Technika wysokoprzepustowa w czasie rzeczywistym do ilościowego określania tworzenia się pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili w ludzkich neutrofilach
1 grudnia 2023
Prezentujemy zautomatyzowaną, wysokoprzepustową metodę ilościowego oznaczania pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili (NET) przy użyciu systemu analizy żywych komórek, w połączeniu z zależnym od przepuszczalności błony metodą podwójnego barwnika.
Nasze badania koncentrują się na neutrofilach, które są niezbędnymi pierwszymi ratownikami w układzie odpornościowym i odgrywają znaczącą rolę w różnych chorobach. W ciągu ostatnich dwóch dekad stało się jasne, że neutrofile przyczyniają się do rozwoju raka lub chorób immunologicznych i innych stanów zapalnych poprzez zakłócanie regulacji immunologicznej. Obejmuje to tworzenie zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofili, NET, struktur przypominających pajęczynę, które reagują na stan zapalny i mogą być celem terapii w tych chorobach.
Jednak pomimo tego, że niektóre obiecujące cząsteczki ukierunkowane na NET są w fazie rozwoju, nadal nie ma zatwierdzonej terapii, która konkretnie wpływa na ten mechanizm. Jest to przynajmniej częściowo spowodowane brakiem obiektywnej, bezstronnej, powtarzalnej i wysokoprzepustowej metody kwantyfikacji tworzenia NET. Nasz protokół wykorzystuje dwukolorowe obrazowanie żywych komórek do analizy zachowania neutrofili przy użyciu przepuszczalnych i nieprzepuszczalnych dla błony barwników do precyzyjnego śledzenia powstawania NET.
Metoda ta rozróżnia tworzenie NET i zdrowe neutrofile na podstawie integralności błony i zapewnia wyraźne różnicowanie typów śmierci komórki poprzez zmiany morfologiczne obserwowane w obrazowaniu z kontrastem fazowym. Metoda ta pozwala przezwyciężyć problemy związane z wcześniej opisanymi technikami ilościowego określania powstawania NET i zapewnia wydajną, powtarzalną i dokładną kwantyfikację NET w sposób zautomatyzowany. Metoda ta pomoże w opracowywaniu leków ukierunkowanych na neutrofile, dając możliwość badania przesiewowego wielu celów terapeutycznych pod kątem tworzenia NET w sposób wysokoprzepustowy.
Po wyizolowaniu neutrofili z ludzkiej krwi obwodowej, należy je ponownie zawiesić w pożywce RPMI 1640 w 1,5-mililitrowej probówce wirówkowej. Dodaj jeden mikrolitr przepuszczalnego dla błony czerwonego barwnika DNA do 1,5 mililitra zawiesiny neutrofili i inkubuj w ciemności przez pięć minut. Odwirować zawiesinę neutrofili o sile 2,500 g przez pięć minut w temperaturze pokojowej.
Po odwirowaniu wyjąć probówkę zawierającą granulowany neutrofil i odessać supernatant. Ponownie zawiesić neutrofile w jednym mililitrze RPMI i ponownie odwirować. Po ostatnim praniu ponownie zawieś neutrofile w jednym mililitrze RPMI.
Dodaj niewielką objętość zawiesiny neutrofili do hemocytometru i policz je pod mikroskopem. Rozcieńczyć zawiesinę neutrofili do 1,5 razy 10 do piątej liczby neutrofili na mililitr za pomocą RPMI. Dodaj cztery mikrolitry od jednego do 100 wstępnie rozcieńczonych, nieprzepuszczalnych dla błony zielonego barwnika DNA do jednego mililitra zawiesiny neutrofili.
Dozować 100 mikrolitrów zawiesiny neutrofili na studzienkę do klarownej płytki 96-dołkowej poddanej działaniu kultur tkankowych. Dodaj 100 mikrolitrów odczynników stymulujących zawierających RPMI z inhibitorem lub bez inhibitora do odpowiednich studzienek. Umieść płytkę w systemie do analizy żywych komórek umieszczonym w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla.
Aby rozpocząć, uruchom oprogramowanie systemu analizy komórek na żywo. Naciśnij symbol plusa w lewym górnym rogu ekranu. , aby zainicjować dodawanie naczynia.
Wybierz opcję Skanuj zgodnie z harmonogramem, a następnie wybierz opcję Nowy, aby uruchomić program skanowania. Wybierz opcję Standardowa. Następnie ustaw ustawienia skanowania jako opcje komórka po komórce na brak, a kanały obrazu na fazę, zielony i czerwony z odpowiednimi czasami akwizycji.
Ustaw obiektyw na 20X. Z listy wybierz płytkę i wybierz położenie naczynia, w którym chcesz umieścić płytkę na tacy systemu obrazowania. Wybierz studzienki zawierające próbki i zdecyduj o liczbie obrazów do przechwycenia w każdym dołku.
Informacje te automatycznie generują szacowany czas skanowania płyty. Kliknij przycisk Utwórz mapę płyt, aby wprowadzić informacje dla każdej studzienki, takie jak typ komórki i złożenie. Następnie nazwij badanie.
Na kolejnym ekranie jako typ analizy należy wybrać analizator podstawowy, a z listy rozwijanej, która pokazuje poprzednio używane definicje analizy, wybierz definicję analizy. Pozostaw widmo niemieszania zarówno dla zielonego, jak i czerwonego na poziomie 0,0. Zaplanuj skanowanie tak, aby odbywało się co 15 do 20 minut przez osiem godzin.
Przeciągnij biały i szary pasek u góry ekranu, aby ustawić czas rozpoczęcia skanowania. Na następnym ekranie przejrzyj ustawienia skanowania i naciśnij Dodaj do harmonogramu, aby rozpocząć skanowanie. Po zeskanowaniu, na karcie widoku otwórz naczynie do analizy, naciśnij przycisk Uruchom analizę po lewej stronie ekranu i wybierz opcję Utwórz nową definicję analizy.
Wybierz podstawowy analizator i użyj kanałów obrazu fazowego, zielonego, czerwonego i nakładających się. Wybierz od sześciu do ośmiu reprezentatywnych przykładowych obrazów do trenowania. Aby skonfigurować definicję analizy, należy ustawić zielone obiekty na neutrofile tworzące zewnątrzkomórkowe pułapki neutrofili lub NET, a czerwone obiekty na jądra wszystkich neutrofili.
Naciśnij Podgląd bieżący lub Podgląd wszystkiego i dostosuj każdy parametr, aby zoptymalizować wyniki. Wybierz czasy skanowania i dołki do analizy. Następnie należy podać etykietę definicji analizy.
Przejrzyj podsumowanie i uruchom analizę. Po analizie należy dwukrotnie kliknąć nazwę definicji analizy, aby otworzyć analizowane badanie. Otwórz warstwy po lewej stronie ekranu i sprawdź, czy każda komórka jest poprawnie oznaczona.
Kliknij opcję Metryki wykresu po lewej stronie ekranu, a następnie wybierz liczbę na obraz, aby uzyskać wartość zieloną. Wybierz punkty czasowe i studnie do wyeksportowania. W przypadku wyboru grupowania wybierz opcję Repliki mapy płyt, aby potwierdzić, że wszystkie dołki są poprawnie określone podczas skanowania, a następnie kliknij opcję Eksportuj dane.
Podobnie wyeksportuj dane dla liczby czerwieni i liczby nakładania się. Korzystając z podanego równania, oblicz procent komórek tworzących NET dla każdego warunku i punktu czasowego. Przebieg formowania się NET w czasie jest wizualizowany poprzez wykreślenie procentowej zawartości neutrofili tworzących NET w każdym punkcie czasowym.
Dodanie inhibitora AKT zablokowało tworzenie NET w neutrofilach stymulowanych PMA lub jonoforem wapnia, co pokazuje, że potencjalne cząsteczki ukierunkowane na tworzenie NET mogą być testowane w sposób wysokoprzepustowy przy użyciu tej metodologii.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia zautomatyzowaną metodę wysokoprzepustową do ilościowego oznaczania zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofilowych (NETs) z wykorzystaniem systemu analizy żywych komórek. Metoda ta opiera się na zastosowaniu dwóch barwników w zależności od przepuszczalności błony, co pozwala na precyzyjne śledzenie powstawania NET.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Immunologia
- Biologia komórki
- Badania nad stanami zapalnymi
Wprowadzenie
- Neutrofile są kluczowymi komórkami pierwszego rzutu w układzie odpornościowym.
- Odgrywają one istotną rolę w przebiegu wielu chorób, w tym nowotworów i zaburzeń immunologicznych.
- Neutrofile przyczyniają się do powstawania stanu zapalnego poprzez tworzenie NET, które są strukturami przypominającymi sieci.
- Obecne terapie ukierunkowane na NET są wciąż w fazie rozwoju i nie zostały jeszcze zatwierdzone.
Cel badania
- Ustalenie wiarygodnej metody ilościowego oznaczania tworzenia się NET.
- Umożliwienie wysokoprzepustowej analizy zachowania neutrofili.
- Wsparcie rozwoju terapii celujących w NET w chorobach zapalnych.
Zastosowane metody
- Obrazowanie żywych komórek w dwóch kolorach.
- Zastosowanie barwników przenikających i nieprzenikających przez błony.
- Zautomatyzowany system wysokoprzepustowej kwantyfikacji.
- Analiza zachowania neutrofili i tworzenia NET.
Główne wyniki
- Metoda ta umożliwia obiektywne i powtarzalne ilościowe oznaczenie NET.
- Możliwość wysokoprzepustowej analizy ułatwia prowadzenie szeroko zakrojonych badań.
- Precyzyjne śledzenie powstawania NET osiągnięto dzięki zastosowaniu podejścia z użyciem dwóch barwników.
- Metoda ta może pomóc w ocenie potencjalnych terapii celujących w NET.
Wnioski
- Zautomatyzowana metoda stanowi znaczący postęp w kwantyfikacji NET.
- Rozwiązuje ona obecne ograniczenia w analizie NET.
- Podejście to może usprawnić badania nad terapiami chorób z udziałem NET.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ilościowe określanie powstawania zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofilnych (NET) z wysoką przepustowością i powtarzalnością eliminuje krytyczne wąskie gardło w poszukiwaniu leków opartym na immunologii. Ta zautomatyzowana metoda obrazowania żywych komórek z wykorzystaniem dwóch barwników umożliwia obiektywną ocenę cząsteczek celujących w NET, wspierając wczesną walidację celów oraz mitygację ryzyka mechanistycznego w ramach portfeli leków na stany zapalne i dysregulację odpornościową. Podejście to zwiększa pewność prognostyczną w rozwoju terapeutyków modulujących neutrofile w obszarach onkologii, chorób autoimmunologicznych oraz zapalnych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia rygorystyczną analizę tworzenia NET jako mechanizmu istotnego w przebiegu choroby.
- Wspiera funkcjonalną walidację celów dla związków modulujących neutrofile.
- Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez odróżnienie NETozy od innych szlaków śmierci komórkowej.
- Zwiększa pewność prognostyczną przy rozwoju preparatów celowanych w NET.
Przesiew i opracowanie testu
- Zapewnia zestandaryzowane, ilościowe wyniki tworzenia NET w wielu różnych warunkach.
- Umożliwia wysokoprzepustowy screening potencjalnych inhibitorów lub modulatorów NETozy.
- Wspiera opracowanie powtarzalnych testów dzięki zautomatyzowanej analizie obrazu i rozróżnianiu dwóch barwników.
- Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne do dalszych etapów oceny związków chemicznych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ujednolica kwantyfikację NET z modelami ludzkich neutrofili istotnymi dla przebiegu choroby.
- Zapewnia ciągłość translacyjną od odkryć in vitro do przedklinicznej walidacji strategii ukierunkowanych na NET.
- Umożliwia podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju projektu w oparciu o dostosowane do ryzyka profile ilościowego hamowania NET.
- Wspiera dopasowanie biomarkerów w badaniach nad stanem zapalnym i dysregulacją immunologiczną.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ta metoda obrazowania żywych komórek z wykorzystaniem dwóch barwników integruje się z procesem odkrywania leków, od wczesnej walidacji celu, poprzez identyfikację związków wiodących, aż po oceny przedkliniczne czynników modulujących NET.
- Biologia odkryć: Obiektywnie kwantyfikuje tworzenie NET w celu wyjaśnienia mechanizmów zależnych od neutrofili oraz wsparcia weryfikacji hipotez.
- Screening: Zapewnia powtarzalność i gotowość do prowadzenia wysokoprzepustowych analiz w celu oceny związków hamujących NETozę.
- Analityka: Generuje ilościowe, rozdzielone w czasie odczyty umożliwiające porównanie inhibicji NET w różnych warunkach.
- Badania translacyjne: Łączy wyniki uzyskane in vitro z modelami przedklinicznymi z wykorzystaniem ludzkich systemów neutrofili.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy skalowalną, zautomatyzowaną platformę do prowadzenia ciągłych kampanii poszukiwania leków ukierunkowanych na NET.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w programach ukierunkowanych na NET.
- Wartość operacyjna: Dostarcza ustandaryzowane, zautomatyzowane i skalowalne przepływy pracy dla ilościowego oznaczania NET.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie świadomych decyzji go/no-go oraz efektywne pod kątem kapitałowym sortowanie portfela aktywów modulujących neutrofile.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój kandydatów w leczeniu stanów zapalnych i chorób odpornościowych.
Wskazówki dotyczące implementacji
- Wymagana jest wiedza ekspercka z zakresu obrazowania żywych komórek oraz biologii neutrofili.
- Konieczny jest dostęp do zautomatyzowanych platform obrazowania oraz infrastruktury analitycznej dla podwójnego barwienia.
- Wymagana jest standaryzacja konfiguracji testów oraz parametrów analizy danych pomiędzy zespołami.
- Może być wymagana adaptacja metody dla różnych źródeł neutrofili lub modeli chorobowych.
- Dokładna kwantyfikacja NET zależy od zastosowania niezawodnych algorytmów analizy obrazu.
