Name: Automatyzacja badań przesiewowych pod mikroskopią krioelektronową w wielu sieciach przy użyciu Smart Leginon (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-01T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 52 s
Description: Poznaj automatyzację przesiewania wielu siatek w kriomikroskopii elektronowej przy użyciu Smart Leginon. Ta metoda znacząco skraca czas analizy i optymalizuje warunki próbek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Niektóre z tych prac zostały wykonane w Centrum Mikroskopii Elektronowej Simonsa w Centrum Biologii Strukturalnej w Nowym Jorku, przy wsparciu Fundacji Simonsa (SF349247), NIH (U24 GM129539) i Zgromadzenia Stanowego Nowego Jorku.

Accelerating Macromolecular Structural Analysis Using Smart Leginon Autoscreen

<ol><li>Noble, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Routine+single+particle+CryoEM+sample+and+grid+characterization+by+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Routine single particle CryoEM sample and grid characterization by tomography.</a> eLife. 7, e34257(2018).</li>
<li>Weissenberger, G., Henderikx, R. J. M., Peters, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+invisible+hands+of+sample+preparation+for+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Understanding the invisible hands of sample preparation for cryo-EM.</a> Nature Methods. 18 (5), 463-471 (2021).</li>
<li>Carragher, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+outcomes+when+optimizing+%27standard%27+sample+preparation+for+single-particle+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Current outcomes when optimizing 'standard' sample preparation for single-particle cryo-EM.</a> Journal of Microscopy. 276 (1), 39-45 (2019).</li>
<li>Kampjut, D., Steiner, J., Sazanov, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM+grid+optimization+for+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM grid optimization for membrane proteins.</a> iScience. 24 (3), 102139(2021).</li>
<li>Suloway, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+molecular+microscopy%3A+The+new+Leginon+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Automated molecular microscopy: The new Leginon system.</a> Journal of Structural Biology. 151 (1), 41-60 (2005).</li>
<li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+electron+microscope+tomography+using+robust+prediction+of+specimen+movements%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements.</a> Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).</li>
<li>Koh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Routine+collection+of+high-resolution+cryo-EM+datasets+using+200+KV+transmission+electron+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Routine collection of high-resolution cryo-EM datasets using 200 KV transmission electron microscope.</a> Journal of Visualized Experiments. 181, 63519(2022).</li>
<li>Cheng, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fully+automated+multi-grid+cryoEM+screening+using+Smart+Leginon%5BTitle%5D)+AND+%22IUCrJ%22%5BJournal%5D)">Fully automated multi-grid cryoEM screening using Smart Leginon.</a> IUCrJ. 10 (1), 77-89 (2023).</li>
<li>Kim, P. T., Noble, A. J., Cheng, A., Bepler, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Learning+to+automate+cryo-electron+microscopy+data+collection+with+Ptolemy%5BTitle%5D)+AND+%22IUCrJ%22%5BJournal%5D)">Learning to automate cryo-electron microscopy data collection with Ptolemy.</a> IUCrJ. 10 (1), 90-102 (2023).</li>
<li>Bepler, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smart+data+collection+for+CryoEM%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Smart data collection for CryoEM.</a> Journal of Structural Biology. 214 (4), 107913(2022).</li>
<li>Bouvette, J., Huang, Q., Riccio, A. A., Copeland, W. C., Bartesaghi, A., Borgnia, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+systematic+evaluation+of+cryo-EM+specimens+with+SmartScope%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Automated systematic evaluation of cryo-EM specimens with SmartScope.</a> eLife. 11, e80047(2022).</li>
<li>Deng, Y., Grollios, F., Kohr, H., van Knippenberg, B., Janus, M., Caglar, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smart+EPU%3A+SPA+Getting+Intelligent%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+and+Microanalysis%22%5BJournal%5D)">Smart EPU: SPA Getting Intelligent.</a> Microscopy and Microanalysis. 27 (S1), 454-455 (2021).</li>
<li>Fan, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CryoRL%3A+Reinforcement+learning+enables+efficient+cryo-EM+data+collection%5BTitle%5D)+AND+%22arXiv%22%5BJournal%5D)">CryoRL: Reinforcement learning enables efficient cryo-EM data collection.</a> arXiv. , (2022).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+path+planning+surpasses+human+efficiency+in+cryo-EM+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv.+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Optimized path planning surpasses human efficiency in cryo-EM imaging.</a> bioRxiv. Biophysics. , (2022).</li>
<li>Lander, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Appion%3A+An+integrated%2C+database-driven+pipeline+to+facilitate+EM+image+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Appion: An integrated, database-driven pipeline to facilitate EM image processing.</a> Journal of Structural Biology. 166 (1), 95-102 (2009).</li>
<li>Rice, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Routine+determination+of+ice+thickness+for+cryo-EM+grids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Routine determination of ice thickness for cryo-EM grids.</a> Journal of Structural Biology. 204 (1), 38-44 (2018).</li>
<li>Russo, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+for+seeing+molecules+in+cells%2C+CZ+Imaging+Institute%27s+Hardware+Frontiers+for+CryoET+Workshop%5BTitle%5D)+AND+%22CZ+Imaging+Institute%27s+Hardware+Frontiers+for+CryoET+Workshop%22%5BJournal%5D)">The potential for seeing molecules in cells, CZ Imaging Institute's Hardware Frontiers for CryoET Workshop.</a> CZ Imaging Institute's Hardware Frontiers for CryoET Workshop. , https://chanzuckerberg.com/science/meetings/hardware-frontiers-cryoet-workshop/ (2023).</li>
<li>Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cryoSPARC%3A+algorithms+for+rapid+unsupervised+cryo-EM+structure+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination.</a> Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).</li>
<li>Budell, W. C., Allegri, L., Dandey, V., Potter, C. S., Carragher, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-electron+microscopic+grid+preparation+for+time-resolved+studies+using+a+novel+robotic+system%2C+Spotiton%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Cryo-electron microscopic grid preparation for time-resolved studies using a novel robotic system, Spotiton.</a> Journal of Visualized Experiments. 168, 62271(2021).</li>
<li>Darrow, M. C., Booth, T., Moore, J. P., Doering, K., Thaw, P., King, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enabling+a+paradigm+shift+in+CryoEM+sample+preparation+with+chameleon%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+and+Microanalysis%22%5BJournal%5D)">Enabling a paradigm shift in CryoEM sample preparation with chameleon.</a> Microscopy and Microanalysis. 27 (S1), 524-525 (2021).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

W tym protokole opisujemy potok dla Smart Leginon Autoscreen, a dodatkowo podstawowe użycie Leginon dla tych, którzy są nowicjuszami w oprogramowaniu do zbierania. Do końca 2024 r. krioEM z pojedynczymi cząstkami ma szansę stać się najbardziej wydajną techniką trójwymiarowego (3D) rozpoznawania struktur białek17. Potok krioEM z pojedynczymi cząstkami składa się z kilku etapów, które są stale optymalizowane w celu zwiększenia jakości danych i przepustowości. Rysunek 2 przedstawia najczęstsze etapy (przygotowanie próbki, przygotowanie siatki, czas i wysiłek związany z przesiewaniem, czas pobierania w wysokiej rozdzielczości, przetwarzanie na żywo i pełne przetwarzanie końcowe) wraz z innymi elementami rurociągu, które można poprawić (dostęp do mikroskopu przesiewowego, szybkość i dokładność etapu, szybkość i dostęp do mikroskopu o wysokiej rozdzielczości). Wyniki z większości kroków stają się pętlami sprzężenia zwrotnego do poprzednich kroków (niebieskie strzałki na rysunku 2), co sprawia, że cały potok jest wysoce współzależny. Każdy krok na rysunku 2 jest pokolorowany, aby przybliżyć, jak dużym wąskim gardłem jest dany krok w stosunku do innych. Smart Leginon Autoscreen znacznie skraca czas i wysiłek operatora związany z przesiewaniem 12 siatek z 6 godzin do mniej niż 10 minut, eliminując w ten sposób wąskie gardło i umożliwiając szybsze przekazywanie informacji zwrotnych na temat przygotowania próbki/siatki (ilustracja 3).
W protokole znajduje się kilka kluczowych etapów, które przedstawiono na rysunku 1. Bardzo ważne jest, aby siatka używana do tworzenia sesji szablonu była reprezentatywna dla pozostałych siatek, które mają być monitorowane. Co ważne, Leginon zapamiętuje wszystkie ustawienia w całym procesie konfiguracji tworzenia sesji szablonu (niebieskie kroki na rysunku 1), co pozwala na szybsze skonfigurowanie powtarzających się sesji szablonów za każdym razem. Podczas tworzenia sesji szablonu najważniejszym krokiem jest skonfigurowanie kierowania we wszystkich powiększeniach, tak aby parametry i progi odzwierciedlały oczekiwaną zmienność w siatkach, które mają być przesiewane. Różne przyciski "Testuj" pozwalają na zwiększenie wydajności w tym procesie konfiguracji. Podczas sesji Autoscreen bardzo ważne jest monitorowanie kilku pierwszych siatek w Appion, aby szybko wykryć wszelkie problemy i naprawić je w Leginon tak szybko, jak to możliwe.
Typowy przepływ pracy w SEMC polega na wprowadzaniu danych Autoscreen do CryoSPARC Live18 i wykorzystaniu tych dodatkowych informacji do informowania pętli sprzężenia zwrotnego o przygotowaniu próbki/siatki. Podczas intensywnych dni optymalizacji krioEM przez badaczy i operatorów, informacje o warunkach próbki i siatki są wprowadzane z powrotem do przygotowania próbki i siatki, podczas gdy Autoscreen nadal przesiewa siatki. Pozwala to na zamrożenie i przesiewanie kilkudziesięciu siatek w ciągu tygodnia8.
Smart Leginon Autoscreen działa w przypadku większości (80%-90%) dziurawych siatek i warunków obserwowanych w SEMC. Pozostałe 10%-20% siatek to te, które czasami nie działają dobrze - siatki z minimalną różnicą kontrastu między otworami a podłożem; siatki z mniejszymi otworami i odstępami (np. 0,6/0,8) - oraz siatki, w których celowanie w wiele siatek jest często niepraktyczne - siatki Spotiton/Chameleon19,20, które składają się z pasków próbki w poprzek siatki; koronkowe kratki. Należy pamiętać, że kolekcja pochylonej siatki z automatycznym filtrowaniem jest w trakcie opracowywania, ale nie jest jeszcze dostępna. Możliwe jest zmodyfikowanie protokołu tak, aby działał z siatkami Spotiton/Chameleon, najpierw ręcznie obrazując obszary paska w celu określenia wąskich progów parametrów, następnie próbując zgrupować odpowiednio większe i mniejsze kwadraty w kroku 2.1.7.4, a następnie wybierając cele z grupy z lodem. Celem tej modyfikacji jest oddzielenie przez Smart Leginon pustych i niepustych kwadratów na dwie grupy. Jeśli zostaną znalezione parametry, mogą one nie rozciągać się dobrze na pozostałe siatki, które mają być ekranowane. Możliwe jest również zmodyfikowanie protokołu tak, aby działał z siatkami Lacey, usuwając skrypt hl_finding.sh w kroku 2.1.9.1 i konfigurując parametry tak, aby były kierowane na jaśniejsze/ciemniejsze obszary zgodnie z potrzebami. Wskaźnik powodzenia tej modyfikacji może się różnić w zależności od siatki w zależności od grubości lodu i materiału siatki.
Rozwiązywanie problemów podczas sesji automatycznego filtrowania jest możliwe, a czasami nawet uzasadnione. Zmiany w ustawieniach wstępnych (np. rozmycie) i parametrach kierowania (np. progach celowania w otwory) można wprowadzać podczas automatycznego zbierania. Podczas zbierania danych przez sesję automatycznego filtrowania nie można anulować sesji siatki, ponieważ spowoduje to zakończenie autoscreen.py. Jednak przyciski Przerwij w węzłach określania wartości docelowej mogą służyć do pomijania dowolnej części siatki lub całej siatki. Czasami autoscreen.py zużywają zbyt dużo pamięci i zawieszają się, oferując dwie opcje: "wymuś zakończenie" lub "poczekaj". Jeśli wybrano opcję "wymuś zakończenie", cały skrypt zostanie zakończony, co będzie wymagało od użytkownika ponownego uruchomienia skryptu w celu zastosowania go do pozostałych siatek w celu prześwietlenia. Jeśli wybrano opcję "czekaj", skrypt będzie kontynuowany, a ustawienia mogą zostać zmienione, aby zapobiec zamrożeniu w przyszłości, np. wyłączenie wyświetlania obrazu w węźle Ekspozycja, zmniejszenie rozmiaru piksela w atlasie lub uruchomienie skryptu czyszczącego pamięć. Jeśli program zawiesi się bez zaoferowania dwóch opcji, błędy pamięci mogą nie ustąpić samoistnie, powodując przerwę w pobieraniu. Opcja "wymuś zakończenie" może być przydatna w tym przypadku.
Smart Leginon Autoscreen jest regularnie używany w SEMC. Ponieważ wąskie gardła w rurociągu krioelektromagnetycznego pojedynczych cząstek są nadal zmniejszane, adopcja krioEM będzie nadal rosła, aby pomóc w znalezieniu odpowiedzi na pytania biologiczne. Protokół ten jest krokiem w kierunku optymalizacji całego rurociągu poprzez zapewnienie jasnej ścieżki do znacznego ograniczenia pętli sprzężenia zwrotnego.

Mikroskopia krioelektronowa pojedynczych cząstek (cryoEM) pozwala na określenie struktury o rozdzielczości zbliżonej do atomowej oczyszczonych kompleksów makromolekularnych. Eksperyment z krioEM z pojedynczymi cząstkami wymaga tylko jednej lub dwóch dobrze dobranych siatek wybranych ze znacznie większego zestawu siatek o różnych warunkach próbki i siatki. Badanie przesiewowe mikroskopu w celu zbadania tych siatek polega na obrazowaniu każdej siatki w kilku powiększeniach w celu określenia, która siatka spełnia najważniejsze kluczowe wymagania dotyczące gromadzenia danych o wysokiej rozdzielczości, w tym grubość lodu, obszary wystarczające do pełnego zbierania danych, czystość białka, stężenie białka, stabilność białka i minimalne preferowane problemy z orientacją<klasa sup="xref">1. Optymalizacja pod kątem tych kluczowych wymagań często wiąże się z informacją zwrotną między badaniem przesiewowym pod mikroskopem a warunkami przygotowania, takimi jak produkcja białka, wybór buforu, potencjalne detergenty i typ siatki2,3,4 (Rysunek 1). Konwencjonalne siatkowanie siatki jest wykonywane ręcznie lub półręcznie za pomocą oprogramowania takiego jak Leginon5, SerialEM6 i EPU7. Konwencjonalne badania przesiewowe wymagają od operatora mikroskopu spędzania godzin przy mikroskopie w celu przesiewania kilku siatek, co tworzy znaczne wąskie gardło w pracy z pojedynczymi cząstkami o wysokiej rozdzielczości, zajmując operatora operacjami na pamięć, a nie optymalizacją próbki/siatki.
Poprzednio, wprowadzono Smart Leginon Autoscreen i podstawowe oprogramowanie do uczenia maszynowego, Ptolemeusza, a ich podstawowe metody i algorytmy wraz z przykładami zostały opisane8,9. Kilka innych pakietów oprogramowania jest zdolnych do w pełni zautomatyzowanego badania przesiewowego z wieloma siatkami lub pracuje nad tym rozwiązaniem10, w tym SmartScope11, Smart EPU12 i CryoRL13,14. Aby rozwiązać problem wąskiego gardła w badaniach przesiewowych, Smart Leginon umożliwia użytkownikowi najpierw skonfigurowanie parametrów rastrowania w sesji mikroskopu szablonowego, a następnie użycie parametrów tej sesji szablonu jako szablonu do przesiewania pełnej kasety siatek w automatycznym ładowaniu mikroskopu. Wszelka ręczna praca podczas przesiewania kaset zostaje wyeliminowana, co pozwala na znacznie bardziej efektywny przebieg pętli sprzężenia zwrotnego optymalizacji.
W tym protokole, pełny przepływ pracy Smart Leginon Autoscreen jest opisany, dzięki czemu czytnik może samodzielnie wykonywać w pełni zautomatyzowane przesiewanie krioelektromagnetyczne z wieloma siatkami. Dla tych, którzy są nowicjuszami w Leginon, pierwsza sekcja w protokole opisuje konwencjonalne użycie Leginon. Wiedza ta składa się z kilkuletniego doświadczenia w pracy z kilkoma mikroskopami z automatycznym ładowaniem, które jest następnie rozwijane w kolejnej sekcji protokołu Smart Leginon. Dodatkowe filmy instruktażowe można znaleźć na https://memc.nysbc.org.

<table><tbody><tr><td>KrioTEM Glacios&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Naukowy&nbsp;</td><td>GLACIOSTEM</td><td>FEG, 200 keV, kamera Falcon 3EC&nbsp;</td></tr><tr><td>Krios cryoTEM&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Naukowy&nbsp;</td><td>KRIOSG4TEM</td><td>XFEG, 300 keV,&nbsp; Filtr energii Gatan BioQuantum, kamera Gatan K3&nbsp;</td></tr><tr><td>Leginon&nbsp;</td><td>Centrum Mikroskopii Elektronowej Simonsa&nbsp;</td><td></td><td>Źródło: http://leginon.org&nbsp;</td></tr><tr><td>Ptolemeusz&nbsp;</td><td>Centrum Uczenia Maszynowego Simons&nbsp;</td><td></td><td>https://github.com/SMLC-NYSBC/ptolemy&nbsp;</td></tr></tbody></table>

automatyzacja badań przesiewowych pod mikroskopią krioelektronową w wielu sieciach przy użyciu smart leginon

Cryo-Electron Microscopy Screening Automation Across Multiple Grids Using Smart Leginon

Postępy w technikach kriomikroskopii elektronowej (cryoEM) w ciągu ostatniej dekady pozwoliły biologom strukturalnym na rutynowe rozdzielanie makromolekularnych kompleksów białkowych do rozdzielczości bliskiej atomowi. Ogólny przepływ pracy całego rurociągu cryoEM obejmuje iterację między przygotowaniem próbki, przygotowaniem siatki krioEM i przesiewaniem próbki/siatki przed przejściem do gromadzenia danych o wysokiej rozdzielczości. Iteracja między przygotowaniem próbki/siatki a przesiewaniem jest zazwyczaj głównym wąskim gardłem dla badaczy, ponieważ każdy eksperyment iteracyjny musi być zoptymalizowany między innymi pod kątem stężenia próbki, warunków buforowych, materiału siatki, rozmiaru otworu siatki, grubości lodu i zachowania cząstek białka w lodzie. Ponadto, po zadowalającym określeniu tych zmiennych, siatki przygotowane w identycznych warunkach różnią się znacznie pod względem tego, czy są gotowe do zbierania danych, dlatego zaleca się dodatkowe sesje przesiewowe przed wyborem optymalnych siatek do zbierania danych o wysokiej rozdzielczości. Ten proces przygotowania i przesiewania próbki/siatki często pochłania kilkadziesiąt siatek i dni pracy operatora przy mikroskopie. Ponadto proces przesiewowy jest ograniczony do dostępności operatora/mikroskopu i dostępności mikroskopu. Tutaj pokazujemy, jak używać Leginon i Smart Leginon Autoscreen do automatyzacji większości badań przesiewowych z siatką cryoEM. Autoscreen łączy w sobie uczenie maszynowe, algorytmy widzenia komputerowego i algorytmy obsługi mikroskopu, aby wyeliminować potrzebę ciągłego ręcznego wprowadzania danych przez operatora. Autoscreen może autonomicznie ładować i obrazować siatki za pomocą obrazowania w wielu skalach za pomocą zautomatyzowanego systemu kaset wymiany próbek, co skutkuje bezobsługowym przesiewaniem siatki dla całej kasety. W rezultacie, czas operatora na przesiewanie 12 siatek może zostać skrócony do ~10 minut w przypadku automatycznego przesiewania w porównaniu do ~6 godzin przy użyciu poprzednich metod, które są utrudnione ze względu na ich niezdolność do uwzględnienia dużej zmienności między siatkami. Protokół ten najpierw wprowadza podstawową konfigurację i funkcjonalność Leginon, a następnie demonstruje funkcjonalność Autoscreen krok po kroku od utworzenia sesji szablonu do końca sesji automatycznego sprawdzania w 12 siatkach.

Zgodnie z protokołem sesje przesiewowe cryoEM mogą być uruchamiane automatycznie i przebiegać pomyślnie dla większości (80%-90%) kratek dziurawych oraz warunków. Wcześniej zaprezentowano kilka przykładów i eksperymentów8,9, aby zademonstrować oczekiwane wyniki udanych sesji Smart Leginon Autoscreen. Udana sesja Autoscreen zaczyna się od ok. 10 min konfiguracji i zazwyczaj kończy się automatycznym przesiewem pełnej kasety zawierającej 12 kratek po około 6 h (30 min na kratkę), podczas której obrazowane jest 3-5 kwadratów o różnych rozmiarach oraz 3-5 otworów na kwadrat z wysokim powiększeniem, co pozwala użytkownikowi na szybkie określenie charakterystyki próbki na każdej kratce i sprawne testowanie różnych warunków próbki/kratki (Rysunek 3). Sporadycznie sesje kończą się niepowodzeniem, co najczęściej wynika z celowania funkcji Autoscreen w uszkodzone kwadraty, niewłaściwej interpretacji dużych gradientów grubości lodu w obrębie kratki lub kwadratów, bądź z błędnej identyfikacji otworów w kratkach węglowych. Ponadto potencjalne wycieki pamięci mogą powodować awarię programu Leginon z powodu nadmiernego zużycia pamięci, co można rozwiązać poprzez zwolnienie pamięci RAM, ponowne uruchomienie komputera lub doinstalowanie dodatkowej pamięci RAM.
<img alt="Schemat przebiegu mikroskopii elektronowej: konfiguracja sesji szablonu, wyrównanie, proces autosekrecji." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66007/66007fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Przebieg pracy funkcji Smart Leginon Autoscreen. Ogólny przegląd procesu pracy Smart Leginon Autoscreen. Najpierw tworzona jest sesja szablonu poprzez wybór parametrów dla reprezentatywnej siatki z partii siatek przeznaczonych do badania. Konfiguracja systemu Leginon i stworzenie sesji szablonu zajmuje mniej niż 45 min. Następnie funkcja Autoscreen jest konfigurowana tak, aby wykorzystać parametry sesji szablonu do przeskanowania wszystkich siatek w kasecie. Konfiguracja funkcji Autoscreen zajmuje mniej niż 10 min. Na koniec Autoscreen kończy sesję skanowania. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66007/66007fig01large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić ten rysunek w większym rozmiarze, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Schemat przepływu pracy pokazujący przygotowanie próbki do obrazowania o wysokiej rozdzielczości; podkreśla wąskie gardła procesu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66007/66007fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Konwencjonalna procedura cryoEM pojedynczych cząsteczek przed automatycznym przesiewaniem. Najczęstsze kroki w konwencjonalnej procedurze cryoEM pojedynczych cząsteczek przed automatycznym przesiewaniem, wraz z komponentami, które można ulepszyć. Każdy krok jest kolorowy, co obrazuje, w jakim stopniu dany etap stanowi wąskie gardło w porównaniu z innymi. Niebieska okrągła strzałka reprezentuje kilka pętli sprzężenia zwrotnego między większością etapów. Przepustowość na kilku etapach zależy w dużej mierze od próbki, funduszy oraz lokalizacji badacza. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66007/66007fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Przygotowanie siatki do Cryo-EM; schemat porównuje grubość lodu i rozkład cząsteczek; analiza mikroskopowa." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66007/66007fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Reprezentatywne wyniki Smart Leginon Autoscreen. Reprezentatywne obrazy wieloskalowe uzyskane zgodnie z protokołem Smart Leginon Autoscreen na cryoTEM TFS Krios z filtrem energetycznym BioQuantum i kamerą K3. (A) Złożony obraz „atlasu” przedstawiający przekrój siatki cryoEM. (B-F) Obrazy wieloskalowe z zaznaczonych lokalizacji w atlasie siatki. Obrazy o niskim powiększeniu w pierwszym rzędzie, średnim powiększeniu w drugim rzędzie i wysokim powiększeniu w trzecim rzędzie zostały wybrane automatycznie, aby uzyskać informacje o próbce z kwadratów o różnej grubości lodu (od cienkiego do grubego). Grubość lodu oszacowana przez Leginon jest pokazana na dole. Paski skali wynoszą 500 µm w (A) oraz 10 µm dla pierwszego rzędu, 5 µm dla drugiego rzędu i 100 nm dla trzeciego rzędu w (B-F). Rysunek został zmodyfikowany za zgodą Cheng i wsp.8. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66007/66007fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>gr: Siatka </td>
			<td>kw: kwadrat </td>
			<td>hln: Otwór </td>
			<td>wentylator: Auto-ostrość </td>
			<td>fcn: Główny obszar koncentracji </td>
			<td>Ekspozycja </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Powiększenie </td>
			<td>210 </td>
			<td>2600 </td>
			<td>6700 </td>
			<td>120000 </td>
			<td>120000 </td>
			<td>120000 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rozostrzenie </td>
			<td>-0.0002 </td>
			<td>-0.00015 </td>
			<td>-0.00015 </td>
			<td>-2 x 10-06 </td>
			<td>-7 x 10-07 </td>
			<td>-2,5 x 10-06 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wielkość plamki </td>
			<td>5 </td>
			<td>5 </td>
			<td>4 </td>
			<td>2 </td>
			<td>2 </td>
			<td>2 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intensywność </td>
			<td>1.1 </td>
			<td>0.83 </td>
			<td>0.65 </td>
			<td>0.44 </td>
			<td>0.44 </td>
			<td>0.45 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wymiar </td>
			<td>1024 x 1024 </td>
			<td>1024 x 1024 </td>
			<td>1024 x 1024 </td>
			<td>1024 x 1024 </td>
			<td>1024 x 1024 </td>
			<td>4096 x 4096 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Przesunięcie </td>
			<td>0, 0 </td>
			<td>0, 0 </td>
			<td>0, 0 </td>
			<td>0, 0 </td>
			<td>512, 512 </td>
			<td>0, 0 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grupowanie danych </td>
			<td>4 x 4 </td>
			<td>4 x 4 </td>
			<td>4 x 4 </td>
			<td>4 x 4 </td>
			<td>2 x 2 </td>
			<td>1 x 1 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Czas naświetlania (ms) </td>
			<td>200 </td>
			<td>500 </td>
			<td>500 </td>
			<td>500 </td>
			<td>500 </td>
			<td>1000 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Przed ekspozycją (s) </td>
			<td>0 </td>
			<td>0 </td>
			<td>0 </td>
			<td>0 </td>
			<td>0 </td>
			<td>0 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dawka (e/Å)2) </td>
			<td>-- </td>
			<td>-- </td>
			<td>-- </td>
			<td>36.5 </td>
			<td>36.5 </td>
			<td>64.7 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zapisz surowe klatki </td>
			<td>Nie </td>
			<td>Nie </td>
			<td>Nie </td>
			<td>Nie </td>
			<td>Nie </td>
			<td>Tak </td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Predefiniowane parametry dla przesiewania siatek cryoEM w Simons Electron Microscopy Center (SEMC) z użyciem cryoTEM Glacios z kamerą Falcon 3EC. Przedstawiono parametry dla każdego ustawienia powszechnie stosowanego w cryoTEM Glacios z kamerą Falcon 3EC w SEMC. Różne mikroskopy oferują różne powiększenia, a w różnych eksperymentach stosuje się zróżnicowane parametry, takie jak defokus i czas ekspozycji.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>gr: siatka </td>
			<td>kwadrat </td>
			<td>hln: Otwór </td>
			<td>automatyczne ustawianie ostrości </td>
			<td>fcn: Główny punkt skupienia </td>
			<td>Ekspozycja </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Powiększenie </td>
			<td>64 </td>
			<td>1700 </td>
			<td>2850 </td>
			<td>75000 </td>
			<td>75000 </td>
			<td>75000 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rozmycie obrazu (defokus) </td>
			<td>0 </td>
			<td>-5 x 10-05 </td>
			<td>-5 x 10-05 </td>
			<td>-1 x 10-06 </td>
			<td>-7 x 10-07 </td>
			<td>-2 x 10-06 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wielkość plamki </td>
			<td>6 </td>
			<td>9 </td>
			<td>9 </td>
			<td>6 </td>
			<td>6 </td>
			<td>7 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intensywność </td>
			<td>0.001 </td>
			<td>1,65 x 10-05 </td>
			<td>1,5 x 10-05 </td>
			<td>4,3 x 10-07 </td>
			<td>4,3 x 10-07 </td>
			<td>5,5 x 10-07 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Szerokość filtra energetycznego </td>
			<td>-- </td>
			<td>-- </td>
			<td>-- </td>
			<td>20 </td>
			<td>20 </td>
			<td>20 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wymiar </td>
			<td>1024 x 1024 </td>
			<td>1024 x 1024 </td>
			<td>1024 x 1024 </td>
			<td>1024 x 1024 </td>
			<td>2048 x 2048 </td>
			<td>4096 x 4096 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Przesunięcie </td>
			<td>0, 0 </td>
			<td>0, 0 </td>
			<td>0, 0 </td>
			<td>0, 0 </td>
			<td>0, 0 </td>
			<td>0, 0 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grupowanie (Binning) </td>
			<td>4 x 4 </td>
			<td>4 x 4 </td>
			<td>4 x 4 </td>
			<td>4 x 4 </td>
			<td>2 x 2 </td>
			<td>1 x 1 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Czas ekspozycji (ms) </td>
			<td>500 </td>
			<td>2000 </td>
			<td>1000 </td>
			<td>500 </td>
			<td>300 </td>
			<td>8700 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Przed ekspozycją (s) </td>
			<td>0 </td>
			<td>0 </td>
			<td>0 </td>
			<td>0 </td>
			<td>0 </td>
			<td>0 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dawka (e/Å)2) </td>
			<td>-- </td>
			<td>-- </td>
			<td>-- </td>
			<td>-- </td>
			<td>-- </td>
			<td>47.4 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zapisz surowe klatki </td>
			<td>Nie </td>
			<td>Nie </td>
			<td>Nie </td>
			<td>Nie </td>
			<td>Nie </td>
			<td>Tak </td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Ustawienia parametrów dla skriningu siatek cryoEM w SEMC przy użyciu cryoTEM Krios z Selectris X i kamerą Falcon 4i. Przedstawiono parametry dla każdego ustawienia powszechnie stosowanego w systemie Krios z filtrem energetycznym Selectris X i kamerą Falcon 4i w SEMC. Różne mikroskopy oferują różne powiększenia, a w zależności od eksperymentu stosowane są różne parametry, takie jak defokus i czas ekspozycji.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>siatka </td>
			<td>sq: kwadrat </td>
			<td>hln: Otwór </td>
			<td>wentylator: automatyczne ustawianie ostrości </td>
			<td>fcn: Główny punkt skupienia </td>
			<td>Ekspozycja </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Powiększenie </td>
			<td>1550 </td>
			<td>940 </td>
			<td>2250 </td>
			<td>81000 </td>
			<td>81000 </td>
			<td>81000 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rozostrzenie </td>
			<td>0 </td>
			<td>-5 x 10-05 </td>
			<td>-5 x 10-05 </td>
			<td>-1 x 10-06 </td>
			<td>-7 x 10-07 </td>
			<td>-2 x 10-06 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wielkość plamki </td>
			<td>4 </td>
			<td>8 </td>
			<td>7 </td>
			<td>6 </td>
			<td>6 </td>
			<td>6 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intensywność </td>
			<td>0.0015 </td>
			<td>0.00017 </td>
			<td>7,3 x 10-05 </td>
			<td>1,3 x 10-06 </td>
			<td>1,3 x 10-06 </td>
			<td>9,2 x 10-07 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Szerokość filtra energetycznego </td>
			<td>-- </td>
			<td>-- </td>
			<td>50 </td>
			<td>20 </td>
			<td>20 </td>
			<td>20 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wymiar </td>
			<td>1024 x 1024 </td>
			<td>1440 x 1024 </td>
			<td>1440 x 1024 </td>
			<td>1440 x 1024 </td>
			<td>1008 x 1008 </td>
			<td>5760 x 4092 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Przesunięcie </td>
			<td>0, 0 </td>
			<td>0, 0 </td>
			<td>0, 0 </td>
			<td>0, 0 </td>
			<td>936, 519 </td>
			<td>0, 0 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grupowanie (binning) </td>
			<td>4 x 4 </td>
			<td>8 x 8 </td>
			<td>8 x 8 </td>
			<td>8 x 8 </td>
			<td>4 x 4 </td>
			<td>2 x 2 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Czas ekspozycji (ms) </td>
			<td>250 </td>
			<td>600 </td>
			<td>600 </td>
			<td>500 </td>
			<td>500 </td>
			<td>2100 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Przed ekspozycją (s) </td>
			<td>0 </td>
			<td>0 </td>
			<td>0 </td>
			<td>0 </td>
			<td>0 </td>
			<td>0 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dawka (e/Å)2) </td>
			<td>-- </td>
			<td>-- </td>
			<td>-- </td>
			<td>-- </td>
			<td>-- </td>
			<td>51 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zapisz surowe klatki </td>
			<td>Nie </td>
			<td>Nie </td>
			<td>Nie </td>
			<td>Nie </td>
			<td>Nie </td>
			<td>Tak </td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 3: Predefiniowane parametry dla screeningu siatek cryoEM w SEMC przy użyciu cryoTEM Krios z BioQuantum i kamerą K3. Przedstawiono parametry dla każdego ustawienia predefiniowanego powszechnie stosowanego w systemie Krios z filtrem energetycznym BioQuantum i kamerą K3 w SEMC. Różne mikroskopy będą oferować różne dostępne powiększenia, a w zależności od eksperymentu stosowane będą różne parametry, takie jak defokus i czas ekspozycji.
Rysunek uzupełniający 1: Ustawienia targetowania pól (Square Targeting) oraz ustawienia pól (Square) dla Smart Legionon. (A) Ustawienia targetowania pól. (B) Ustawienia pól. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66007/Supplementary%20Figure%20(1).pdf" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Rycina uzupełniająca 2: Ustawienia targetowania otworów (Hole Targeting) oraz ustawienia otworów (Hole settings) dla Smart Legimon. (A) Ustawienia targetowania otworów. (B) Ustawienia otworów. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66007/Supplementary%20Figure%20(2).pdf" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Rycina uzupełniająca 3: Ustawienia targetowania ekspozycji oraz ustawienia ekspozycji dla Smart Leginon. (A) Ustawienia targetowania ekspozycji. (B) Ustawienia ekspozycji. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66007/Supplementary%20Figure%20(3).pdf" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Rycina uzupełniająca 4: Ustawienia ostrości oraz ustawienia sekwencji ostrości dla programu Smart Leginon. (A) Ustawienia ostrości. (B) Ustawienia sekwencji ostrości (Defocus1). (C) Ustawienia sekwencji ostrości (Defocus2). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66007/Supplementary%20Figure%20(4).pdf" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Rycina uzupełniająca 5: Ustawienia Z_Focus oraz ustawienia sekwencji Z_Focus dla systemu Smart Leginon. (A) Ustawienia Z_Focus. (B) Ustawienia sekwencji Z_Focus (Stage_Tilt_Rough). (C) Ustawienia sekwencji Z_Focus (Stage_Tilt_Fine). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66007/Supplementary%20Figure%20(5).pdf" target="_blank">Aby pobrać ten plik, kliknij tutaj.</a>
Rycina uzupełniająca 6: Przykład atlasu po skonfigurowaniu parametrów Smart Legion Square_Targeting. Niebieskie okręgi to blobby, zielone znaki plus to miejsca akwizycji, a brązowy znak „x” to aktualna pozycja stolika. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66007/Supplementary%20Figure%20(6).pdf" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Rysunek uzupełniający 7: Przykład atlasu po ustawieniu parametrów Smart Legion Hole_Targeting. Fioletowe znaki plus oznaczają położenia sieci, zielone znaki plus w ramkach oznaczają miejsca akwizycji, a niebieski znak plus oznacza punkt ostrości. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66007/Supplementary%20Figure%20(7).pdf" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Rycina uzupełniająca 8: Przykład atlasu po ustawieniu parametrów Smart Leginon Exposure_Targeting. Niebieskie okręgi to bloby, zielone znaki plus to miejsca akwizycji, a niebieski znak plus to miejsce ogniskowania. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66007/Supplementary%20Figure%20(8).pdf" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Rycina uzupełniająca 9: Konfiguracja terminala Smart Leginon Autoscreen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66007/Supplementary%20Figure%20(9).pdf" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Rysunek uzupełniający 10: Konfiguracja interfejsu użytkownika Smart Leginon Autoscreen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66007/Supplementary%20Figure%20(10).pdf" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Badanie przesiewowe z użyciem wielu siatek w mikroskopii krioelektronowej (cryoEM) jest często żmudnym procesem, który wymaga wielu godzin uwagi. Ten protokół pokazuje, jak skonfigurować standardową kolekcję Leginon i Smart Leginon Autoscreen, aby zautomatyzować ten proces. Protokół ten można zastosować do większości dziurawych siatek foliowych cryoEM.

Automatyzacja badań przesiewowych pod mikroskopią krioelektronową w wielu sieciach przy użyciu Smart Leginon

Advancements in cryo-electron microscopy (cryoEM) techniques over the past decade have allowed structural biologists to routinely resolve macromolecular ...

W Centrum Mikroskopii Elektronowej Simons staramy się zapewnić doskonałe usługi mikroskopii elektronowej, wiedzę specjalistyczną i szkolenia dla lokalnych i krajowych naukowców oraz opracowywać innowacyjne metody optymalizacji przepływów pracy. Nasz zakres obejmuje usługi, rozwój, uczenie maszynowe i badania biomedyczne. Staramy się odpowiedzieć na pytanie, w jaki sposób możemy lepiej zoptymalizować nasze usługi?Uczenie maszynowe zmienia dziedzinę elektromikroskopii. Gromadzenie danych staje się coraz bardziej zautomatyzowane. Narzędzia do analizy danych szybko stają się coraz bardziej wydajne.Obejmuje to odszumianie obrazów, wybieranie cząstek, analizę elastyczności 3G i budowanie modeli. Regularnie aktualizujemy oprogramowanie, aby uwzględnić różne sytuacje, takie jak różne otwory w siatce, pochylona kolekcja lub błędy zidentyfikowane za pomocą oprogramowania do testów beta w naszym środowisku produkcyjnym. Uwzględniamy również opinie naszych użytkowników, dzięki czemu stale udostępniamy funkcje, które są dla nich przydatne.Smart Leginon radzi sobie z pracochłonnymi i czasochłonnymi zadaniami związanymi z przesiewaniem jednej lub więcej siatek na krio-TEM. Umożliwia operatorom i badaczom szybsze przesiewanie i analizowanie siatek, jednocześnie uwalniając czas na równoległą optymalizację warunków siatki i próbek. Skraca to również czas i koszty mikroskopu.Smart Leginon Autoscreen oferuje w pełni bezobsługowe badanie przesiewowe z wieloma siatkami, które zajmuje około 10 minut, aby skonfigurować wyświetlanie dla 12 siatek. W porównaniu z ręcznym badaniem przesiewowym, nasz protokół pozwala zaoszczędzić kilka godzin dziennie. Od czasu wprowadzenia Smart Leginon, inne wolne i komercyjne oprogramowanie zostało opracowane do podobnej automatyzacji.Aby rozpocząć, skonfiguruj interfejs Leginon, a następnie przejdź do aplikacji i kliknij Uruchom. W oknie Uruchom aplikację wybierz aplikację Ptolemeusz Ustaw główną na komputer Leginon oraz zakres i kamerę na odpowiednie komputery. Teraz zaimportuj ustawienia predefiniowane w Menedżerze ustawień predefiniowanych.Upewnij się, że w ustawieniach węzła kierowania kwadratowego są zaznaczone opcje Sortuj cele według najkrótszej ścieżki i Włącz kierowanie automatyczne. W ustawieniach węzła kwadratowego upewnij się, że zaznaczona jest opcja Poczekaj, aż węzeł przetworzy obraz. Dodaj ustawienie wstępne Kwadrat do listy, jeśli nie zostało jeszcze uwzględnione.W obszarze Ustawienia zaawansowane zaznacz opcję Ustaw te przysłony podczas obrazowania i upewnij się, że wartości przysłony są prawidłowe. Aby dostosować ustawienia węzła celowania w otwory, zaznacz opcję Zezwalaj na weryfikację wybranych celów przez użytkownika. Usuń zaznaczenie opcji Kolejkuj cele w kolejce i Pomiń automatyczną wyszukiwarkę otworów.W ustawieniu węzła otworu zaznacz opcję Poczekaj, aż węzeł przetworzy obraz, a ustawienie wstępne otworu znajduje się na liście po prawej stronie. W ustawieniach zaawansowanych zaznacz opcję Ustaw te przysłony podczas obrazowania i potwierdź wartości przysłony. W ustawieniach węzła Kierowanie na ekspozycję wybierz opcję Zezwalaj na weryfikację wybranych celów przez użytkownika. Upewnij się, że pola Kolejka do celów i Pomiń automatyczną wyszukiwarkę otworów nie są zaznaczone.Aby skonfigurować ustawienia węzła ekspozycji, upewnij się, że opcja Poczekaj, aż węzeł przetworzy obraz nie jest zaznaczona. Upewnij się, że ustawienie wstępne ekspozycji znajduje się na liście po prawej stronie. W obszarze Ustawienia zaawansowane wybierz opcję Ustaw te przysłony podczas obrazowania i sprawdź, czy wartości przysłony są dokładne.W ustawieniach węzła fokusu upewnij się, że opcja Poczekaj, aż węzeł przetworzy obraz nie jest zaznaczona. Sprawdź, czy ustawienie wstępne automatycznego ustawiania ostrości jest wymienione po prawej stronie, i ustaw żądaną dokładność autofokusa na 4 x 10 na 6 metrów. W sekwencji ostrości węzła ostrości aktywuj tylko kroki automatycznego ustawiania ostrości z pochyleniem dwóch wiązek.Aby dostosować ustawienia węzła ostrości Z, upewnij się, że opcja Poczekaj, aż węzeł przetworzy obraz nie jest zaznaczona. Upewnij się, że ustawienie wstępne Hole jest wymienione po prawej stronie i ustaw żądaną dokładność autofokusa na 5 x 10 na 5 metrów. W sekwencji ostrości węzła ostrości Z Focus Node włącz tylko dwa kroki pochylenia stolika przy małym powiększeniu.Po określeniu wysokości siatki Z i zebraniu atlasu, użyj kwadratowego węzła celowniczego w Ptolemeuszu, aby zlokalizować kwadraty. Obserwuj niebieskie kółka na każdym kwadracie. Najedź kursorem na każdą plamę, aby wyświetlić jej rozmiar obliczony przez Ptolemeusza i zapisać rozmiary największych i najmniejszych plam.Aby zmodyfikować ustawienia progu, dostosuj minimalny i maksymalny zakres filtra, aby uwzględnić pożądane kwadraty i wykluczyć niepożądane. Naciśnij przycisk Drobne kwadraty na górnym pasku narzędzi. Dostosuj zakres filtrów, aż funkcja Drobne kwadraty będzie skutecznie celować w kwadraty.W ustawieniach akwizycji wybierz odpowiednie wartości dla maksymalnej liczby celów i liczby grup docelowych do próbkowania. Gdy parametry będą zadowalające, kliknij przycisk Odtwórz, aby kontynuować. Następnie użyj narzędzia Linijka w węźle Celowanie w otwór, aby zmierzyć średnicę otworu.W ustawieniach szablonu upewnij się, że zmierzona średnica jest zgodna z ostateczną średnicą szablonu i kliknij przycisk Testuj. Dostosuj wartość średnicy, aż wszystkie otwory będą miały jasne białe szczyty w środku. Kliknij przycisk Test (Testuj) w ustawieniach progu.Modyfikuj wartość A, aż binaryzowany obraz będzie wyraźnie pokazywał białe obszary wyłącznie w miejscach, w których znajdują się otwory. W ustawieniach obiektów blob zmierz minimalną odległość od krawędzi za pomocą linijki i wprowadź tę wartość, aby wykluczyć obiekty docelowe obramowania. Filtruj obiekty blob na podstawie rozmiaru, zaokrąglenia i żądanej ilości.Umieść kursor na obiektach blob, aby wyświetlić ich wartości, a następnie kliknij przycisk Testuj, aby przejrzeć bieżące ustawienia. Wprowadź promień otworów i odstępy między nimi w Ustawieniach kratowni. Następnie kliknij przycisk 42, aby zmierzyć wartość odniesienia intensywności obszaru próżni.W ustawieniach pobierania zaznacz opcję użyj podzbioru celów pozyskiwania i ustaw wartość Maksymalna próbka na niską liczbę, na przykład 2. Zdefiniuj szeroki zakres średnich grubości lodu i odchyleń standardowych. Użyj kierowania testowego, aby losowo wybrać cel na podstawie powyższych wartości.Kliknij przycisk Odtwórz, aby kontynuować, gdy wszystkie ustawienia będą zadowalające. W ustawieniach otworu ustaw skrypt powłoki na hl.finding. sh ścieżka skryptu w instalacji Ptolemeusza.Ustaw minimalny ból na mniej niż zero. Wprowadź promień otworów. Następnie kliknij przycisk Pokaż wartość, aby zmierzyć wartość natężenia odniesienia obszaru próżni.Kliknij przycisk Testuj, aby znaleźć siatkę otworów. W obszarze Ustawienia pobierania zaznacz opcję Użyj podzbioru celów pozyskiwania i ustaw przykładową wartość maksymalną na małą liczbę, na przykład 4. Ustaw szeroki zakres średnich grubości lodu i odchyleń standardowych.Kliknij przycisk Odtwórz, gdy wszystkie ustawienia są zadowalające. Leginon wykona eucentryczne ustawianie ostrości i zbierze obrazy w dużym powiększeniu, które będzie można zobaczyć w węźle ekspozycji. Sprawdź następny obraz z celowaniem ekspozycji, aby zobaczyć, czy ustawienia są wystarczające.Gdy spełnisz te wymagania, odznacz opcję Zezwalaj na weryfikację wybranych celów przez użytkownika w ustawieniach Kierowanie na ekspozycję i Celowanie w dołki. Po zakończeniu przesiewania siatki kliknij Plik, a następnie Wyjdź, aby zamknąć Leginon. Aby skonfigurować Smart Leginon Autoscreen, uruchom smartlegenionautoscreen.py w oknie terminala Wybierz GY i wprowadź na ekran rozdzieloną przecinkami listę miejsc w siatce. Następnie wprowadź pełne dane dla przepływu pracy. Wprowadź nazwę sesji szablonu dla nowych sesji i wartość wysokości Z sesji szablonu.Otworzy się GY, w którym można wprowadzić nazwę sesji i wybrać powiązania projektu dla każdej siatki. Pozostaw mikroskop bez nadzoru lub monitoruj go w Leginon, Appion i komputerze mikroskopu.

cryo-electron-microscopy-screening-automation-across-multiple-grids

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Przedstawiamy protokół, jak wykorzystać wysokoprzepustową tomografię krioelektronową do określenia wysokiej rozdzielczości struktur in situ maszyn molekularnych. Protokół pozwala na przetwarzanie dużych ilości danych, pozwala uniknąć typowych wąskich gardeł i skraca przestoje zasobów, pozwalając użytkownikowi skupić się na ważnych kwestiach biologicznych.

Korzystanie z Tomoauto: protokół dla wysokowydajnej zautomatyzowanej tomografii krioelektronowej

Ten protokół opisuje techniki używane do określania struktur kanałów jonowych za pomocą mikroskopii krioelektronowej, w tym system bakulowirusa używany do efektywnej ekspresji genów w komórkach ssaków przy minimalnym wysiłku i toksyczności, ekstrakcję białek, oczyszczanie i kontrolę jakości, przygotowanie siatki próbek i badanie przesiewowe, a także zbieranie i przetwarzanie danych.

Ekspresja i oczyszczanie ludzkiego wrażliwego na lipidy kanału kationowego TRPC3 do oznaczania strukturalnego za pomocą mikroskopii krioelektronowej pojedynczych cząstek

Protokół przedstawiony tutaj opisuje użycie Spotiton, nowatorskiego systemu robotycznego, do dostarczenia dwóch interesujących próbek na samozasłaniającą się, nanodrucianą siatkę, które mieszają się przez minimum 90 ms przed zeszkleniem w płynnym kriogenie.

Przygotowanie mikroskopowej siatki krioelektronowej do badań rozdzielczych w czasie przy użyciu nowatorskiego systemu robotycznego, Spotiton

Ten protokół pokazuje, jak obrazować biologiczne próbki kriokonserwowane za pomocą kriostrukturalnej mikroskopii świetlnej. Demonstrujemy metodologię, obrazując cytoszkielet komórek U2OS.

Mikroskopijne gromadzenie danych z komórek zakonserwowanych kriogenicznie

Używanie mielenia skupionej wiązki jonów do produkcji szklistych blaszek na siatce z zamrożonych próbek biologicznych do krioelektronowej tomografii.

Przygotowanie blaszek z szklistych próbek biologicznych przy użyciu dwuwiązkowego skaningowego mikroskopu elektronowego do kriotomografii elektronowej

Określanie struktury kompleksów makromolekularnych za pomocą cryoEM stało się rutyną dla niektórych klas białek i kompleksów. W tym miejscu podsumowano ten proces (przygotowanie próbki, badanie przesiewowe, pozyskiwanie i przetwarzanie danych), a czytelnicy są kierowani do dalszych szczegółowych zasobów i zmiennych, które mogą ulec zmianie w przypadku trudniejszych próbek.

Mikroskopia krioelektronowa pojedynczych cząstek: od próbki do struktury

Mikroskopia krioelektronowa pojedynczych cząstek wymaga odpowiedniego pakietu oprogramowania i przyjaznego dla użytkownika potoku do wysokowydajnej automatycznej akwizycji danych. W tym miejscu przedstawiamy zastosowanie w pełni zautomatyzowanego pakietu oprogramowania do akwizycji obrazu, Latitude-S, oraz praktycznego potoku do gromadzenia danych o zeszklonych biomolekułach w warunkach niskich dawek.

Przyjazne dla użytkownika, wysokowydajne i w pełni zautomatyzowane oprogramowanie do akwizycji danych do mikroskopii krioelektronowej pojedynczych cząstek

Ten artykuł opisuje, jak efektywnie wykorzystać trzy platformy przetwarzania cryo-EM, tj. cryoSPARC v3, RELION-3 i Scipion 3, aby stworzyć pojedynczy i solidny przepływ pracy mający zastosowanie do różnych zestawów danych o pojedynczych cząstkach do określania struktury w wysokiej rozdzielczości.

Solidny przebieg przetwarzania w mikroskopii krioelektronowej jednocząsteczkowej (cryo-EM) z cryoSPARC, RELION, i Scipion

Mapy krio-EM makromolekuł o wysokiej rozdzielczości można również uzyskać za pomocą mikroskopów TEM 200 kV. Protokół ten przedstawia najlepsze praktyki w zakresie ustawiania dokładnych wyrównań optyki, schematów akwizycji danych i wyboru obszarów obrazowania, które są niezbędne do pomyślnego zbierania zestawów danych o wysokiej rozdzielczości przy użyciu TEM 200 kV.

Rutynowe zbieranie zestawów danych krio-EM o wysokiej rozdzielczości przy użyciu transmisyjnego mikroskopu elektronowego 200 KV

Ten protokół szczegółowo opisuje przygotowanie kompleksów nukleosomalnych przy użyciu dwóch metod przygotowania próbek do zamrażania siatek TEM.

Przygotowanie cząstek rdzenia nukleosomów skompleksowanych z czynnikami naprawy DNA do oznaczania strukturalnego w mikroskopii krioelektronowej

Poznaj automatyzację przesiewania wielu siatek w kriomikroskopii elektronowej przy użyciu Smart Leginon. Ta metoda znacząco skraca czas analizy i optymalizuje warunki próbek.

Automatyzacja badań przesiewowych pod mikroskopią krioelektronową w wielu sieciach przy użyciu Smart Leginon

Przeglądaj więcej filmów