CRISPR-Cas9 Edycja genomu zarodków szczurów przy użyciu wirusa związanego z adenowirusem (AAV) i elektroporacją zarodków 2-komórkowych

Narzędzia do edycji genomu oparte na CRISPR znacznie ułatwiły produkcję genetycznie modyfikowanych modeli przedstawicieli. System CRISPR składa się z pojedynczego prowadzącego kompleksu RNA do nukleazy Cas9 i można go zaprogramować tak, aby celował w interesującą sekwencję w genomie w celu utworzenia dwuniciowego pęknięcia DNA. Poprzez jednoczesne dostarczanie matrycy naprawy DNA, to pęknięcie DNA może zostać precyzyjnie przywrócone wraz z dodaniem dowolnej pożądanej zmodyfikowanej sekwencji DNA w procesie zwanym naprawą kierowaną homologią.

To właśnie dzięki temu procesowi jesteśmy w stanie wygenerować modele szczurów typu knock-in z ukierunkowanymi insercjami lub podstawieniami DNA. Korzystając z tego protokołu, przedstawiamy zmodyfikowane podejście wykorzystujące wirusa związanego z adenowirusem do dostarczenia matrycy naprawy DNA do zarodków szczurów, wraz z późniejszym dostarczaniem kompleksów CRISPR Cas9 przez elektroporację zarodków dwukomórkowych. Serotytypy AAV 1 lub 6 są pakowane w zmodyfikowaną matrycę naprawy DNA, zaprojektowaną tak, aby można ją było zintegrować z genomem szczura w procesie naprawy kierowanej homologią za pośrednictwem CRISPR.