Name: Model ex vivo przerzutów do otrzewnej raka jajnika z wykorzystaniem ludzkiej sieci (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-26T14:15:00.000+00:00
Duration: 5 min 42 s
Description: Poznaj trójwymiarowy model ex vivo interakcji komórek raka jajnika z siecią ludzką. Ta metoda pozwala badać mechanizmy prozapalne w niszy tłuszczowej i testować nowe terapie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie jest częściowo finansowane przez The Janet Burros Memorial Foundation. Dziękujemy pacjentkom oraz Zakładowi Ginekologii Onkologicznej Instytutu Onkologii Karmanos za pobranie próbek sieci pokarmowej. Wyrażamy również uznanie dla Biobanku i Rdzenia Nauk Korelacyjnych w Instytucie Raka Karmanos za koordynację rekrutacji pacjentów i przygotowanie preparatów patologicznych. Biobank i rdzeń nauk korelacyjnych jest częściowo wspierany przez grant Centrum NIH P30 CA22453 dla Instytutu Raka Karmanos na Uniwersytecie Stanowym Wayne.

Poniższy protokół badawczy został sprawdzony i zatwierdzony przez Wayne State University Institutional Review Board (IRB). Przed zabiegiem uzyskano świadomą zgodę od wszystkich pacjentów. Rysunek 1 ilustruje trzy ogólne kroki w tym protokole.
1. Przygotowanie tkanki ludzkiej sieci
<ol>
	<li>Przygotować pożywkę hodowlaną sieci (DMEM/F12 + 10% płodowej surowicy bydlęcej + 1% penicyliny-streptomycyny) i przechowywać w temperaturze 4 °C. Podwielokrotność 30-40 ml tej pożywki przelać do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 50 ml lub pojemnika na próbkę chirurgiczną.</li>
	<li>Pobieranie próbek chirurgicznych z biopsji omentalnej lub operacji omentektomii. Zanurzyć sterylną próbkę w pożywce hodowlanej sieci natychmiast po usunięciu na sali operacyjnej. Jeśli przebieg pracy na to nie pozwala, należy jak najszybciej umieścić próbkę w pożywce do hodowli sieci komórkowej. Przenieść próbkę, umieszczając ją na lodzie i przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu przetworzenia. 
	UWAGA: Wielkość usuniętej próbki sieci określi ilość tkanki nadającej się do obróbki.</li>
	<li>Próbkę sieci należy przetworzyć w ciągu 1-2 godzin od pobrania za pomocą okapu z przepływem laminarnym. Upewnij się, że wszystkie materiały i narzędzia są sterylne lub wysterylizowane.</li>
	<li>Wyjąć sieć z pojemnika zbiorczego i przenieść ją do naczynia hodowlanego o średnicy 100 mm. Zanurz próbkę w 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (1x PBS) i delikatnie umyj próbkę, aby usunąć wszelkie skrzepy krwi lub zanieczyszczenia.</li>
	<li>Pokrój tkankę na kawałki (0,5 cm x 0,5 cm lub 100-200 mg; <silna klasa="xfig">Rysunek 2A) za pomocą małych nożyczek chirurgicznych lub skalpela 10-15 mm. Użyj małych kleszczy chirurgicznych, aby pomóc manipulować tkanką i uniknąć zmiażdżenia sieci włosów. Jeśli do chirurgicznego usunięcia próbki sieci użyto urządzenia energetycznego, należy unikać używania zniekształconej tkanki na uszczelnionej krawędzi.</li>
	<li>Umieść każdy kawałek pokrojonej sieci w osobnych dołkach 24-dołkowej płytki hodowlanej i wypełnij studzienki 500 μl pożywki hodowlanej sieci lub do objętości wystarczającej do przykrycia sieci bez pozwalania, aby kawałek sieci unosił się nad dnem studzienki (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2B).</li>
	<li>Przechowywać kawałki sieci w świeżych pożywkach hodowlanych w temperaturze 4 °C do momentu, gdy będą gotowe do wstrzyknięcia.</li>
</ol>
2. Przygotowanie komórek raka jajnika
<ol>
	<li>Hodowla ludzkich komórek raka jajnika w kolbie hodowlanej o średnicy 75cm2 w temperaturze 37 °C i 5% CO2 do co najmniej 75% zbiegu do dnia pobrania sieci komórkowej. 
	UWAGA: Ten protokół wykorzystuje mCherry-dodatnie komórki ludzkiego raka jajnika OCSC1-F2 wcześniej opisane15,16,17,18. Można go zmodyfikować do dowolnej linii komórek rakowych oznaczonej sygnałem fluorescencyjnym.</li>
	<li>Przygotować komórki w okapie z przepływem laminarnym natychmiast po pobraniu próbki sieci komórkowej. Upewnij się, że wszystkie materiały i narzędzia są sterylne lub wysterylizowane.</li>
	<li>Dodać 10 ml sterylnego 1x PBS do kolby hodowlanej i umyć komórki, delikatnie kołysząc kolbą. Usuń 1x PBS, a następnie dodaj 3 ml 0,05% trypsyny-EDTA.</li>
	<li>Delikatnie kołysać kolbą hodowlaną, aby pokryć wszystkie komórki, a następnie umieścić kolbę w inkubatorze (37 °C i 5% CO2 ) na nie dłużej niż 5 minut. Postukać w kolbę hodowlaną, aby całkowicie odłączyć komórki, a następnie zneutralizować trypsynę, dodając 3 ml pożywki do hodowli sieci komórkowej.</li>
	<li>Wymieszać zawiesinę komórkową przez pipetowanie, a następnie przenieść zawiesinę do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Odwirować zawiesinę przez 5 minut w temperaturze 1 200 x g w temperaturze 24 °C. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 6 ml świeżej pożywki do hodowli sieci komórkowej.</li>
	<li>Policz komórki za pomocą hemekytometru. Rozcieńczyć zawiesinę komórek do co najmniej 100 000 komórek na 100-200 μl zawiesiny. Jest to objętość wstrzyknięcia do każdego odciętego kawałka sieci jajowej.</li>
	<li>Przenieść odpowiednią liczbę komórek do nowej kolby hodowlanej, aby kontynuować pasaż komórkowy.</li>
</ol>
3. Wstrzyknięcie komórek raka jajnika
<ol>
	<li>Za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml pobrać zawiesinę krwinek, a następnie przymocować igłę 26 G. Nie należy pobierać zawiesiny komórek za pomocą igły, ponieważ może to spowodować fragmentację komórek.</li>
	<li>Użyj małych kleszczy chirurgicznych, aby podnieść kawałek przeciętej sieci komórkowej. Przenieść sieć do oddzielnego, działającego sterylnego naczynia w celu ułatwienia wstrzyknięcia. Delikatnie przekłuć sieć końcówką igły i wstrzyknąć niewielką objętość zawiesiny komórkowej do tkanki (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2C).</li>
	<li>Powtórzyć wstrzyknięcie na kilka obszarów sieci do całkowitej objętości co najmniej 100 μl lub 100 000 komórek. Należy zauważyć, że duża część zawiesiny komórkowej może wydawać się gromadzona wokół próbki. Jeśli istnieją obawy co do jakości wstrzyknięcia, należy powtórzyć wstrzyknięcie lub wstrzyknąć większą objętość zawiesiny komórkowej do próbki.</li>
	<li>Wstrzyknięte próbki sieci należy umieścić z powrotem w każdym dołku 24-dołkowej płytki hodowlanej. Zwróć uwagę, że objętość pożywki hodowlanej sieci jest na poziomie, który pokrywa sieć bez pozwalania jej na unoszenie się na wodzie. Ostrożnie obchodź się z płytką i umieść ją w inkubatorze (37 °C i 5% CO2 ).</li>
	<li>OPCJONALNIE: Użyj Matrigel (macierz błony podstawnej), aby zawiesić tkankę sieci w stałej matrycy, aby umożliwić łatwiejsze wstrzykiwanie i bardziej skoncentrowane dostarczanie zawiesiny komórek.
	<ol>
		<li>Bezpośrednio przed użyciem rozmrozić matrycę błony podstawnej w temperaturze 4 °C i wymieszać w stosunku 1:1 z pożywką hodowlaną sieci komórkowej. Mieszaninę z matrycą błony podstawnej należy przechowywać na lodzie lub w temperaturze 4 °C do momentu wstrzyknięcia. Napełnij puste studzienki wystarczającą ilością mieszanki macierzy błony podstawnej, aby zanurzyć odcięty kawałek sieci komórkowej.</li>
		<li>Umieścić próbki w mieszaninie matrycy błony podstawnej, a następnie umieścić 24-dołkową płytkę hodowlaną w inkubatorze (37 °C i 5% CO2 ) na 20 minut. Po zestaleniu się mieszaniny kontynuować wstrzykiwanie, jak opisano powyżej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Potwierdź udane wstrzyknięcie za pomocą obrazowania fluorescencyjnego. Upewnij się, że w miejscach wstrzyknięcia jest wizualizowana smuga sygnału fluorescencyjnego (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2D). Należy pamiętać, że rzeczywista liczba komórek przyczepionych do sieci po wstrzyknięciu jest nieprzewidywalna.</li>
</ol>
4. Współhodowla komórek ludzkiej sieci i raka jajnika
<ol>
	<li>Zmieniaj pożywkę co 48-72 godziny, dodając 500-2000 μl świeżych pożywek hodowlanych sieci komórkowej. Nie należy pipetować pożywki bezpośrednio na tkankę sieci leków, ponieważ może to spowodować przemieszczenie komórek rakowych. Zwróć uwagę, że jeśli kolor nośnika zmieni się na żółty, zmień media. 
	UWAGA: Częstotliwość zmiany pożywki będzie zależeć od objętości użytej pożywki i trajektorii wzrostu komórek rakowych. Gdy komórki rakowe zasieją sieć, to, czy kawałek sieci unosi się na wodzie, nie jest już ważne.</li>
	<li>OPCJONALNIE: Jeśli zastosowano matrycę z membraną podstawną, matryca zwykle rozpuszcza się do czasu pierwszej wymiany podłoża.</li>
	<li>Monitoruj wzrost guzów raka jajnika za pomocą obrazowania fluorescencyjnego. Częstotliwość obrazowania zależy od uznania badacza. Przewiduj dowody na istnienie małych guzów o około 14 dni (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3A-C). Wyniki mogą się różnić w zależności od jakości wstrzyknięcia.</li>
	<li>Zakończ eksperyment na podstawie punktu końcowego eksperymentu. 
	UWAGA: Wzrost guza i integralność tkanki sieci zaobserwowano w ciągu ostatnich 50 dni.</li>
</ol>

Establishing a 3D Ex Vivo Model for Ovarian Cancer-Omentum Interaction

<ol><li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Wagle, N. S., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+statistics%5BTitle%5D)+AND+%22CA+Cancer+J+Clin%22%5BJournal%5D)">Cancer statistics.</a> CA Cancer J Clin. 73 (1), 17-48 (2023).</li>
<li>Berek, J. S., Renz, M., Kehoe, S., Kumar, L., Friedlander, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+of+the+ovary%2C+fallopian+tube%2C+and+peritoneum%3A+2021+update%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Gynaecol+Obstet%22%5BJournal%5D)">Cancer of the ovary, fallopian tube, and peritoneum: 2021 update.</a> Int J Gynaecol Obstet. 155 (Suppl 1), 61-85 (2021).</li>
<li>Ledermann, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Newly+diagnosed+and+relapsed+epithelial+ovarian+carcinoma%3A+ESMO+clinical+practice+guidelines+for+diagnosis%2C+treatment+and+follow-up%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Oncol%22%5BJournal%5D)">Newly diagnosed and relapsed epithelial ovarian carcinoma: ESMO clinical practice guidelines for diagnosis, treatment and follow-up.</a> Ann Oncol. 24 (Suppl 6), vi24-32 (2013).</li>
<li>Jelovac, D., Armstrong, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+progress+in+the+diagnosis+and+treatment+of+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22CA+Cancer+J+Clin%22%5BJournal%5D)">Recent progress in the diagnosis and treatment of ovarian cancer.</a> CA Cancer J Clin. 61 (3), 183-203 (2011).</li>
<li>Morgan, R. J. Jr, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+cancer.+Clinical+practice+guidelines+in+oncology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Natl+Compr+Canc+Netw%22%5BJournal%5D)">Ovarian cancer. Clinical practice guidelines in oncology.</a> J Natl Compr Canc Netw. 6 (8), 766-794 (2008).</li>
<li>Nieman, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipocytes+promote+ovarian+cancer+metastasis+and+provide+energy+for+rapid+tumor+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Adipocytes promote ovarian cancer metastasis and provide energy for rapid tumor growth.</a> Nat Med. 17 (11), 1498-1503 (2011).</li>
<li>Motohara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evolving+story+of+the+metastatic+voyage+of+ovarian+cancer+cells%3A+cellular+and+molecular+orchestration+of+the+adipose-rich+metastatic+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">An evolving story of the metastatic voyage of ovarian cancer cells: cellular and molecular orchestration of the adipose-rich metastatic microenvironment.</a> Oncogene. 38 (16), 2885-2898 (2019).</li>
<li>Di Nicola, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Omentum+a+powerful+biological+source+in+regenerative+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Regen+Ther%22%5BJournal%5D)">Omentum a powerful biological source in regenerative surgery.</a> Regen Ther. 11, 182-191 (2019).</li>
<li>Meza-Perez, S., Randall, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+functions+of+the+omentum%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immunological functions of the omentum.</a> Trends Immunol. 38 (7), 526-536 (2017).</li>
<li>Liu, M., Silva-Sanchez, A., Randall, T. D., Meza-Perez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specialized+immune+responses+in+the+peritoneal+cavity+and+omentum%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Specialized immune responses in the peritoneal cavity and omentum.</a> J Leukoc Biol. 109 (4), 717-729 (2021).</li>
<li>Lee, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+facilitate+ovarian+cancer+premetastatic+niche+formation+in+the+omentum%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Neutrophils facilitate ovarian cancer premetastatic niche formation in the omentum.</a> J Exp Med. 216 (1), 176-194 (2019).</li>
<li>Cardenas, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipocyte+microenvironment+promotes+Bclxl+expression+and+confers+chemoresistance+in+ovarian+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Apoptosis%22%5BJournal%5D)">Adipocyte microenvironment promotes Bclxl expression and confers chemoresistance in ovarian cancer cells.</a> Apoptosis. 22 (4), 558-569 (2017).</li>
<li>Wu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer-associated+adipocytes%3A+key+players+in+breast+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hematol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Cancer-associated adipocytes: key players in breast cancer progression.</a> J Hematol Oncol. 12 (1), 95(2019).</li>
<li>Zhang, Z., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue%3A+The+dysfunctional+adipocyte+-+a+cancer+cell%27s+best+friend%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue: The dysfunctional adipocyte - a cancer cell's best friend.</a> Nat Rev Endocrinol. 14 (3), 132-134 (2018).</li>
<li>Alvero, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRX-E-002-1+Induces+c-Jun-dependent+apoptosis+in+ovarian+cancer+stem+cells+and+prevents+recurrence+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Ther%22%5BJournal%5D)">TRX-E-002-1 Induces c-Jun-dependent apoptosis in ovarian cancer stem cells and prevents recurrence in vivo.</a> Mol Cancer Ther. 15 (6), 1279-1290 (2016).</li>
<li>Alvero, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+approach+for+the+detection+of+intraperitoneal+micrometastasis+using+an+ovarian+cancer+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Novel approach for the detection of intraperitoneal micrometastasis using an ovarian cancer mouse model.</a> Sci Rep. 7, 40989(2017).</li>
<li>Craveiro, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+modifications+in+ovarian+cancer+stem+cells+following+Paclitaxel+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Med%22%5BJournal%5D)">Phenotypic modifications in ovarian cancer stem cells following Paclitaxel treatment.</a> Cancer Med. 2 (6), 751-762 (2013).</li>
<li>Sumi, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+model+for+non-invasive+imaging+to+detect+and+monitor+ovarian+cancer+recurrence%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Murine model for non-invasive imaging to detect and monitor ovarian cancer recurrence.</a> J Vis Exp. (93), e51815(2014).</li>
<li>Agarwal, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+migration+inhibitory+factor+expression+in+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Obstet+Gynecol%22%5BJournal%5D)">Macrophage migration inhibitory factor expression in ovarian cancer.</a> Am J Obstet Gynecol. 196 (4), 348.e1-348.e5 (2007).</li>
<li>Kelly, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TLR-4+signaling+promotes+tumor+growth+and+paclitaxel+chemoresistance+in+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">TLR-4 signaling promotes tumor growth and paclitaxel chemoresistance in ovarian cancer.</a> Cancer Res. 66 (7), 3859-3868 (2006).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CBX7+binds+the+E-box+to+inhibit+TWIST-1+function+and+inhibit+tumorigenicity+and+metastatic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">CBX7 binds the E-box to inhibit TWIST-1 function and inhibit tumorigenicity and metastatic potential.</a> Oncogene. 39 (20), 3965-3979 (2020).</li>
<li>Tedja, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+stable+epithelial-mesenchymal+hybrid+cancer+cells+with+tumorigenic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Generation of stable epithelial-mesenchymal hybrid cancer cells with tumorigenic potential.</a> Cancers (Basel). 15 (3), 15030684(2023).</li>
<li>Dauleh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+cultured+mesothelial+cells+derived+from+the+murine+adult+omentum%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Characterisation of cultured mesothelial cells derived from the murine adult omentum.</a> PLoS One. 11 (7), e0158997(2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Korzystając z tego protokołu, opracowano przedkliniczny model rakowatości otrzewnej w raku jajnika, stosując połączenie podstawowych technik in vitro i ex vivo. Postępujący wzrost guza zaobserwowano w ciągu 50 dni wspólnej hodowli po wysianiu próbek sieci komórkami ludzkiego raka jajnika mCherry + OCSC1-F2. Metoda ta została opracowana i zoptymalizowana w kilku próbach eksperymentalnych z wykorzystaniem różnych próbek sieci komórkowej. Pomyślny wzrost guza zależał od jakości sieci komórkowej, żywotności komórek nowotworowych i skuteczności iniekcji. W tym raporcie użyliśmy tylko komórek mCherry + OCSC1-F2 i linii ludzkiego raka jajnika mCherry + R182 wcześniej opisanych w kilku publikacjach 12,15,16,17,18,19,20,21,22. Wykorzystując te dwie linie komórkowe o różnych czasach podwojenia (16 godzin dla OCSC1-F2 i 36 godzin dla R182), zauważono różnicę w czasie osiągnięcia logarytmicznego wzrostu w tkance omentalnej. Mimo to udało nam się ustalić obie linie komórkowe w systemie kohodowli.
Sprawna komunikacja między badaczami, koordynatorami badań i zespołami chirurgicznymi miała kluczowe znaczenie dla pobierania i przetwarzania próbek sieci komórkowych. Badacz zidentyfikował kandydatów do protokołu, koordynatorzy badania uzyskali zgodę pacjentów przed operacją, a badacz pobrał próbki z sali operacyjnej. Biorąc pod uwagę ten przebieg pracy, harmonogram badacza musiał być elastyczny, ponieważ wiele czynników wpływających na pobranie danych po stronie pacjenta było nieprzewidywalnych (np. odwołana operacja, zmieniony czas operacji, nieodpowiednia sieć lub jej brak). Bezpośrednia wizualizacja i selekcja tkanek z sali operacyjnej zapewniła integralność próbek, sterylność chirurgiczną i terminowe przetwarzanie. Początkowo pobieranie próbek powierzono koordynatorom badań; Jednak po pobraniu kilku próbek zauważyliśmy, że czas do przetworzenia był opóźniony (tj. >4 godziny), a jakość sieci była znacznie gorsza (np. tkanka była w kawałkach). W jednym z badań eksperymentalnych tkanka jajowa była przechowywana w temperaturze 4 °C przez 48 godzin przed wstrzyknięciem, ponieważ komórki rakowe nie były gotowe na czas. Podobny wzrost guza był nadal obserwowany, ale ta sekwencja nie została powtórzona, ponieważ wiadomo, że zmiany temperatury wpływają na mikrośrodowisko guza (TME).
Przed pobraniem próbki ważne było, aby mieć wystarczająco zlewające się komórki rakowe zgodnie z harmonogramem operacji. Ponieważ liczba próbek pobieranych każdego miesiąca była różna, aktywne hodowle komórek raka jajnika nie zawsze były utrzymywane. Zamrożone komórki rozmrażano co najmniej 1 tydzień wcześniej, posiewano przy użyciu standardowego protokołu, a następnie co najmniej raz przepuszczano komórki, aby zapewnić żywotność. Linie komórkowe użyte w tym protokole były stosunkowo odporne; Jednak nadal spotykaliśmy się z przypadkami, w których komórki nie wyzdrowiały do dnia operacji i nie można było ich wstrzyknąć. W tym badaniu nie podjęto próby wstrzyknięcia komórek rakowych, które były mniej niż w 50% zlewające się. Późniejsze opóźnienia związane z przygotowaniem komórek zostały złagodzone dzięki zastosowaniu dobrej sterylnej techniki i dzieleniu komórek w proporcjach w celu utrzymania konfluencji w zależności od przewidywanego harmonogramu pobierania próbek. Ograniczyliśmy protokół tylko do dwóch fluorescencyjnie znakowanych linii komórek rakowych, ale ważne jest, aby pamiętać, że można również wykorzystać inne ustalone linie komórek rakowych lub pierwotne komórki rakowe bez białek fluorescencyjnych.
Wreszcie, tempo wzrostu guza było skorelowane ze zbieganiem się komórek rakowych sąsiadujących z adipocytami i w ich obrębie bezpośrednio po wstrzyknięciu. Ustalono to, wykonując obrazy fluorescencyjne wszystkich próbek sieci po wstrzyknięciu. W porównaniu z inokulacją komórek nowotworowych narządów litych lub tkanek podskórnych, wstrzykiwanie komórek rakowych do tkanki omentalnej było trudniejsze. Luźna struktura i tłusta konsystencja sieci uniemożliwiają tkance skuteczne zatrzymywanie objętości zawiesiny komórkowej bez przeciekania. Gdy do wstrzykiwania używano mniejszej igły (tj. 30 G lub węższej), istniała obawa o fragmentację komórek, ponieważ proliferacja komórek była zmniejszona. Przetestowaliśmy różne techniki wstrzykiwań, liczbę komórek i objętości zawiesiny komórek i znaleźliśmy spójne wyniki z protokołem opisanym powyżej. Jednocześnie przyznajemy, że takie zmiany w protokole prawdopodobnie nadal będą dawać podobne wyniki, biorąc pod uwagę złośliwy charakter komórek. Dodanie Matrigelu ułatwiło etap wstrzykiwania, ponieważ macierz zewnątrzkomórkowa lepiej utrzymywała zawiesinę komórkową; Jednak ta metoda jest droższa i nie konsekwentnie powodowała większego obciążenia guza w próbkach. Ogólnie rzecz biorąc, rzadko zdarzało się, aby którykolwiek z okazów sieci nie rozwijał guzów, ale liczba guzów i szybkość wzrostu były różne.
Model ten symulował cechę charakterystyczną nowotworzenia raka jajnika poprzez replikację wczesnych przerzutów do bogatych w tłuszcz tkanek otrzewnej. Protokół ten pozwala na zmianę bez wymaganych umiejętności, jest łatwy do powielenia i generuje system o potencjalnej wartości translacyjnej. W porównaniu z istniejącymi modelami in vitro i ex vivo w raku jajnika, opisana tutaj metoda łączy kilka technik w celu uzyskania modelu, który zachowuje architekturę guza i TME przez długi okres życia. Dodatkowo zaobserwowaliśmy, że gdy próbka sieci z wieloma guzami została przeniesiona do nowej studzienki i wyhodowana z siecią wolną od raka (tj. Nie wstrzyknięta), naiwna sieć została zasiana komórkami rakowymi w ciągu 7 dni. Odkrycie to sugeruje, że replikowane guzy zachowują potencjał przerzutowy poprzez przejście nabłonkowo-mezenchymalne. Nie zidentyfikowaliśmy żadnych podobnych modeli raka jajnika w literaturze, w których hodowano biopsje tkanek przez dłuższy czas. Podejście to jest poparte wcześniejszym odkryciem, że komórki międzybłonka wyizolowane z sieci myszy mogą być hodowane przez ponad 30 pasaży po pobraniu23.
Model opisany w tym badaniu może być wykorzystany do lepszego zrozumienia wpływu bezpośredniej interakcji między komórkami raka jajnika a komórkami sieci bogatej w tłuszcz. Komórki nowotworowe można oddzielić od tkanek sieci i uzyskać do analizy transkryptomicznej lub immunohistochemicznej (IHC). Dodatkowo komórki mogą być wykorzystywane do badań odpowiedzi na leki.
Głównymi ograniczeniami tego modelu jest to, że liczba guzów, tempo wzrostu guza i lokalizacja guzów były nieprzewidywalne. Brak standaryzacji i zróżnicowania między próbkami może ograniczyć zastosowanie tego modelu. Dokonaliśmy również kilku obserwacji, które będą wymagały dalszej analizy podczas opracowywania tego protokołu. Na przykład, "kontrolne" powtórzenia w jednym eksperymencie nie były w rzeczywistości wolne od raka, ponieważ u pacjenta zdiagnozowano następnie mikroprzerzuty do jaj; Jednak guzy, które nie zostały wstrzyknięte, pozostały żywe przez cały okres eksperymentalny. Przyszłe zastosowania tego modelu będą obejmowały badania molekularne TME podczas wczesnej nowotworzenia, manipulację TME poprzez wstrzykiwanie komórek odpornościowych oraz badania odpowiedzi na leki. Podsumowując, uważamy, że opisany tu model przedkliniczny wzbogaci repertuar istniejących narzędzi badawczych i pomoże wyjaśnić mechanizmy molekularne TME w raku jajnika.

Rak jajnika jest najbardziej śmiertelnym nowotworem ginekologicznym na świecie1. Ryzyko zachorowania na ten nowotwór w ciągu całego życia wynosi około 1 na 70, przy czym mediana wieku rozpoznania wynosi 63 lata2. Pierwotne nowotwory złośliwe jajnika są klasyfikowane histologicznie jako nabłonkowe lub nienabłonkowe. Nabłonkowy rak jajnika (EOC) stanowi ponad 90% nowotworów, a najczęstszym podtypem jest rak surowiczy o wysokim stopniu złośliwości (HGSC), który stanowi około 70%-80% EOC. Obecnie nie ma skutecznych metod badań przesiewowych, które pozwoliłyby na wczesne wykrycie choroby. Tak więc większość pacjentów jest diagnozowana w zaawansowanym stadium (tj. Fédération Internationale de Gynécologie et d'Obstétrique [FIGO] stadium III lub IV) po tym, jak rak rozprzestrzenił się w jamie otrzewnej2.
Standardowe leczenie pierwszej linii to operacja cytoredukcyjna w celu usunięcia wszystkich widocznych makroskopowych chorób, a następnie chemioterapia uzupełniająca oparta na platynie, aby zniszczyć wszelkie pozostałości choroby mikroskopowej. Chociaż w ciągu ostatnich dwóch dekad poczyniono wiele postępów w leczeniu raka jajnika, około 70% pacjentek z zaawansowaną chorobą powróci do nałogu w ciągu 3 lat leczenia3. Biorąc pod uwagę ogólnie złe rokowania dla tych pacjentów, trwające i przyszłe badania translacyjne w EOC mają na celu zidentyfikowanie biomarkerów do wczesnego wykrywania, zapobieganie przerzutom, ulepszenie obecnych terapii w celu uniknięcia oporności i opracowanie nowych spersonalizowanych metod leczenia raka.
Uogólnione przerzuty w obrębie jamy otrzewnej i związana z nią chemooporność to dwa główne ograniczenia dla poprawy leczenia pacjentek z rakiem jajnika4,5. Sieć słoniowa, struktura przypominająca tłuszczowy fartuch, która zwisa z żołądka nad jelitami, jest głównym miejscem przerzutów raka jajnika6,7. Oprócz funkcji bariery fizycznej, wykazano, że sieć ma zdolności regeneracyjne i angiogenne oraz posiada aktywność immunologiczną, które razem promują unaczynienie, przyspieszają gojenie się ran i ograniczają infekcje8. Zawiera wysokie stężenie komórek macierzystych, które mogą różnicować się w różne typy komórek i mogą pomóc w naprawie uszkodzonych tkanek. Sieć może ulec zapaleniu w odpowiedzi na uraz lub infekcję, co wyzwala migrację komórek odpornościowych do miejsca urazu9. Te komórki odpornościowe uwalniają czynniki wzrostu i inne cząsteczki, które pomagają w naprawie i regeneracji uszkodzonej tkanki. Komórki odpornościowe, takie jak makrofagi, limfocyty i komórki plazmatyczne, zlokalizowane w sieci są strukturami znanymi jako "mleczne plamki", które są odpowiedzialne za wykrywanie i atakowanie patogenów oraz regulację odporności otrzewnowej. Wykazano również, że sieć odgrywa rolę w indukowaniu tolerancji immunologicznej10, która jest zdolnością układu odpornościowego do tolerowania własnych antygenów i nie atakowania zdrowych tkanek. Jednak te same działania związane z odpornością są również zaangażowane w patologiczne reakcje, takie jak wzrost guzów omentalnych, przerzuty i ucieczka przed nadzorem immunologicznym9,11. Wcześniejsze badania z naszego laboratorium i innych wykazały unikalną i aktywną rolę mikrośrodowiska tłuszczowego w hamowaniu przeciwnowotworowych odpowiedzi immunologicznych oraz w nabywaniu chemooporności12,13,14. Niestety, mamy ograniczone informacje na temat mechanizmów komórkowych i molekularnych, dzięki którym sieć zapewnia mikrośrodowisko pronowotworowe.
Aby lepiej zrozumieć interakcje między komórkami nowotworowymi a siecią, stworzono system hodowli 3D składający się z ludzkich komórek raka jajnika i eksplantatów sieci pochodzących od pacjentów. Opisany tutaj protokół stanowi nowatorski model ex vivo rakowatości otrzewnej. Model ten naśladuje naturalny postęp nowotworzenia raka jajnika w tej tkance bogatej w tkankę tłuszczową. Proponowany model jest łatwy do wygenerowania, niedrogi i potencjalnie możliwy do zastosowania w badaniach translacyjnych w badaniach nad rakiem jajnika.

<table><tbody><tr><td>0,05% Trypsyna-EDTA (1x)</td><td>Gibco</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>1 ml Strzykawka insulinowa z odłączaną igłą 26 G</td><td>BD</td><td>329652</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Pipety serologiczne</td><td>CELLTREAT</td><td>229010B</td><td></td></tr><tr><td>100 mm Naczynie do hodowli tkankowych</td><td>Fisherbrand</td><td>FB012924</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Probówka wirówkowa</td><td>CELLTREAT</td><td>229411</td><td></td></tr><tr><td>24-dołkowa Płytka hodowlana</td><td>Costar</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Probówka wirówkowa</td><td>CELLTREAT</td><td>229421</td><td></td></tr><tr><td>75 cm2 Kolba do hodowli tkankowych</td><td>CELLTREAT</td><td>229341</td><td></td></tr><tr><td>Licznik komórek Corning</td><td></td><td>9819000</td><td></td></tr><tr><td>Cytation 5 Imager</td><td>Biotek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 (1:1) (1x), +L-glutamina, +2.438 g/L Sód Wodorowęglan</td><td>Gibco</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca, kwalifikowana</td><td>Gibco</td><td>1043028</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>356230</td><td>Matryca z membraną podstawną</td></tr><tr><td>nr 10 Jednorazowy skalpel ze stali nierdzewnej</td><td>Integra-Miltex</td><td>4410</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina Streptomycyna</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem, pH 7,4 ( 1x)</td> <td>Mikroskop obrotowy Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Echo</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

model ex vivo przerzutów do otrzewnej raka jajnika z wykorzystaniem ludzkiej sieci

An Ex Vivo Model of Ovarian Cancer Peritoneal Metastasis Using Human Omentum

Rak jajnika jest najbardziej śmiercionośnym nowotworem ginekologicznym. Sieć odgrywa kluczową rolę w zapewnianiu wspierającego mikrośrodowiska komórkom przerzutowego raka jajnika, a także sygnałów immunomodulacyjnych, które umożliwiają tolerancję guza. Mamy jednak ograniczone modele, które ściśle naśladują interakcję między komórkami raka jajnika a tkankami bogatymi w tkankę tłuszczową. Aby lepiej zrozumieć mechanizmy komórkowe i molekularne, za pomocą których sieć zapewnia mikrośrodowisko pronowotworowe, opracowaliśmy unikalny model 3D interakcji komórka-sieć nowotworowa ex vivo. Za pomocą ludzkiej sieci jesteśmy w stanie hodować komórki raka jajnika w tym bogatym w tłuszcz mikrośrodowisku i monitorować czynniki odpowiedzialne za wzrost guza i regulację immunologiczną. Oprócz zapewnienia platformy do badania tego bogatego w tłuszcz mikrośrodowiska guza, model ten stanowi doskonałą platformę do opracowywania i oceny nowych podejść terapeutycznych do celowania w przerzutowe komórki nowotworowe w tej niszy. Proponowany model jest łatwy do wygenerowania, niedrogi i ma zastosowanie w badaniach translacyjnych.

Pomyślne wprowadzenie komórek raka jajnika do próbek sieci ownetrum było widoczne około 14. dnia (Rysunek 3A-C). W celu umożliwienia dalszych eksperymentów przygotowano i wstrzyknięto co najmniej 24 powtórzenia na każdą pobraną próbkę. Wzrost guza monitorowano, wykonując obrazy fluorescencyjne (Rysunek 3D,E). Obrazy wymagały uważnej interpretacji, ponieważ na dnie każdej studni, poza obszarem przytwierdzenia do sieci, rosła również monowarstwa komórek nowotworowych. Aby uniknąć nakładania się sygnałów fluorescencyjnych z monowarstwy komórek raka, preferowano obrazowanie sieci w stanie zawieszenia w pożywce.
Brak sygnału fluorescencyjnego w 14. dniu można uznać za niepowodzenie iniekcji. Zaobserwowano, że komórki nowotworowe początkowo rozprzestrzeniały się po powierzchni sieci większej podczas pierwszych 7 dni, lecz z czasem gromadziły się, tworząc guzy (Rysunek 3A-D). Pomiar zastępczy obciążenia nowotworowego między próbkami stanowiła szybkość zmiany koloru pożywki hodowli sieci z czerwonego na żółty (Rysunek 3F). Wykorzystano obrazowanie fluorescencyjne, ocenę histologiczną oraz badanie makroskopowe, aby potwierdzić wzrost guza i żywotność tkanki sieci po 50 dniach kokultury (Rysunek 4).
<img alt="Schemat eksperymentu barwienia tkanek; Krok 1 do 3 iniekcji strzykawką do analizy komórkowej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66031/66031fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Ilustracja ogólnych kroków protokołu. (A) Krok 1: Przygotowanie sieci otrzewnej; (B) Krok 2: iniekcja komórek nowotworowych; (C) Krok 3: ustanowienie mikrośrodowiska komórek nowotworowych w sieci otrzewnej. (Rycina przygotowana w BioRender.com). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66031/66031fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Proces inżynierii tkankowej; obejmuje pobranie próbki, pomiar, hodowlę komórkową i mikroskopię fluorescencyjną." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66031/66031fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Przygotowanie i wstrzyknięcie komórek nowotworowych do sieci wielkopłucnej. (A) Sieć wielkopłucna jest pocięta na kawałki o wymiarach 1x1 cm. (B) Każdy fragment umieszcza się w studzience płytki 24-dołkowej i pokrywa 500 μL pożywki. (C) Wstrzykiwanie komórek nowotworowych do fragmentu sieci wielkopłucnej. (D) Po wstrzyknięciu obserwuje się smugę fluorescencyjnych komórek nowotworowych. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66031/66031fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Obrazy mikroskopowe agregacji komórek w czerwonej fluorescencji; obejmują dołki testowe dla interakcji związków." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66031/66031fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Reprezentatywne obrazy po 14 i 25 dniach kokultury. (A-C) Reprezentatywne obrazy po 14 dniach kokultury: (A) kontrast fazowy, (B) kanał mCherry, (C) obraz nałożony. (D-E) Reprezentatywne obrazy po 25 dniach kokultury. (F) Zmiana koloru medium z różowego na żółty wskazuje na pomyślną iniekcję komórek nowotworowych i ustanowienie kokultury. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66031/66031fig03large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Disekcja i histologia tkanki tłuszczowej; preparaty mikroskopowe tkanki tłuszczowej, analiza struktury komórkowej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66031/66031fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Morfologia makroskopowa oraz barwienie hematoksyliną i eozyną (H&amp;E). (A,B) Reprezentatywna morfologia makroskopowa ko-kultur w 50. dniu; strzałki wskazują miejsca wzrostu komórek raka jajnika mCherry+. (C,D) Reprezentatywne barwienie H&amp;E ko-kultur w 50. dniu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66031/66031fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Ten protokół opisuje ustanowienie trójwymiarowego (3D) modelu ex vivo interakcji komórka rakowa - sieć komórkowa. Model ten stanowi platformę do wyjaśnienia mechanizmów pronowotworowych w niszy tkanki tłuszczowej oraz do testowania nowych terapii.

Model ex vivo przerzutów do otrzewnej raka jajnika z wykorzystaniem ludzkiej sieci

Ovarian cancer is the deadliest gynecologic malignancy. The omentum plays a key role in providing a supportive microenvironment to metastatic ovarian ...

W obecnych badaniach wykorzystuje się systemy zimnych hodowli składające się z izolowanych adipocytów i komórek raka jajnika. Te adipocyty są różnicowane in vitro od preadipocytów. Komórki te są następnie oddzielane przez wkładkę Transwell i dlatego nie mają bezpośredniego kontaktu między komórkami.Ta metoda hodowli ex vivo oferuje model do badania bezpośredniej interakcji komórek nowotworowych z mikrośrodowiskiem tłuszczowym. Nasz model zachowuje strukturę ludzkiej sieci komórkowej, a tym samym utrzymuje różne typy komórek, które zwykle znajdują się w tym narządzie. Oprócz adipocytów w skład tych komórek wchodzą fibroblasty wspomagające, a także komórki odpornościowe.Model ten utrzymuje również te komórki w ich wrodzonej macierzy. Model ten stanowi doskonałą platformę do opracowywania i oceny nowatorskich podejść terapeutycznych do celowania w przerzutowe komórki nowotworowe w tej niszy. Na początek wyjmij świeżo wyciętą ludzką sieć z pojemnika zbiorczego wewnątrz okapu z przepływem laminarnym.Zanurz sieć w PBS, aby delikatnie zmyć resztki krwi lub zanieczyszczenia. Za pomocą skalpela i kleszczy pokrój tkankę na kawałki. Umieść kawałki sieci w indywidualnych dołkach 24-dołkowej płytki hodowlanej.Następnie napełnij studzienki 500 mikrolitrami pożywki hodowlanej sieci komórkowej. Dodaj 10 mililitrów sterylnego PBS do kolby hodowlanej zawierającej 75% zlejących się ludzkich komórek raka jajnika mCherry-dodatnich. Delikatnie kołysz kolbą, aby umyć komórki.Usuń PBS i dodaj trzy mililitry 0,05% trypsyny-EDTA. Delikatnie kołysz kolbą hodowlaną, aby równomiernie rozprowadzić trypsynę-EDTA na przyłączonych komórkach. Następnie umieść kolbę w inkubatorze na pięć minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza pod 5% dwutlenkiem węgla.Następnie wyjąć kolbę z inkubatora. Teraz dotknij kolby hodowlanej, aby całkowicie odłączyć komórki, a następnie dodaj trzy mililitry pożywki hodowlanej sieci komórkowej, aby zneutralizować trypsynę. Kilkakrotnie odpipetować zawiesinę komórek, aby dobrze ją wymieszać.Przenieś zawiesinę do 15-mililitrowej stożkowej rurki. Odwirować zawiesinę o stężeniu 1,200 G przez pięć minut w temperaturze 24 stopni Celsjusza. Teraz odpipetuj supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w sześciu mililitrach świeżej pożywki hodowlanej sieci komórkowej.Weź 10 mikrolitrów zawiesiny komórek, aby policzyć komórki za pomocą licznika komórek. Rozcieńczyć zawiesinę komórkową świeżą pożywką hodowlaną do wymaganej gęstości. Za pomocą strzykawki o pojemności jednego mililitra pobrać zawiesinę komórek rakowych.Podłączyć igłę o rozmiarze 26 do strzykawki. Teraz użyj pary małych kleszczy chirurgicznych, aby podnieść kawałek pociętej sieci i umieścić ją w osobnym sterylnym naczyniu. Następnie wstrzyknąć około 100 mikrolitrów zawiesiny komórek rakowych do tkanki.Alternatywnie wymieszaj równe objętości rozmrożonej macierzy błony podstawnej z kulturą sieci komórkowej. Umieścić mieszaninę na lodzie do momentu wstrzyknięcia. Po zanurzeniu kawałków sieci w mieszance matrycowej w dołkach płytki hodowlanej, inkubować płytkę przez 20 minut.Następnie wyjmij płytkę z inkubatora. Gdy mieszanina zestale się, wstrzyknij kawałki sieci z komórkami rakowymi. Potwierdź udane wstrzyknięcie komórek rakowych za pomocą obrazowania fluorescencyjnego.Smuga sygnału fluorescencyjnego może być widoczna w miejscach wstrzyknięcia jako potwierdzenie. Aby ułatwić kohodowlę komórek sieci i komórek rakowych, dodawaj od 500 do 200 mikrolitrów świeżej pożywki co 48 do 72 godzin. Wreszcie, za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego, monitoruj wzrost guzów raka jajnika.Wzrost guza może być widoczny w ciągu dwóch tygodni. Komórki raka jajnika zostały pomyślnie zintegrowane z fragmentami sieci do 14 dnia. Komórki rakowe początkowo rozprzestrzeniają się po powierzchni sieci w pierwszym tygodniu.Z biegiem czasu komórki gromadziły się, tworząc guzy. Obciążenie guzem zostało potwierdzone zmianą koloru sieci środkowej, która zmieniła kolor z czerwonego na żółty.

an-ex-vivo-model-ovarian-cancer-peritoneal-metastasis-using-human

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Opisany tutaj test oczyszczania mezotelium wykorzystuje komórki znakowane fluorescencyjnie oraz mikroskopię wideo poklatkową do wizualizacji i ilościowego pomiaru interakcji między wielokomórkowymi sferoidami raka jajnika a monowarstwami komórek mezoteliów. Test ten modeluje wczesne etapy przerzutowania raka jajnika.

Test oczyszczania mezotelialnego in vitro modelujący wczesne etapy przerzutowania raka jajnika

W tym filmie demonstrujemy rozwój trójwymiarowego modelu in vitro wyściółki jamy otrzewnej. Ta kultura organotypowa może pomóc w badaniu adhezji, inwazji i proliferacji komórek raka jajnika.

Modelowanie przerzutów raka jajnika w błonie śluzowej jamy otrzewnej: metoda tworzenia modelu 3D wyściółki otrzewnej in vitro

Ten film opisuje protokół izolacji pierwotnych ludzkich komórek międzybłonka od próbki ludzkiej sieci komórkowej. Komórki międzybłonka można wykorzystać do stworzenia modelu raka jajnika in vitro w celu zbadania adhezji, inwazji i proliferacji komórek raka jajnika.

Izolacja komórek międzybłonkowych: technika izolowania pierwotnych komórek międzybłonka z próbki ludzkiej tkanki sieci

W tym filmie tworzymy ex vivo hodowlę narządów omentalnych pokrytą komórkami raka jajnika wykazującymi ekspresję GFP, aby zbadać kolonizację raka jajnika w obrębie eksplantatu jajnika. Protokół ten analizuje struktury komórek odpornościowych w sieci znane jako mleczne plamki, które sprzyjają przerzutom.

Modelowanie kolonizacji komórek raka jajnika sieci komórkowej: metoda ex vivo do ustalenia kolonizacji plamki mlecznej znakowanych fluorescencyjnie komórek raka jajnika w mysich eksplantatach sieci

Ten film opisuje protokół tworzenia mysiego modelu eksperymentalnego do badania rozwoju guza i przerzutów do otrzewnej. Ten model raka jajnika jest generowany przez ortotopową inokulację ludzkich komórek nabłonkowego raka jajnika do jajników samicy myszy.

Ortotopowa inokulacja komórek raka jajnika do mysiego jajnika: procedura mająca na celu stworzenie mysiego modelu raka jajnika do badania rozsiewu komórek w otrzewnie

Przedstawiamy protokół, który implementuje zarówno podejścia in vivo, jak i ex vivo do badania kolonizacji tkanki tłuszczowej otrzewnowej przez raka jajnika, szczególnie sieci komórkowej. Ponadto przedstawiamy protokół ilościowego i analitycznego oznaczania struktur komórek odpornościowych w sieci znanych jako plamki mleczne, które sprzyjają przerzutom tkanki tłuszczowej otrzewnej.

Metody in vivo i ex vivo do badania przerzutowej kolonizacji raka jajnika struktur mlecznej w tkance tłuszczowej otrzewnej

Przerzuty raka jajnika charakteryzują się licznymi rozlanymi zmianami wewnątrzotrzewnowymi, tak że dokładne wizualne określenie obciążenia guzem jest trudne.  W niniejszym artykule opisano metodę ilościowego oznaczania obciążenia guzem przerzutowym in situ i ex vivo przy użyciu komórek nowotworowych znakowanych białkiem czerwonej fluorescencji (RFP) i obrazowania optycznego.

Kwantyfikacja przerzutów do raka jajnika do zatrzewnej

Tutaj prezentujemy protokół do budowy trójwymiarowego modelu in vitro wyściółki jamy otrzewnej, składającego się z pierwotnych ludzkich komórek międzybłonka i fibroblastów pokrytych macierzą zewnątrzkomórkową, jako narzędzie do badania adhezji, inwazji i proliferacji komórek raka jajnika.

Modelowanie wczesnych etapów rozsiewu raka jajnika w organotypowym posiewie ludzkiej jamy otrzewnowej

Aby wyjaśnić wieloetapowy proces rozprzestrzeniania się raka jajnika w otrzewnej, obecne badanie przedstawia mysi eksperymentalny model pierwotnego rozwoju guza i przerzutów do otrzewnej poprzez ortotopową inokulację tymi komórkami nowotworowymi.<br...

Mysi eksperymentalny model pierwotnego rozwoju guza i przerzutów do otrzewnej za pomocą ortotopowej inokulacji komórkami raka jajnika

Ten manuskrypt opisuje rozwój modelu zwierzęcego, który pozwala na bezpośrednie testowanie wpływu niedotlenienia guza na przerzuty i rozszyfrowywanie mechanizmów jego działania. Chociaż opisane tutaj eksperymenty koncentrują się na mięsaku Ewinga, podobne podejście można zastosować do innych typów nowotworów.

In vivo (in vivo) Model do badania wpływu hipoksji na przerzuty nowotworu

Poznaj trójwymiarowy model ex vivo interakcji komórek raka jajnika z siecią ludzką. Ta metoda pozwala badać mechanizmy prozapalne w niszy tłuszczowej i testować nowe terapie.

Model ex vivo przerzutów do otrzewnej raka jajnika z wykorzystaniem ludzkiej sieci

Przeglądaj więcej filmów