroskopu wyposażonym w system mikromanipulatora. Przymocuj igłę do uchwytu kapilary i umieść pierwszy zarodek w lewym rzędzie, a końcówkę igły w tej samej płaszczyźnie ogniskowej. Załaduj olej silikonowy do igły na 2-3 s.</li>
		<li>Rozpocznij pobieranie PGC od zarodków w lewym rzędzie. Używając soczewki obiektywowej 20x, delikatnie przesuń końcówkę igły do powierzchni przedniego końca zarodka i wbij zarodek w kierunku tylnego końca, nie przesuwając igły, ale przesuwając stolik mikroskopu.</li>
		<li>Gdy końcówka igły dotrze do tylnego końca, lekko cofnij igłę i całkowicie rozładuj żółtko z igły tuż wewnątrz warstwy komórek somatycznych.</li>
		<li>Utrzymując stałe ciśnienie w igle, przesuń końcówkę igły do PGC tuż wewnątrz tylnego bieguna i delikatnie, ale nie zajmując dużo czasu, załaduj PGC.</li>
		<li>Szybko wyciągnij igłę z zarodka i wypuść żółtko i inne zanieczyszczenia z igły do basenu oleju silikonowego, utrzymując PGC w igle. Następnie załaduj czysty olej silikonowy z basenu.</li>
		<li>Powtórzyć kroki od 2.4.2 do 2.4.5 dla pozostałych zarodków w lewym rzędzie. Przed pobraniem PGC od nowego zarodka należy zdeponować jak najwięcej oleju silikonowego załadowanego w kroku 2.4.5 wewnątrz warstwy komórek somatycznych, trzymając jednocześnie załadowane PGC w igle. Gwarantuje to, że nowo załadowane PGC sąsiadują z poprzednio zebranymi PGC bez żadnego materiału pośredniego między nimi.</li>
		<li>Po zakończeniu pobierania PGC z zarodków w lewym rzędzie, należy w miarę możliwości oddzielić PGC od żółtka i innych zanieczyszczeń. Aby to osiągnąć, umieść wszystkie PGC w igle na powierzchni zarodka i usuń wszelkie żółtka lub inne zanieczyszczenia z innego sąsiedniego zarodka.</li>
		<li>Następnie zbierz PGC z zarodków w prawym rzędzie. Połącz PGC zebrane z prawego i lewego rzędu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Stosowanie środka krioprotekcyjnego (CPA) do PGC
	<ol>
		<li>Po umyciu igły z CPA w jednej kropli, załaduj świeży CPA w innej kropli do igły i dodaj CPA do PGC osadzonych na zarodku. Wielkość CPA powinna być równoważna wielkości CPC.</li>
		<li>Usuń jak najwięcej CPA z klastra PGC 1-2 s po dodaniu CPA. PGC nieznacznie się kurczą i stają się kwadratowe natychmiast po dodaniu CPA.</li>
		<li>Opróżnij igłę, a następnie załaduj olej silikonowy na 5 s lub dłużej. Załaduj wszystkie zebrane PGC, a następnie ponownie załaduj olej silikonowy na 5 s lub dłużej. PGC są teraz umieszczone pomiędzy dwiema warstwami oleju silikonowego (<klasa silna = "xfig">Rysunek 2B). 
		UWAGA: Ważne jest, aby usunąć jak najwięcej żółtka, CPA i innych zanieczyszczeń.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kriokonserwacja PGC
	<ol>
		<li>Otwórz trójdrożny kran (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C), a następnie odłącz igłę od mikromanipulatora. Zetrzyj olej z powierzchni igły miękką bibułą. Nie dotykać bezpośrednio końcówki igły tkanką.</li>
		<li>Przymocuj igłę do uchwytu na igłę i zablokuj ją u podstawy za pomocą taśmy winylowej (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 1H). Przymocuj etykietę do rurki uchwytu.</li>
		<li>Błyskawicznie zamroź uchwyt z igłą skierowaną w dół, zanurzając go w ciekłym azocie. Nie zwalniaj uchwytu, dopóki płyn nie przestanie musować z rusztu.</li>
		<li>Przechowuj uchwyt w zbiorniku ciekłego azotu w obszarze fazy ciekłej, a nie w obszarze fazy gazowej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Rozmrażanie i przesadzanie PGC
<ol>
	<li>Zbieranie, dechorionacja i wyrównywanie zarodków z agametycznych muszek żywiciela
	<ol>
		<li>Zbierz i zdechorionuj zarodki od agametycznych much gospodarza, postępując zgodnie z krokiem 2.</li>
		<li>Wyrównaj zarodki gospodarza w stadium 5 agametycznym na szkiełku do przeszczepu. Jednak tym razem zorientuj tylną stronę po prawej stronie (strona, która ma być manipulowana), a brzuszną do góry (<silna klasa="xfig">Rysunek 5). Ustaw około 30 zarodków w dwóch rzędach w ciągu 20 minut.</li>
		<li>Podczas wyrównywania zarodków używaj nawilżacza przez 2-10 minut, jeśli wymaga tego wilgotność w pomieszczeniu (Tabela 1). Idealna wilgotność wynosi od 30% do 40%, ale może się ona różnić w zależności od warunków termicznych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozmrażanie i przesadzanie PGC w zarodkach gospodarza
	<ol>
		<li>Aby szybko rozmrozić kriokonserwowane PGC, wsuń uchwyt zawierający igłę do temperatury pokojowej 1x roztwór EBR z igłą skierowaną w dół i trzymaj ją zanurzoną przez 10 sekund.</li>
		<li>Umieść szkiełko do przeszczepu na stoliku mikroskopu. Przymocuj rozmrożoną igłę do uchwytu kapilary i umieść pierwszy zarodek w lewym rzędzie i końcówkę igły w tej samej płaszczyźnie ogniskowej.</li>
		<li>Używając soczewki obiektywowej 20x, delikatnie przesuń końcówkę igły na powierzchnię tylnego końca zarodka.</li>
		<li>Delikatnie szturchaj zewnętrzną stronę każdego zarodka i upewnij się, że powoli wracają do swojego pierwotnego kształtu. Szturchanie potwierdzi, że ciśnienie wewnętrzne zarodka nie jest ani za wysokie, ani za niskie. </li>
		<li>Delikatnie przesuń igłę i wbij zarodek od tylnego bieguna.</li>
		<li>Delikatnie umieść około 10-20 PGC tuż wewnątrz tylnego bieguna, dokładnie między błoną witelinową a warstwą komórek somatycznych zarodka. Unikaj odkładania ich w warstwie komórek somatycznych. Jeśli płyn perivitelinowy wycieknie z zarodka, należy go zassać do igły i usunąć.</li>
		<li>Wycofać igłę z zarodka. Powtórzyć kroki 3.2.5 i 3.2.6 dla kolejnych zarodków.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Inkubacja zarodków i odtwarzanie szczepów dawców
<ol>
	<li>Usuń wszystkie zarodki, które nie otrzymały przeszczepionych PGC i inkubuj pozostałe zarodki w wilgotnej komorze (<silna klasa="xfig">Rysunek 1G) w temperaturze 25 °C.</li>
	<li>Po upływie 24 godzin lub więcej od przeszczepienia i jak najszybciej po wykluciu należy użyć kleszczy do pobrania i przeniesienia wyklutych larw do standardowych fiolek z pokarmem Drosophila i inkubować w temperaturze 25 °C.</li>
	<li>Aby ożywić szczep, skrzyżuj nowo powstałe samice i samce (<silna klasa="xfig">Ryc. 6). 
	UWAGA: Gospodarze agametyczni umożliwiają odtworzenie całego genomu za jednym razem bez krzyżowania się ze szczepami chromosomów równoważących. Współistnienie agametycznych samców w fiolce nie będzie miało znaczenia, ponieważ samice, nawet jeśli są z nimi kojarzone, nie wykazują długotrwałych reakcji po kryciu, w tym zmniejszonej podatności na remating18,19.</li>
</ol>

Cryopreservation of PGCs for Long-Term Preservation of Drosophila Strains

<ol><li>Brüschweiler, W., Gehring, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+freezing+living+ovaries+of+Drosophila+melanogaster+larvae+and+its+application+to+the+storage+of+mutant+stocks%5BTitle%5D)+AND+%22Experientia%22%5BJournal%5D)">A method for freezing living ovaries of Drosophila melanogaster larvae and its application to the storage of mutant stocks.</a> Experientia. 29, 134-135 (1973).</li>
<li>Steponkus, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+of+Drosophila+melanogaster+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation of Drosophila melanogaster embryos.</a> Nature. 345, 170-172 (1990).</li>
<li>Mazur, P., Cole, K. W., Hall, J. W., Schreuders, P. D., Mahowald, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryobiological+preservation+of+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cryobiological preservation of Drosophila embryos.</a> Science. 258 (5090), 1932-1935 (1992).</li>
<li>Zhan, L., Li, M. G., Hays, T., Bischof, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+method+for+Drosophila+melanogaster+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Comm%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation method for Drosophila melanogaster embryos.</a> Nat Comm. 12, 2412(2021).</li>
<li>Van Deusen, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+determination+in+germ+line+chimeras+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Sex determination in germ line chimeras of Drosophila melanogaster.</a> Development. 37 (1), 173-185 (1977).</li>
<li>Breen, T. R., Duncan, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+expression+of+genes+that+regulate+the+bithorax+complex+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Maternal expression of genes that regulate the bithorax complex of Drosophila melanogaster.</a> Dev Biol. 118, 442-456 (1986).</li>
<li>Schupbach, T., Wieschaus, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+autonomy+of+maternal-effect+mutations+altering+the+embryonic+body+pattern+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Germline autonomy of maternal-effect mutations altering the embryonic body pattern of Drosophila.</a> Dev Biol. 113, 443-448 (1986).</li>
<li>Irish, V., Lehmann, R., Akam, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+posterior-group+gene+nanos+functions+by+repressing+hunchback+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The Drosophila posterior-group gene nanos functions by repressing hunchback activity.</a> Nature. 338, 646-648 (1989).</li>
<li>Hülskamp, M., Schröder, C., Pfeifle, C., Jäckle, H., Tautz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Posterior+segmentation+of+the+Drosophila+embryo+in+the+absence+of+a+maternal+posterior+organizer+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Posterior segmentation of the Drosophila embryo in the absence of a maternal posterior organizer gene.</a> Nature. 338, 629-632 (1989).</li>
<li>Steinmann-Zwicky, M., Schmid, H., Nöthiger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-autonomous+and+inductive+signals+can+determine+the+sex+of+the+germ+line+of+Drosophila+by+regulating+the+gene+Sxl%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cell-autonomous and inductive signals can determine the sex of the germ line of Drosophila by regulating the gene Sxl.</a> Cell. 57 (1), 157-166 (1989).</li>
<li>Stein, D., Roth, S., Vogelsang, E., Nüsslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+polarity+of+the+dorsoventral+axis+in+the+drosophila+embryo+is+defined+by+an+extracellular+signal%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The polarity of the dorsoventral axis in the drosophila embryo is defined by an extracellular signal.</a> Cell. 65 (5), 725-735 (1991).</li>
<li>Kobayashi, S., Yamada, M., Asaoka, M., Kitamura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+role+of+the+posterior+morphogen+nanos+for+germline+development+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Essential role of the posterior morphogen nanos for germline development in Drosophila.</a> Nature. 380, 708-711 (1996).</li>
<li>Asaoka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Offspring+production+from+cryopreserved+primordial+germ+cells+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Comm+Biol%22%5BJournal%5D)">Offspring production from cryopreserved primordial germ cells in Drosophila.</a> Comm Biol. 4 (1), 1159(2021).</li>
<li>Blitz, I. L., Fish, M. B., Cho, K. W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leapfrogging%3A+primordial+germ+cell+transplantation+permits+recovery+of+CRISPR%2FCas9-induced+mutations+in+essential+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Leapfrogging: primordial germ cell transplantation permits recovery of CRISPR/Cas9-induced mutations in essential genes.</a> Development. 143 (15), 2868-2875 (2016).</li>
<li>Koslová, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+CRISPR%2FCas9+editing+of+the+NHE1+gene+renders+chickens+resistant+to+the+J+subgroup+of+avian+leukosis+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Precise CRISPR/Cas9 editing of the NHE1 gene renders chickens resistant to the J subgroup of avian leukosis virus.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (4), 2108-2112 (2020).</li>
<li>Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+zebrafish+maternal-zygotic+mutants+through+transplantation+of+ectopically+induced+and+Cas9%2FgRNA+targeted+primordial+germ+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Genet+Genom%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of zebrafish maternal-zygotic mutants through transplantation of ectopically induced and Cas9/gRNA targeted primordial germ cells.</a> J Genet Genom. 47 (1), 37-47 (2020).</li>
<li>Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. Stages of Drosophila Embryogenesis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCampos-Ortega%2C+JA+%22The+Embryonic+Development+of+Drosophila%22">The Embryonic Development of Drosophila</a>. , Second Edition, Springer, Berlin, Heidelberg. (1997).</li>
<li>Manning, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sperm+factor+affecting+the+receptivity+of+Drosophila+melanogaster+females%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A sperm factor affecting the receptivity of Drosophila melanogaster females.</a> Nature. 194, 252-253 (1962).</li>
<li>Kubli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex-peptides%3A+seminal+peptides+of+the+Drosophila+male%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Sex-peptides: seminal peptides of the Drosophila male.</a> Cell Mol Life Sci. 60, 1689-1704 (2003).</li>
<li>Lehmann, R., Nüsslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abdominal+segmentation%2C+pole+cell+formation%2C+and+embryonic+polarity+require+the+localized+activity+of+oskar%2C+a+maternal+gene+in+drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Abdominal segmentation, pole cell formation, and embryonic polarity require the localized activity of oskar, a maternal gene in drosophila.</a> Cell. 47 (1), 141-152 (1986).</li>
<li>Kiger, A. A., Gigliotti, S., Fuller, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+genetics+of+the+essential+Drosophila+Nucleoporin+nup154%3A+allelic+differences+due+to+an+outward-directed+promoter+in+the+P-element+3%E2%80%B2+end%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Developmental genetics of the essential Drosophila Nucleoporin nup154: allelic differences due to an outward-directed promoter in the P-element 3′ end.</a> Genetics. 153 (2), 799-812 (1999).</li>
<li>Rienzi, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perspectives+in+gamete+and+embryo+cryopreservation%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Reprod+Med%22%5BJournal%5D)">Perspectives in gamete and embryo cryopreservation.</a> Semin Reprod Med. 36 (5), 253-264 (2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Kluczowym czynnikiem sukcesu w kriokonserwacji i reanimacji PGC jest wykorzystanie dobrych zarodków. Młode samice (np. w wieku od 3 do 5 dni) powinny być wykorzystywane do pobierania zarodków. Zarówno zarodki dawcy, jak i gospodarza są oceniane za pomocą badania mikroskopowego i wykorzystuje się tylko te w stadium blastodermy (stadium 5)12. W przypadku pobrania PGC zwykle wyrównujemy około 40 zarodków dawcy w ciągu 20 minut i pobieramy PGC z około 30 zarodków we wczesnym stadium 5; Nie wykorzystuje się zarodków starszych i wadliwych. Po kriokonserwacji i rozmrożeniu PGC powinny zachować swój kształt; PGC pękają w nieudanej konserwacji. Zarodki gospodarza powinny również znajdować się w stadium 5 i mieć umiarkowane ciśnienie wewnętrzne; Zarodki powinny powoli wracać do swojego pierwotnego kształtu po delikatnym szturchnięciu. Nadmiernie i niedostatecznie wysuszone zarodki nie będą się normalnie rozwijać po przeszczepie. Ponieważ heteroseksualne przeszczepienie PGC nie wytwarza gamet u Drosophila 5,10, przeszczepienie PGC z zarodków wielu dawców do zarodków gospodarza ma większe szanse na uzyskanie płodnych dorosłych. W tym celu zwykle pobieramy PGC z około 30 zarodków na igłę.
Jako krioprotektanty wypróbowaliśmy glikol etylenowy, dimetylosulfotlenek i glicerol wraz z sacharozą w różnych stężeniach. Ustaliliśmy, że EBR zawierający 20% glikolu etylenowego i 1 M sacharozy jest najlepszy13; jednak stosowanie różnych krioprotektantów może poprawić konserwację PGC22.
Ta metoda kriokonserwacji wymaga specjalistycznych umiejętności w zakresie obchodzenia się z PGC, a do wygodnego pobierania i przeszczepiania PGC potrzeba około 6 tygodni szkolenia. Aby ocenić i poprawić biegłość umiejętności, można to podzielić na sześć etapów treningowych: 1) wyrównywanie zarodków na szkiełku podstawowym, 2) sterowanie manipulatorem, 3) przeszczepianie PGC z zarodka do innego zarodka bez krioprezerwacji, 4) przesadzanie PGC z 10 lub więcej zarodków do 5 do 10 zarodków, 5) przesadzanie PGC po zastosowaniu CPA i 6) przesadzanie PGC po zamrożeniu i rozmrożeniu. Każdy krok może zająć 1 tydzień. Cele krótkoterminowe na etapie 3 to wskaźnik wylęgu na poziomie 40%, żywotność od zarodka do dorosłego osobnika na poziomie 10%-20% oraz częstotliwość płodnych much na poziomie 20%.
Kriokonserwacja PGC wymaga kosztownego oprzyrządowania i wysoko wykwalifikowanego personelu. Dlatego ta metoda może nie być stosowana przez wiele laboratoriów. Obecna metoda PGC ma jednak kilka ważnych aspektów. Po pierwsze, PGC są znacznie mniejsze niż zarodki i są bardzo przepuszczalne dla krioprotektantów. Natomiast przepuszczalność krioprotektantu jest poważnie ograniczona przez woskowate warstwy zarodków Drosophila, co stanowi najpoważniejszy problem w kriokonserwacji zarodków. Rzeczywiście, wcześniejsze badania dołożyły wszelkich starań, aby znaleźć okno czasowe, w którym zarodki mają wysoki wskaźnik przeżywalności i cieńszą warstwę woskowiny. Drugi dotyczy zmienności rozwojowej i morfologicznej między szczepami. PGC pobiera się z zarodków we wczesnym stadium 5 (2 h 30 min-3 h 20 min po złożeniu jaj), natomiast kriokonserwację zarodków przeprowadza się na zarodkach w stadium 16 (14-22 h po złożeniu jaj). Zarodki są zatem znacznie starsze i wykazują znacznie większą zmienność szczepu w optymalnym oknie czasowym dla kriokonserwacji w porównaniu z krioprezerwacją PGC. Rzeczywiście, częstotliwość wytwarzania przez gospodarzy potomstwa pochodzącego od dawcy nie różniła się między pięcioma szczepami badanymi przez Asaokę i wsp.13, chociaż gospodarze nie byli agametyczni. Co więcej, PGC mają potencjał do wykorzystania w zastosowaniach inżynierii genetycznej, takich jak edycja genomu 14,15,16.

Utrzymanie szczepów Drosophila poprzez przenoszenie dorosłych much do nowych fiolek z jedzeniem nieuchronnie prowadzi do akumulacji mutacji i zmian epigenetycznych w czasie. Konieczne jest opracowanie alternatywnej metody długoterminowego utrzymania szczepów Drosophila bez takich zmian, zwłaszcza w przypadku szczepów referencyjnych, w których musi zostać zachowany cały genom. Opisano kilka udanych prób kriokonserwacji zarodków lub jajników Drosophila1,2,3. Niestety, nadal nie mają one praktycznego zastosowania ze względu na niską odtwarzalność. Rzeczywiście, zarodki we wczesnym stadium mają niski wskaźnik przeżywalności po kriokonserwacji ze względu na wysoką zawartość żółtka, co utrudnia przenikanie i dyfuzję czynnika krioprotekcyjnego (CPA)2,3. Przepuszczalność CPA jest również poważnie ograniczona przez woskowate warstwy zarodków w późnym stadium rozwoju. Znalezienie specyficznego dla szczepu okresu czasu, w którym zarodki mają wysoki wskaźnik przeżywalności i cieńszą warstwę wosku, jest trudne i czasochłonne. Ostatnio Zhan et al.4 ulepszyli metody przenikania zarodków, ładowania CPA i witryfikacji oraz z powodzeniem krioprezerwowali zarodki wielu szczepów. Metody te nie są jednak łatwe do zastosowania, ponieważ żywotność zarodków po przepuszczalności jest zwykle słaba. W związku z tym nadal potrzebna jest dalsza poprawa i rozwój alternatywnych podejść. Metody polegające na kriokonserwacji pierwotnych komórek rozrodczych (PGC) są alternatywnym podejściem do długoterminowego utrzymania szczepów Drosophila.
Przeszczep PGC (zwany również komórką biegunową) został wykorzystany do generowania chimer linii zarodkowej, zwłaszcza u kobiet, do badania procesów takich jak matczyne skutki śmiertelnych mutacji zygotycznych i determinacja płci komórek rozrodczych5,6,7,8,9,10,11,12. PGC są znacznie mniejsze niż zarodki i prawdopodobnie są wysoce przepuszczalne dla większości krioprotektantów. Co więcej, zmienność rozwojowa i morfologiczna między szczepami jest mniej problematyczna, a gospodarz agametyczny umożliwia szybkie odtworzenie całych genomów. Niedawno opracowaliśmy nową metodę krioprezerwacji PGC13, która zapobiega nieuniknionym zmianom genetycznym i epigenetycznym w szczepach Drosophila. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół.
Ta metoda kriokonserwacji wymaga specjalistycznej wiedzy w zakresie obsługi PGC i oprzyrządowania. Chociaż podejście krok po kroku może być skutecznym rozwiązaniem dla tych, którzy go nie znają, może być nieodpowiednie dla małych laboratoriów ze względu na wymagania dotyczące oprzyrządowania. Ten protokół kriokonserwacji PGC można łatwiej dostosować do stosowania z różnymi gatunkami Drosophila i różnymi gatunkami owadów niż protokoły kriokonserwacji zarodków ze względu na mniejsze różnice rozwojowe i morfologiczne. PGC mogą być również potencjalnie wykorzystywane w zastosowaniach inżynierii genetycznej, takich jak edycja genomu14,15,16. Podsumowując, metoda ta może być stosowana w centrach magazynowych i innych laboratoriach w celu utrzymania szczepów much i innych owadów przez dłuższy czas bez zmian.

<table><tbody><tr><td>Kwas octowy</td><td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation</td><td>017-00256</td><td>Do pobierania zarodków</td></tr><tr><td>Agar w proszku</td><td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation</td><td>010-08725</td><td>Do pobierania zarodków</td></tr><tr><td>Chlorek wapnia</td><td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation</td><td>038-24985</td><td>Do roztworu EBR</td></tr><tr><td>Kapilarny</td><td>instrument Sutter</td><td>B100-75-10-PT</td><td>SZKŁO BOROKRZEMIANOWE; OD: 1.0mm, ID: 0.75mm , długość: 10cm, 225szt</td></tr><tr><td>Uchwyt kapilarny</td><td>Eppendorf</td><td>5196 081.005</td><td>Uchwyt kapilarny 4; do mikromanipulacji</td></tr><tr><td>Mieszanina kwasu chromowego</td><td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation</td><td>037-05415</td><td>Do mycia igieł</td></tr><tr><td>roztwór</td><td></td><td></td> CPA <td>1x EBR zawierający 20% glikolu etylenowego i 1M sacharozy</td></tr><tr><td>Taśma dwustronna</td><td>3M</td><td>Scotch w-12</td><td>Do ekstrakcji kleju</td></tr><tr><td>Ephrussi&ndash; Beadle Ringer roztwór (EBR)</td><td></td><td></td><td>130 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2 i 10 mM Hepes przy pH 6,9</td></tr><tr><td>Etanol (99,5)</td><td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation</td><td>057-00451</td><td>Do pobierania zarodków</td></tr><tr><td>Glikol etylenowy</td><td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation</td><td>054-00983</td><td>Do roztworu CPA</td></tr><tr><td>Falcon 50 mm x 9 mm bakteriologiczna szalka Petriego</td><td>Corning Inc.</td><td>351006</td><td>Do pobierania zarodków</td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td>Vigor</td><td>Type5 Titan</td><td>Do obsługi zarodków</td></tr><tr><td>Sok winogronowy</td><td>Asahi Soft Drinks Co., LTD.</td><td>Welch's Grape 100</td><td>Do zbierania zarodków</td></tr><tr>Talerz <td></td><td></td><td>agarowy z sokiem winogronowym</td><td>50% sok winogronowy, 2% agar, 1% etanol, 1% kwas octowy</td></tr><tr><td>Heptan</td><td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation</td><td>084-08105</td><td>Do ekstrakcji kleju</td></tr><tr><td>Nawilżacz</td><td>powietrza APIX INTERNATIONAL CO., LTD.</td><td>FSWD2201-WH</td><td>Do preparacji zarodków</td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony</td><td>Leica Microsystems GmbH</td><td>Leica&nbsp; DM IL LED</td><td>Do mikromanipulacji</td></tr><tr><td>Szklana strzykawka Luer-lock</td><td>Tokyo Garasu Kikai Co., Ltd.</td><td>0550 14 71 08</td><td>Pokryj tłok olejem silikonowym (FL-100-450CS); do mikromanipulacji</td></tr><tr><td>Mikromanipulator mechaniczny</td><td>Leica Microsystems GmbH</td><td></td><td>Do mikromanipulacji</td></tr><tr><td>Szkło do mikroszkiełek</td><td>Matsunami Glass Ind., Ltd.</td><td>S-2441</td><td>Do wyrównywania zarodków</td></tr><tr><td>Mikromłynek</td><td>NARISHIGE Group</td><td>Na zamówienie</td><td>EG-401-S w połączeniu z EG-401 i MF2 (z soczewką okularową MF2-LE15 ); do przygotowania igły</td></tr><tr><td>Kamera mikroskopowa</td><td>Leica Microsystems GmbH</td><td>Leica MC170 HD</td><td>Do mikromanipulacji</td></tr><tr><td>Uchwyt igły</td><td>Merck KGaA</td><td>Eppendorf TransferTip (ES)</td><td>Do kriokonserwacji</td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Nacalai Tesque, Inc.</td><td>28514-75</td><td>Do roztworu EBR</td></tr><tr><td>Ściągacz</td><td>NARISHIGE Group</td><td>PN-31</td><td>Do przygotowania igły; poziom grzałki jest ustawiony na 85,0-98,4, główny poziom magnesu na 57,8, a poziom podrzędny magnesu na 45,0.</td></tr><tr><td>Taśma klejąca PVC do izolacji elektrycznej</td><td>Nitto Denko Corporation</td><td>&nbsp; J2515</td><td>Do ramy puli zarodków</td></tr><tr><td>Olej silikonowy</td><td>Shin-Etsu Chemical, Co, Ltd.</td><td>FL-100-450CS</td><td>Do obsługi zarodków</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Nacalai Tesque, Inc.</td><td>31320-05</td><td>Do roztworu EBR</td></tr><tr><td>Roztwór podchlorynu sodu</td><td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation</td><td>197-02206</td><td>Nierozcieńczony i świeżo przygotowany; do naruszania zarodków</td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Nacalai Tesque, Inc.</td><td>30404-45</td><td>Dla rozwiązania CPA</td></tr></tbody></table>

kriokonserwacja pierwotnych komórek rozrodczych i ożywienie szczepów drosophila

Primordial Germ Cell Cryopreservation and Revival of Drosophila Strains

Szczepy Drosophila muszą być utrzymywane poprzez częste przenoszenie dorosłych much do nowych fiolek. Niesie to ze sobą niebezpieczeństwo pogorszenia mutacji i zmian fenotypowych. W związku z tym konieczne jest opracowanie alternatywnej metody długoterminowego przechowywania bez takich zmian. Pomimo wcześniejszych udanych prób, kriokonserwacja zarodków Drosophila nadal nie ma praktycznego zastosowania ze względu na niską odtwarzalność. W tym miejscu opisujemy protokół kriokonserwacji pierwotnych komórek rozrodczych (PGC) i odrodzenia szczepu poprzez przeszczepienie kriokonserwowanych PGC do agametycznych zarodków gospodarza Drosophila melanogaster (D. melanogaster). PGC są wysoce przepuszczalne dla środków krioprotekcyjnych (CPA), a zmienność rozwojowa i morfologiczna między szczepami jest mniej problematyczna niż w przypadku krioprezerwacji zarodków. W tej metodzie PGC są pobierane z około 30 zarodków dawcy, ładowane do igły po leczeniu CPA, a następnie kriokonserwowane w ciekłym azocie. Aby wytworzyć gamety pochodzące od dawcy, kriokonserwowane PGC w igle są rozmrażane, a następnie umieszczane w około 15 agametycznych zarodkach gospodarza. Dzięki temu protokołowi osiągnięto częstość co najmniej 15% płodnych much, a liczba potomstwa na płodną parę była zawsze więcej niż wystarczająca, aby ożywić oryginalny szczep (średnia liczba potomstwa wynosiła 77,2 ± 7,1), co wskazuje na zdolność kriokonserwowanych PGC do przekształcania się w komórki macierzyste linii zarodkowej. Średnia liczba płodnych much na igłę wynosiła 1,1 ± 0,2, a 9 z 26 igieł dało dwa lub więcej płodnego potomstwa. Stwierdzono, że 11 igieł wystarcza do wyprodukowania 6 lub więcej potomstwa, w którym prawdopodobnie znajduje się co najmniej jedna samica i jeden samiec. Żywiciel agametyczny umożliwia szybkie ożywienie szczepu, po prostu krzyżując nowo pojawiające się samice i samce much. Ponadto PGC mogą być wykorzystywane w zastosowaniach inżynierii genetycznej, takich jak edycja genomu.

Wydajność transplantacji kriokonserwowanych PGC została opisana przez Asaoka et al.13 i przedstawiono ją w Tabeli 2 dla transplantacji PGC kriokonserwowanych przez 1 dzień lub dłużej w ciekłym azocie. Odsetek wyklucia wyniósł 168/208 transplantowanych embrionów (80,8%), a przeżywalność od stadium embrionu do postaci dorosłej wyniosła 87/208 (41,8%). Częstość występowania płodnych much wyniosła 28/87 (32,2%). Częstość ta nie różniła się między PGC kriokonserwowanymi przez 8 do 30 dni a tymi kriokonserwowanymi przez 31-150 dni (20/57 vs. 8/30, G' = 0,63, p &gt;0,1, d.f. = 1). Średnia liczba potomstwa na parę wyniosła 77,2 ± 7,1 (n = 18, 28-122), co wskazuje na zdolność kriokonserwowanych PGC do przekształcenia się w komórki macierzyste linii zarodkowej. Z 26 igieł 10 nie dało żadnego płodnego potomstwa, 7 igieł dało 1 płodne potomstwo, 7 igieł dało 2 płodne potomstwa, a 2 igły dały 3 lub 4 płodne potomstwa. Średnia liczba płodnych much na igłę wyniosła 1,1 ± 0,2. Na podstawie tych danych, z 95% pewnością, 11 igieł jest wystarczających do uzyskania 6 lub więcej osobników potomstwa, wśród których prawdopodobnie znajduje się co najmniej jedna samica i jeden samiec.
W powyższych eksperymentach jako gospodarza agametycznego wykorzystano embriony wykazujące ekspresję mRNA ovo-A w PGC (nanos&gt;ovo-A, embriony OvoA_OE). spośród 669 samic F1 i 720 samców F1 uzyskanych z par po transplantacji nanos&gt;ovo-A, nie stwierdzono żadnego osobnika „uciekiniera” (escaper) pochodzącego z PGC gospodarza. Kilka mutantów oskar (osk) wykazuje również agametyczność zależną od temperatury20,21. Ponieważ mutant osk o wysokiej żywotności homozygotycznej i fenotypie agametycznym nie jest już dostępny, odtworzono mutant missense osk[8]20 za pomocą edycji genomu wspomaganej systemem CRISPR/Cas9. Muchy te były całkowicie agametyczne (0 uciekinierów spośród 230 samic i 192 samców) w temperaturze 25 °C, jednak w 23 °C pojawiło się kilka uciekinierów (1 z 248 samic i 1 z 290 samców). Z tego względu embriony nanos&gt;ovo-A są zalecane jako agametyczne embriony gospodarza. Linie UASp-ovo-A oraz nanos-Gal413 będą wkrótce dostępne w KYOTO Drosophila Stock Center.
<img alt="Konfiguracja laboratoryjna do elektrofizjologii i rejestracji komórkowej; obejmuje mikroskopy, układy płynne i patch-clamp." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65985/65985fig01v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Wymagane wyposażenie. (A) System mikromanipulacyjny do zbierania i transplantacji komórek. i) mikroskop odwrócony, ii) mechaniczny mikromanipulator, iii) strzykawka, iv) uchwyt kapilarny, v) kurek trójdrożny, vi) nawilżacz i vii) stereomikroskop. (B) Strzykawka. (C) Kurek trójdrożny i rurki silikonowe łączące strzykawkę z uchwytem kapilarnym. (D) Igła i uchwyt kapilarny przymocowane do mikromanipulatora. (E) Pojemnik do zbierania zarodków z płytką do zbierania zarodków (średnica 6 cm, wysokość 7,7 cm). (F) Sitko z ocynkowanej stali nierdzewnej. (G) Pojemnik wykorzystywany jako komora wilgotna ze szkiełkiem przedmiotowym. Aby utrzymać wilgotność, należy umieścić mokry papier na dnie i zamknąć pokrywkę. (H) Uchwyt do igieł z igłą do kriokonserwacji. (I) Statyw do przechowywania materiałów do kriokonserwacji oraz pudełko z igłami. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65985/65985fig01largev2.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Układ do izolacji pierwotnych komórek płciowych; schemat z olejem silikonowym, ramką na embriony, szczegółem kleju heptanowego." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65985/65985fig02v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Szklany preparat do zbierania PGC oraz igła do kriotekcji. (A) Szklany preparat do zbierania pierwotnych komórek płciowych (PGC) pokryty klejem. Dechorionowane embriony są ustawione w dwóch rzędach, zorientowane przednią częścią w prawo (strona podlegająca manipulacji) i stroną brzuszna do góry. Przymocowano ramkę na pulę embrionów, naniesiono dwie krople roztworu środków krioprotekcyjnych (CPA), a pulę wypełniono olejem silikonowym. (B) Igła powinna zawierać jak najmniejszą ilość żółtka i innych zanieczyszczeń. Podczas kriotekcji w ciekłym azocie PGC znajdują się pomiędzy dwiema warstwami oleju silikonowego. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65985/65985fig02largev2.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat techniki szlifowania: trzyetapowy proces naukowego ostrzenia igieł z wyszczególnionymi kątami szlifowania." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65985/65985fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Wykonywanie igły. Trzyetapowa metoda polerowania końcówki w celu wykonania igły o odpowiedniej wielkości otworu i ostrym zakończeniu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65985/65985fig03large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić większą wersję tego rysunku, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Oś czasu pobierania embrionów z pobieraniem PGC, inkubacją i zamrażaniem; schemat blokowy procesu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65985/65985fig04v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Schemat pobierania embrionów. Po dwóch wstępnych pobraniach zwykle wykonujemy trzy lub cztery pobrania dziennie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65985/65985fig04largev2.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Równowaga statyczna; schemat przedstawiający orientację przednio-tylną w układzie biologicznym; opisane osie." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65985/65985fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Ustawienie embrionów gospodarza. Ustawienie embrionów gospodarzy na szkiełku przedmiotowym. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65985/65985fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat transmisji linii zarodkowej muchy, przedstawiający kriokonserwację, transplantację PGC i rozwój potomstwa F1." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65985/65985fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6: Przegląd metody kriokonserwacji PGC. Przegląd wszystkich kroków podjętych w celu przeprowadzenia kriokonserwacji pierwotnych komórek zarodkowych (PGC). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65985/65985fig06large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td colspan="3">Wilgotność pomieszczenia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>&lt; 30%</td>
			<td>~ 30%</td>
			<td>&gt; 30%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ustaw zarodki biorcy w jednej linii 
			(~20 min)</td>
			<td>Stosować nawilżacz przez 2–10 min</td>
			<td>Stosować nawilżacz przerywanie przez 1 min.</td>
			<td>Nie należy używać nawilżacza</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rozmrożenie dawczych PGC</td>
			<td>Nie dotyczy</td>
			<td>Nie dotyczy</td>
			<td>Nie dotyczy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osuszyć PGC na powietrzu</td>
			<td>Pomiń ten krok</td>
			<td>Pomiń ten krok</td>
			<td>5 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanieść olej silikonowy</td>
			<td>Nie dotyczy</td>
			<td>Nie dotyczy</td>
			<td>Nie dotyczy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transplantacja PGC</td>
			<td>Nie dotyczy</td>
			<td>Nie dotyczy</td>
			<td>Nie dotyczy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Wszystkie te etapy powinny zostać zakończone w ciągu 50 min.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Wysychanie embrionów podczas ustawiania embrionów i rozmrażania PGC.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Szczep dawca</td>
			<td>Okres kriokonserwacji</td>
			<td>Liczba transferowanych embrionów (A)</td>
			<td>Liczba wylęgłych larw (B) 
			(wylęgalność, B/A)</td>
			<td>Liczba imago po wyjściu z poczwarki (C) 
			(żywotność od jaja do imago, C/A)</td>
			<td>Liczba płodnych osobników dorosłych (D) 
			(częstość występowania płodnych much, D/C)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M17</td>
			<td>8–30 dni</td>
			<td>134</td>
			<td>108 
			(80.6%)</td>
			<td>57 
			(42.5%)</td>
			<td>20 
			(35.1%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M17</td>
			<td>31 – 150 dni</td>
			<td>74</td>
			<td>60 
			(81.1%)</td>
			<td>30 
			(40.5%)</td>
			<td>8 
			(26.7%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="6">M17: yw; TM6B, P{Dfd-GMR-nvYFP}4, Sb[1] Tb[1] ca[1]/ Pri[1]</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Efektywność transplantacji kriokonserwowanych PGC.Tabela została zmodyfikowana na podstawie źródła13. Wszystkie dane pochodzą od gospodarzy agametycznych.

Wysoce pożądana jest długoterminowa metoda konserwacji szczepów Drosophila jako alternatywa dla częstego przenoszenia dorosłych much do fiolek ze świeżą żywnością. Protokół ten opisuje kriokonserwację pierwotnych komórek rozrodczych Drosophila i odrodzenie szczepu poprzez ich przeszczepienie do agametycznych zarodków gospodarza.

Kriokonserwacja pierwotnych komórek rozrodczych i ożywienie szczepów Drosophila

Drosophila strains must be maintained by the frequent transfer of adult flies to new vials. This carries a danger of mutational deterioration and ...

Szczep Drosophila musi być utrzymywany poprzez częste przenoszenie dorosłych much do nowych fiolek. Stwarza to niebezpieczeństwo pogorszenia się sytuacji mutacyjnej i zmian genetycznych. Naszym celem jest opracowanie alternatywnej metody długoterminowego zachowania szczepów Drosophila bez takich zmian.W porównaniu z edycją in vivo, edycja genomu pierwotnych komórek rozrodczych (PGC) może zwiększyć nieefektywność efektu dominacji i spowodować bardziej skomplikowane zmiany genomowe. Tym samym szerokie zastosowanie manipulacji PGC ułatwia inżynierię genetyczną w wielu dziedzinach. Teraz skupimy się na ksenotransplantacji.Wykorzystując Drosophila melanogaster jako zastępczego gospodarza, udało nam się ożywić zasoby gatunków komórek w podgrupie gatunków melanogaster. Odnosząc się do barier ksenotransplantacji i znajdując możliwe rozwiązania, chcielibyśmy zbadać potencjalne zastosowanie przeszczepu PGC i krioprezerwacji. Przystąp do pobierania pierwotnych komórek rozrodczych lub PGC z zarodków Drosophila po złożeniu systemu mikromanipulatora.Podczas pracy pod mikroskopem stereoskopowym użyj kleszczy do transferu zarodków. Ułóż zarodki z odciętą kosmówką w dwóch rzędach na szkiełku podstawowym do pobierania PGC wzdłuż dwóch linii odniesienia. Ustaw zarodki przodem do prawej i brzuszną stroną do góry.Delikatnie przesunąć końcówkę igły do przeszczepu do przedniego końca zarodka. Penetruj zarodek, przesuwając stolik mikroskopu i lekko cofnij igłę, gdy końcówka dotrze do tylnego końca. Wypuścić żółtko z igły do wnętrza warstwy komórek somatycznych.Przesunąć końcówkę igły do tylnego bieguna i delikatnie załadować PGC do igły, nie zajmując dużo czasu. Szybko wyciągnij igłę z zarodka. Usunąć żółtko i inne zanieczyszczenia z igły, zachowując PGC.Załaduj czysty olej silikonowy z basenu do igły. Przed pobraniem PGC z nowego zarodka należy zdeponować jak najwięcej oleju silikonowego w warstwie komórek somatycznych, jednocześnie utrzymując załadowane PGC w igle. Po zebraniu PGC ze wszystkich zarodków z rzędu, umieść PGC na powierzchni zarodka i wyładuj żółtko lub inne zanieczyszczenia na inny sąsiedni zarodek.W podobny sposób zbierz i połącz PGC z zarodków w drugim rzędzie. Przystąp do kriokonserwacji pierwotnych komórek rozrodczych lub PGC. Po pobraniu i zdeponowaniu PGC z zarodków dawcy na powierzchni zarodka.Umyj igłę do przeszczepu środkiem krioprotekcyjnym lub CPA i załaduj do igły świeży CPA. Dodaj załadowany CPA do PGC zdeponowanych na zarodku, upewniając się, że objętość CPA jest równoważna objętości PGC. Usuń nadmiar CPA z grupy PGC od jednej do dwóch sekund po dodaniu CPA.Następnie opróżnij igłę i załaduj ją olejem silikonowym na pięć sekund lub dłużej. Załaduj wszystkie zebrane PGC do igły, a następnie ponownie załaduj olej silikonowy na pięć sekund lub dłużej. Upewnij się, że PGC są umieszczone między dwiema warstwami oleju silikonowego.Odłączyć igłę od mikromanipulatora. Za pomocą miękkiej bibuły zetrzyj olej z powierzchni igły, nie dotykając końcówki igły chusteczką. Przymocuj igłę do uchwytu na igłę i za pomocą taśmy winylowej zablokuj ją w miejscu u podstawy.Błyskawicznie zamroź uchwyt z igłą skierowaną w dół, zanurzając go w ciekłym azocie. Nie zwalniaj uchwytu, dopóki płyn nie przestanie musować z rusztu. Przechowywać uchwyt w zbiorniku magazynującym ciekły azot w obszarze fazy ciekłej.Aby rozpocząć, wyrównaj zarodki gospodarza Drosophila w stadium pięciu na szkiełku transplantacyjnym. Ustawiając ich tył w prawo i brzusznie do góry, ustaw około 30 zarodków w dwóch rzędach w ciągu 20 minut. Rozmrozić kriokonserwowane PGC w igle, zanurzając uchwyt z igłą skierowaną w dół w roztworze EBR o temperaturze pokojowej.Trzymaj go zanurzonego przez 10 sekund. Umieść szkiełko do przeszczepu na stoliku mikroskopowym. Przymocuj rozmrożoną igłę do uchwytu kapilary i umieść pierwszy zarodek w lewym rzędzie, a końcówkę igły w tej samej płaszczyźnie ogniskowej.Używając soczewki obiektywowej 20X, delikatnie umieść końcówkę igły na powierzchni tylnego końca zarodka. Delikatnie szturchaj zewnętrzną stronę każdego zarodka i upewnij się, że powoli wracają do swojego pierwotnego kształtu. Penetruj zarodek od tylnego bieguna za pomocą igły.Delikatnie umieść około 10 do 20 PGC wewnątrz tylnego bieguna, szczególnie między błoną witeliny a warstwą komórek somatycznych i wycofaj igłę z zarodka przed powtórzeniem tego samego dla kolejnych zarodków. Wreszcie, aby ożywić szczep, krzyżuj nowo pojawiające się samice i samce.

primordial-germ-cell-cryopreservation-revival-drosophila

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Niniejszy film demonstruje przygotowanie pierwotnych kultur neuronalnych z embrionów Drosophila w stadium środkowej gastruli. Widoki żywych kultur przedstawiają komórki 1 godzinę po wysianiu oraz zróżnicowane neurony po 2 dniach wzrostu w zdefiniowanym medium opartym na wodorowęglanach. Neurony te są elektrycznie pobudliwe i tworzą połączenia synaptyczne.

Przygotowanie kultur neuronalnych z zarodków Drosophila w stadium środkowej gastruli

Technika ta umożliwia odsłonięcie układu nerwowo-mięśniowego embrionów Drosophila do przeprowadzenia immunohistochemii lub rejestracji elektrofizjologicznej. Jest ona przydatna do badania wczesnych etapów rozwoju nerwowo-mięśniowego lub wykonywania badań elektrofizjologicznych u mutantów, które nie są w stanie wykluć się z jaj.

Zbieranie i przygotowywanie embrionów Drosophila do rejestracji elektrofizjologicznej i innych procedur

Przedstawiamy szczegółowy protokół przygotowania pierwotnych komórek wydzielonych z embrionów Drosophila. Zdolność do przeprowadzania skutecznej perturbacji RNAi, wraz z innymi molekularnymi, biochemicznymi i obrazowymi metodami analizy komórek, pozwoli na rozstrzygnięcie wielu kwestii badawczych w pierwotnych komórkach Drosophila.

Podstawowe hodowle komórkowe z embrionów Drosophila w stadium gastruli

W niniejszej pracy prezentujemy nowo opracowany zestaw I•Cryo do krio konserwacji plemników myszy. Dzięki zastosowaniu tego zestawu konsekwentnie poprawiono rozwój embrionów w stadium dwóchkomórkowym po rozmrożeniu plemników w 5 szczepach myszy. W okresie 1,5 roku zarchiwizowano 49 genetycznie zmodyfikowanych linii myszy poprzez krio konserwację plemników za pomocą zestawu I•Cryo, a następnie pomyślnie odzyskano je metodą IVF.

Kriokonserwacja i odzyskiwanie plemników myszy przy użyciu zestawu I·Cryo

Ten protokół opisuje sekcję i hodowlę nienaruszonych jąder i torbieli linii zarodkowej poczwarek Drosophila melanogaster. Metoda ta pozwala na mikroskopową obserwację spermatogenezy ex vivo. Ponadto opisano test farmakologiczny wpływu inhibitorów na określone etapy rozwoju komórek rozrodczych w jądrach poczwarki.

Ex vivo Posiew jądra poczwarki Drosophila i pojedyncze torbiele linii zarodkowej samca: rozwarstwienie, obrazowanie i leczenie farmakologiczne

Głównym celem tego badania było dostosowanie procedury witryfikacji zanurzonej w igłach (NIV) do kriokonserwacji całych jąder danio pręgowanego. Dodatkowo przetestowano powtarzalność metody w pięciu różnych szczepach danio pręgowanego.

Kriokonserwacja spermatogonii danio pręgowanego za pomocą ultraszybkiego chłodzenia zanurzonego w całej igle jądra

Ta praca opisuje protokół generowania bibliotek Hi-C o wysokiej rozdzielczości in situ z ciasno zaszczepionych zarodków Drosophila melanogaster przed gastrulacją.

Generowanie bibliotek wychwytywania konformacji chromatyny w całym genomie z ciasno zainscenizowanych wczesnych zarodków Drosophila

Linie komórkowe Drosophila są ważnymi odczynnikami zarówno dla badań podstawowych, jak i biomedycznych. Ten artykuł zawiera protokoły rozmrażania, subhodowli i kriokonserwacji powszechnie stosowanych linii komórkowych Drosophila, aby pomóc naukowcom w włączeniu tych odczynników do ich badań.

Rozmrażanie, hodowla i kriokonserwacja linii komórkowych Drosophila

Tutaj udostępniamy protokół sekcji wymagany do zobrazowania na żywo późnej embrionalnej męskiej gonady Drosophila. Protokół ten pozwoli na obserwację dynamicznych procesów komórkowych w normalnych warunkach lub po manipulacji transgenicznej lub farmakologicznej.

Sekcja i obrazowanie na żywo późnej embrionalnej gonady Drosophila

Ten artykuł bierze za przykład transgenezę za pośrednictwem integrazy phiC31 u Drosophila i przedstawia zoptymalizowany protokół mikroiniekcji zarodka, kluczowy krok do tworzenia transgenicznych muszek.

Mikroiniekcja zarodka w celu transgenezy u Drosophila

Tutaj udostępniamy szczegółowy protokół do wykonywania na żywo obrazowania asymetrycznego podziału komórek macierzystych linii zarodkowej (GSC) w niszy jajnikowej Drosophila. Używamy linii transgenicznej, która wszechobecnie ulega ekspresji fuzji białka zielonej fluorescencji (GFP) białka spektrosomu Par-1.

Rozszerzone obrazowanie na żywo nisz komórek macierzystych linii zarodkowej Drosophila melanogaster

Poznaj metodę kriokonserwacji pierwotnych komórek rozrodczych Drosophila i ich ksenotransplantację w celu ożywienia szczepów. Technika ta umożliwia długoterminowe przechowywananie materiału genetycznego bez ryzyka mutacji.

Kriokonserwacja pierwotnych komórek rozrodczych i ożywienie szczepów Drosophila

Przeglądaj więcej filmów