Automatyzacja badań przesiewowych pod mikroskopią krioelektronową w wielu sieciach przy użyciu Smart Leginon
1 grudnia 2023
Badanie przesiewowe z użyciem wielu siatek w mikroskopii krioelektronowej (cryoEM) jest często żmudnym procesem, który wymaga wielu godzin uwagi. Ten protokół pokazuje, jak skonfigurować standardową kolekcję Leginon i Smart Leginon Autoscreen, aby zautomatyzować ten proces. Protokół ten można zastosować do większości dziurawych siatek foliowych cryoEM.
W Centrum Mikroskopii Elektronowej Simons staramy się zapewnić doskonałe usługi mikroskopii elektronowej, wiedzę specjalistyczną i szkolenia dla lokalnych i krajowych naukowców oraz opracowywać innowacyjne metody optymalizacji przepływów pracy. Nasz zakres obejmuje usługi, rozwój, uczenie maszynowe i badania biomedyczne. Staramy się odpowiedzieć na pytanie, w jaki sposób możemy lepiej zoptymalizować nasze usługi?
Uczenie maszynowe zmienia dziedzinę elektromikroskopii. Gromadzenie danych staje się coraz bardziej zautomatyzowane. Narzędzia do analizy danych szybko stają się coraz bardziej wydajne.
Obejmuje to odszumianie obrazów, wybieranie cząstek, analizę elastyczności 3G i budowanie modeli. Regularnie aktualizujemy oprogramowanie, aby uwzględnić różne sytuacje, takie jak różne otwory w siatce, pochylona kolekcja lub błędy zidentyfikowane za pomocą oprogramowania do testów beta w naszym środowisku produkcyjnym. Uwzględniamy również opinie naszych użytkowników, dzięki czemu stale udostępniamy funkcje, które są dla nich przydatne.
Smart Leginon radzi sobie z pracochłonnymi i czasochłonnymi zadaniami związanymi z przesiewaniem jednej lub więcej siatek na krio-TEM. Umożliwia operatorom i badaczom szybsze przesiewanie i analizowanie siatek, jednocześnie uwalniając czas na równoległą optymalizację warunków siatki i próbek. Skraca to również czas i koszty mikroskopu.
Smart Leginon Autoscreen oferuje w pełni bezobsługowe badanie przesiewowe z wieloma siatkami, które zajmuje około 10 minut, aby skonfigurować wyświetlanie dla 12 siatek. W porównaniu z ręcznym badaniem przesiewowym, nasz protokół pozwala zaoszczędzić kilka godzin dziennie. Od czasu wprowadzenia Smart Leginon, inne wolne i komercyjne oprogramowanie zostało opracowane do podobnej automatyzacji.
Aby rozpocząć, skonfiguruj interfejs Leginon, a następnie przejdź do aplikacji i kliknij Uruchom. W oknie Uruchom aplikację wybierz aplikację Ptolemeusz Ustaw główną na komputer Leginon oraz zakres i kamerę na odpowiednie komputery. Teraz zaimportuj ustawienia predefiniowane w Menedżerze ustawień predefiniowanych.
Upewnij się, że w ustawieniach węzła kierowania kwadratowego są zaznaczone opcje Sortuj cele według najkrótszej ścieżki i Włącz kierowanie automatyczne. W ustawieniach węzła kwadratowego upewnij się, że zaznaczona jest opcja Poczekaj, aż węzeł przetworzy obraz. Dodaj ustawienie wstępne Kwadrat do listy, jeśli nie zostało jeszcze uwzględnione.
W obszarze Ustawienia zaawansowane zaznacz opcję Ustaw te przysłony podczas obrazowania i upewnij się, że wartości przysłony są prawidłowe. Aby dostosować ustawienia węzła celowania w otwory, zaznacz opcję Zezwalaj na weryfikację wybranych celów przez użytkownika. Usuń zaznaczenie opcji Kolejkuj cele w kolejce i Pomiń automatyczną wyszukiwarkę otworów.
W ustawieniu węzła otworu zaznacz opcję Poczekaj, aż węzeł przetworzy obraz, a ustawienie wstępne otworu znajduje się na liście po prawej stronie. W ustawieniach zaawansowanych zaznacz opcję Ustaw te przysłony podczas obrazowania i potwierdź wartości przysłony. W ustawieniach węzła Kierowanie na ekspozycję wybierz opcję Zezwalaj na weryfikację wybranych celów przez użytkownika. Upewnij się, że pola Kolejka do celów i Pomiń automatyczną wyszukiwarkę otworów nie są zaznaczone.
Aby skonfigurować ustawienia węzła ekspozycji, upewnij się, że opcja Poczekaj, aż węzeł przetworzy obraz nie jest zaznaczona. Upewnij się, że ustawienie wstępne ekspozycji znajduje się na liście po prawej stronie. W obszarze Ustawienia zaawansowane wybierz opcję Ustaw te przysłony podczas obrazowania i sprawdź, czy wartości przysłony są dokładne.
W ustawieniach węzła fokusu upewnij się, że opcja Poczekaj, aż węzeł przetworzy obraz nie jest zaznaczona. Sprawdź, czy ustawienie wstępne automatycznego ustawiania ostrości jest wymienione po prawej stronie, i ustaw żądaną dokładność autofokusa na 4 x 10 na 6 metrów. W sekwencji ostrości węzła ostrości aktywuj tylko kroki automatycznego ustawiania ostrości z pochyleniem dwóch wiązek.
Aby dostosować ustawienia węzła ostrości Z, upewnij się, że opcja Poczekaj, aż węzeł przetworzy obraz nie jest zaznaczona. Upewnij się, że ustawienie wstępne Hole jest wymienione po prawej stronie i ustaw żądaną dokładność autofokusa na 5 x 10 na 5 metrów. W sekwencji ostrości węzła ostrości Z Focus Node włącz tylko dwa kroki pochylenia stolika przy małym powiększeniu.
Po określeniu wysokości siatki Z i zebraniu atlasu, użyj kwadratowego węzła celowniczego w Ptolemeuszu, aby zlokalizować kwadraty. Obserwuj niebieskie kółka na każdym kwadracie. Najedź kursorem na każdą plamę, aby wyświetlić jej rozmiar obliczony przez Ptolemeusza i zapisać rozmiary największych i najmniejszych plam.
Aby zmodyfikować ustawienia progu, dostosuj minimalny i maksymalny zakres filtra, aby uwzględnić pożądane kwadraty i wykluczyć niepożądane. Naciśnij przycisk Drobne kwadraty na górnym pasku narzędzi. Dostosuj zakres filtrów, aż funkcja Drobne kwadraty będzie skutecznie celować w kwadraty.
W ustawieniach akwizycji wybierz odpowiednie wartości dla maksymalnej liczby celów i liczby grup docelowych do próbkowania. Gdy parametry będą zadowalające, kliknij przycisk Odtwórz, aby kontynuować. Następnie użyj narzędzia Linijka w węźle Celowanie w otwór, aby zmierzyć średnicę otworu.
W ustawieniach szablonu upewnij się, że zmierzona średnica jest zgodna z ostateczną średnicą szablonu i kliknij przycisk Testuj. Dostosuj wartość średnicy, aż wszystkie otwory będą miały jasne białe szczyty w środku. Kliknij przycisk Test (Testuj) w ustawieniach progu.
Modyfikuj wartość A, aż binaryzowany obraz będzie wyraźnie pokazywał białe obszary wyłącznie w miejscach, w których znajdują się otwory. W ustawieniach obiektów blob zmierz minimalną odległość od krawędzi za pomocą linijki i wprowadź tę wartość, aby wykluczyć obiekty docelowe obramowania. Filtruj obiekty blob na podstawie rozmiaru, zaokrąglenia i żądanej ilości.
Umieść kursor na obiektach blob, aby wyświetlić ich wartości, a następnie kliknij przycisk Testuj, aby przejrzeć bieżące ustawienia. Wprowadź promień otworów i odstępy między nimi w Ustawieniach kratowni. Następnie kliknij przycisk 42, aby zmierzyć wartość odniesienia intensywności obszaru próżni.
W ustawieniach pobierania zaznacz opcję użyj podzbioru celów pozyskiwania i ustaw wartość Maksymalna próbka na niską liczbę, na przykład 2. Zdefiniuj szeroki zakres średnich grubości lodu i odchyleń standardowych. Użyj kierowania testowego, aby losowo wybrać cel na podstawie powyższych wartości.
Kliknij przycisk Odtwórz, aby kontynuować, gdy wszystkie ustawienia będą zadowalające. W ustawieniach otworu ustaw skrypt powłoki na hl.finding. sh ścieżka skryptu w instalacji Ptolemeusza.
Ustaw minimalny ból na mniej niż zero. Wprowadź promień otworów. Następnie kliknij przycisk Pokaż wartość, aby zmierzyć wartość natężenia odniesienia obszaru próżni.
Kliknij przycisk Testuj, aby znaleźć siatkę otworów. W obszarze Ustawienia pobierania zaznacz opcję Użyj podzbioru celów pozyskiwania i ustaw przykładową wartość maksymalną na małą liczbę, na przykład 4. Ustaw szeroki zakres średnich grubości lodu i odchyleń standardowych.
Kliknij przycisk Odtwórz, gdy wszystkie ustawienia są zadowalające. Leginon wykona eucentryczne ustawianie ostrości i zbierze obrazy w dużym powiększeniu, które będzie można zobaczyć w węźle ekspozycji. Sprawdź następny obraz z celowaniem ekspozycji, aby zobaczyć, czy ustawienia są wystarczające.
Gdy spełnisz te wymagania, odznacz opcję Zezwalaj na weryfikację wybranych celów przez użytkownika w ustawieniach Kierowanie na ekspozycję i Celowanie w dołki. Po zakończeniu przesiewania siatki kliknij Plik, a następnie Wyjdź, aby zamknąć Leginon. Aby skonfigurować Smart Leginon Autoscreen, uruchom smartlegenionautoscreen.
py w oknie terminala Wybierz GY i wprowadź na ekran rozdzieloną przecinkami listę miejsc w siatce. Następnie wprowadź pełne dane dla przepływu pracy. Wprowadź nazwę sesji szablonu dla nowych sesji i wartość wysokości Z sesji szablonu.
Otworzy się GY, w którym można wprowadzić nazwę sesji i wybrać powiązania projektu dla każdej siatki. Pozostaw mikroskop bez nadzoru lub monitoruj go w Leginon, Appion i komputerze mikroskopu.
Przegląd
Ten protokół opisuje automatyzację wielokratowego przesiewania mikroskopii krioelektronowej (cryoEM) za pomocą Smart Leginon Autoscreen. Poprzez usprawnienie procesu konfiguracji, naukowcy mogą znacznie zmniejszyć czas poświęcany na przesiewanie siatek, co pozwala na bardziej efektywną analizę i optymalizację warunków próbek.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Mikroskopia krioelektronowa
- Automatyzacja w mikroskopii
- Analiza obrazu
Tło
- Wielokratowe przesiewanie cryoEM jest tradycyjnie pracochłonne.
- Automatyzacja może zwiększyć efektywność i obniżyć koszty.
- Smart Leginon Autoscreen umożliwia nienadzorowane przesiewanie.
- Uczenie maszynowe poprawia zbieranie danych i analizę w mikroskopii elektronowej.
Cel badania
- Aby zautomatyzować proces wielokratowego przesiewania cryoEM.
- Aby zmniejszyć czas i pracochłonność analizy siatek.
- Aby zoptymalizować przepływy pracy dla naukowców w mikroskopii elektronowej.
Zastosowane metody
- Konfiguracja interfejsu Leginon dla zautomatyzowanego przesiewania.
- Konfiguracja różnych ustawień celowania i ekspozycji.
- Wykorzystanie aplikacji Ptolemy do przetwarzania obrazów.
- Integracja opinii użytkowników dla ciągłej poprawy.
Główne wyniki
- Smart Leginon Autoscreen zmniejsza czas przesiewania o kilka godzin dziennie.
- Operatorzy mogą efektywnie przesiewać wiele siatek.
- Automatyzacja umożliwia równoległą optymalizację warunków siatki i próbki.
- Ciągłe aktualizacje oprogramowania poprawiają funkcjonalność na podstawie potrzeb użytkowników.
Wnioski
- Automatyzacja w cryoEM znacznie poprawia efektywność przepływu pracy.
- Smart Leginon Autoscreen jest cennym narzędziem dla naukowców.
- Przyszłe rozwój prawdopodobnie będzie nadal zwiększać automatyzację i analizę danych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Automated cryo-electron microscopy (cryoEM) grid screening using Smart Leginon addresses a critical bottleneck in structural biology and biopharma discovery workflows. By reducing operator time and increasing throughput, this automation enhances the efficiency of early-stage structure-based drug discovery and target validation. The approach enables scalable, reproducible screening across multiple grids, supporting robust decision-making at key inflection points in the discovery pipeline.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Accelerates structural interrogation of macromolecular complexes for target validation.
- Enables rapid optimization of sample and grid conditions, reducing experimental ambiguity.
- Supports predictive confidence in structural hypotheses for portfolio triage.
Screening & Assay Development
- Prepares validated cryoEM grids for downstream high-resolution data collection workflows.
- Standardizes grid screening, improving reproducibility and quantitative assessment of sample quality.
- Facilitates scalable, unattended screening to enable reliable evaluation of multiple conditions.
Translational & Preclinical Research
- Provides structural insights that inform translational biomarker alignment when relevant.
- Ensures continuity from discovery-stage screening to preclinical structural validation.
- Reduces risk by enabling early identification of optimal sample conditions for further development.
Pipeline & Workflow Integration
Smart Leginon Autoscreen integrates into the discovery continuum from early sample optimization through lead identification and preclinical structural validation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling rapid, reproducible grid screening.
- Screening: Delivers standardized, quantitative outputs for comparing grid and sample conditions.
- Analytics: Provides high-content imaging and statistical outputs to inform selection of grids for high-resolution data collection.
- Translational Research: Maintains structural continuity for biomarker and mechanistic studies when supported by the workflow.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, reusable automation capability for multi-project screening needs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in structural studies.
- Operational Value: Standardizes and scales grid screening, reducing operator time from hours to minutes.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions and capital efficiency by accelerating early-stage structural validation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of structurally validated targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cryoEM sample preparation and grid optimization.
- Depends on access to automated cryoEM instrumentation and compatible software infrastructure.
- Demands cross-team standardization of screening parameters and data management.
- May require adaptation for different grid types or sample classes as supported by the software.
- Practical limitations include microscope availability and initial setup for automation workflows.
