Name: Trójwymiarowe akustyczne urządzenie montażowe do masowej produkcji sferoid komórkowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-13T12:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 17 s
Description: Poznaj metodę akustycznego montażu 3D do produkcji sferoid komórkowych bez rusztowań. Technika zwiększa przepustowość i zapewnia jednolitą wielkość sferoid w badaniach biologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Narodowy Kluczowy Program Badań i Rozwoju Chin (2022YFA1104600) oraz Chińską Fundację Nauk Przyrodniczych Prowincji Zhejiang (LQ23H160011).

1. Wykonanie akustycznego urządzenia montażowego 3D
<ol>
	<li>Zacznij od przygotowania czterech arkuszy PMMA o grubości 1 mm poprzez cięcie laserowe30, a następnie przystąp do sklejania ich ze sobą, tworząc kwadratową komorę o wewnętrznej szerokości 21 mm i wysokości 10 mm.</li>
	<li>Następnie przymocuj kolejny arkusz PMMA o grubości 1 mm do dna komory, aby służył jako uchwyt na biotusz.</li>
	<li>Ostrożnie przymocuj trzy przetworniki tytanianu cyrkonianu ołowiu (PZT) (każdy o długości 20 mm, szerokości 10 mm, grubości 0.7 mm i pierwotnej częstotliwości rezonansowej 3 MHz, patrz Tabela materiałów) odpowiednio na zewnątrz trzech ortogonalnych ścianek komory. Upewnij się, że dolny przetwornik PZT jest wyśrodkowany pod komorą.</li>
	<li>przewody do dwóch obszarów przewodzących każdego przetwornika PZT.</li>
	<li>Na koniec przymocuj urządzenie do pustej podstawy, aby zapobiec kontaktowi dolnego PZT z innymi blatami.</li>
</ol>
2. Konfiguracja systemu montażu akustycznego
<ol>
	<li>Zacznij od zamontowania urządzenia akustycznego na stoliku mikroskopowym, co pozwoli na obserwację wnętrza komory z widokiem z góry.</li>
	<li>Mikroskop cyfrowy należy umieścić po stronie urządzenia, która jest wolna od przetworników PZT, umożliwiając obserwację wnętrza komory z widokiem z boku.</li>
	<li>Niezależnie podłącz przewody z trzech przetworników PZT szeregowo do trzech wzmacniaczy mocy i trzech kanałów wyjściowych generatorów funkcyjnych (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Zaprogramuj ustawienia w generatorach funkcyjnych dla każdego przetwornika PZT, określając parametry, takie jak przebieg sinusoidalny, częstotliwość i amplituda.</li>
	<li>Aby zapewnić sterylizację, napełnij komorę urządzenia akustycznego 75% alkoholem przez 5 minut, a następnie dokładnie wyczyść sterylnym roztworem PBS. Następnie należy naświetlić komorę światłem UV w czystej ławie przez co najmniej 1 godzinę.</li>
</ol>
3. Procedura hodowli komórkowej i zbioru
<ol>
	<li>Rozpocznij od hodowli komórek C3A, ludzkiej linii komórkowej raka wątrobowokomórkowego, w kolbie do hodowli komórek T25 przy użyciu zmodyfikowanego podłoża Eagle (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnionego 10% płodowej surowicy bydlęcej i 1% penicyliny-streptomycyny (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Gdy komórki C3A osiągną około 80% konfluencji, przeprowadź pasaż komórkowy w następujący sposób: najpierw dwukrotnie umyj dno kolby hodowlanej PBS. Następnie dodać 2 ml 0,05% trypsyny-EDTA do kolby do hodowli komórkowej i inkubować w temperaturze 37 °C, aby ułatwić oddzielenie komórek. Zatrzymaj proces trypsynizacji, dodając 2 ml kompletnej pożywki hodowlanej.</li>
	<li>Przenieść roztwór komórek do probówki o pojemności 15 ml i odwirować go przy 200 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej, aby uzyskać osad komórkowy.</li>
</ol>
4. Przygotowanie biotuszu
<ol>
	<li>Przygotować 6% (w/v) roztwór GelMA zawierający 0,5% (w/v) fenylo-2,4,6-trimetylobenzoilofosfinianu litu (LAP) przez rozpuszczenie 0,3 g GelMA i 0,025 g LAP (patrz tabela materiałów) w 5 ml buforowego roztworu fosforanowego (PBS). Pozostawić mieszaninę w łaźni wodnej o temperaturze 47 °C na 1 godzinę.</li>
	<li>Przed zmieszaniem z komórkami przepuścić roztwór GelMA przez filtr 0,22 μm (patrz tabela materiałów) w celu sterylizacji.</li>
	<li>Zawiesić wspomniany powyżej osad komórkowy (krok 3.3) w pożywce do hodowli komórkowych. Zabarwić niewielką objętość komórek 0,4% roztworem błękitu trypanowego, a następnie użyć czystego hemocytometru do zliczania komórek.</li>
	<li>Wymieszać odpowiednią ilość komórek C3A, obliczoną na podstawie gęstości komórek uzyskanej powyżej, ze sterylizowanym roztworem GelMA, aby przygotować biotusz o gęstości komórek 2 × 106 komórek/ml.</li>
	<li>W celu wizualizacji zmontowanych sferoid komórkowych należy wstępnie wybarwić komórki C3A poprzez inkubację z 2 μM cell trackerem (barwnik DiO, patrz tabela materiałów) w temperaturze 37 °C przez 20 minut. Następnie przed użyciem należy trzykrotnie umyć oznakowane komórki świeżą pożywką do hodowli komórek.</li>
</ol>
5. Montaż sferoid ogniw za pomocą urządzenia akustycznego
<ol>
	<li>Odpipetować więcej niż 1 ml biotuszu do wysterylizowanej komory. Upewnij się, że odległość twarzą w twarz między powierzchnią cieczy a dnem komory jest całkowitą wielokrotnością połowy długości fali akustycznej. 
	UWAGA: Odległość tę można kontrolować, regulując ilość dodawanego biotuszu. Długość fali akustycznej (λ) można oszacować za pomocą wzoru λ = c/f, gdzie c oznacza prędkość dźwięku w ośrodku, a f jest częstotliwością przetwornika PZT.</li>
	<li>Włącz generator funkcyjny i wzmacniacz mocy, aby zainicjować uruchamianie każdego przetwornika PZT. 
	UWAGA: Zaleca się, aby najpierw uruchomić każdy przetwornik PZT indywidualnie, aby uzyskać optymalny wzór komórkowy linii równoległej. Można to osiągnąć, przeprowadzając przemiatanie częstotliwości z krokiem o wielkości 0,001 MHz w pobliżu pierwotnej częstotliwości rezonansowej dla każdego przetwornika PZT. Następnie należy jednocześnie zastosować te optymalne sygnały do wszystkich trzech przetworników PZT, aby uzyskać oczekiwany wzór komórkowy 3D-dot. Przed zastosowaniem każdego sygnału wejściowego upewnij się, że komórki są równomiernie rozproszone w biotuszu poprzez delikatne mieszanie.</li>
	<li>Usieciuj biotusz za pomocą niebieskiego światła (405 nm, 60 mW/cm2, 30 s), aby stworzyć rusztowanie hydrożelowe 3D, które otacza agregaty komórkowe zmontowane akustycznie. Następnie wyłącz generator funkcyjny i wzmacniacz mocy.</li>
	<li>Ostrożnie przenieś rusztowanie hydrożelowe 3D z komory na szalkę Petriego i pokrój je na małe kawałki (np. 2 mm × 2 mm × 2 mm) za pomocą czystej brzytwy.</li>
	<li>Dodać pożywkę do hodowli komórkowej. 
	UWAGA: Pamiętaj, aby codziennie zmieniać pożywkę hodowlaną.</li>
</ol>
6. Odzyskiwanie sferoid komórkowych
<ol>
	<li>Zacznij od obserwacji tworzenia się sferoid w różnych warstwach rusztowań za pomocą odwróconego mikroskopu.</li>
	<li>Po 3 dniach hodowli należy usunąć pożywkę hodowlaną i dwukrotnie dokładnie umyć rusztowania hydrożelowe PBS.</li>
	<li>Inkubować rusztowania z więcej niż 2 ml buforu do lizy GelMA w rozcieńczeniu 1:200 z pożywką do hodowli komórkowych przez 30 minut w inkubatorze komórkowym. Ten krok ma na celu rozpuszczenie rusztowań hydrożelowych.</li>
	<li>Przenieść roztwór z poprzedniego etapu do probówki, a następnie odwirować go przy 200 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej, aby uzyskać osad sferoidalny komórki.</li>
	<li>Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w świeżej pożywce hodowlanej do dalszych zastosowań.</li>
</ol>
7. Analiza żywotności sferoidów
<ol>
	<li>Ocenić żywotność sferoid komórkowych zarówno w rusztowaniach hydrożelowych, jak i w odzyskanych sferoidach, używając zestawu do barwienia żywych/martwych (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Próbki inkubować w różnych punktach czasowych hodowli z 1 ml roztworu PBS zawierającego 1 μl Calcein-AM i 2 μl jodku propidyny (PI) przez 15 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>W przypadku próbek znajdujących się w rusztowaniach hydrożelowych należy je dwukrotnie przemyć bezpośrednio PBS. W przypadku odzyskanych sferoid należy odwirować przy 200 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej w celu uzyskania sferoidalnej osadki i umyć ją dwukrotnie przed obserwacją.</li>
	<li>Obserwuj próbki za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego i uchwyć obrazy fluorescencyjne.</li>
	<li>Oblicz stosunek obszaru barwionego Calcein-AM do całkowitego obszaru barwionego zarówno Calcein-AM, jak i PI za pomocą ImageJ, aby określić żywotność sferoidy.</li>
</ol>

Scalable Generation of Uniform Cell Spheroids Using a 3D Acoustic Assembly Device

<ol><li>Eiraku, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organizing+optic-cup+morphogenesis+in+three-dimensional+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture.</a> Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).</li>
<li>Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organogenesis+in+a+dish%3A+modeling+development+and+disease+using+organoid+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Organogenesis in a dish: modeling development and disease using organoid technologies.</a> Science. 345 (6194), 1247125(2014).</li>
<li>Habanjar, O., Diab-Assaf, M., Caldefie-Chezet, F., Delort, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+cell+culture+systems%3A+tumor+application%2C+advantages%2C+and+disadvantages%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">3D cell culture systems: tumor application, advantages, and disadvantages.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (22), 12200(2021).</li>
<li>Decarli, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+spheroids+as+a+versatile+research+platform%3A+formation+mechanisms%2C+high+throughput+production%2C+characterization+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biofabrication%22%5BJournal%5D)">Cell spheroids as a versatile research platform: formation mechanisms, high throughput production, characterization and applications.</a> Biofabrication. 13 (3), 032002(2021).</li>
<li>Lee, Y. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+spheroids+potentiating+cell-cell+and+cell-ECM+interactions+by+self-assembly+of+stem+cell+microlayer%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Engineering spheroids potentiating cell-cell and cell-ECM interactions by self-assembly of stem cell microlayer.</a> Biomaterials. 165, 105-120 (2018).</li>
<li>Zhuang, P., Chiang, Y. H., Fernanda, M. S., He, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+spheroids+as+building+blocks+towards+3d+bioprinting+of+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Bioprinting%22%5BJournal%5D)">Using spheroids as building blocks towards 3d bioprinting of tumor microenvironment.</a> International Journal of Bioprinting. 7 (4), 444(2021).</li>
<li>Foty, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+hanging+drop+cell+culture+protocol+for+generation+of+3D+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids.</a> Journal of Visualized Experiments. 51, e2720(2011).</li>
<li>Laschke, M. W., Menger, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+is+3D%3A+boosting+spheroid+function+for+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Life is 3D: boosting spheroid function for tissue engineering.</a> Trends in Biotechnology. 35 (2), 133-144 (2017).</li>
<li>Fu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+drug+screening+based+on+massive+3d+tumor+cultures+using+micropatterned+array+chips%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Combinatorial drug screening based on massive 3d tumor cultures using micropatterned array chips.</a> Analytical Chemistry. 95 (4), 2504-2512 (2023).</li>
<li>Kang, S. M., Kim, D., Lee, J. H., Takayama, S., Park, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+microsystems+for+spheroid+and+organoid+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Engineered microsystems for spheroid and organoid studies.</a> Advanced Healthcare Materials. 10 (2), 2001284(2021).</li>
<li>Kim, S. J., Kim, E. M., Yamamoto, M., Park, H., Shin, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+multi-cellular+spheroids+for+tissue+engineering+and+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Engineering multi-cellular spheroids for tissue engineering and regenerative medicine.</a> Advanced Healthcare Materials. 9 (23), 2000608(2020).</li>
<li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+acoustic+manipulation+of+living+cells+and+organisms+based+On+2D+array%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">3D acoustic manipulation of living cells and organisms based On 2D array.</a> IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 69 (7), 2342-2352 (2022).</li>
<li>Armstrong, J. P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+anisotropic+muscle+tissue+using+acoustic+cell+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Engineering anisotropic muscle tissue using acoustic cell patterning.</a> Advanced Materials. 30 (43), 1802649(2018).</li>
<li>Drinkwater, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+perspective+on+acoustical+tweezers-devices%2C+forces%2C+and+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Physics+Letters%22%5BJournal%5D)">A perspective on acoustical tweezers-devices, forces, and biomedical applications.</a> Applied Physics Letters. 117 (18), 180501(2020).</li>
<li>Bouyer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Bio-Acoustic+Levitational+%28BAL%29+assembly+method+for+engineering+of+multilayered%2C+3d+brain-like+constructs%2C+using+human+embryonic+stem+cell+derived+neuro-progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">A Bio-Acoustic Levitational (BAL) assembly method for engineering of multilayered, 3d brain-like constructs, using human embryonic stem cell derived neuro-progenitors.</a> Advanced Materials. 28 (1), 161-167 (2016).</li>
<li>Chansoria, P., Narayanan, L. K., Schuchard, K., Shirwaiker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasound-assisted+biofabrication+and+bioprinting+of+preferentially+aligned+three-dimensional+cellular+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Biofabrication%22%5BJournal%5D)">Ultrasound-assisted biofabrication and bioprinting of preferentially aligned three-dimensional cellular constructs.</a> Biofabrication. 11 (3), 035015(2019).</li>
<li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acoustic+assembly+of+cell+spheroids+in+disposable+capillaries%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Acoustic assembly of cell spheroids in disposable capillaries.</a> Nanotechnology. 29 (50), 504006(2018).</li>
<li>Hu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On-chip+hydrogel+arrays+individually+encapsulating+acoustic+formed+multicellular+aggregates+for+high+throughput+drug+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">On-chip hydrogel arrays individually encapsulating acoustic formed multicellular aggregates for high throughput drug testing.</a> Lab on a Chip. 20 (12), 2228-2236 (2020).</li>
<li>Wu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+acoustofluidic+focusing+and+separation+of+rare+tumor+cells+using+transparent+lithium+niobate+transducers%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">The acoustofluidic focusing and separation of rare tumor cells using transparent lithium niobate transducers.</a> Lab on a Chip. 19 (23), 3922-3930 (2019).</li>
<li>Chen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+acoustofluidic+fabrication+of+tumor+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">High-throughput acoustofluidic fabrication of tumor spheroids.</a> Lab on a Chip. 19 (10), 1755-1763 (2019).</li>
<li>Sriphutkiat, Y., Kasetsirikul, S., Zhou, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+cell+spheroids+using+Standing+Surface+Acoustic+Wave+%28SSAW%29%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Bioprinting%22%5BJournal%5D)">Formation of cell spheroids using Standing Surface Acoustic Wave (SSAW).</a> International Journal of Bioprinting. 4 (1), 130(2018).</li>
<li>Guex, A. G., Di Marzio, N., Eglin, D., Alini, M., Serra, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+waves+that+make+the+pattern%3A+a+review+on+acoustic+manipulation+in+biomedical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Materials+Today+Bio%22%5BJournal%5D)">The waves that make the pattern: a review on acoustic manipulation in biomedical research.</a> Materials Today Bio. 10, 100110(2021).</li>
<li>Harley, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+biofabrication+techniques+towards+functional+bioprinted+heterogeneous+engineered+tissues%3A+A+comprehensive+review%5BTitle%5D)+AND+%22Bioprinting%22%5BJournal%5D)">Advances in biofabrication techniques towards functional bioprinted heterogeneous engineered tissues: A comprehensive review.</a> Bioprinting. 23, 00147(2021).</li>
<li>Yang, Y., Dejous, C., Hallil, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trends+and+applications+of+surface+and+bulk+acoustic+wave+devices%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Micromachines+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Trends and applications of surface and bulk acoustic wave devices: a review.</a> Micromachines (Basel). 14 (1), 43(2022).</li>
<li>Ma, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acoustic+holographic+cell+patterning+in+a+biocompatible+hydrogel%29%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Acoustic holographic cell patterning in a biocompatible hydrogel).</a> Advanced Materials. 32 (4), 1904181(2020).</li>
<li>Miao, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+fabrication+of+cell+spheroids+with+3D+acoustic+assembly+devices%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Bioprinting%22%5BJournal%5D)">High-throughput fabrication of cell spheroids with 3D acoustic assembly devices.</a> International Journal of Bioprinting. 9 (4), 733(2023).</li>
<li>Jeger-Madiot, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organization+and+culture+of+Mesenchymal+Stem+Cell+spheroids+in+acoustic+levitation%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Self-organization and culture of Mesenchymal Stem Cell spheroids in acoustic levitation.</a> Scientific Reports. 11 (1), 8355(2021).</li>
<li>Cai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acoustofluidic+assembly+of+3D+neurospheroids+to+model+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Acoustofluidic assembly of 3D neurospheroids to model Alzheimer's disease.</a> Analyst. 145 (19), 6243-6253 (2020).</li>
<li>Mei, J., Zhang, N., Friend, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+surface+acoustic+wave+devices+on+lithium+niobate%5BTitle%5D)+AND+%22Jove-Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Fabrication of surface acoustic wave devices on lithium niobate.</a> Jove-Journal of Visualized Experiments. (160), e61013(2020).</li>
<li>Niculescu, A. G., Chircov, C., Bîrcă, A. C., Grumezescu, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+and+applications+of+microfluidic+devices%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Fabrication and applications of microfluidic devices: a review.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (4), 2011(2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Wydajna i stabilna produkcja sferoid komórkowych o wysokiej przepustowości przy użyciu technologii takich jak urządzenie do montażu akustycznego 3D jest bardzo obiecująca dla rozwoju inżynierii biomedycznej i badań przesiewowych leków 1,2,3. Takie podejście upraszcza masową produkcję sferoid komórkowych za pomocą prostych procedur.
Istnieją jednak krytyczne czynniki, które należy wziąć pod uwagę podcz...

3D modele hodowli in vitro, które dostarczają więcej cech strukturalnych i morfologicznych podobnych do in vivo w porównaniu z konwencjonalnymi modelami hodowli 2D, zostały uznane za obiecujące systemy w różnych zastosowaniach biomedycznych, takich jak inżynieria tkankowa, modelowanie chorób i badania przesiewowe leków1,2,3. Jako jeden z typów modelu hodowli 3D, sferoidy komórkowe zazwyczaj odnoszą się do agregacji komórek, tworząc sferoidalne struktury 3D charakteryzujące się wzmocnionymi interakcjami komórka-komórka i komórka-macierz4,5,6. W związku z tym wytwarzanie sferoid komórkowych stało się potężnym narzędziem umożliwiającym różnorodne badania biologiczne.
Różne techniki, w tym wiszące krople7, nieprzylepne płytki8, lub urządzenia mikrostudzienne9, zostały opracowane w celu uzyskania sferoid. Zasadniczo metody te zwykle ułatwiają składanie komórek poprzez wykorzystanie sił fizycznych, takich jak siła grawitacji, przy jednoczesnej minimalizacji interakcji między komórkami a podłożem. Jednak często obejmują one pracochłonne procesy, mają niską produktywność i stanowią wyzwanie dla kontrolowania rozmiaru sferoidów10,11. Co ważne, produkcja sferoid o pożądanej wielkości i jednorodności w wystarczającej ilości ma ogromne znaczenie dla zaspokojenia określonych zastosowań biologicznych. W przeciwieństwie do wyżej wymienionych metod, fale akustyczne, jako jeden z rodzajów techniki sterowanej siłą zewnętrzną12,13,14, wykazały potencjał do masowej produkcji sferoid komórkowych o wysokiej jakości i przepustowości, w oparciu o zasadę zwiększania agregacji komórek przez siły zewnętrzne15,16,17,18. W przeciwieństwie do sił elektromagnetycznych lub magnetycznych, techniki manipulacji komórkami oparte na akustyce są nieinwazyjne i bezznacznikowe, umożliwiając tworzenie sferoidów o doskonałej biokompatybilności19,20.
Zazwyczaj urządzenia oparte na falach akustycznych na powierzchni stojącej (SAW) i masowych falach akustycznych (BAW) zostały opracowane do generowania sferoid, wykorzystując węzły akustyczne (AN) wytwarzane przez odpowiednie stojące pola akustyczne21,22,23. W szczególności akustyczne urządzenia montażowe oparte na BAW, z zaletami wygodnej produkcji, łatwej obsługi i doskonałej skalowalności, zyskały uwagę przy wytwarzaniu sferoid komórkowych24,25. Niedawno opracowaliśmy łatwe urządzenie do montażu akustycznego oparte na BAWs, które ma możliwość generowania sferoid o wysokiej przepustowości26. Proponowane urządzenie składa się z kwadratowej komory z polimetakrylanu metylu (PMMA) z trzema przetwornikami tytanianu cyrkonianu ołowiu (PZT) ustawionymi odpowiednio w płaszczyźnie X/Y/Z. Taki układ umożliwia stworzenie trójwymiarowego wzoru tablicy punktowej lewitujących węzłów akustycznych (LAN) do sterowania montażem komórek. W porównaniu z wcześniej zgłaszanymi urządzeniami opartymi na BAW lub SAWs, które mogą tworzyć tylko tablicę 1D lub 2D ANs27,28,29, obecne urządzenie umożliwia 3D kropkową tablicę sieci LAN do szybkiego tworzenia agregacji komórek w roztworze żelatyny metakryloylowej (GelMA). Następnie, po trzech dniach hodowli, agregaty komórkowe dojrzewały do postaci sferoid o wysokiej żywotności w fotoutwardzalnych rusztowaniach GelMA. Wreszcie, z rusztowań GelMA można było łatwo uzyskać dużą liczbę sferoid o jednolitych rozmiarach do dalszych zastosowań.

<table><tbody><tr><td>0,22-&mu; m filtr</td><td>Merck</td><td>SLGSM33SS</td><td>Używany do sterylizacji roztworem GelMA</td></tr><tr><td>Naczynie do hodowli komórek 35 mm</td><td>Corning</td><td>430165</td><td>Używany do hodowli komórek</td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny</td><td>Nikon</td><td>A1RHD25</td><td>Fluorescencyjna obserwacja komórek</td></tr><tr><td>Barwnik DiO</td><td>Beyotime</td><td>C1038</td><td>Barwnik używany do barwienia komórek</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco 12430054</td><td></td><td>Pożywki do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10099141C</td><td>Suplement pożywki do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Generator funkcyjny</td><td>Rigol</td><td>DG5352</td><td>Do generowania sygnału RF</td></tr><tr><td>GelMA</td><td>Regenovo</td><td>brak</td><td>Służy do przygotowania biotuszu</td></tr><tr><td>Bufor do lizy GelMA</td><td></td><td>EFL EFL-GM-LS-001</td><td>Służy do rozpuszczania rusztowań GelMA</td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony</td><td>Nikon</td><td>Ti-U</td><td>Obserwacja komórek</td></tr><tr><td>LAP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>900889</td><td>Używany jako fotoinicjator</td></tr><tr><td>Zestaw Live-Dead</td><td>Beyotime</td><td>C2015M</td><td>Analiza żywotności komórek</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010002</td><td>Używany jako bufor</td></tr><tr><td>Penicylina-streptomycyna</td><td>Gibco</td><td>15070063</td><td>Zapobiegaj zanieczyszczeniu kultur komórkowych</td></tr><tr><td>Wzmacniacz mocy</td><td>Minicircuit</td><td>LCY-22+</td><td>Zwiększ amplituda napięcia sygnału RF</td></tr><tr><td>Przetworniki PZT</td><td>Yantai Xingzhiwen Trading Co., Ltd.</td><td>PZT-41</td><td>Zespoły funkcyjne do akustycznego urządzenia montażowego</td></tr><tr><td>Kolba do hodowli komórkowych T25</td><td>Corning</td><td>430639</td><td>Służy do hodowli komórek</td></tr><tr><td>Błękit trypanowy&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15250061</td><td>Zliczanie komórek</td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td>Enzym dysocjacji komórek</td></tr></tbody></table>

trójwymiarowe akustyczne urządzenie montażowe do masowej produkcji sferoid komórkowych

Three-Dimensional Acoustic Assembly Device for Mass Manufacturing of Cell Spheroids

Sferoidy komórkowe są obiecującymi modelami trójwymiarowymi (3D), które zyskały szerokie zastosowanie w wielu dziedzinach biologii. Protokół ten przedstawia metodę wytwarzania wysokiej jakości i wysokowydajnych sferoid komórkowych przy użyciu akustycznego urządzenia do montażu 3D za pomocą zwrotnych procedur. Akustyczne urządzenie montażowe składa się z trzech przetworników tytanianu cyrkonianu ołowiu (PZT), z których każdy jest umieszczony w płaszczyźnie X/Y/Z kwadratowej komory z polimetakrylanu metylu (PMMA). Ta konfiguracja umożliwia generowanie wzoru 3D dot-array lewitujących węzłów akustycznych (LAN), gdy stosowane są trzy sygnały. W rezultacie, komórki w roztworze żelatyny metakryloylu (GelMA) mogą być kierowane do sieci LAN, tworząc jednolite agregaty komórkowe w trzech wymiarach. Roztwór GelMA jest następnie utwardzany promieniami UV i sieciowany, aby służył jako rusztowanie, które wspomaga wzrost agregatów komórkowych. Na koniec uzyskuje się i pobiera masy dojrzałych sferoid poprzez następnie rozpuszczenie rusztowań GelMA w łagodnych warunkach. Proponowane nowe akustyczne urządzenie do montażu komórek 3D umożliwi produkcję sferoidów komórkowych, a nawet organoidów, oferując technologię o dużym potencjale w dziedzinie biologii.

W niniejszym badaniu zaprojektowano urządzenie do akustycznego montażu 3D w celu masowej produkcji sferoidów komórkowych. Urządzenie akustyczne składało się z kwadratowej komory z dwoma przetwornikami PZT przymocowanymi do płaszczyzny X i płaszczyzny Y na zewnętrznej powierzchni komory oraz jednym przetwornikiem PZT na dnie komory (Rycina 1A,B). Trzy kanały wyjściowe z dwóch generatorów funkcji zostały podłączone do trzech wzmacniaczy mocy w celu generowania trzech niezależn...

Sferoidy komórkowe były uważane za jeden z potencjalnych modeli w dziedzinie zastosowań biologicznych. W tym artykule opisano protokoły skalowalnego generowania sferoid komórkowych za pomocą urządzenia do montażu akustycznego 3D, które zapewnia wydajną metodę solidnego i szybkiego wytwarzania jednolitych sferoid komórkowych.

Trójwymiarowe akustyczne urządzenie montażowe do masowej produkcji sferoid komórkowych

Cell spheroids are promising three-dimensional (3D) models that have gained wide applications in many biological fields. This protocol presents a method ...

Modele 3D i wirtualne modele hodowli, takie jak sferoidy komórek, są szeroko stosowane w dziedzinie inżynierii genetycznej, modelowania opóźnionego i ogólnych badań przesiewowych. Nasze badania koncentrują się na opracowaniu zaawansowanej metody inżynieryjnej do wytwarzania sferoid lub innych modeli 3D i wirtualnych kultur o wysokiej jakości dla różnorodnych badań biologicznych. W obecnym protokole sferoidy rosły w rusztowaniu JAMA i są ostatecznie osiągane poprzez rozpuszczenie rusztowania, co powoduje dodatkowe zabiegi.Spróbujemy akustycznie zmontować agregaty komórkowe w pożywce hodowlanej, aby umożliwić im wzrost w sferoidach bez rusztowania. W porównaniu z technikami montażu magnetycznego, fale akustyczne mogą bezpośrednio składać ogniwa w sposób bezrobotny bez potencjalnego toksycznego wpływu na komórki. Poza tym nasz protokół umożliwia składanie sferoid komórkowych w trójwymiarową matrycę, co znacznie zwiększa przepustowość.Na początek wysterylizuj komorę urządzenia akustycznego 75% alkoholem przez pięć minut, a następnie wyczyść urządzenie sterylnym PBS i naświetlaj je światłem UV przez godzinę. Zamontuj sterylne urządzenie akustyczne na stoliku mikroskopowym, aby obserwować wnętrze komory z widokiem z góry. Mikroskop cyfrowy należy umieścić po stronie urządzenia, która jest wolna od przetworników PZT, umożliwiając obserwację wnętrza komory w widoku z boku.Niezależnie podłącz przewody z trzech przetworników PZT szeregowo do trzech wzmacniaczy mocy i trzech kanałów wyjściowych generatorów funkcyjnych. Zaprogramuj ustawienia w generatorach funkcyjnych dla każdego przetwornika PZT, określając parametry, takie jak przebiegi sinusoidalne, częstotliwość i amplituda. Hodowla komórek 3CA w DMEM uzupełniona 10% FBS i 1% streptomycyną penicyliny w kolbie do hodowli komórek T25.Gdy komórki osiągną 80% zlewanie się, przemyj kulturę dwukrotnie PBS. Po wyjęciu PBS dodaj dwa mililitry 0,05% trypsyny-EDTA do kolby i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza w celu oderwania komórek. Dodaj dwa mililitry kompletnej pożywki do hodowli komórkowej do kolby, aby zatrzymać trypsynizację.Przenieść zawiesinę komórek do 15-mililitrowej probówki i odwirować przy 200 G przez pięć minut. Aby przygotować roztwór biotuszu, należy wymieszać odpowiednią ilość zawiesiny komórek C3A ze sterylizowanym roztworem GelMA. Wstępnie wybarwić sferoidy komórek C3A dwoma roztworami do śledzenia komórek mikromolowych w temperaturze 37 stopni przez 20 minut.Aby umyć komórki, najpierw usuń supernatant przez odwirowanie, a następnie dodaj świeżą pożywkę do hodowli komórkowych. Dodaj co najmniej dwa mililitry biotuszu do wysterylizowanej komory urządzenia akustycznego. Włącz generator funkcyjny i wzmacniacz mocy, aby zainicjować uruchamianie każdego przetwornika PZT w celu wygenerowania tablicy 3D agregatów komórek.Sieciuj biotusz za pomocą niebieskiego światła przez 30 sekund, aby stworzyć rusztowania hydrożelowe 3D, akustycznie otaczające zmontowane agregaty komórkowe. Następnie ostrożnie przenieś rusztowanie hydrożelowe 3D z komory na szalkę Petriego. Pokrój go na małe kawałki za pomocą czystej brzytwy, a następnie dodaj pożywkę do hodowli komórkowych na szalkę Petriego.Inkubować sferoidy komórek C3A w różnych punktach czasowych hodowli w jednym mililitrze PBS zawierającym jeden mikrolitr wapnia AM i dwa mikrolitry jodku propidyny przez 15 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Próbkę osadzoną w rusztowaniach hydrożelowych przepłukać dwukrotnie PBS. W przypadku odzyskanych sferoid przeprowadzić wirowanie przy 200 G przez pięć minut i dwukrotnie przemyć PBS.Za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego obserwuj sferoidy i uchwyć obrazy. Agregacje komórek zostały ułożone w regularny wzór 3D z tablicą kropek z zielonym sygnałem fluorescencyjnym. Zmontowane agregaty C3A GelMA stopniowo integrowały się i tworzyły ciasne sferoidy do trzeciego dnia, czemu towarzyszył wzrost średnicy sferoidy.Żywotność sferoid komórkowych pozostawała dobra przed trzecim dniem, ale nieznacznie spadła po tygodniu hodowli. Uwolnione sferoidy zachowały dobrą morfologię sferyczną, z wąskim rozkładem wielkości wraz z pożądaną żywotnością i ekspresją albuminy.

three-dimensional-acoustic-assembly-device-for-mass-manufacturing

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Opisujemy prostą i szybką metodę generowania trójwymiarowych sferoid tkankopodobnych oraz ich potencjalne zastosowanie w ilościowym określaniu różnic w oddziaływaniach międzykomórkowych.

Prosty protokół hodowli komórkowej metodą wiszącej kropli do generowania sferoidów 3D

Sferoidy to rodzaj modelu 3D hodowli komórkowej używany do dokładniejszego reprezentowania środowiska komórki w porównaniu do jednowarstwowych modeli hodowli komórkowych 2D. W przykładowym protokole zobaczymy, jak naukowcy generują sferoidy z linii komórkowej raka jelita grubego i stosują obrazowanie żywych komórek do śledzenia wzrostu sferoid.

Generowanie sferoidów z linii komórkowych: trójwymiarowa (3D) metoda hodowli komórek

Tutaj opisujemy szybki i elastyczny protokół tworzenia sferoid 3D komórek poprzez agregację komórek. Można go łatwo dostosować do wielu typów komórek i nadaje się do stosowania w różnych zastosowaniach, w tym w testach migracji komórek, inwazji lub anoikis, a także do obrazowania i ilościowego określania interakcji komórka-macierz.

Wydajna i elastyczna metoda agregacji komórek do produkcji sferoidów 3D

Prezentujemy napędzane silnikiem odśrodkowe urządzenie mikroprzepływowe, które może hodować sferoidy komórek. Za pomocą tego urządzenia sferoidy jednego lub wielu typów komórek mogą być łatwo hodowane w warunkach wysokiej grawitacji.

Platforma lab-on-a-CD do generowania wielokomórkowych trójwymiarowych sferoid

Tutaj opisujemy produkcję na dużą skalę sferoidów zrębu/komórek macierzystych (ASC) pochodzących z tkanki tłuszczowej przy użyciu automatycznego systemu pipetowania do zasiewania zawiesiny komórkowej, zapewniając w ten sposób jednorodność wielkości i kształtu sferoidy. Te sferoidy ASC mogą być używane jako elementy budulcowe dla podejść do biodruku 3D.

Wielkoskalowa, zautomatyzowana produkcja sferoid komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej do biodruku 3D

Ten protokół szczegółowo opisuje metodę produkcji trzech różnych typów sferoidów w sposób, który czyni je odpowiednimi do badań przesiewowych i analiz na dużą skalę o wysokiej zawartości. Ponadto przedstawiono przykłady pokazujące, w jaki sposób można je analizować na poziomie sferoidalnym i poszczególnych komórek.

Niezawodna metoda produkcji sferoid na dużą skalę do zastosowań związanych z przesiewaniem i analizą o wysokiej zawartości

Obecny protokół opisuje technikę wytwarzania sferoidów tkankowych na dużą skalę przy użyciu wydrukowanego w 3D urządzenia przypominającego stempel.

Generowanie sferoid tkankowych za pomocą wydrukowanego w 3D urządzenia przypominającego stempel

Tutaj opisujemy różne metody tworzenia wielokomórkowych sferoidów, aby przeprowadzić następczą wieloparametrową mikroskopię żywych komórek. Wykorzystując mikroskopię obrazowania czasu życia fluorescencji (FLIM), autofluorescencję komórkową, barwniki barwiące i nanocząstki, przedstawiono podejście do analizy metabolizmu komórkowego, niedotlenienia i śmierci komórki w żywych trójwymiarowych (3D) nowotworach i sferoidach pochodzących z komórek macierzystych.

Produkcja i wieloparametrowa mikroskopia obrazowania czasu życia fluorescencji żywych komórek (FLIM) sferoid wielokomórkowych

To badanie przedstawia opłacalną i efektywną metodologię generowania struktur komórkowych 3D za pomocą systemu opartego na stemplach do tworzenia mikrostudzienek w formach agarozowych. System sprzyja tworzeniu się jednolitych sferoidów/organoidów, poprawiając w ten sposób interakcje komórkowe. Takie podejście zmniejsza zmienność eksperymentalną i wspiera zastosowania w testowaniu leków i inżynierii tkankowej.

Generowanie trójwymiarowych sferoidów/organoidów z dwuwymiarowych kultur komórkowych przy użyciu nowatorskiego urządzenia do stemplowania

Opisano płaski oraz trójwymiarowy druk z użyciem przewodzących tuszy metalicznych. Nasze podejście otwiera nowe możliwości wytwarzania drukowanych urządzeń elektronicznych, optoelektronicznych i biomedycznych o nietypowych układach w skali mikro.

Planarny i trójwymiarowy druk atramentów przewodzących

Poznaj metodę akustycznego montażu 3D do produkcji sferoid komórkowych bez rusztowań. Technika zwiększa przepustowość i zapewnia jednolitą wielkość sferoid w badaniach biologicznych.

Trójwymiarowe akustyczne urządzenie montażowe do masowej produkcji sferoid komórkowych

Przeglądaj więcej filmów