CRISPR-Cas9 Edycja genomu zarodków szczurów przy użyciu wirusa związanego z adenowirusem (AAV) i elektroporacją zarodków 2-komórkowych

Narzędzia do edycji genomu oparte na CRISPR znacznie ułatwiły produkcję genetycznie modyfikowanych modeli przedstawicieli. System CRISPR składa się z pojedynczego prowadzącego kompleksu RNA do nukleazy Cas9 i można go zaprogramować tak, aby celował w interesującą sekwencję w genomie w celu utworzenia dwuniciowego pęknięcia DNA. Poprzez jednoczesne dostarczanie matrycy naprawy DNA, to pęknięcie DNA może zostać precyzyjnie przywrócone wraz z dodaniem dowolnej pożądanej zmodyfikowanej sekwencji DNA w procesie zwanym naprawą kierowaną homologią.

To właśnie dzięki temu procesowi jesteśmy w stanie wygenerować modele szczurów typu knock-in z ukierunkowanymi insercjami lub podstawieniami DNA. Korzystając z tego protokołu, przedstawiamy zmodyfikowane podejście wykorzystujące wirusa związanego z adenowirusem do dostarczenia matrycy naprawy DNA do zarodków szczurów, wraz z późniejszym dostarczaniem kompleksów CRISPR Cas9 przez elektroporację zarodków dwukomórkowych. Serotytypy AAV 1 lub 6 są pakowane w zmodyfikowaną matrycę naprawy DNA, zaprojektowaną tak, aby można ją było zintegrować z genomem szczura w procesie naprawy kierowanej homologią za pośrednictwem CRISPR.

AAV dodaje się do 30-mikrolitrowej kropli szczurzej pożywki KSOM w końcowym stężeniu 3 X 10 do 7 kopii genomu na mikrolitr. Następnie świeżo pobrane zarodki w jednym stadium komórkowym z widocznymi przedjądrzami są przenoszone do pożywki zawierającej AAV, co pozwala na transdukcję wirusa. Korzystając z naszego protokołu, nie ma potrzeby rozrzedzania osłonki przejrzystej, ponieważ serotypy AAV 1 i 6 są w stanie łatwo przejść w celu skutecznego dostarczenia matrycy naprawy DNA.

Zarodki są hodowane za pomocą AAV przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla i maksymalną wilgotnością. Następnego dnia sporządza się mieszaninę do elektroporacji zawierającą sto nanogramów na mikrolitr pojedynczego przewodnika RNA i sto nanogramów na mikrolitr białka Cas9 rozcieńczonego w pożywce OptiMIM. Mieszaninę inkubuje się w temperaturze pokojowej przez 10 minut, aby umożliwić tworzenie kompleksów CRISPR RNP.

W czasie inkubacji włącza się elektroporator, a przewody są przymocowane do elektrod szkiełkowych. Po zakończeniu tworzenia RNP pipetuje się pięć mikrolitrów mieszaniny do elektroporacji między elektrodami, uważając, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza do roztworu. Zarodki, znajdujące się obecnie w fazie dwukomórkowej, są usuwane z pożywki zawierającej AAV i ostrożnie przenoszone do mieszaniny elektroporacyjnej między elektrodami.

Zarodki są wyrównane, upewniając się, że żadne z elektrod nie dotykają żadnej z elektrod, ponieważ spowoduje to lizę podczas elektroporacji. Oto widok tej procedury przez mikroskop. Ważne jest również, aby pamiętać, że impedancja będzie się zmniejszać wraz ze wzrostem objętości między elektrodami.

Z tego powodu, a także aby nie rozcieńczać mieszaniny do elektroporacji, wraz z zarodkami należy przenieść minimalną ilość pożywki. Następnie mierzy się impedancję, naciskając przycisk z symbolem oma. Impedancja powinna mieścić się w zakresie od 0,18 do 0,3 oma.

Jeśli znajduje się w zasięgu, elektroporację rozpoczyna się poprzez naciśnięcie przycisku start. Ten proces trwa tylko kilka sekund, a tak to wygląda pod mikroskopem. Zauważysz, że na każdej elektrodzie szybko tworzą się bąbelki.

Bezpośrednio po elektroporacji pobiera się zarodki ze szkiełka podstawowego i trzykrotnie myje je w świeżej pożywce KSOM dla szczurów. Zarodki mogą być następnie hodowane do badań in vitro lub przenoszone do surogatek w celu uzyskania żywego potomstwa. Należy zauważyć, że obrzęk zarodka jest powszechny po elektroporacji.

Ten obrzęk powinien ustąpić po kilku godzinach na posiewie. Często zdarza się również, że procesy fuzji komórkowej występują nawet w 20% zarodków dwukomórkowych po elektroporacji. Fuzji komórkowej można zazwyczaj uniknąć poprzez staranne ustawienie zarodków w osi poziomej między elektrodami.

Testowanie naszego protokołu na zarodkach szczurów i badania przesiewowe hodowanych blastów w celu wprowadzenia zmodyfikowanej krótkiej sztucznej sekwencji intronowej zawierającej dwa miejsca loxP. Zauważyliśmy, że ponad 60% blastocyst zawiera prawidłowo ukierunkowany allel knock-in w oparciu o analizę sekwencji nowej generacji. Następnie, po dalszym testowaniu naszego protokołu w celu wyprodukowania żywych szczurów knock-in, opracowujemy projekt mający na celu zaprojektowanie sekwencji powlekającej rekombinazę Cre ukierunkowanej na miejsce startowe ATG szczurzego genu DRD2.

Spośród 11 urodzonych potomstwa, 10 było dodatnich w analizie PCR w pięciu głównych ramionach homologii, trzech głównych ramionach homologii i wewnętrznym teście PCR w celu wykrycia rekombinazy Cre. Podsumowując w siedmiu różnych projektach, osiągnęliśmy 76% średni wskaźnik sukcesu knock-in u zwierząt założycielskich, określony na podstawie analizy PCR na skrzyżowaniach ramion homologii i weryfikacji sekwencji DNA. Korzystając z tego dostarczania DNA za pośrednictwem AAV i procesu elektroporacji zarodków dwukomórkowych, doświadczyliśmy znacznie wyższej wydajności knock-in niż tradycyjne podejścia do insercji DNA o długości do trzech KB.

Ważne jest również, aby zauważyć, że chociaż wykazaliśmy zastosowanie tej procedury w zarodkach szczurów, może ona być skutecznie stosowana również u innych gatunków w celu generowania ukierunkowanych insercji DNA.