Name: Technika wysokoprzepustowa w czasie rzeczywistym do ilościowego określania tworzenia się pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili w ludzkich neutrofilach (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-01T13:20:00.000+00:00
Duration: 7 min 19 s
Description: Poznaj zautomatyzowaną metodę wysokoprzepustową do ilościowego określania tworzenia się pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili w ludzkich neutrofilach. Technika wykorzystuje podwójne barwniki do precyzyjnego śledzenia NET w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Sekcji Obrazowania Światłem w Biurze Nauki i Technologii w Narodowym Instytucie Zapalenia Stawów oraz Chorób Układu Mięśniowo-Szkieletowego i Skóry Narodowych Instytutów Zdrowia. Badania te były wspierane przez Intramural Research Program Narodowego Instytutu Zapalenia Stawów oraz Chorób Układu Mięśniowo-Szkieletowego i Skóry Narodowych Instytutów Zdrowia (ZIA AR041199).

Neutrofile od zdrowych ochotników pobrano po uzyskaniu świadomej zgody zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez Instytucjonalną Komisję Recenzencką (IRB) Narodowych Instytutów Zdrowia (NIH). Protokół jest zgodny z wytycznymi komitetu etyki badań nad ludźmi NIH.
1. Barwienie neutrofilów i przygotowanie płytki do analizy
<ol>
	<li>Pobrać krew obwodową po uzyskaniu odpowiedniej pisemnej zgody, zgodnie z wytycznymi danej instytucji, i wyizolować neutrofile dowolną preferowaną metodą. Przykładowo, metoda z użyciem Ficoll-dextranu10,11 jest powszechnie stosowaną metodą izolacji neutrofili z ludzkiej krwi obwodowej. 
	UWAGA: Chociaż opisana tutaj metoda wykorzystuje neutrofile ludzkie, podobny protokół można zastosować do analizy neutrofili mysich.</li>
	<li>Resuspendować neutrofile w pożywce Roswell Park Memorial Institute (RPMI; patrz Tabela materiałów) 1640 do stężenia 2,0 x 106 neutrofili/mL i przenieść zawiesinę neutrofili do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 mL. 
	UWAGA: Zazwyczaj nie dodajemy płodowej surowicy bydlęcej (FBS) do pożywek hodowlanych, ponieważ albuminy obecne w FBS mogą ograniczać tworzenie NET12, a termostabilna nukleaza w FBS może degradować NET13.</li>
	<li>Dodać przepuszczalny przez błony czerwony barwnik DNA (patrz Tabela materiałów) w ilości 1 µL na 1,5 mL zawiesiny neutrofili.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 min w ciemności. Centryfugować przy 2500 x g przez 5 min w temperaturze pokojowej i usunąć nadsącz.</li>
	<li>Resuspendować neutrofile w 1 mL RPMI, następnie centryfugować przy 2500 x g przez 5 min w temperaturze pokojowej i usunąć nadsącz. Powtórzyć 2x (łącznie 3x przemyć).</li>
	<li>Resuspendować neutrofile w 1 mL RPMI i policzyć przy użyciu licznika komórek. Rozcieńczyć zawiesinę neutrofili do stężenia 1,5 x 105 neutrofili/mL.</li>
	<li>Dodać 4 µL nieprzepuszczalnego przez błony zielonego barwnika DNA (patrz Tabela materiałów), uprzednio rozcieńczonego 1:100, na 1 mL zawiesiny neutrofili.</li>
	<li>Nanieść do każdego dołka przezroczystej płytki 96-dołkowej przeznaczonej do hodowli tkanek (patrz Tabela materiałów) po 100 µL zawiesiny neutrofili. Każdą warunek ustawić w trzech powtórzeniach. 
	UWAGA: Wykazaliśmy wcześniej7, że w tej metodzie nie ma różnic w tworzeniu i ilościowym określaniu NET, niezależnie od tego, czy neutrofile zostaną umieszczone na płytkach z powłoką z poli-L-lizyny, czy bez niej. W związku z tym zastosowanie płytki przeznaczonej do hodowli tkanek jest wystarczające dla tej metody.</li>
	<li>Dodać do odpowiednich dołków 100 µL RPMI zawierającego odczynniki stymulujące z inhibitorem lub bez, bądź każdy inny interesujący odczynnik. Zawsze stosować dołki kontroli pozytywnej, dodając 500 nM mirystyleanu 13-octanu forbolu (PMA) lub 2,5 µM jonoforu wapniowego (A23187); w niniejszym przypadku użyto inhibitora AKT w stężeniu 30 µM.</li>
	<li>Umieścić płytkę w systemie analizy żywych komórek (patrz Tabela materiałów) znajdującym się w inkubatorze z 5% CO2. 
	UWAGA: Kilka minut po tym kroku na górnej i dolnej powierzchni płytki może pojawić się kondensacja. Może ona utrudniać prawidłowe obrazowanie. Przed rozpoczęciem skanowania dokładnie wytrzeć i usunąć kondensację. Włożyć płytkę do urządzenia, uruchomić oprogramowanie, wprowadzić protokół skanowania, a następnie wytrzeć płytkę bezpośrednio przed pierwszym skanowaniem.</li>
</ol>
2. Skanowanie płytki w celu wizualizacji neutrofili tworzących NET
<ol>
	<li>Uruchom oprogramowanie (patrz Tabela materiałów (w celu uzyskania szczegółowych informacji o oprogramowaniu). Uruchom Dodaj naczynie poprzez naciśnięcie znaku + w lewym górnym rogu.</li>
	<li>Wybierz Skanowanie zgodnie z harmonogramemWybierz Nowy. 
	UWAGA: Po utworzeniu tego elementu należy przeprowadzić ten sam protokół skanowania, wybierając Kopiuj poprzednie oraz wybranie zapisanego protokołu na następnym ekranie.</li>
	<li>Wybierz StandardUstaw parametry skanowania w następujący sposób: opcje Cell-by-Cell: żadne; kanały obrazowania: faza, zielony (czas akwizycji: 200 ms), czerwony (czas akwizycji: 400 ms); obiektyw: 20x.</li>
	<li>Wybierz z listy płytkę, która jest używana. Wybierz lokalizację naczynia, w której należy umieścić płytkę na tacy systemu obrazowania żywych komórek.</li>
	<li>Wybierz studzienki, w których znajdują się próbki, i określ liczbę obrazów do wykonania dla każdej studzienki. Na podstawie liczby obrazów na studzienkę wygeneruj szacowany czas skanowania płytki. Zazwyczaj wystarczające są 4 obrazy na studzienkę, jednak liczba ta może się różnić w zależności od warunków i częstotliwości skanowania.</li>
	<li>Wprowadź informacje dla każdej studzienki (np. typ komórek i związek), klikając Utwórz mapę płytki w celu nadania nazwy badaniu. 
	UWAGA: Mapa płytki może zostać przygotowana i zapisana wcześniej przy użyciu edytora map płytki w oprogramowaniu. Zapisane dane mapy płytki można zaimportować podczas tego kroku. W razie potrzeby można pominąć wprowadzanie informacji o mapie płytki i wykonać tę czynność później. Dane można uzyskać również bez wprowadzania informacji o układzie płytki. Zaleca się jednak wprowadzenie informacji o płytce, aby ułatwić późniejszą analizę.</li>
	<li>Na następnym ekranie wybierz Podstawowy analizator jako typ analizy i wybrać Protokół analizy z listy rozwijanej, która wyświetla wcześniej używane definicje analiz (nie protokoły skanowania). Wartości odmieszania widmowego (spectral unmixing) dla kanałów zielonego i czerwonego mogą pozostać na poziomie 0,0%. 
	UWAGA: Ten krok można pominąć, jeśli jest to pożądane.</li>
	<li>Zaplanuj skanowanie. W tym eksperymencie należy skanować co 15–20 minut przez 8 godzin. Ustaw czas rozpoczęcia skanowania, przesuwając biały i szary pasek znajdujący się na górze ekranu. 
	UWAGA: Należy unikać zbyt częstego skanowania, w przeciwnym razie urządzenie może nie działać prawidłowo z powodu przegrzania. Czas skanowania nie powinien przekraczać 12 h na dobę. W przypadku zbyt częstego skanowania może pojawić się alert.</li>
	<li>Sprawdź ustawienia skanowania na następnym ekranie i naciśnij Dodaj do harmonogramu aby rozpocząć skanowanie. Należy poczekać, aż zostanie zeskanowany pierwszy zestaw obrazów, aby potwierdzić, czy wszystko działa prawidłowo.
	<ol>
		<li>Czasami komórki mogą nie być odpowiednio ustawione w ogniskowej. W takim przypadku należy sprawdzić, czy występuje kondensacja (i w razie potrzeby ją usunąć), czy płytka jest prawidłowo umieszczona w tacy lub czy pozycja płytki została poprawnie określona itd. Jeśli komórki nadal unoszą się w zawiesinie i nie opadły na dno studzienki, należy odczekać około 5 min przed rozpoczęciem skanowania.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Ustawienie definicji analizy w celu kwantyfikacji NET
<ol>
	<li>Otwórz badanie (naczynie) do analizy w zakładce View. Naciśnij Launch Analysis po lewej stronie ekranu. Wybierz Create New Analysis Definition.
	<ol>
		<li>Jeśli analiza była przeprowadzana wcześniej, użyj tej samej definicji analizy z niewielkimi zmianami, wybierając Copy Existing Analysis Definition. W takim przypadku przejdź do kroku 3.3. Jeśli używasz analizy bez żadnych zmian, wybierz Use Existing Analysis Definition; nie jest to zalecane, ponieważ poziom fluorescencji może różnić się między badaniami w różne dni i zazwyczaj konieczne są niewielkie korekty.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wybierz Basic Analyzer. Użyj wszystkich kanałów obrazu: Phase, Green, Red oraz Overlap. 
	UWAGA: Chociaż do zliczania NET zazwyczaj używamy masek obiektów zielonych i czerwonych, maska obiektów overlap jest użyteczna, gdy istotne są zanieczyszczenia (debris). W takich przypadkach liczba obiektów overlap będzie używana jako licznik zamiast liczby obiektów zielonych (patrz krok 3.9). Jeśli liczba obiektów overlap zostanie użyta zamiast liczby obiektów zielonych, wszystkie sygnały czerwone muszą zostać poprawnie zliczone. Dostosuj ustawienia sygnału czerwonego tak, aby zliczać wszystkie obiekty czerwone o niskim sygnale na obrazach wykonanych w późniejszych punktach czasowych, ale nie zliczać zanieczyszczeń.</li>
	<li>Wybierz 6–8 reprezentatywnych obrazów próbek do trenowania. Dla niniejszego eksperymentu uwzględnij następujące obrazy: 
	Obrazy wykonane między 0 a 20 min, aby zoptymalizować ustawienia sygnału zielonego i skompensować subtelne sygnały zielone, które mogą być generowane w neutrofilach nietworzących NET 
	Obrazy maksymalnej ilości NET z kontrolą pozytywną, wykonane między 3 a 6 h (czas zależy od zastosowanej stymulacji), aby zoptymalizować ustawienia sygnału zielonego w celu zdefiniowania neutrofilów tworzących NET 
	Obrazy wykonane około 1 h w celu zliczenia całkowitej liczby komórek (zbarwionych czerwonym barwnikiem), ponieważ czerwony sygnał jądrowy jest najsilniejszy około 1 h (kiedy wszystkie komórki opadną na dno dołka) i stopniowo słabnie z powodu śmierci komórek. 
	Obrazy zawierające zanieczyszczenia, aby wykluczyć je z zliczania.</li>
	<li>Ustaw definicję analizy. Obiekty czerwone i zielone odpowiadają odpowiednio jądrom wszystkich neutrofili oraz tych, które tworzą NET. Zacznij od następnego przykładu i naciśnij Preview Current lub Preview All, a następnie moduluj każdy parametr, aby zoptymalizować wyniki: 
	Dla Green: Segmentation- Background subtraction: Top-Hat; Radius: 100 µM; Threshold: 0.3 GCU; Edge split: On; Edge sensitivity: -20; Cleanup -Hole fill: 100 µm2; Adjust size 0 pixels; Filters- Area: min 20 µm2, max 500 µm2; Eccentricity: max 0.97; Mean Intensity: min 1.00 
	​Dla Red: Segmentation- Background subtraction: Top-Hat; Radius: 10 µM; Threshold: 1.0 GCU; Edge split: ON; Edge sensitivity: -50; Cleanup-Hole fill: 50 µm2; Adjust size 0 pixels; Filters- Area: min 20 µm2, max 400 µm2; Mean Intensity: min 1.5.
	<ol>
		<li>Jeśli w neutrofilach, które nie powinny tworzyć NET (np. niestymulowane neutrofile w 0 min z jądrami wielopłatowymi), pojawi się nadmierny sygnał zielony, może to wynikać z prześwitu sygnału czerwonego wykrywanego w kanale zielonym. W takim przypadku wróć do kroku 3.1, otwórz Image Layers po lewej stronie ekranu i usuń sygnały czerwone z kanału zielonego za pomocą funkcji Spectral Unmixing.</li>
		<li>Inną opcją jest przygotowanie jednego dołka do pojedynczego barwienia czerwonym barwnikiem jądrowym, aby ustalić, jaka część sygnału czerwonego powinna zostać usunięta z kanału zielonego. Z drugiej strony, prześwit sygnału zielonego do kanału czerwonego zazwyczaj nie wpływa na analizy. 
		UWAGA: Nie ma znaczenia, czy czułość na sygnał czerwony jest niska i nie wszystkie sygnały czerwone są zarejestrowane na obrazach wykonanych w późniejszych punktach czasowych (np. w punkcie 6 h). Maksymalna liczba zliczonych obiektów czerwonych na każdym obrazie jest uznawana za całkowitą liczbę neutrofili na obrazie i zostanie użyta jako mianownik w kroku 3.9. Zazwyczaj czerwone sygnały jądrowe osiągają szczyt około 1 h i stopniowo słabną z powodu śmierci komórek (Rycina 1B). Dlatego dostosuj ustawienia sygnału czerwonego, aby poprawnie zliczać obiekty czerwone na obrazach z maksymalnymi sygnałami czerwonymi.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wybierz czasy skanowania i dołki do analizy. Zazwyczaj należy przeanalizować wszystkie punkty czasowe i dołki. Nadaj etykietę definicji analizy.</li>
	<li>Sprawdź podsumowanie i uruchom analizę. Analiza trwa kilka godzin (czas trwania zależy od liczby punktów czasowych i dołków). Po uruchomieniu nazwa definicji analizy zostanie wyświetlona pod nazwą badania w zakładce View, a po zakończeniu pojawi się pełna data.</li>
	<li>Po zakończeniu otwórz przeanalizowane badanie, dwukrotnie klikając nazwę definicji analizy. Otwórz Layers po lewej stronie ekranu i sprawdź, czy każda komórka jest poprawnie zaznaczona. Jeśli nie jest poprawnie zaznaczona, wróć do kroku 3.1 i powtórz kolejne kroki.</li>
	<li>Kliknij Graph Metrics po lewej stronie ekranu, aby wyeksportować dane. Wybierz Green Count, Red Count lub Overlap Count (Per Image), a następnie wybierz punkty czasowe i dołki do eksportu. W przypadku wyboru grupowania wybierz Plate Map Replicates, jeśli wszystkie dołki zostały poprawnie określone podczas skanowania.</li>
	<li>Wyeksportuj dane. Oblicz procent komórek tworzących NET dla każdego stanu/punktu czasowego za pomocą następującego równania, korzystając z odpowiedniego oprogramowania. 
	<img alt="Wzór obliczania procentu NET, stosunek liczby obiektów zielonych do czerwonych, równanie edukacyjne." src="/files/ftp_upload/66051/66051eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 1"> 
	UWAGA: Powodem, dla którego mianownikiem jest maksymalna liczba obiektów czerwonych, jest fakt, że liczba obiektów czerwonych osiąga szczyt około 1 h i stopniowo spada z powodu śmierci komórek.</li>
</ol>

Quantifying NET Formation Using Dual-Dye Live Cell Analysis

<ol><li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li>
<li>Wigerblad, G., Kaplan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+in+systemic+autoimmune+and+autoinflammatory+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps in systemic autoimmune and autoinflammatory diseases.</a> Nat Rev Immunol. 23 (5), 274-288 (2022).</li>
<li>Wagner, D. D., Heger, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thromboinflammation%3A+From+atherosclerosis+to+COVID-19%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Thromboinflammation: From atherosclerosis to COVID-19.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 42 (9), 1103-1112 (2022).</li>
<li>Njeim, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NETosis+contributes+to+the+pathogenesis+of+diabetes+and+its+complications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">NETosis contributes to the pathogenesis of diabetes and its complications.</a> J Mol Endocrinol. 65 (4), R65-R76 (2020).</li>
<li>De Meo, M. L., Spicer, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+neutrophil+extracellular+traps+in+cancer+progression+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Immunol%22%5BJournal%5D)">The role of neutrophil extracellular traps in cancer progression and metastasis.</a> Semin Immunol. 57, 101595(2021).</li>
<li>Nakabo, S., Romo-Tena, J., Kaplan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+as+drivers+of+immune+dysregulation+in+autoimmune+diseases+with+skin+manifestations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Neutrophils as drivers of immune dysregulation in autoimmune diseases with skin manifestations.</a> J Invest Dermatol. 142 (3 Pt B), 823-833 (2022).</li>
<li>Gupta, S., Chan, D. W., Zaal, K. J., Kaplan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+real-time+imaging+technique+to+quantify+NETosis+and+distinguish+mechanisms+of+cell+death+in+human+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">A high-throughput real-time imaging technique to quantify NETosis and distinguish mechanisms of cell death in human neutrophils.</a> J Immunol. 200 (2), 869-879 (2018).</li>
<li>Nakabo, S., Kaplan, M. J., Gupta, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+neutrophils+undergoing+NET+formation+and+distinguishing+mechanisms+of+neutrophil+cell+death+by+use+of+a+high-throughput+method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantification of neutrophils undergoing NET formation and distinguishing mechanisms of neutrophil cell death by use of a high-throughput method.</a> Methods Mol Biol. 2543, 129-140 (2022).</li>
<li>Singh, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moonlighting+chromatin%3A+when+DNA+escapes+nuclear+control%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Moonlighting chromatin: when DNA escapes nuclear control.</a> Cell Death Differ. 30 (4), 861-875 (2023).</li>
<li>Carmona-Rivera, C., Kaplan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+and+quantification+of+NETosis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">Induction and quantification of NETosis.</a> Curr Protoc Immunol. 115, 14.41.11-14.41.14 (2016).</li>
<li>Hsu, A. Y., Peng, Z., Luo, H., Loison, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+human+neutrophils+from+whole+blood+and+buffy+coats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of human neutrophils from whole blood and buffy coats.</a> J Vis Exp. (175), 62837(2021).</li>
<li>Neubert, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+and+serum+albumin+inhibit+in+vitro+formation+of+neutrophil+extracellular+traps+%28NETs%29%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Serum and serum albumin inhibit in vitro formation of neutrophil extracellular traps (NETs).</a> Front Immunol. 10, 12(2019).</li>
<li>von Kockritz-Blickwede, M., Chow, O. A., Nizet, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fetal+calf+serum+contains+heat-stable+nucleases+that+degrade+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Fetal calf serum contains heat-stable nucleases that degrade neutrophil extracellular traps.</a> Blood. 114 (25), 5245-5246 (2009).</li>
<li>Zhao, W., Fogg, D. K., Kaplan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+image-based+quantitative+method+for+the+characterization+of+NETosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel image-based quantitative method for the characterization of NETosis.</a> J Immunol Methods. 423, 104-110 (2015).</li>
<li>Papayannopoulos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+in+immunity+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps in immunity and disease.</a> Nat Rev Immunol. 18 (2), 134-147 (2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Obecne metody ilościowego oznaczania NET ex vivo mają kilka wad, które ograniczają naszą zdolność do badania neutrofili, NET i potencjalnych celów terapeutycznych w sposób bezstronny i wysokoprzepustowy10,14. Na przykład bezpośrednie liczenie komórek tworzących NET po barwieniu immunofluorescencyjnym, uważane za złoty standard w oznaczaniu ilościowym NET, jest niskoprzepustowe i zależy od subiektywnego poglądu operatora. Test płytkowy wykrywający fluores...

Pułapki zewnątrzkomórkowe neutrofili (NET) to przypominające sieć struktury chromatyny wydzielane z neutrofili w odpowiedzi na różne bodźce zapalne. NET składają się z DNA, histonów i różnych białek/peptydów przeciwdrobnoustrojowych, które zatrzymują i zabijają zakaźne patogeny oraz wywołują reakcje zapalne1.
Chociaż NET są korzystne dla obrony gospodarza przed patogenami, zwróciły uwagę jako potencjalny czynnik różnych chorób autoimmunologicznych2, thrombosis3, metabolic diseases4, oraz przerzutowego wzrostu nowotworów5. W związku z tym hamowanie tworzenia NET jest potencjalną opcją terapeutyczną dla tych chorób. Jednak pomimo kilku obiecujących cząsteczek ukierunkowanych na NETs, które są w fazie rozwoju6, nadal nie ma zatwierdzonej terapii, która konkretnie wpływa na ten mechanizm. Jest to, przynajmniej częściowo, spowodowane brakiem obiektywnych, bezstronnych, odtwarzalnych i wysokoprzepustowych metod kwantyfikacji tworzenia NET.
Ustaliliśmy i opisaliśmy nową metodę wykorzystującą dwukolorową platformę obrazowania żywych komórek7,8. Obrazy poklatkowe neutrofili barwionych barwnikiem jądrowym przepuszczalnym dla błony i barwnikiem DNA nieprzepuszczalnym dla błony są analizowane przez oprogramowanie, a liczba neutrofili przed i po utworzeniu NET jest liczona w wielu punktach czasowych. Ponieważ integralność błony plazmatycznej jest tracona podczas tworzenia NET przez regulację demontażu Laminy B za pośrednictwem PKCα i CDK4/6 Lamin A/C za pośrednictwem PKCα 9, neutrofile tworzące NET są barwione przez nieprzepuszczalny dla błony barwnik DNA, podczas gdy zdrowe neutrofile nie są. Metoda ta przezwycięża problemy związane z wcześniej opisanymi technikami ilościowego określania powstawania NET i zapewnia bezstronną, wysokowydajną, powtarzalną i dokładną kwantyfikację NET w sposób zautomatyzowany.

<table><tbody><tr><td>Inhibitor AKT</td><td>Calbiochem</td><td>124028</td><td></td></tr><tr><td>przezroczysta 96-dołkowa płytka</td><td>Corning</td><td>3596</td><td></td></tr><tr><td>System analizy żywych komórek</td><td>Sartorius</td><td>N/A</td><td>Incucyte Software (v2019B)</td></tr><tr><td>Nieprzepuszczalny dla błony zielony barwnik DNA&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S7020</td><td></td></tr><tr><td>Nuclear red dye</td><td>Enzo</td><td>ENZ-52406</td><td>Granulki neutrofili po zabarwieniu stają się niebieskawe.</td></tr><tr><td>Można stosować RPMI</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11835030</td><td>Phenol red containig RPMI.</td></tr></tbody></table>

technika wysokoprzepustowa w czasie rzeczywistym do ilościowego określania tworzenia się pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili w ludzkich neutrofilach

Real-Time High Throughput Technique to Quantify Neutrophil Extracellular Traps Formation in Human Neutrophils

Neutrofile to komórki z linii mieloidalnej, które stanowią kluczową część wrodzonego układu odpornościowego. Ostatnia dekada ujawniła dodatkowe kluczowe role, jakie neutrofile odgrywają w patogenezie raka, chorób autoimmunologicznych oraz różnych ostrych i przewlekłych stanów zapalnych, przyczyniając się do inicjacji i utrwalenia dysregulacji immunologicznej poprzez wiele mechanizmów, w tym tworzenie zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofili (NET), które są strukturami kluczowymi w obronie przeciwdrobnoustrojowej. Ograniczenia w technikach ilościowego określania powstawania NET w bezstronny, powtarzalny i skuteczny sposób ograniczyły naszą zdolność do dalszego zrozumienia roli neutrofili w zdrowiu i chorobach. Opisujemy zautomatyzowaną, wysokoprzepustową metodę pomiaru neutrofili ulegających powstawaniu NET w czasie rzeczywistym przy użyciu platformy obrazowania żywych komórek w połączeniu z podejściem podwójnego barwnika zależnym od przepuszczalności błony przy użyciu dwóch różnych barwników DNA do obrazowania wewnątrzkomórkowego i zewnątrzkomórkowego DNA. Metodologia ta jest w stanie pomóc w ocenie fizjologii neutrofili i testowaniu cząsteczek, które mogą być ukierunkowane na tworzenie NET.

Metoda ta umożliwia uzyskanie obrazów w kontraście fazowym, obrazów z czerwoną fluorescencją (barwnik przenikający przez błonę) oraz obrazów z zieloną fluorescencją (barwnik nieprzenikający przez błonę), wykonanych w każdym punkcie czasowym. Równolegle z procesem tworzenia NET obserwuje się zmiany morfologiczne w obrazach w kontraście fazowym i czerwonej fluorescencji, a po przerwaniu ciągłości błony można zaobserwować zieloną fluorescencję (Rycina 1). W tym teście neutrofile tworzące NET są...

Prezentujemy zautomatyzowaną, wysokoprzepustową metodę ilościowego oznaczania pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili (NET) przy użyciu systemu analizy żywych komórek, w połączeniu z zależnym od przepuszczalności błony metodą podwójnego barwnika.

Technika wysokoprzepustowa w czasie rzeczywistym do ilościowego określania tworzenia się pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili w ludzkich neutrofilach

Neutrophils are myeloid-lineage cells that form a crucial part of the innate immune system. The past decade has revealed additional key roles that ...

Nasze badania koncentrują się na neutrofilach, które są niezbędnymi pierwszymi ratownikami w układzie odpornościowym i odgrywają znaczącą rolę w różnych chorobach. W ciągu ostatnich dwóch dekad stało się jasne, że neutrofile przyczyniają się do rozwoju raka lub chorób immunologicznych i innych stanów zapalnych poprzez zakłócanie regulacji immunologicznej. Obejmuje to tworzenie zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofili, NET, struktur przypominających pajęczynę, które reagują na stan zapalny i mogą być celem terapii w tych chorobach.Jednak pomimo tego, że niektóre obiecujące cząsteczki ukierunkowane na NET są w fazie rozwoju, nadal nie ma zatwierdzonej terapii, która konkretnie wpływa na ten mechanizm. Jest to przynajmniej częściowo spowodowane brakiem obiektywnej, bezstronnej, powtarzalnej i wysokoprzepustowej metody kwantyfikacji tworzenia NET. Nasz protokół wykorzystuje dwukolorowe obrazowanie żywych komórek do analizy zachowania neutrofili przy użyciu przepuszczalnych i nieprzepuszczalnych dla błony barwników do precyzyjnego śledzenia powstawania NET.Metoda ta rozróżnia tworzenie NET i zdrowe neutrofile na podstawie integralności błony i zapewnia wyraźne różnicowanie typów śmierci komórki poprzez zmiany morfologiczne obserwowane w obrazowaniu z kontrastem fazowym. Metoda ta pozwala przezwyciężyć problemy związane z wcześniej opisanymi technikami ilościowego określania powstawania NET i zapewnia wydajną, powtarzalną i dokładną kwantyfikację NET w sposób zautomatyzowany. Metoda ta pomoże w opracowywaniu leków ukierunkowanych na neutrofile, dając możliwość badania przesiewowego wielu celów terapeutycznych pod kątem tworzenia NET w sposób wysokoprzepustowy.Po wyizolowaniu neutrofili z ludzkiej krwi obwodowej, należy je ponownie zawiesić w pożywce RPMI 1640 w 1,5-mililitrowej probówce wirówkowej. Dodaj jeden mikrolitr przepuszczalnego dla błony czerwonego barwnika DNA do 1,5 mililitra zawiesiny neutrofili i inkubuj w ciemności przez pięć minut. Odwirować zawiesinę neutrofili o sile 2,500 g przez pięć minut w temperaturze pokojowej.Po odwirowaniu wyjąć probówkę zawierającą granulowany neutrofil i odessać supernatant. Ponownie zawiesić neutrofile w jednym mililitrze RPMI i ponownie odwirować. Po ostatnim praniu ponownie zawieś neutrofile w jednym mililitrze RPMI.Dodaj niewielką objętość zawiesiny neutrofili do hemocytometru i policz je pod mikroskopem. Rozcieńczyć zawiesinę neutrofili do 1,5 razy 10 do piątej liczby neutrofili na mililitr za pomocą RPMI. Dodaj cztery mikrolitry od jednego do 100 wstępnie rozcieńczonych, nieprzepuszczalnych dla błony zielonego barwnika DNA do jednego mililitra zawiesiny neutrofili.Dozować 100 mikrolitrów zawiesiny neutrofili na studzienkę do klarownej płytki 96-dołkowej poddanej działaniu kultur tkankowych. Dodaj 100 mikrolitrów odczynników stymulujących zawierających RPMI z inhibitorem lub bez inhibitora do odpowiednich studzienek. Umieść płytkę w systemie do analizy żywych komórek umieszczonym w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla.Aby rozpocząć, uruchom oprogramowanie systemu analizy komórek na żywo. Naciśnij symbol plusa w lewym górnym rogu ekranu. , aby zainicjować dodawanie naczynia.Wybierz opcję Skanuj zgodnie z harmonogramem, a następnie wybierz opcję Nowy, aby uruchomić program skanowania. Wybierz opcję Standardowa. Następnie ustaw ustawienia skanowania jako opcje komórka po komórce na brak, a kanały obrazu na fazę, zielony i czerwony z odpowiednimi czasami akwizycji.Ustaw obiektyw na 20X. Z listy wybierz płytkę i wybierz położenie naczynia, w którym chcesz umieścić płytkę na tacy systemu obrazowania. Wybierz studzienki zawierające próbki i zdecyduj o liczbie obrazów do przechwycenia w każdym dołku.Informacje te automatycznie generują szacowany czas skanowania płyty. Kliknij przycisk Utwórz mapę płyt, aby wprowadzić informacje dla każdej studzienki, takie jak typ komórki i złożenie. Następnie nazwij badanie.Na kolejnym ekranie jako typ analizy należy wybrać analizator podstawowy, a z listy rozwijanej, która pokazuje poprzednio używane definicje analizy, wybierz definicję analizy. Pozostaw widmo niemieszania zarówno dla zielonego, jak i czerwonego na poziomie 0,0. Zaplanuj skanowanie tak, aby odbywało się co 15 do 20 minut przez osiem godzin.Przeciągnij biały i szary pasek u góry ekranu, aby ustawić czas rozpoczęcia skanowania. Na następnym ekranie przejrzyj ustawienia skanowania i naciśnij Dodaj do harmonogramu, aby rozpocząć skanowanie. Po zeskanowaniu, na karcie widoku otwórz naczynie do analizy, naciśnij przycisk Uruchom analizę po lewej stronie ekranu i wybierz opcję Utwórz nową definicję analizy.Wybierz podstawowy analizator i użyj kanałów obrazu fazowego, zielonego, czerwonego i nakładających się. Wybierz od sześciu do ośmiu reprezentatywnych przykładowych obrazów do trenowania. Aby skonfigurować definicję analizy, należy ustawić zielone obiekty na neutrofile tworzące zewnątrzkomórkowe pułapki neutrofili lub NET, a czerwone obiekty na jądra wszystkich neutrofili.Naciśnij Podgląd bieżący lub Podgląd wszystkiego i dostosuj każdy parametr, aby zoptymalizować wyniki. Wybierz czasy skanowania i dołki do analizy. Następnie należy podać etykietę definicji analizy.Przejrzyj podsumowanie i uruchom analizę. Po analizie należy dwukrotnie kliknąć nazwę definicji analizy, aby otworzyć analizowane badanie. Otwórz warstwy po lewej stronie ekranu i sprawdź, czy każda komórka jest poprawnie oznaczona.Kliknij opcję Metryki wykresu po lewej stronie ekranu, a następnie wybierz liczbę na obraz, aby uzyskać wartość zieloną. Wybierz punkty czasowe i studnie do wyeksportowania. W przypadku wyboru grupowania wybierz opcję Repliki mapy płyt, aby potwierdzić, że wszystkie dołki są poprawnie określone podczas skanowania, a następnie kliknij opcję Eksportuj dane.Podobnie wyeksportuj dane dla liczby czerwieni i liczby nakładania się. Korzystając z podanego równania, oblicz procent komórek tworzących NET dla każdego warunku i punktu czasowego. Przebieg formowania się NET w czasie jest wizualizowany poprzez wykreślenie procentowej zawartości neutrofili tworzących NET w każdym punkcie czasowym.Dodanie inhibitora AKT zablokowało tworzenie NET w neutrofilach stymulowanych PMA lub jonoforem wapnia, co pokazuje, że potencjalne cząsteczki ukierunkowane na tworzenie NET mogą być testowane w sposób wysokoprzepustowy przy użyciu tej metodologii.

real-time-high-throughput-technique-to-quantify-neutrophil

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ten film demonstruje technikę in vitro do generowania i izolowania neutrofili w pułapkach zewnątrzkomórkowych (NET). Neutrofile są izolowane z krwi obwodowej i stymulowane octanem mirystynianu forbolu (PMA) w celu wytworzenia NET. Podczas inkubacji neutrofile przechodzą proces śmierci komórki (NETosis) w celu uwolnienia NET zawierających zdekondensowaną chromatynę zmieszaną z ziarnistymi białkami cytoplazmatycznymi.

Technika in vitro do generowania ludzkich pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofilów

Ten film demonstruje indukcję i wizualizację zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofili lub NET w wstępnie oznakowanych neutrofilach przy użyciu surowicy pacjenta zawierającej przeciwciała cytoplazmatyczne anty-neutrofilowe. Co więcej, zastosowanie nieprzepuszczalnego barwnika DNA i mikroskopii fluorescencyjnej umożliwia wizualizację NET.

Indukcja i wizualizacja zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofili we wstępnie znakowanych neutrofilach

Testy o wysokiej przepustowości są prezentowane, które w połączeniu dostarczają doskonałych narzędzi do ilościowego oznaczania uwalniania NET z ludzkich neutrofili.

Wysokoprzepustowy pomiar uwalniania zewnątrzkomórkowego DNA i ilościowego tworzenia NET w ludzkich neutrofilach in vitro

Opisujemy metody izolowania neutrofili u psów z krwi pełnej i wizualizacji powstawania NET w żywych neutrofilach za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Opisano również protokoły ilościowego oznaczania powstawania NET i ekspresji cytrulinowanego histonu H3 (citH3) za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej.

In vitro Tworzenie zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofili u psów: analiza dynamiczna i ilościowa za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Tutaj prezentujemy protokół do generowania zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofili (NET) i obsługi NETQUANT, w pełni automatycznej opcji oprogramowania do ilościowego oznaczania NET w obrazach immunofluorescencyjnych.

Zautomatyzowana kwantyfikacja oparta na obrazie pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili przy użyciu NETQUANT

Ten protokół opisuje wysoce czuły i wysokoprzepustowy test pułapki zewnątrzkomórkowej neutrofili (NET) do półautomatycznego oznaczania ilościowego tworzenia ex vivo NET za pomocą immunofluorescencji trójwymiarowej mikroskopii konfokalnej. Protokół ten może być wykorzystany do oceny powstawania i degradacji NET po różnych bodźcach i może być wykorzystany do badania potencjalnych terapii ukierunkowanych na NET.

Wysokoprzepustowy test do oceny i ilościowego określania tworzenia pułapek zewnątrzkomórkowych w neutrofilach

Prezentowany tutaj jest protokół do indukcji i analizy in vitro zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofilowych (NET). Kwantyfikacja DNA, katelicydyny (LL37) i aktywności enzymów dostarczyła danych, które pokazują zmienność składu i morfologii NET indukowanych przez bodźce mikrobiologiczne i chemiczne w podobnie kontrolowanych warunkach.

Analiza morfologiczna i kompozycyjna pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili indukowanych bodźcami mikrobiologicznymi i chemicznymi

Ten zdefiniowany protokół opisuje podejście do mikroskopii wysokoprzepustowej w czasie rzeczywistym w celu wizualizacji i ilościowego określenia uwalniania ludzkich neutrofili zewnątrzkomórkowych (NET) in vitro. Powtarzalna metoda pozwala na zbadanie charakterystyki i kinetyki uwalniania NET po stymulacji odrębnymi induktorami NETozy oraz umożliwia ocenę farmakologii antagonistów NETozy.

Wysokoprzepustowa, mikroskopowa kwantyfikacja uwalniania ludzkich neutrofili z zewnątrzkomórkowych pułapek i ocena farmakologii antagonistów w czasie rzeczywistym

Zewnątrzkomórkowe pułapki neutrofilowe (NETs) stanowią istotny mechanizm odporności wrodzonej służący do zwalczania patogennych bakterii, grzybów i pasożytów. W niniejszym opracowaniu opisujemy metody izolacji granulocytów neutrofilowych z krwi ludzkiej oraz ich aktywacji w celu tworzenia NETs. Przedstawiamy techniki przygotowania próbek umożliwiające wizualizację NETs w mikroskopii świetlnej i elektronowej.

Zewnątrzkomórkowe pułapki neutrofilowe: Jak je generować i wizualizować

Tutaj przedstawiamy eksperymentalną technikę fluorescencji pod mikroskopem przyżyciowym do wizualizacji heterotypowych interakcji płytkowo-neutrofilowych na aktywowanym śródbłonku podczas zapalenia naczyń i tworzenia skrzeplin u żywych myszy. Ta mikroskopowa technologia będzie cenna w badaniu molekularnego mechanizmu chorób naczyniowych i testowaniu środków farmakologicznych w warunkach patofizjologicznych.

Obrazowanie w czasie rzeczywistym heterotypowych interakcji płytk-neutrofile na aktywowanym śródbłonku podczas zapalenia naczyń i tworzenia skrzeplin u żywych myszy

Poznaj zautomatyzowaną metodę wysokoprzepustową do ilościowego określania tworzenia się pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili w ludzkich neutrofilach. Technika wykorzystuje podwójne barwniki do precyzyjnego śledzenia NET w czasie rzeczywistym.

Technika wysokoprzepustowa w czasie rzeczywistym do ilościowego określania tworzenia się pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili w ludzkich neutrofilach (Wideo) | JoVE Journal

Technika wysokoprzepustowa w czasie rzeczywistym do ilościowego określania tworzenia się pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili w ludzkich neutrofilach

Przeglądaj więcej filmów