Name: Wykorzystanie obrazowania na żywo ex vivo do badania podziałów i ruchów komórek podczas odnawiania zębów myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-27T14:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: Poznaj metodę obrazowania na żywo ex vivo do badania podziałów i ruchów komórek nabłonkowych w zębach dorosłych myszy. Technika ta umożliwia obserwację dynamicznych zachowań komórkowych w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Laboratorium Zaawansowanej Mikroskopii Świetlnej/Spektroskopii UCLA oraz Centrum Doskonałości Leica Microsystems w Kalifornijskim Instytucie Nanosystemów (RRID:SCR_022789) za dostarczenie mikroskopii dwufotonowej. AS był wspierany przez ISF 604-21 z Izraelskiej Fundacji Naukowej. JH był wspierany przez R03DE030205 i R01DE030471 z NIH/NIDCR. AS i JH były również wspierane przez 2021007 grantowe z Amerykańsko-Izraelskiej Dwunarodowej Fundacji Naukowej (BSF).

Wszystkie myszy były utrzymywane w obiektach wolnych od patogenów na Uniwersytecie Kalifornijskim w Los Angeles (UCLA) lub Uniwersytecie Hebrajskim w Jerozolimie (HUJI). Wszystkie eksperymenty na myszach przeprowadzono zgodnie z przepisami i protokołami zatwierdzonymi przez odpowiedni Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (IACUC) (ARC-2019-013; UCLA) lub (MD-23-17184-3; HUJI). Ogólny przebieg kroków eksperymentalnych jest pokazany w Rysunek 2A. Szczegółowe informacje dotyczące wszystkich instrumentów, odczynników i materiałów użytych w tym protokole można znaleźć w Tabeli Materiałów.
1. Przygotowanie roztworów i żeli
<ol>
	<li>Pożywka preparacyjna: Przygotować świeży DMEM/F12 z 0,5% glukozy i utrzymywać w cieple w temperaturze 37 °C, aż będzie potrzebna w kroku 2.4. 
	UWAGA: Używamy DMEM/F12 bez czerwieni fenolowej w celu zmniejszenia autofluorescencji podczas obrazowania na żywo.</li>
	<li>1x Pożywka hodowlana: Przygotuj świeżą pożywkę, używając 50% DMEM/F12, 50% surowicy szczurzej, 1x substytut glutaminy, 1x aminokwasy endogenne MEM, 1% glukozy, 0,1 mg/ml kwasu L-askorbinowego i 0,5% penicyliny-streptomycyny. Utrzymuj go w cieple w temperaturze 37 °C, aż będzie potrzebny w kroku 5.5. Pożywka ta służy do hodowli eksplantatów siekaczy podczas obrazowania na żywo. 
	UWAGA: Surowica szczura powinna być wysokiej jakości i specjalnie przygotowana do hodowli całych tkanek przez badaczy lub ze źródła komercyjnego. W szczególności krew musi być odwirowana (przez 5 minut w temperaturze 1 200 × g w temperaturze pokojowej), zanim zacznie tworzyć się krzepnięcie. Po odwirowaniu powstały skrzep fibryny należy wycisnąć i wyrzucić33.</li>
	<li>Żel hodowlany: Żel ma na celu unieruchomienie próbek podczas obrazowania i jest przygotowywany na świeżo.
	<ol>
		<li>Zrobić 2% żel w DMEM/F12, rozpuszczając 200 mg agarozy o niskiej temperaturze topnienia w 10 ml DMEM/F12 za pomocą kuchenki mikrofalowej. Przechowywać 2% żel w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Przygotuj 2x pożywkę hodowlaną (bez DMEM/F12) mieszając 50% surowicy szczurzej, 1x substytut glutaminy, 1x aminokwasy endogenne MEM, 1% glukozy, 0,1 mg/ml kwasu L-askorbinowego i 0,5% penicyliny-streptomycyny. Podgrzać 2x pożywkę hodowlaną (bez DMEM/F12) do 37 °C.</li>
		<li>Przygotować 1% żel hodowlany, mieszając równe objętości 2% żelu i 2x pożywki hodowlanej (bez DMEM/F12). Przechowywać 1% żel hodowlany w temperaturze 37 °C do czasu, gdy będzie potrzebny w kroku 5.1. 
		UWAGA: Upewnij się, że wszystkie roztwory są ciepłe przed zmieszaniem, aby uniknąć żelowania. Stwierdziliśmy, że 1% żel nadaje się do hodowli siekaczy dorosłych myszy. Zawartość procentową żelu należy określić empirycznie, jeśli mają być hodowane inne tkanki.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Ekstrakcja żuchwy dorosłej myszy
<ol>
	<li>Eutanazja myszy w pożądanym wieku przy użyciu standardowych procedur zatwierdzonych przez IACUC. 
	UWAGA: Tutaj używamy uduszenia CO2, a następnie zwichnięcia szyjki macicy. Przepisy dotyczące eutanazji zwierząt mogą się różnić w różnych regionach. Badacze powinni uzyskać niezbędne zgoda instytucjonalne przed przeprowadzeniem eksperymentów i zapewnić zgodność z lokalnymi przepisami dotyczącymi opieki nad zwierzętami.</li>
	<li>Zdezynfekuj mysz za pomocą 70% etanolu.</li>
	<li>Odetnij głowę myszy i wyciągnij lewą i prawą żuchwę.
	<ol>
		<li>Połóż mysz na brzuchu, a następnie użyj przemysłowej żyletki #9 z pojedynczym ostrzem, aby przeciąć obszar szyi i oddzielić głowę myszy od reszty ciała. 
		UWAGA: Jeśli mają zostać pobrane również tkanki z gardła lub szyi, nie należy wykonywać dekapitacji i można bezpośrednio przejść do kroku 2.3.2.</li>
		<li>Odwróć mysz tak, aby jej brzuszna strona była skierowana do góry, a żuchwy były łatwo dostępne.</li>
		<li>Zabezpiecz głowę zwierzęcia, trzymając ją delikatnie między kciukiem a palcem wskazującym.</li>
		<li>Użyj żyletki, aby wykonać nacięcie w połowie odległości strzałkowej, które przecina skórę dolnej szczęki od dolnej wargi w kierunku dekoltu. 
		UWAGA: Ostrze chirurgiczne #15 może być również użyte do wykonania nacięcia i późniejszych rozwarstwień (kroki 2.3.6-2.3.9).</li>
		<li>Podczas wykonywania nacięcia rozłóż przeciętą skórę za pomocą kciuka i palca wskazującego, aby odsłonić mięśnie i kość szczęki pod spodem.</li>
		<li>Użyj żyletki, aby przeciąć mięśnie żwaczy po stronie policzkowej dolnej szczęki, tak aby zewnętrzna strona lewej i prawej półkrwi była teraz wolna od przyczepów mięśniowych.</li>
		<li>Przeciąć mięśnie błonowo-gnykowe wzdłuż wewnętrznej strony żuchwy, aby usunąć znajdujące się tam przyczepy mięśniowe.</li>
		<li>Wykonaj kolejne nacięcie w spojeniu żuchwy, które łączy dwie półkrwiożercze. Po przecięciu żuchwa zostanie podzielona na lewą i prawą połowę.</li>
		<li>Wciśnij żyletkę między kłykieć żuchwy a staw skroniowo-żuchwowy i ostrożnie odetnij półkość od reszty głowy. 
		UWAGA: Stwierdziliśmy, że pomocne jest jednoczesne delikatne pociągnięcie siekacza podczas cięcia. Należy zachować ostrożność, aby nie złamać żuchwy i nie uszkodzić tkanek miękkich w jej wnętrzu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Natychmiast przenieś wypreparowane żuchwy na szalkę Petriego za pomocą podgrzanego podłoża preparacyjnego (krok 1.1) i usuń pozostałe tkanki mięśniowe za pomocą ostrza chirurgicznego #15. 
	UWAGA: Przechowywanie próbek w zimnych pożywkach spowalnia aktywność komórek, co skutkuje opóźnionym lub nawet nieudanym przywróceniem niektórych czynności komórek, takich jak proliferacja lub ruch komórek, podczas obrazowania na żywo.</li>
</ol>
3. Izolacja całych siekaczy myszy
UWAGA: Dalsza izolacja siekacza odbywa się pod mikroskopem preparacyjnym w jasnym polu.
<ol>
	<li>Wizualnie zidentyfikuj owalny obszar żuchwy, który zakrywa panewkę siekacza i mieści wierzchołkową część siekacza.</li>
	<li>Ustaw żuchwę tak, aby wewnętrzna (językowa) powierzchnia była skierowana do góry.</li>
	<li>Trzymając żuchwę na miejscu za pomocą pary ząbkowanych kleszczy, wygeneruj okno w okolicy owalnej, goląc leżącą nad nią kość błony za pomocą ostrza chirurgicznego #15, w kierunku od kłykcia w kierunku zębów trzonowych. To odsłania tkankę miękką siekacza wierzchołkowego na wewnętrznej powierzchni.</li>
	<li>Odwróć żuchwę tak, aby zewnętrzna (policzkowa) powierzchnia była skierowana do góry.</li>
	<li>Wygeneruj okienko w owalnym obszarze zewnętrznej żuchwy, jak opisano w kroku 3.3 i użyj końcówki skalpela, aby usunąć wszelkie pozostałe fragmenty kości na krawędzi. Upewnij się, że wierzchołkowy koniec zęba jest widoczny z obu stron. 
	UWAGA: Unikaj nadmiernego nacisku podczas golenia kości, aby zapobiec uszkodzeniu leżącej pod spodem tkanki miękkiej.</li>
	<li>Systematycznie odcinaj kości otaczające siekacz, aby odizolować cały ząb.
	<ol>
		<li>Wykonaj czyste cięcie w płaszczyźnie, która bezpośrednio przylega do siekacza wierzchołkowego, aby najpierw usunąć wyrostek kłykciowy. 
		UWAGA: Uważaj, aby nie przeciąć siekacza.</li>
		<li>Wykonaj drugie cięcie tuż za 3. zębem trzonowym, ale grzbietowo do siekacza, nie uszkadzając zęba. Spowoduje to usunięcie kości, która obejmuje wyrostek dziobiasty.</li>
		<li>Seryjnie cięte od końca wyrostka kątowego w kierunku siekacza, aby stopniowo usuwać brzuszną żuchwę w sposób krokowy. 
		UWAGA: Nabłonek zębów i związane z nim tkanki przyzębia są często przyklejone do kości i łatwo je oderwać, jeśli duża część kości brzusznej zostanie przecięta za jednym razem. Aby oddzielić kość od tkanki miękkiej siekacza, można włożyć skalpel (lub parę ostrych, nieząbkowanych kleszczy) między dwie tkanki na wierzchołkowym końcu siekacza i delikatnie przesunąć instrument do przodu.</li>
		<li>Odetnij kość wyrostka zębodołowego z zębami trzonowymi i wszelkie pozostałe kości, które są nadal przyczepione do siekacza.</li>
		<li>Cały siekacz jest teraz odizolowany. Przenieść całkowicie wypreparowany siekacz do naczynia z czystym, ciepłym podłożem preparacyjnym (krok 1.1).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Powtórz kroki 3.2-3.6, aby w razie potrzeby odizolować dodatkowe siekacze. 
	UWAGA: Siekacze szczękowe/górne myszy również utrzymują dorosłe komórki macierzyste i mogą być używane do badania regeneracji zębów34. Badacze dentystyczni zazwyczaj koncentrują się na dolnych siekaczach, ponieważ są one bardziej dostępne i można je łatwiej wypreparować niż górne siekacze. Różnice między komórkami progenitorowymi siekaczy żuchwy i szczęki pozostają do ustalenia.</li>
</ol>
4. Usunięcie tkanek przyzębia w celu odsłonięcia pętli nabłonkowej szyjki macicy
<ol>
	<li>Gdy cały siekacz leży na stronie językowej i przytrzymując ząb na miejscu za pomocą ząbkowanych kleszczy, użyj pary cienkich kleszczy #5, aby zacząć podwijać tkanki przyzębia pokrywające siekacz wierzchołkowy i obszar pętli szyjnej.</li>
	<li>Ostrożnie oderwij tkankę przyzębia od zawiązka wierzchołkowego, tak aby boczna strona pętli szyjnej (lub inne obszary zainteresowania) stała się widoczna pod lunetą. 
	UWAGA: Należy zachować ostrożność, aby nie uszkodzić nabłonka zębowego lub nie oderwać go od mezenchymy. Jeśli siekacz ma sygnały fluorescencyjne w obszarze zainteresowania i dostępny jest fluorescencyjny mikroskop preparacyjny, sygnały fluorescencyjne można wykorzystać do rozróżnienia typów tkanek i ułatwienia sekcji. Ważne jest, aby skutecznie przeprowadzić sekcje 2-4, aby próbki można było szybko przenieść do pożywki hodowlanej i odpowiednio konserwować poprzez hodowlę eksplantacyjną (patrz poniżej).</li>
</ol>
5. Osadzanie tkanek do hodowli eksplantatów
<ol>
	<li>Dodaj 500 μl ciepłego, niezestalonego żelu hodowlanego do studzienki na 24-dołkowej płytce i szybko przenieś wypreparowane całe siekacze do dołka. Zakręć płytką kilka razy, aby wypłukać siekacze.</li>
	<li>Dodać 400 μl ciepłego, niezestalonego żelu hodowlanego do szalki hodowlanej i przenieść wypłukane siekacze do naczynia. 
	UWAGA: Używamy dostępnego na rynku naczynia hodowlanego, które jest kompatybilne z konfiguracją perfuzyjną. Zobacz krok 6.4, aby zapoznać się z alternatywnymi opcjami.</li>
	<li>Ustaw siekacz tak, aby umieścił obszar pętli szyjnej (lub inne obszary zainteresowania) na środku naczynia (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A,B) i dostosuj nachylenie siekacza wierzchołkowego do żądanej płaszczyzny obrazowania. 
	UWAGA: Orientację tkanki należy wykonać szybko przed całkowitym żelowaniem.</li>
	<li>Po związaniu żelu użyj pary cienkich kleszczyków, aby usunąć żel z obszaru zainteresowania, aby nie był pokryty żelem.</li>
	<li>Dodać odpowiednią ilość ciepłej pożywki hodowlanej, powoli pipetując ją do krawędzi naczynia, aby po prostu przykryć próbkę (~150 μl).</li>
	<li>Przenieść hodowlę eksplantatów do inkubatora do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C, aby umożliwić osiadanie tkanek i dostosowanie ich do warunków hodowli przez 1 godzinę.</li>
</ol>
6. Mikroskopia poklatkowa eksplantatów siekaczy
UWAGA: W tym eksperymencie użyliśmy pionowego mikroskopu wyposażonego w 25-krotny obiektyw zanurzający w wodzie, który ma aperturę numeryczną 1. Ogólnie rzecz biorąc, soczewka zanurzająca w wodzie z dużą aperturą numeryczną najlepiej nadaje się do obrazowania głębokich tkanek.
<ol>
	<li>Włącz mikroskop i laser dwufotonowy.</li>
	<li>Przymocuj naczynie hodowlane do stage adapter i zamontuj pierścień adaptera perfuzji na górze (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2C).</li>
	<li>Podłącz stage adapter do regulatora temperatury ustawionego na utrzymanie kultury na poziomie 37 °C.</li>
	<li>Podłączyć wlot i wylot pierścienia adaptera do pompy mikroperfuzyjnej i rozpocząć perfuzję pożywki hodowlanej, z prędkością perfuzji ustawioną na 20 na pompie. Powoduje to powolny przepływ (~5 ml/h) pożywki hodowlanej nad górną powierzchnią próbek (<silna klasa="xfig">Rysunek 2C). 
	UWAGA: Zapoznaj się z Tabelą materiałów, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat systemu do utrzymywania tkanki w stabilnie kontrolowanym środowisku. Można również stosować inne systemy. Można również zastosować kombinację płyty grzewczej o temperaturze 37 °C i domowego naczynia do hodowli perfuzyjnej (rysunek uzupełniający S1) z wlotem i wylotem podłączonym do pomp strzykawkowych.</li>
	<li>Umieść pierścień bariery kontroli atmosfery (ACBR) na górze pierścienia adaptera i opuść obiektyw przez ACBR, aby po prostu zetknąć się z pożywką hodowlaną (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2D).</li>
	<li>Dostosuj długość fali lasera do 920 nm, aby uwidocznić zarówno sygnały GFP, jak i czerwonej fluorescencji (np. tdTomato).</li>
	<li>Zlokalizuj próbki przez okulary, a następnie w oprogramowaniu mikroskopu.</li>
	<li>Skonfiguruj stosy Z, obrazowanie wielopozycyjne i interwały czasowe za pomocą oprogramowania. Aby postępować zgodnie z tym protokołem, należy użyć kroku Z o rozmiarze 4 μm i odstępu czasu 5 minut dla 14 h. 
	UWAGA: Odkryliśmy, że interwał czasowy dłuższy niż 5 minut jest często niewystarczający do uchwycenia płynnych ruchów i podziałów komórek.</li>
	<li>Zainicjuj obrazowanie poklatkowe. 
	UWAGA: Sample pozycja może ulec zmianie w ciągu pierwszej godziny i mogą być wymagane dalsze regulacje.</li>
	<li>Zapisywanie plików do dalszego przetwarzania i analizy danych.</li>
</ol>

Live Tracking of Dental Cells via Two-Photon Microscopy

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Obrazowanie żywych tkanek jest ważną techniką, która pozwala nam badać dynamiczne procesy i zachowania komórek, gdy są one utrzymywane w swoim niszowym środowisku41. W idealnej sytuacji obrazowanie na żywo jest wykonywane in vivo z wysoką rozdzielczością czasowo-przestrzenną. Jednak obrazowanie in vivo narządów ssaków może być trudne ze względu na niedostępność tkanek, nieprzezroczystość optyczną i trudności w unieruchomieniu zwierzęcia lub narządu przez dłuższy czas<sup class="x...

W ciągu ostatnich dwóch dekad siekacz myszy stał się nieocenioną platformą do badania zasad regulacji dorosłych komórek macierzystych i regeneracji zębów1,2. Siekacz myszy rośnie w sposób ciągły i odnawia się przez całe życie zwierzęcia. Jest to możliwe dzięki utrzymaniu zarówno nabłonkowych, jak i mezenchymalnych komórek macierzystych, które mogą samoodnawiać się i różnicować w różne typy komórek zęba1,2. Podczas gdy komórki macierzyste nabłonka zębów powodują powstawanie ameloblastów, które wydzielają macierz szkliwa, mezenchymalne komórki macierzyste zębów powodują powstawanie odontoblastów, cementoblastów i fibroblastów, które tworzą odpowiednio zębinę, cement i więzadło przyzębia3,4,5,6. Ten ciągły dopływ nowych komórek utrzymuje homeostazę tkanek i umożliwia wymianę starych komórek, które zostały utracone w wyniku zużycia lub urazów narządu żucia7,8. Wyjaśnienie mechanizmów komórkowych i molekularnych, które regulują utrzymanie i różnicowanie komórek macierzystych zęba, ma zatem kluczowe znaczenie dla zrozumienia regeneracji zębów, obszaru rosnącego zainteresowania.
Anatomicznie, duża część siekacza dorosłej myszy jest zamknięta w kości szczęki. Podczas gdy krawędź sieczna zęba jest odsłonięta, wierzchołkowy koniec siekacza mieści się w zębodole i jest mocno przymocowany do otaczającej kości poprzez więzadła przyzębia i tkanki łączne (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1A,B). Wierzchołkowy koniec siekacza jest również obszarem wzrostu zęba i utrzymuje komórki pnia i progenitora zęba zarówno w warstwie nabłonkowej, jak i w miazdze mezenchymalnej9,10,11,12,13. W szczególności komórki macierzyste nabłonka zębów są utrzymywane na bulwiastym końcu nabłonka, znanym jako pączek wierzchołkowy, określany również jako wargowa pętla szyjna (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1C). Podobnie jak w przypadku nabłonka jelitowego i naskórka, odnowa nabłonka w siekaczu jest przede wszystkim wspierana przez aktywnie cykliczne komórki macierzyste i ich wysoce proliferacyjne pośrednie potomstwo, zwane komórkami wzmacniającymi tranzyt14,15,16,17, oba znajdujące się w wewnętrznej części pętli szyjnej. Nie wiadomo jednak, czy nabłonek siekacza zawiera i wykorzystuje komórki macierzyste w stanie spoczynku podczas regeneracji. W przeciwieństwie do tego, zarówno aktywne, jak i spokojne mezenchymalne komórki macierzyste zębów zostały zidentyfikowane w miazdze wierzchołkowej, a spoczynkowe komórki macierzyste funkcjonują jako populacja rezerwowa, która aktywuje się podczas naprawy urazu13,18.
Wiele odkryć dotyczących biologii odnawiania i regeneracji siekaczy myszy wynikało z badań histologicznych, w których próbki są uzyskiwane w różnych punktach czasowych, ustalane, przetwarzane, a następnie dzielone na cienkie mikrony plastry wzdłuż określonej płaszczyzny. Dzięki szczegółowej analizie skrawków histologicznych z różnych modeli mysich, które umożliwiają śledzenie linii lub zaburzeń genetycznych, naukowcy zidentyfikowali linie komórkowe różnych populacji przodków, a także szlaki genetyczne i sygnałowe, które kontrolują homeostazę siekaczy i naprawę urazów19,20,21. Jednak statyczne dwuwymiarowe (2D) obrazy nieistotnych komórek w sekcjach nie mogą uchwycić pełnego spektrum zachowań komórkowych i organizacji przestrzennych w żywej tkance, takich jak zmiany kształtu komórki, ruchy i kinetyka komórkowa. Wykrywanie i mierzenie tych szybkich zmian komórkowych, które zachodzą w skali czasowej, która jest nierozwiązywalna przez sekcjonowanie tkanek, wymaga innej strategii. Co więcej, uzyskanie takich informacji ma również kluczowe znaczenie dla zrozumienia, w jaki sposób komórki zębowe oddziałują ze sobą, reagują na różne bodźce sygnałowe i samoorganizują się w celu utrzymania struktur i funkcji tkanek.
Pojawienie się czterowymiarowego (4D) głębokiego obrazowania tkanek za pomocą mikroskopii dwufotonowej 22, technologia integrująca trzy wymiary przestrzenne z rozdzielczością czasową, pokonuje nieodłączne ograniczenia analizy histologicznej, umożliwiając czasoprzestrzenne badanie hodowanych eksplantatów tkanek, organoidów, a nawet tkanek in situ23,24,25,26. Na przykład obrazowanie na żywo 4D rozwijającego się nabłonka zębów ujawniło czasoprzestrzenne wzorce podziałów i migracji komórek, które koordynują wzrost tkanek, tworzenie centrum sygnalizacyjnego i morfogenezę nabłonka zębów27,28,29,30,31,32. W siekaczu dorosłej myszy obrazowanie 4D zostało niedawno przystosowane do badania zachowań komórkowych podczas naprawy uszkodzeń nabłonka zębów. Obrazowanie na żywo ujawniło, że komórki warstwy międzyśrodkowej w warstwie nadpodstawnej mogą być bezpośrednio przekształcane w ameloblasty w warstwie podstawnej w celu regeneracji uszkodzonego nabłonka, kwestionując tradycyjny paradygmat naprawy uszkodzeń nabłonka15.
Tutaj opisujemy preparację, hodowlę i obrazowanie siekacza dorosłej myszy, skupiając się na komórkach nabłonka w wargowej pętli szyjki macicy (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). Technika ta zachowuje witalność komórek zęba przez ponad 12 godzin i umożliwia śledzenie na żywo komórek znakowanych fluorescencyjnie w rozdzielczości pojedynczej komórki. Podejście to pozwala na badanie ruchu i migracji komórek, a także dynamicznych zmian w kształcie komórki i orientacji podziału w normalnych warunkach hodowli lub w odpowiedzi na zaburzenia genetyczne, fizyczne i chemiczne.

<table><tbody><tr><td>24-dołkowa, płaska płytka do hodowli tkankowej</td><td>Olympus plastics</td><td>25-107</td><td></td></tr><tr><td>25x HC IRAPO motCORR cel do zanurzania w wodzie</td><td>Leica</td><td>11507704</td><td></td></tr><tr><td>Kwas askorbinowy (Witamina C)</td><td>Acros Organics</td><td>352685000</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glukoza bioxtra&nbsp;</td><td>System Sigma Aldrich</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>Delta T&nbsp;</td><td>Bioptechs</td><td>0420-4</td><td>W tym kontrola temperatury, naczynia hodowlane i konfiguracja perfuzji</td></tr><tr><td>Mikroskop preparacyjny - LEICA S9E</td><td>Leica</td><td>LED300 SLI</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Thermo Scientific</td><td>11039047</td><td>Podłoże podstawowe bez czerwieni fenolowej</td></tr><tr><td>Ostrze chirurgiczne z piór (#15)</td><td>Pióro</td><td>72044-15</td><td></td></tr><tr><td>Szczypce do drobnych końcówek</td><td>FST</td><td>11252-23</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>35050-061</td><td>Substytut glutaminy</td></tr><tr><td>Leica SP8-DIVE wyposażony w 25X HC IRAPO motCORR cel zanurzania w wodzie&nbsp;</td><td>Leica</td><td>n/a niskotopliwa</td><td></td></tr><tr><td>agaroza</td><td>NuSieve</td><td>50080</td><td></td></tr><tr><td>aminokwasy endogenne (100x)</td><td>Penicylina Thermo Scientific</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>&ndash; streptomycyna</td><td>Thermo Scientific 15140122</td><td></td><td>10 000 U/ml&nbsp;</td></tr><tr><td>Szalka Petriego</td><td>Gen Clone</td><td>32-107G</td><td>90 mm&nbsp;</td></tr><tr><td>Surowica szczurza</td><td>Valley Biomedical</td><td>AS3061SC</td><td>Przetworzone do obrazowania na żywo</td></tr><tr><td>Żyletka #9</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>Rękojeść skalpela</td><td>FST</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki</td><td>FST</td><td>37133</td><td></td></tr><tr><td>kleszcze ząbkowane</td><td>FST</td><td>11000-13</td><td></td></tr><tr><td>nożyczki sprężynowe</td><td>FST</td><td>91500-09</td><td></td></tr></tbody></table>

wykorzystanie obrazowania na żywo ex vivo do badania podziałów i ruchów komórek podczas odnawiania zębów myszy

Using Ex Vivo Live Imaging to Investigate Cell Divisions and Movements During Mouse Dental Renewal

Ciągle rosnący siekacz myszy wyłania się jako wysoce elastyczny system modelowy do badania regulacji dorosłych nabłonkowych i mezenchymalnych komórek macierzystych oraz regeneracji zębów. Te populacje progenitorowe aktywnie dzielą się, przemieszczają i różnicują, aby utrzymać homeostazę tkanek i regenerować utracone komórki w sposób responsywny. Jednak tradycyjne analizy z wykorzystaniem nieruchomych skrawków tkanek nie były w stanie uchwycić dynamicznych procesów ruchów i interakcji komórkowych, co ograniczało naszą zdolność do badania ich regulacji. W artykule opisano protokół utrzymywania całych siekaczy myszy w systemie hodowli eksplantatów i śledzenia na żywo komórek nabłonka zębów za pomocą wielofotonowej mikroskopii poklatkowej. Technika ta uzupełnia nasz istniejący zestaw narzędzi do badań stomatologicznych i pozwala badaczom na uzyskanie informacji czasoprzestrzennych na temat zachowań i organizacji komórek w żywej tkance. Przewidujemy, że ta metodologia pomoże naukowcom w dalszym badaniu mechanizmów kontrolujących dynamiczne procesy komórkowe zachodzące zarówno podczas odnawiania, jak i regeneracji zębów.

Obszar apikalny siekacza dorosłej myszy znajduje się wewnątrz żuchwy (Rysunek 1), przez co nie jest bezpośrednio dostępny do wizualizacji i śledzenia na żywo komórek progenitorowych znajdujących się w strefie wzrostu. W związku z tym opracowaliśmy metodę wyodrębniania całego siekacza z kości żuchwy i utrzymywania go w systemie hodowli eksplantatów do dwufotonowej mikroskopii timelapse (Rysunek 2>). Poniżej opisujemy reprezentatywne wyniki obrazujące dynamiczny p...

Obrazowanie na żywo ex vivo to potężna technika badania dynamicznych procesów ruchów komórkowych i interakcji w żywych tkankach. W tym miejscu przedstawiamy protokół, który implementuje mikroskopię dwufotonową do śledzenia na żywo komórek nabłonka zębów w hodowanych całych siekaczach dorosłych myszy.

Wykorzystanie obrazowania na żywo ex vivo do badania podziałów i ruchów komórek podczas odnawiania zębów myszy

The continuously growing mouse incisor is emerging as a highly tractable model system to investigate the regulation of adult epithelial and mesenchymal ...

Aby utrzymać prawidłową organizację komórkową podczas odnowy narządów, tkanka zbliżająca się do komórek porusza się i dzieli określone orientacje i wzorce. Dlatego ważne jest, aby zrozumieć zasady i przepisy tych dynamicznych zdarzeń komórkowych. Siekacz myszy jest nowym modelem do badań nad dorosłymi komórkami macierzystymi, a w systemie dostępnych jest wiele narzędzi genetycznych do badania funkcji genów i znakowania komórek w celu śledzenia linii.Większość dotychczasowych badań wykorzystuje próbki zębów dorosłych pobrane i ustaliła określone punkty czasowe, co uniemożliwia nam zbadanie zachowania żywych komórek. W tym protokole opisujemy metodę śledzenia stylu życia dorosłych siekaczy myszy, a technika ta umożliwi przyszłe badania, które mają na celu zrozumienie, w jaki sposób dynamiczne zachowania komórek przyczyniają się do odnowy i naprawy tkanek zębowych. Na początek odwróć uśpioną mysz tak, aby jej brzuszna strona była skierowana do góry, a żuchwy były łatwo dostępne.Delikatnie zabezpiecz główkę myszy między kciukiem a palcem wskazującym. Używając żyletki, zaczynając od dolnej wargi w kierunku dekoltu, wykonaj nacięcie w połowie strzałki na skórze dolnej szczęki. Podczas nacięcia użyj kciuka i palca wskazującego, aby otworzyć przeciętą skórę, odsłaniając spodnie mięśnie i kość szczęki.Następnie przetnij mięśnie żwaczy po stronie policzkowej dolnej szczęki. Przeciąć mięśnie błonowo-gnykowe wzdłuż wewnętrznej strony żuchwy i usunąć przyczepy mięśniowe. Wykonaj kolejne nacięcie w syntezie żuchwy, łącząc dwie krwiochwyty, rozdzielając je na lewą i prawą połowę.Wciśnij żyletkę między kłykieć żuchwy a staw skroniowo-żuchwowy, aby ostrożnie odciąć półkłykiet od reszty głowy. Natychmiast przenieś wypreparowane żuchwy na szalkę Petriego zawierającą wstępnie podgrzane podłoże preparacyjne. Następnie, pod mikroskopem preparacyjnym w jasnym polu, użyj ostrza chirurgicznego numer 15, aby usunąć tkanki mięśniowe.Zidentyfikuj owalny obszar żuchwy, który obejmuje panewkę siekacza i mieści wierzchołkową część siekacza. Ustaw żuchwy tak, aby wewnętrzna lub językowa powierzchnia była skierowana do góry. Trzymając żuchwę parą ząbkowanych kleszczy, używając ostrza chirurgicznego numer 15, ogol leżącą nad nią kość błony od kłykcia w kierunku zębów trzonowych, aby wytworzyć okno na owalu.To odsłania tkankę miękką siekacza wierzchołkowego na wewnętrznej powierzchni. Następnie obróć żuchwę tak, aby zewnętrzna lub policzkowa powierzchnia była skierowana do góry. Jak pokazano dla wewnętrznej żuchwy, wygeneruj okno w owalnym obszarze na zewnętrznej żuchwie.Za pomocą kleszczy usuń pozostałe fragmenty kości na krawędzi, upewniając się, że wierzchołkowy koniec zęba jest widoczny z obu stron. Aby odizolować cały ząb, wykonaj czyste cięcie w płaszczyźnie bezpośrednio przylegającej do siekacza wierzchołkowego, aby usunąć wyrostek kłykciowy. Następnie wykonaj drugie cięcie tuż za trzecim zębem trzonowym, ale grzbietowo do siekacza, nie uszkadzając zęba, aby usunąć wyrostek dziobiasty.Seryjnie cięty od końca wyrostka kątowego w kierunku siekacza, aby stopniowo usuwać brzuszną żuchwę. Następnie odetnij kość wyrostka zębodołowego z zębami trzonowymi i wszelkie pozostałe kości, które są nadal przyczepione do siekacza. Przenieść całkowicie wypreparowany siekacz do naczynia zawierającego podgrzane podłoże do preparacji.Włącz mikroskop fluorescencyjny i wykorzystaj sygnał fluorescencyjny z tkanek, aby pokierować usunięciem przyzębia. Ustaw siekacz wewnętrzny po jego stronie językowej i za pomocą ząbkowanych kleszczy przytrzymaj ząb na miejscu. Następnie za pomocą pary cienkich kleszczyków numer 5 zacznij zakładać tkanki przyzębia pokrywające siekacz wierzchołkowy i okolicę pętli szyjnej.Ostrożnie oderwij tkanki przyzębia od pąka wierzchołkowego, tak aby widoczna była boczna strona pętli szyjki macicy. Na początek dodaj 500 mikrolitrów ciepłego żelu hodowlanego do dołka w 24-dołkowej płytce. Szybko przenieś wypreparowane całe siekacze odizolowane od myszy do studni.Zakręć płytką kilka razy, aby wypłukać siekacze. Dodaj 400 mikrolitrów ciepłego żelu hodowlanego do naczynia hodowlanego i przenieś wypłukane siekacze do naczynia. Ustaw siekacz tak, aby ustawić obszar pętli szyjnej na środku naczynia i dostosuj nachylenie siekacza wierzchołkowego do żądanej płaszczyzny obrazowania.Po związaniu żelu, za pomocą cienkich kleszczy, usuń żel z obszaru zainteresowania. Dodać około 150 mikrolitrów ciepłej pożywki hodowlanej do krawędzi naczynia, aby przykryć próbkę. Umieść kulturę eksplantatów w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby tkanka mogła się uspokoić.Po godzinie włącz mikroskop i laser dwufotonowy. Przymocuj naczynie hodowlane do stage adapter i umieść pierścień adaptera perfuzyjnego na górze. Podłącz stage adapter do regulatora temperatury, aby utrzymać kulturę w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Podłącz wlot i wylot pierścienia adaptera do pompy mikroperfuzyjnej. Ustaw prędkość perfuzji na 20 i rozpocznij perfuzję pożywki nad próbką. Umieść ACBR na górze pierścienia adaptera i podnieś stolik tak, aby obiektyw pasował do ACBR, aby zetknąć się z pożywką hodowlaną.Zmień długość fali lasera na 920 nanometrów, aby zobrazować GFP. Po zlokalizowaniu próbki w okularze, zwizualizuj ją za pomocą oprogramowania mikroskopowego, a następnie ustaw rozmiar kroku Z wynoszący cztery mikrometry i odstęp czasu wynoszący pięć minut przez 14 godzin. Rozpocznij obrazowanie poklatkowe i zapisz kolejne fiolki do dalszej analizy danych.W mikroskopii poklatkowej pętli szyjki macicy k14-Cre, R26-rtTA, tetO-H2B-GFP, sygnały H2B-GFP obserwowano głównie w obszarze trans-amplifikacyjnym pętli szyjnej, wskazując na aktywne podziały komórkowe. Ponadto zaobserwowano kondensację i wyrównanie chromosomów na płytce metafazowej w komórkach mitotycznych, a następnie ich segregację podczas antyfazy i do dwóch komórek potomnych. Większość podziałów komórkowych była prostopadła lub pod kątem w stosunku do błony podstawnej, z mniejszą liczbą podziałów poziomych równoległych do błony podstawnej.Zdarzenia podziału komórek były również widoczne w pętlach szyjki macicy K14-Cre, R26-mT/mG, gdzie wszystkie błony komórkowe nabłonka były oznaczone na zielono. Komórki mitotyczne zidentyfikowano na podstawie ich zaokrąglenia komórek i późniejszej cytokinezy. W pętlach szyjki macicy K14-Cre, R26-mT/mG obserwowano również poziome, jak i pionowe podziały komórkowe.

using-ex-vivo-live-imaging-to-investigate-cell-divisions-movements

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

W niniejszej pracy opracowujemy narzędzia niezbędne do obrazowania żywych komórek ex vivo w celu śledzenia podziałów pojedynczych komórek w neuroepitelium myszy w stadium...

Ex vivo obrazowanie na żywo podziałów pojedynczych komórek w neuroepitelium myszy

Mitoza neuronalnego progenitora jest krytycznym parametrem neurogenezy. Znaczna część naszej wiedzy na temat mitozy progenitorowej neuronów opiera się na analizie utrwalonej tkanki. Obrazowanie na żywo w embrionalnych wycinkach mózgu jest wszechstronną techniką oceny mitozy z wysoką rozdzielczością czasową i przestrzenną w kontrolowanym środowisku.

Obrazowanie na żywo mitozy w rozwijającej się korze embrionalnej myszy

Tutaj prezentujemy protokół obrazowania na żywo fuzji wtórnego podniebienia myszy za pomocą mikroskopii konfokalnej. Protokół ten może być stosowany w połączeniu z różnymi fluorescencyjnymi liniami myszy reporterowych oraz z inhibitorami szlaków w celu uzyskania wglądu mechanistycznego. Protokół ten może być zaadaptowany do obrazowania na żywo w innych systemach rozwojowych.

Obrazowanie na żywo fuzji wtórnego podniebienia myszy

Obrazowanie immunofluorescencyjne jest ograniczone przez możliwość obserwacji złożonych, zależnych od czasu procesów biologicznych w zaledwie jednej migawce w czasie. Badanie to przedstawia podejście do obrazowania na żywo przeprowadzone na precyzyjnie wyciętych wycinkach gruczołu podżuchwowego myszy. Takie podejście pozwala na obserwację w czasie rzeczywistym interakcji komórka-komórka podczas homeostazy oraz procesów regeneracji i naprawy.

Badanie interakcji komórka-komórka w gruczole ślinowym za pomocą obrazowania żywych komórek ex vivo

Tutaj prezentujemy protokół hodowli łuków gardłowych w celu zbadania biologii komórek progenitorowych serca i mięśni oraz ich mikrośrodowiska.

Ex vivo Hodowla łuków gardłowych w celu zbadania przodków serca i mięśni oraz ich niszy

Hodowla pionowych kropelek ex vivo jest alternatywą dla obecnych technik eksperymentalnych in vitro i in vivo. Protokół ten jest łatwy do wykonania i wymaga mniejszych ilości odczynnika, a jednocześnie umożliwia manipulowanie i badanie unaczynienia, morfogenezy i organogenezy płodu.

Wykorzystanie ex vivo pionowych kultur kropelkowych całych narządów płodu do badania procesów rozwojowych podczas organogenezy myszy

Celem tego protokołu jest opisanie metody funkcji utraty i zysku, która ma zastosowanie do identyfikacji neogeniny jako specyficznego dla etapu receptora, który prowadzi do trofektodermy i różnicowania wewnętrznej masy komórkowej w preimplantacyjnych zarodkach myszy.

Podejście oparte na utracie i wzmocnieniu funkcji w celu zbadania determinantów wczesnego losu komórek w preimplantacyjnych zarodkach myszy

Łącząc transplantację komórek, znakowanie cytoszkieletu i podejście do utraty/wzmocnienia funkcji, ten protokół opisuje, w jaki sposób migrująca prospektywna płytka przedstrunowa danio pręgowanego może być wykorzystana do analizy funkcji genu kandydującego w migracji komórek in vivo.

Analiza migracji komórek in vivo przy użyciu przeszczepów komórek i obrazowania poklatkowego w zarodkach danio pręgowanego

Przedstawiono metodę tworzenia i obrazowania na żywo różnych humanizowanych nisz szpiku kostnego u myszy. W oparciu o niszę podporową utworzoną przez ludzkie komórki mezenchymalne, dodanie ludzkich komórek śródbłonka indukuje tworzenie ludzkich naczyń, podczas gdy dodanie rhBMP-2 indukuje tworzenie chimerycznej tkanki kostnej ludzko-mysi.

Bioinżynieria humanizowanych mikrośrodowisk szpiku kostnego u myszy i ich wizualizacja za pomocą obrazowania na żywo

Ten manuskrypt opisuje metodę hodowli jajników in vitro, która umożliwia obrazowanie żywych komórek zygot i zarodków Arabidopsis. Metoda ta jest wykorzystywana do wizualizacji dynamiki wewnątrzkomórkowej podczas polaryzacji zygoty i specyfikacji losu komórki w rozwijających się zarodkach.

In vitro Hodowla zalążków do obrazowania żywymi komórkami polaryzacji zygoty i wzorca zarodka u Arabidopsis thaliana

Poznaj metodę obrazowania na żywo ex vivo do badania podziałów i ruchów komórek nabłonkowych w zębach dorosłych myszy. Technika ta umożliwia obserwację dynamicznych zachowań komórkowych w czasie rzeczywistym.

Wykorzystanie obrazowania na żywo ex vivo do badania podziałów i ruchów komórek podczas odnawiania zębów myszy

Przeglądaj więcej filmów