Name: Podwójne nagrania zewnątrzkomórkowe w hipokampie myszy i korze przedczołowej myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-16T13:40:00.000+00:00
Duration: 4 min 44 s
Description: Poznaj metodę podwójnych rejestracji LFP w hipokampie i korze przedczołowej myszy. Technika ta umożliwia badanie wpływu leków na potencjały lokalne i komunikację międzyregionową w mózgu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Royal Melbourne Hospital Neuroscience Foundation (A2087).

To badanie zostało zatwierdzone przez Komitet Etyki Zwierząt Florey (Uniwersytet w Melbourne, nr 22-025UM) zgodnie z australijskim kodeksem opieki i wykorzystywania zwierząt do celów naukowych. Do niniejszego badania wykorzystano samce myszy C57BL/6 (8 tygodni), uzyskane z Centrum Zasobów Zwierzęcych (Australia).
1. Projekt i wykonanie sceny głównej
UWAGA: Płytka PCB sceny głównej to kompaktowa, czterowarstwowa płytka o wymiarach 14 mm x 12 mm, przeznaczona do umieszczenia bezpośrednio na głowie zwierzęcia. Wykorzystuje komercyjny układ wzmacniacza (patrz tabela materiałów), a wszystkie pliki projektowe i Gerber są dostępne online (link do GitHub: https://github.com/dechuansun/Intan-headstage/tree/main/pcbway).
<ol>
	<li>Podaj producentowi następujące specyfikacje: Grubość płyty: 0,6 mm; Minimalne śledzenie/odstępy: 4 mils; Minimalny rozmiar otworu: 0,2 mm.</li>
	<li>Podczas procesu montażu PCB postępuj zgodnie z następującą kolejnością:
	<ol>
		<li>układ wzmacniacza do płytki za pomocą pistoletu na gorące powietrze ustawionego na 350 °C.</li>
		<li>elementy pasywne.</li>
		<li>złącze SPI i złącze elektrody (patrz tabela materiałów).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sprawdź pod mikroskopem w celu zapewnienia jakości. Zamocuj złącze SPI na miejscu za pomocą żywicy epoksydowej, aby zwiększyć stabilność.</li>
	<li>Do akwizycji sygnału należy używać oprogramowania do nagrywania innych firm i tablicy sterowniczej (patrz tabela materiałów). Zapoznaj się z instrukcją obsługi oprogramowania, aby uzyskać szczegółowe instrukcje.</li>
	<li>Zaprojektowana scena czołowa obsługuje 8 kanałów. W oprogramowaniu włącz kanały 8, 9, 12, 13, 20, 21, 22 i 23 do nagrywania.</li>
</ol>
2. Produkcja elektrod
<ol>
	<li>Przytnij druty wolframowe pokryte PFA (patrz tabela materiałów) na określone długości dla różnych typów elektrod: elektroda kory przedczołowej (12 mm), elektroda hipokampa (10 mm) i elektroda uziemiająca (6 mm).</li>
	<li>Pokrój mosiężną rurkę (patrz tabela materiałów) na segmenty 3 mm.</li>
	<li>Usuń 2 mm powłoki na końcu każdego drutu za pomocą zapalniczki, a następnie bezpiecznie drut elektrody do mosiężnej rurki. Rurka mosiężna ma średnicę wewnętrzną 0,45 mm i średnicę zewnętrzną 0,60 mm.</li>
	<li>W przypadku elektrody uziemiającej ze stali nierdzewnej M1.2 (patrz Tabela materiałów) do elektrody. Nałóż topnik na bazie kwasu fosforowego na, aby poprawić. Po przylutowaniu wyczyść za pomocą alkoholu. 
	UWAGA: Nosić rękawice dla ochrony podczas procesu.</li>
</ol>
3. Zabieg chirurgiczny
<ol>
	<li>Znieczulij mysz w komorze anestezjologicznej z 3% izofluranem i przepływem tlenu 1 l/min.</li>
	<li>Umieść znieczuloną mysz na poduszce grzewczej i zabezpiecz ją w ramce stereotaktycznej (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Dostosuj szybkość utrzymywania izofluranu do 2,5-3% i zmniejsz przepływ tlenu do 500 ml/min. Za pomocą uszczypnięcia palca u nogi sprawdź, czy zwierzę jest nadal pod głęboką narkozą.</li>
	<li>Podskórnie wstrzyknąć karprofen w dawce 0,5 mg/kg mc. i nałożyć maść do oczu w celu ochrony oczu.</li>
	<li>Ogol i wysterylizuj głowę myszy za pomocą jodu powidonu i 80% etanolu.</li>
	<li>Wykonaj nacięcie o średnicy 8 mm wzdłuż linii środkowej skóry głowy, usuwając tkankę łączną w obszarze nacięcia.</li>
	<li>Nałóż nadtlenek wodoru, aby oczyścić powierzchnię czaszki, uważając, aby nie dotknąć otaczającej skóry.</li>
	<li>Wyrównaj punkty orientacyjne bregma i lambda na tym samym poziomie, aby uzyskać dokładne umieszczenie elektrod (bregma i lambda to miejsca, w których szew strzałkowy przecina szwy koronalne i lambdoidalne).</li>
	<li>Wywierć otwory na elektrodę referencyjną/uziemiającą, kotwiące (zadzior wiertarski 0,9 mm) i elektrody aktywne (zadziory wiertarskie 0,3 mm) w określonych współrzędnych.</li>
	<li>Przymocuj specjalnie wykonaną elektrodę (krok 2) do ramienia ramy stereotaktycznej i upewnij się, że jest prostopadła do mózgu.</li>
	<li>Wszczepić elektrodę w obszar CA1 hipokampa (AP - 1,8 mm, ML - 1,3 mm, DV - 1,4 mm). 
	UWAGA: AP, przednio-tylny; ML, środkowo-boczny; DV, grzbietowo-brzuszny.</li>
	<li>Powtórzyć wszczepienie elektrody w korze przedczołowej (AP - 2,0 mm, ML - 0,3 mm, DV - 1,7 mm).</li>
	<li>Zabezpiecz elektrody dostępnym na rynku mocnym klejem i cementem dentystycznym (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Wszczep dwie kotwiące 1,2 mm (AP - 1,8 mm, ML -1,6 mm), aby zapobiec przesuwaniu się.</li>
	<li>Ustawić elektrodę referencyjną/masową w bezpośrednim kontakcie z oponą twardą, 2 mm z tyłu i 2 mm jednostronnie do punktu orientacyjnego lambda.</li>
	<li>Podłącz mosiężną rurkę po stronie elektrod do wielokanałowego złącza gniazda (patrz tabela materiałów) z elektrodą uziemiającą pośrodku.</li>
	<li>Użyj rurki termokurczliwej 0.8 mm na zewnątrz środkowego kołka do izolacji.</li>
	<li>Zabezpiecz elektrody, kotwiące i łącznik za pomocą kleju i cementu dentystycznego.</li>
</ol>
4. Opieka pooperacyjna
<ol>
	<li>Aby złagodzić ból pooperacyjny, należy wstrzykiwać karprofen w dawce 5-10 mg/kg podskórnie co 12-24 godziny na podstawie oceny bólu przez okres trzech dni.</li>
	<li>Należy zapewnić zwierzęciu tygodniowy okres rekonwalescencji przed rozpoczęciem jakichkolwiek procedur rejestracyjnych lub doświadczalnych.</li>
</ol>
5. Procedura nagrywania
<ol>
	<li>Ze zwierzęciem należy obchodzić się przez 15 minut, dwa razy dziennie, przez trzy kolejne dni.</li>
	<li>Podnieś myszy, delikatnie zaciskając wokół nich dłoń, nie wywierając nadmiernego nacisku.</li>
	<li>Umieść deskę do sceny, na głowie zwierzęcia na 30 minut raz dziennie przez trzy kolejne dni.</li>
	<li>W dniu nagrania należy zaaklimatyzować zwierzę w pomieszczeniu do nagrywania na 30 minut.</li>
	<li>Umieść zwierzę w małej komorze nagrywającej w klatce Faradaya, aby zmniejszyć zewnętrzne zakłócenia elektryczne. Dołącz niestandardową scenę główną do nagrywania.</li>
	<li>Otwórz oprogramowanie do nagrywania i wybierz częstotliwość próbkowania 2.00 kHz. Wyłącz wszystkie kanały z wyjątkiem 13 i 20, wybierając każdy kanał i naciskając spację.</li>
	<li>W oknie przepustowości sprzętowej ustaw dolną przepustowość na 2 Hz, a górną przepustowość na 100 Hz.</li>
	<li>W oknie filtrowania programowego ustaw filtr dolnoprzepustowy na 100 Hz, a filtr górnoprzepustowy na 2 Hz.</li>
	<li>Wybierz ścieżkę przechowywania, klikając Wybierz nazwę pliku, a następnie kliknij Nagraj.</li>
	<li>Rozpocznij każdą sesję nagraniową od 10-minutowego okresu przyzwyczajenia, po którym następuje 15-minutowy podstawowy zapis EEG.</li>
	<li>Po zapisie wyjściowym należy podać lek we wstrzyknięciu dootrzewnowym i kontynuować zapis przez dodatkowe 30 minut bez opóźnień. 
	UWAGA: Zapoznaj się z sekcją Wyniki, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat stosowanych leków.</li>
</ol>

LFP Recording in Mouse Brain for Cognitive Research and Drug Analysis

<ol><li>Einevoll, G. T., Kayser, C., Logothetis, N. K., Panzeri, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+and+analysis+of+local+field+potentials+for+studying+the+function+of+cortical+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Modelling and analysis of local field potentials for studying the function of cortical circuits.</a> Nat Rev Neurosci. 14 (11), 770-785 (2013).</li>
<li>Buzsaki, G., Anastassiou, C. A., Koch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+of+extracellular+fields+and+currents-EEG%2C+ECOG%2C+LFP+and+spikes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The origin of extracellular fields and currents-EEG, ECOG, LFP and spikes.</a> Nat Rev Neurosci. 13 (6), 407-420 (2012).</li>
<li>Sigurdsson, T., Stark, K. L., Karayiorgou, M., Gogos, J. A., Gordon, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+hippocampal-prefrontal+synchrony+in+a+genetic+mouse+model+of+schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Impaired hippocampal-prefrontal synchrony in a genetic mouse model of schizophrenia.</a> Nature. 464 (7289), 763-767 (2010).</li>
<li>Witton, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disrupted+hippocampal+sharp-wave+ripple-associated+spike+dynamics+in+a+transgenic+mouse+model+of+dementia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Disrupted hippocampal sharp-wave ripple-associated spike dynamics in a transgenic mouse model of dementia.</a> J Physiol. 594 (16), 4615-4630 (2016).</li>
<li>Englot, D. J., Konrad, P. E., Morgan, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regional+and+global+connectivity+disturbances+in+focal+epilepsy%2C+related+neurocognitive+sequelae%2C+and+potential+mechanistic+underpinnings%5BTitle%5D)+AND+%22Epilepsia%22%5BJournal%5D)">Regional and global connectivity disturbances in focal epilepsy, related neurocognitive sequelae, and potential mechanistic underpinnings.</a> Epilepsia. 57 (10), 1546-1557 (2016).</li>
<li>Pievani, M., De Haan, W., Wu, T., Seeley, W. W., Frisoni, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+network+disruption+in+the+degenerative+dementias%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurol%22%5BJournal%5D)">Functional network disruption in the degenerative dementias.</a> Lancet Neurol. 10 (9), 829-843 (2011).</li>
<li>Sigurdsson, T., Duvarci, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippocampal-prefrontal+interactions+in+cognition%2C+behavior+and+psychiatric+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Syst+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Hippocampal-prefrontal interactions in cognition, behavior and psychiatric disease.</a> Front Syst Neurosci. 9, 190(2015).</li>
<li>Sun, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+antipsychotic+drugs+and+potassium+channel+modulators+on+spectral+properties+of+local+field+potentials+in+mouse+hippocampus+and+pre-frontal+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Effects of antipsychotic drugs and potassium channel modulators on spectral properties of local field potentials in mouse hippocampus and pre-frontal cortex.</a> Neuropharmacology. 191, 108572(2021).</li>
<li>Bokil, H., Andrews, P., Kulkarni, J. E., Mehta, S., Mitra, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronux%3A+A+platform+for+analyzing+neural+signals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Chronux: A platform for analyzing neural signals.</a> J Neurosci Methods. 192 (1), 146-151 (2010).</li>
<li>Bozkurt, A., Lal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-cost+flexible+printed+circuit+technology+based+microelectrode+array+for+extracellular+stimulation+of+the+invertebrate+locomotory+system%5BTitle%5D)+AND+%22Sens+Actuator+A+Phys%22%5BJournal%5D)">Low-cost flexible printed circuit technology based microelectrode array for extracellular stimulation of the invertebrate locomotory system.</a> Sens Actuator A Phys. 169 (1), 89-97 (2011).</li>
<li>Du, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+mapping+of+in+vivo+gastrointestinal+slow+wave+activity+using+flexible+printed+circuit+board+electrodes%3A+Methodology+and+validation%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">High-resolution mapping of in vivo gastrointestinal slow wave activity using flexible printed circuit board electrodes: Methodology and validation.</a> Ann Biomed Eng. 37, 839-846 (2009).</li>
<li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroscience.+Histological+Staining+of+Neural+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Neuroscience. Histological Staining of Neural Tissue.</a> JoVE. , (2023).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przedstawiony tutaj protokół przedstawia procedurę konstruowania niestandardowego stopnia czołowego zaprojektowanego specjalnie do jednoczesnego rejestrowania podwójnych potencjałów pola lokalnego (LFP) w hipokampie (HIP) i korze przedczołowej (PFC). Szczegółowe kroki przedstawione w tym protokole dostarczają wystarczających informacji dla badaczy, aby dokładnie zbadać komunikację sygnałową zarówno w każdym regionie, jak i między HIP i PFC.
Specjalnie zaprojektowana scena główna wykorzystuje komercyjny układ wzmacniacza. Podczas gdy obecna konfiguracja obsługuje nagrywanie 8 kanałów, stację czołową można łatwo dostosować do pełnej pojemności 32 kanałów, zapewniając w ten sposób potencjał do zwiększenia pojemności kanału odpowiedniego do nagrywania w układzie elektrod. Biorąc pod uwagę niski koszt sceny, jedną z opcji jest trwałe przymocowanie deski do głowy zwierzęcia. Takie podejście ma tę zaletę, że minimalizuje artefakty ruchu i zmniejsza ogólny poziom zakłóceń spowodowanych ruchem. 
Wykonana na zamówienie elektroda wykazuje stabilny, długotrwały zapis LFP, utrzymując dobrą jakość sygnału przez okres 3-5 miesięcy. Innym realnym podejściem jest zastosowanie elastycznych płytek drukowanych na bazie poliimidu jako układów elektrod10,11. Te elastyczne płytki drukowane można zintegrować ze sceną czołową nagrywającą, aby umożliwić nagrywanie wielokanałowe. Zaletą tej metody jest uproszczenie przygotowania elektrod i zabiegów chirurgicznych. Waga implantu z głowicą i bez niej jest bardzo lekka, wynosi odpowiednio 0,198 g i 0,812 g, dzięki czemu jest odpowiedni dla bardzo młodych myszy.
Jednym z ograniczeń obecnej techniki nagrywania są potencjalne zakłócenia powodowane przez wiszący kabel, które mogą zakłócać naturalne zachowanie zwierzęcia podczas eksperymentów. Aby rozwiązać ten problem, można rozważyć alternatywne rozwiązania, takie jak wykorzystanie karty SD do przechowywania danych lub wdrożenie modułu nadajnika sygnału bezprzewodowego.
Istotnym i krytycznym etapem protokołu jest dokładne ustawienie elektrody. Kluczowe znaczenie ma zapewnienie precyzyjnego i spójnego rozmieszczenia elektrod, aby umożliwić porównywalność między eksperymentami. Aby zweryfikować położenie elektrody, należy przeprowadzić badanie histologiczne12. Przydatną techniką poprawiającą prawidłowe ustawienie elektrod w HPC jest nagrywanie, gdy elektroda jest włożona pionowo, ponieważ silne rytmy theta i odpalanie neuronów wskażą prawidłowe umieszczenie. Zaleca się wykorzystanie dorosłych myszy w wieku powyżej 8 tygodni, ponieważ jakość sygnału może z czasem ulec pogorszeniu lub spowodować nieprawidłowe umieszczenie wraz z wiekiem myszy. Uwzględnienie tych rozważań pomoże utrzymać wiarygodność i ważność wyników eksperymentalnych. 
Podsumowując, protokół przedstawiony w tym artykule zapewnia ramy do badania komunikacji sygnałowej między różnymi obszarami mózgu. Umożliwia to naukowcom zbadanie dynamiki neuronalnej i interakcji w obrębie tych regionów i między nimi.

Lokalne potencjały pola (LFP) odnoszą się do aktywności elektrycznej rejestrowanej z przestrzeni zewnątrzkomórkowej, odzwierciedlającej zbiorową aktywność zlokalizowanej grupy neuronów. Wykazują one zróżnicowany zakres częstotliwości, od wolnych fal o częstotliwości 1 Hz do szybkich oscylacji przy 100 Hz lub 200 Hz. Określone pasma częstotliwości zostały powiązane z funkcjami poznawczymi, takimi jak uczenie się, pamięć i podejmowanie decyzji1,2. Zmiany właściwości LFP zostały wykorzystane jako biomarkery różnych zaburzeń neurologicznych, w tym demencji i schizofrenii3,4. Analiza zapisów LFP może dostarczyć cennych informacji na temat podstawowych mechanizmów patologicznych związanych z tymi stanami i potencjalnych strategii terapeutycznych.
Podwójny zapis LFP to technika używana do pomiaru zlokalizowanej aktywności elektrycznej w obrębie i pomiędzy dwoma określonymi obszarami mózgu. Technika ta stanowi cenną okazję do zbadania skomplikowanej dynamiki neuronalnej i komunikacji sygnałów zachodzących w różnych obszarach mózgu i między nimi. Wcześniejsze badania wykazały, że wykrywanie zmian we właściwościach neuronalnych poszczególnych regionów mózgu może być złożone, ale można zaobserwować zmiany w międzyregionalnej komunikacji korowej5,6. Dlatego wykorzystanie podwójnego nagrywania LFP stanowi skuteczny sposób na rozwiązanie tego problemu.
Łączność hipokampowo-przedczołowa odgrywa kluczową rolę w modulowaniu funkcji poznawczych, a dysfunkcja została powiązana z różnymi zaburzeniami neurologicznymi7,8. Zapisy tych obszarów z podwójnymi elektrodami mogą dostarczyć informacji o tych interakcjach. Niestety, dostępne są ograniczone informacje na temat metod wykonywania dwuelektrodowych nagrań LFP między tymi obszarami. Co więcej, dostępne na rynku urządzenia rejestrujące są na ogół drogie i nie można ich dostosować do konkretnych projektów eksperymentalnych. Konwencjonalna metoda rejestrowania LFP polega na użyciu ekranowanego do połączenia urządzenia rejestrującego z elektrodami wszczepionymi w mózg zwierzęcia. Takie podejście jest jednak podatne na artefakty ruchu i szumy otoczenia, co wpływa na jakość i niezawodność rejestrowanych sygnałów.
Ten protokół opisuje kompleksową procedurę wykonywania dwuelektrodowych nagrań LFP w hipokampie myszy i korze przedczołowej, przy użyciu taniego specjalnie zaprojektowanego stopnia głowy, który można umieścić na głowie zwierzęcia. Metody te umożliwiają naukowcom badanie specyficznych dla regionu wzorców oscylacyjnych w obrębie dwóch odrębnych regionów mózgowych oraz badanie międzyregionalnej wymiany informacji i połączeń między tymi obszarami.

<table><tbody><tr><td>Rura mosiężna&nbsp;</td><td>Albion Alloys, USA</td><td>Średnica wewnętrzna 0,45 mm</td><td></td></tr><tr><td>Carprofen&nbsp;</td><td>Rimadyl, Pfizer Zdrowie zwierząt&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Komercyjny układ wzmacniacza</td><td>Intantech</td><td>RHD 2132</td><td></td></tr><tr><td>Tablica sterownicza</td> System <td></td>nagrywania <td>Intantech</td><td>RHD</td></tr><tr><td>Cement dentystyczny&nbsp;</td><td>Paladur</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Koszulki termokurczliwe</td><td>Panduit</td> Śruba ze stali nierdzewnej <td>M1,2 o średnicy</td><td></td>0,8 mm</tr><tr><td></td><td>Narzędzia do zegarków</td><td>Śruba</td><td></td>zegara i zegarka</tr><tr><td>Złącze gniazda wielokanałowego&nbsp;</td><td>Harwin,</td><td>raster AU 1,27 mm, gniazdo</td><td></td>do płytek drukowanych,</tr><tr><td>przewody wolframowe powlekane PFA&nbsp;</td><td>A-M SYSTEMS, USA</td><td>Średnica wewnętrzna 150 &mikro; m&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Topnik na bazie kwasu fosforowego</td><td>Chip Quik</td><td>CQ4LF-0.5</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do nagrywania</td> Oprogramowanie do <td>nagrywania</td><td></td><td>Intantech</td> RHX</tr><tr><td>Rama stereotaktyczna</td><td>Świat Instrumenty precyzyjne</td><td>Mysz Instrument</td><td></td>stereotaktyczny</tr><tr><td>Super klej</td><td>UHU</td><td>Ultra szybki</td><td></td></tr></tbody></table>

podwójne nagrania zewnątrzkomórkowe w hipokampie myszy i korze przedczołowej myszy

Dual Extracellular Recordings in the Mouse Hippocampus and Prefrontal Cortex

Technika rejestrowania lokalnych potencjałów pola (LFP) jest metodą elektrofizjologiczną używaną do pomiaru aktywności elektrycznej zlokalizowanych populacji neuronów. Służy jako kluczowe narzędzie w badaniach poznawczych, szczególnie w obszarach mózgu, takich jak hipokamp i kora przedczołowa. Podwójne nagrania LFP między tymi obszarami są szczególnie interesujące, ponieważ pozwalają na eksplorację międzyregionalnej komunikacji sygnałowej. Jednak metody wykonywania tych nagrań są rzadko opisywane, a większość komercyjnych urządzeń nagrywających jest albo droga, albo brakuje im możliwości dostosowania do konkretnych projektów eksperymentalnych. W badaniu przedstawiono kompleksowy protokół wykonywania dwuelektrodowych zapisów LFP w hipokampie myszy i korze przedczołowej w celu zbadania wpływu leków przeciwpsychotycznych i modulatorów kanału potasowego na właściwości LFP w tych obszarach. Technika ta umożliwia pomiar właściwości LFP, w tym widm mocy w każdym regionie mózgu i spójności między nimi. Dodatkowo, na potrzeby tych eksperymentów opracowano niedrogie, specjalnie zaprojektowane urządzenie rejestrujące. Podsumowując, protokół ten zapewnia środki do rejestrowania sygnałów o wysokim stosunku sygnału do szumu w różnych regionach mózgu, ułatwiając badanie międzyregionalnej komunikacji informacyjnej w mózgu.

Przedstawione tutaj wyniki demonstrują wpływ kilku leków na właściwości lokalnych potencjałów polowych (LFPs) badanych w czterech kohortach samców myszy C57BL/6 (n = 8 dla każdej kohorty; wiek: 8 tygodni; masa ciała: 24,0 ± 0,42 g). Przebadane leki obejmowały lek przeciwpsychotyczny klozapinę, modulatory kanałów potasowych 4-aminopirydynę (4-AP) i retigabinę, a także sól fizjologiczną jako nośnik kontrolny.
Jak pokazano na Rysunku 1, mysz umieszczono w małej komorze rejestracyjnej, a potencjały polowe (LFP) zbierano z hipokampa (HIP) i kory przedczołowej (PFC) za pomocą specjalnie zaprojektowanej głowicy rejestrującej. Ponieważ badanie to koncentrowało się przede wszystkim na analizie pasm częstotliwości theta i gamma, zarejestrowany sygnał poddano najpierw wstępnemu filtrowaniu pasmowoprzepustowemu w zakresie częstotliwości 2-100 Hz, a następnie próbkowaniu z częstotliwością 2000 Hz. Sygnał podzielono następnie na kilka 2 s epok. Epoki wykazujące wyraźne artefakty ruchowe zostały zidentyfikowane i w konsekwencji wykluczone z dalszych procesów analizy. Widma mocy LFP zarówno w HIP, jak i PFC, a także koherencję HIP-PFC zmierzono przy użyciu metody analizy opartej na wielofunkcyjnym oknie (multi-taper)9. W analizie zastosowano pięć okien Slepiana, a iloczyn czasu i szerokości pasma ustawiono na trzy, aby uzyskać optymalną koncentrację widmową. Do wygenerowania spektrogramów czasowo-częstotliwościowych oraz przebiegu czasowego koherencji HIP-PFC zastosowano przesuwne okno o szerokości 1 s i kroku 100 ms.
Jak pokazano na Rysunku 2 i Rysunku 3, podanie soli fizjologicznej nie wywołało żadnych dostrzegalnych efektów w widmach mocy LFP w HIP i PFC ani w koherencji HIP-PFC. Zarówno retigabina, jak i klozapina spowodowały wyraźne zmniejszenie mocy w pasmie gamma (30-100 Hz) w HIP i PFC, a także zmniejszenie koherencji HIP-PFC w pasmie gamma. W przeciwieństwie do nich, 4-AP wywołało efekty przeciwstawne, charakteryzujące się zwiększoną mocą pasma gamma w HIP i PFC oraz zwiększoną koherencją w pasmie gamma pomiędzy HIP a PFC.
<img alt="Schemat eksperymentu neurologicznego: mysz z kablem SPI i headstage'em, testowanie leków w obszarach mózgu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66003/66003fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Schemat układu eksperymentalnego. Elektrody zostały zaimplantowane w hipokampie (HIP) oraz korze przedczołowej (PFC) w celu rejestracji lokalnych potencjałów polowych. Zwierzę umieszczono w małej komorze rejestracyjnej, a do złącza elektrod przymocowano specjalnie zaprojektowany headstage. Każda sesja rejestracji rozpoczynała się od 10 min sesji bazowej, po której następowała 30 min sesja z podaniem leku. Przebadano działanie soli fizjologicznej, klozapiny, 4-AP oraz retygabiny. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66003/66003fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Spektrogramy aktywności neuronalnej; analiza częstotliwościowa; sól fizjologiczna, 4-AP, retigabina, klozapina; koherencja." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66003/66003fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2Wpływ leków przeciwpsychotycznych i modulatorów kanałów potasowych na aktualną aktywność elektrofizjologiczną w hipokampie (HIP) i korze przedczołowej (PFC). Znormalizowany spektrogram potencjałów polowych w HIP i PFC, wraz z koherencją HIP-PFC, wykazał efekty zależne od czasu dla wszystkich badanych leków. Leki podawano poprzez iniekcja doszpikowa w czasie t = 15 min. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66003/66003fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykresy analizy mocy częstotliwości mózgu w HIP i PFC; porównanie wpływu soli fizjologicznej i leków." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66003/66003fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Wpływ leków przeciwpsychotycznych i modulatorów kanałów potasowych na gęstość widmową mocy w HIP i PFC. 4-AP znacząco zwiększył moc w paśmie gamma w obu obszarach mózgu, podczas gdy klozapina i retygabina stłumiły moc w paśmie gamma w obu obszarach. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66003/66003fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Ten protokół opisuje użycie specjalnie zaprojektowanego urządzenia rejestrującego i elektrod do rejestrowania lokalnych potencjałów pola i badania przepływu informacji w hipokampie myszy i korze przedczołowej.

Podwójne nagrania zewnątrzkomórkowe w hipokampie myszy i korze przedczołowej myszy

The technique of recording local field potentials (LFPs) is an electrophysiological method used to measure the electrical activity of localized neuronal ...

W badaniu tym przedstawiono kompleksowy protokół wykonywania podwójnych, elektrodowych zapisów LFP w hipokampie myszy i korze przedczołowej w celu zbadania wpływu leków na właściwości LFP w tych obszarach. Protokół ten zapewnia tanie i ultralekkie urządzenie rejestrujące sygnały mózgowe, które jest w pełni zoptymalizowane pod kątem badań poznawczych na myszach. Badanie to dostarcza środków do rejestrowania sygnałów o wysokim współczynniku szumu sygnału w różnych regionach mózgu, ułatwiając badanie międzyregionalnej komunikacji informacyjnej w mózgu.Na początek przytnij druty wolframowe pokryte politetrafluoroetylenem na określone długości dla kory przedczołowej, hipokampa i elektrody uziemiającej. Pokrój mosiężną rurkę na trzymilimetrowe segmenty. Za pomocą zapalniczki usuń dwa milimetry powłoki na końcu każdego drutu, a następnie bezpiecznie drut elektrody do mosiężnej rurki.W przypadku elektrody uziemiającej ze stali nierdzewnej M1.2 do elektrody i nałóż topnik na bazie kwasu fosforowego na, aby poprawić. Na początek umieść znieczuloną mysz na poduszce grzewczej i zabezpiecz ją w ramce stereotaktycznej. Wykonaj ośmiomilimetrowe nacięcie wzdłuż linii środkowej skóry głowy i usuń tkankę łączną z tego obszaru.Ustaw punkty orientacyjne bregma i lambda na tym samym poziomie, aby uzyskać dokładne umieszczenie elektrody. Następnie wywierć otwory na elektrody odniesienia lub uziemiające, kotwiące i elektrody aktywne jako określone współrzędne. Przymocuj wykonaną na zamówienie elektrodę do ramienia ramy stereotaktycznej i upewnij się, że jest prostopadła do mózgu.Wszczepić elektrodę w obszar CA1 hipokampa. Następnie użyj mocnego kleju i cementu dentystycznego, aby zabezpieczyć elektrody. Włóż dwie kotwiące o średnicy 1,2 milimetra, aby zapobiec ruchowi.Następnie umieść elektrodę odniesienia lub uziemiającą w bezpośrednim kontakcie z oponą twardą, dwa milimetry do tyłu i dwa milimetry jednostronnie do punktu orientacyjnego lambda. Podłącz mosiężną rurkę elektrod do wielokanałowego złącza gniazda, umieszczając elektrodę uziemiającą pośrodku. Użyj rurki termokurczliwej o średnicy 0.8 milimetra na zewnątrz środkowego kołka w celu izolacji.Zabezpiecz elektrody, kotwiące i łączniki klejem i cementem dentystycznym i pozwól zwierzęciu dojść do siebie. Na początek wszczepij elektrody w hipokampie i korze przedczołowej myszy. Po tygodniowym okresie rekonwalescencji umieść zwierzę w małej komorze rejestracyjnej w klatce Faradaya, aby zmniejszyć zewnętrzne zakłócenia elektryczne.Podłącz niestandardowy stopień główny do nagrywania. Otwórz oprogramowanie do nagrywania i wybierz częstotliwość próbkowania 2,00 kiloherca. Następnie wybierz każdy kanał i naciśnij spację, aby wyłączyć wszystkie kanały z wyjątkiem 13 i 20.W oknie przepustowości sprzętowej ustaw dolną przepustowość na dwie herce, a górną przepustowość na 100 herców. Ustaw filtr dolnoprzepustowy na 100 herców, a filtr górnoprzepustowy na dwa herce w oknie filtrowania programowego. Aby wybrać ścieżkę przechowywania, kliknij wybierz nazwę pliku, a następnie kliknij Nagraj, aby rozpocząć nagrywanie.Rozpocznij każdą sesję nagraniową od 10-minutowego okresu przyzwyczajenia, po którym następuje 15-minutowy podstawowy zapis elektroencefalogramu. Po zapisie wyjściowym należy podać lek we wstrzyknięciu dootrzewnowym i kontynuować zapis przez dodatkowe 30 minut bez zwłoki. Podawanie soli fizjologicznej nie wpływało na lokalne potencjały polowe, widma mocy ani koherencję hipokampa i kory przedczołowej.Zarówno retygabina, jak i klozapina wykazały znaczne zmniejszenie mocy pasma gamma w hipokampie i korze przedczołowej, a także w hipokampie pasma gamma i koherencji kory przedczołowej. W przeciwieństwie do tego, cztery aminopirydyny wykazywały zwiększoną moc pasma gamma w hipokampie i korze przedczołowej, czemu towarzyszyła zwiększona koherencja w paśmie gamma między tymi dwoma regionami.

dual-extracellular-recordings-mouse-hippocampus-prefrontal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Opisano przygotowanie ostrych skrawków mózgu z izolowanych struktur hipokampa oraz jednoczesne rejestracje elektrofizjologiczne astrocytów i neuronów w stratum radiatum podczas stymulacji kolaterali Schaffera. Zaprezentowano farmakologiczną izolację prądów transporterów potasu i glutaminianu w astroglei.

Podwójne rejestracje elektrofizjologiczne odpowiedzi astroglialnych i neuronalnych wywołanych synaptycznie w ostrych skrawkach hipokampa

Film demonstruje procedurę rejestrowania potencjału pola lokalnego (LFP) w wycinkach kory hipokampowo-śródwęchowej myszy. Stymulacja elektryczna jest zapewniona w warstwie promieniowej CA3 hipokampa, co powoduje zmiany potencjału postsynaptycznego w warstwie piramidalnej CA1. Rejestrowana jest łączna zmiana potencjału błonowego neuronów CA1, zwana potencjałem pola lokalnego.

Rejestracja potencjału pola lokalnego w wycinkach kory hipokampowo-śródwęchowej myszy

Ten film pokazuje rejestrację rytmicznej aktywności sieci neuronalnej, znanej również jako oscylacje theta, w izolowanym hipokampie. Elektrody są umieszczane w różnych warstwach i pozycjach przestrzennych w celu wykrywania i analizowania oscylacji theta. Pokazuje to unikalny skład neuronalny i łączność sieci neuronalnej w różnych warstwach hipokampa.

Zapis in vitro oscylacji theta w hipokampie myszy

Nagrania par to równoczesne nagrania klamrów całych komórek z dwóch synaptycznie połączonych neuronów, umożliwiające precyzyjną elektrofizjologiczną i farmakologiczną charakterystykę synaps między poszczególnymi neuronami. Poniżej opisujemy szczegółową metodologię i wymagania dotyczące ustalenia tej techniki w organotypowych kulturach plastrów hipokampa w dowolnym laboratorium wyposażonym do elektrofizjologii.

Sparowane nagrania całych komórek w organotypowych wycinkach hipokampa

Demonstrujemy wykonanie, kalibrację i właściwości dwóch typów mikroelektrod selektywnych jonowo (dwulufowych i koncentrycznych) do pomiaru stężeń jonów w tkance mózgowej. Są one następnie wykorzystywane w przygotowaniu plastra hipokampa myszy, aby pokazać, że aktywność pobudzająca zmienia zarówno zewnątrzkomórkowe stężenie potasu, jak i sodu.

Dwulufowe i koncentryczne mikroelektrody do pomiaru zewnątrzkomórkowych sygnałów jonowych w tkance mózgowej

Prezentujemy metody budowy elektrod do jednoczesnego rejestrowania zewnątrzkomórkowej aktywności neuronalnej i uwalniania wielu substancji neuroaktywnych w pobliżu miejsc rejestracji u obudzonych myszy. Technika ta pozwala na szczegółową analizę przypuszczalnych lokalnych wejść synaptycznych do neuronu będącego przedmiotem zainteresowania.

Zewnątrzkomórkowy zapis aktywności neuronalnej w połączeniu z mikrojonoforowym zastosowaniem substancji neuroaktywnych u obudzonych myszy

Ten protokół opisuje rejestrację lokalnych potencjałów pola za pomocą wielozębowych liniowych sond krzemowych. Konwersja sygnałów za pomocą analizy gęstości źródła prądu pozwala na rekonstrukcję lokalnej aktywności elektrycznej w hipokampie myszy. Dzięki tej technice można badać ograniczone przestrzennie oscylacje mózgu u swobodnie poruszających się myszy.

Rejestrowanie przestrzennie ograniczonych oscylacji w hipokampie zachowujących się myszy

Prezentujemy in vivo elektrofizjologiczny zapis potencjału pola lokalnego (LFP) w obustronnej wtórnej korze ruchowej (M2) myszy, który może być zastosowany do oceny lateralizacji półkuli. Badanie wykazało zmienione poziomy synchronizacji między lewym i prawym M2 u myszy APP/PS1 w porównaniu z kontrolami WT.

Ocena lateralizacji półkuli z obustronnym zapisem potencjału pola lokalnego w wtórnej korze ruchowej myszy

Użyliśmy elektrod rejestrujących i stymulujących w podłużnych wycinkach mózgu hipokampa oraz podłużnie rozmieszczonych elektrod rejestrujących i stymulujących w grzbietowym hipokampie in vivo, aby wywołać zewnątrzkomórkowe potencjały postsynaptyczne i wykazać długoterminową plastyczność synaptyczną wzdłuż podłużnego międzypłytkowego CA1.

Badanie długoterminowej plastyczności synaptycznej w międzypłytkowym hipokampie CA1 za pomocą zapisu pola elektrofizjologicznego

Przedstawiamy protokół przygotowania ostrych plastrów z grzbietowo-pośredniego hipokampa myszy. Porównujemy ten preparat poprzeczny z cięciem koronalnym pod względem jakości zapisów i zachowania cech morfologicznych zarejestrowanych neuronów.

Przygotowanie ostrych wycinków z grzbietowego hipokampa do zapisu całych komórek i rekonstrukcji neuronów w zakręcie zębatym dorosłych myszy

Protokół opisuje metodologię zewnątrzkomórkowego zapisu w korze ruchowej (MC) w celu ujawnienia zewnątrzkomórkowych właściwości elektrofizjologicznych u swobodnie poruszających się świadomych myszy, a także analizę danych lokalnych potencjałów pola (LFP) i skoków, co jest przydatne do oceny aktywności neuronalnej sieci leżącej u podstaw interesujących zachowań.

Wielokanałowy zapis zewnątrzkomórkowy w swobodnie poruszających się myszach

Poznaj metodę podwójnych rejestracji LFP w hipokampie i korze przedczołowej myszy. Technika ta umożliwia badanie wpływu leków na potencjały lokalne i komunikację międzyregionową w mózgu.

Podwójne nagrania zewnątrzkomórkowe w hipokampie myszy i korze przedczołowej myszy

Przeglądaj więcej filmów