Ustalenie i charakterystyka organoidów żołądkowych pochodzących od pacjenta z biopsji łagodnego ciała żołądka i nabłonka antralnego

Nasze badania koncentrują się na dziedzicznych przyczynach raka żołądka. W szczególności interesuje nas dziedziczny rozlany rak żołądka spowodowany wariantami powodującymi chorobę w genie CDH1 lub CTNNA1. Badamy również rolę BRCA1 i BRCA2 w ryzyku raka żołądka i kancerogenezie.

Organoidy są coraz częściej wykorzystywane w różnych dziedzinach badań, a gastroenterologia nie jest wyjątkiem, więc wraz z tym pojawia się potrzeba standaryzacji tych technik generowania tych organoidów, w szczególności organoidów żołądkowych pochodzących od pacjentów. Nasz protokół oferuje metodę krok po kroku do niezawodnego generowania organoidów żołądkowych pochodzących od pacjenta z biopsji zarówno antralnych, jak i cielesnych obszarów żołądka. W szczególności stosujemy podejście oparte na trawieniu pojedynczych komórek, aby umożliwić standaryzowane wysiewanie komórek w celu dokonania wiarygodnych porównań między organoidami wygenerowanymi od różnych pacjentów.

Nasze odkrycia pokazują, że w porównaniu z organoidami żołądkowymi pochodzącymi od pacjentów z obszaru ciała żołądka, te z obszaru antralnego faktycznie rosną liczniejsze i większe w ciągu 20 dni po początkowym wysiewie. Odkrycia te powinny być brane pod uwagę przez badaczy, którzy chcą wykorzystać organoidy żołądkowe pochodzące z różnych regionów żołądka. Aby rozpocząć izolację pojedynczych komórek z biopsji żołądka pobranych podczas endoskopii górnej części pacjenta, najpierw pozwól tkance osiąść na dnie stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów.

Po ustabilizowaniu się użyj pipety do odessania pożywki i umyj biopsje dwukrotnie jednym mililitrem PBS uzupełnionego antybiotykiem. Przenieś co najmniej 20 miligramów tkanki do 1,5 mililitrowej probówki zawierającej jeden mililitr PBS uzupełnionej naziemną telewizją cyfrową. Użyj cienkich nożyczek do preparowania, aby pokroić tkankę na kawałki o wielkości od jednego do dwóch milimetrów lub mniejsze.

Użyj mini wirówki stołowej przez 15 sekund, aby zagregować kawałki tkanki na dnie probówki, a następnie odessać jak najwięcej supernatantu. Dodaj pięć mililitrów świeżo podgrzanego buforu wytrawiającego do 50-mililitrowej stożkowej probówki. Przenieś 500 mikrolitrów buforu z tej probówki do 1,5 mililitrowej probówki zawierającej kawałki tkanki.

Następnie za pomocą nożyczek odetnij końcówkę pipety o pojemności 1 000 mikrolitrów od dołu, aby zwiększyć średnicę końcówki w celu zminimalizowania utraty tkanki. Teraz, za pomocą zmodyfikowanej końcówki pipety, przenieś małe kawałki tkanki z rurki o pojemności 1,5 mililitra do buforu wytrawiającego w probówce o pojemności 50 mililitrów. Inkubować bufor wytrawiający i mieszaninę tkanek w temperaturze 37 stopni przez 30 minut z wytrząsaniem orbitalnym przy 200 obr./min.

Następnie dodaj pięć mililitrów podgrzanej trypsyny z 0,25% EDTA do tkanki w buforze trawiennym i inkubuj. Zneutralizuj bufor wytrawiający i trypsynę, dodając równą objętość zaawansowanej pożywki DMEM/F-12 i przepuść zawiesinę przez sitko komórkowe o wielkości 70 mikronów. Na początek usuń rozmrożoną matrycę błony podstawnej z lodu.

Dodaj obliczoną objętość macierzy błony podstawnej do pojedynczych komórek pochodzących z biopsji żołądka i delikatnie wymieszaj, pipetując w górę iw dół przez około 10 sekund. Następnie za pomocą pipety szybko przenieś 50 mikrolitrowych porcji mieszaniny matrycy i komórek do środka poszczególnych studzienek na 24-dołkowej płytce do hodowli tkankowej. Natychmiast przykryj talerz i jednym płynnym ruchem odwróć talerz do góry nogami.

Umieść odwróconą płytkę w inkubatorze do hodowli tkankowych o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 35 minut, aby umożliwić polimeryzację macierzy błony podstawnej. Następnie dodaj 500 mikrolitrów wstępnie podgrzanych pożywek z organoidów żołądkowych do każdej studzienki, upewniając się, że górna część każdej kopuły jest całkowicie zanurzona w pożywce. Organoidy są na ogół identyfikowalne w ciągu 10 dni po wysianiu pojedynczych komórek.

Do 20 dnia są duże i zazwyczaj trzeba je przejść. Liczba organoidów ciała i antralnych osiągnęła szczyt w 10 dniu po wysiewie, po czym zmniejszyła się, choć nie znacząco. Organoidy wygenerowane z tkanki biopsji antralnej wykazywały większą szybkość wzrostu w porównaniu z organoidami generowanymi z tkanki biopsji ciała.

U różnych pacjentów zwykle obserwowano różnorodność morfologii organoidów w każdej pojedynczej kopule. Jednak średnio sferyczność organoidów wykazywała niewielką zmienność. Po tym, jak organoidy żołądkowe pochodzące od pacjenta są gotowe do pasażowania, rozpocznij rutynowe przekazywanie organoidów.

Najpierw usuń pożywkę z każdej studzienki zawierającej organoidy osadzone w macierzy błony podstawnej, wykonanej w płytce 24-dołkowej. Następnie dozuj jeden mililitr lodowato zimnej, zaawansowanej pożywki DMEM/F-12 bezpośrednio na kopułę matrycy membrany podstawnej. Kontynuuj zasysanie i dozowanie pożywki, aż wszystkie fragmenty kopuły oderwą się od płytki.

Następnie należy przetransportować zarówno pożywkę, jak i rozdrobnioną matrycę błony podstawnej ze studni do następnej studni i powtórzyć proces dla wszystkich studzienek przeznaczonych do pasażowania. Po zdemontowaniu ostatniej kopuły matrycy membrany podstawnej, należy dozować pożywkę i mieszaninę do probówki o pojemności 1,5 mililitra. Przymocuj końcówkę o pojemności 1 000 mikrolitrów do pipety P1000, a następnie włóż tę końcówkę do końcówki o pojemności 200 mikrolitrów.

Korzystając z tej konfiguracji pipet, energicznie pipetuj mieszaninę matrycy organoidowej w górę iw dół około 25 razy, aby rozdrobnić organoidy na małe kawałki. Odwirować rozdrobnioną mieszaninę organoidów za pomocą wirówki stołowej w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 30 sekund w temperaturze 2 000 g. Za pomocą pipety odessać pożywkę i supernatant macierzy błony podstawnej.

Dodać obliczoną objętość świeżej macierzy błony podstawnej do granulowanych organoidów w probówce. Delikatnie odpipetować zawartość probówki w górę i w dół, aby wymieszać. Szybko, podwielokrotność 50 mikrolitrów mieszaniny matrycy organoidowej do pojedynczych dołków 24-dołkowej płytki.

Natychmiast przykryj talerz i jednym płynnym ruchem odwróć talerz do góry nogami. Umieść odwróconą płytkę w inkubatorze do hodowli tkankowych o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 35 minut, aby umożliwić polimeryzację macierzy błony podstawnej. Na koniec dodaj 500 mikrolitrów wstępnie podgrzanych pożywek z organoidów żołądkowych do każdej studzienki.

Do 20 dnia po inicjacji organoidy były gotowe do przejścia, na co wskazywał duży rozmiar organoidu lub ciemne wnętrze. Organoidy, które pozostawiono do przekroczenia tych punktów, zaczęły rozpadać się na monowarstwy 2D. Po przejściu i ponownym wysianiu żołądka, kopuły zawierały wiele fragmentów organoidów, które bardzo szybko zreorganizowały się w wiele więcej organoidów.