Regulacja wzrostu komórek Schwanna za pomocą nanosekundowego pulsacyjnego pola elektrycznego do regeneracji nerwów obwodowych in vitro

Nasze badania koncentrują się na promowaniu regeneracji nerwów obwodowych przez komórki Schwanna stymulowane nsPEF. Mamy nadzieję, że uda nam się opracować nowy sposób skutecznej aktywacji komórek Schwanna, ponieważ regeneracja nerwów jest w większości przypadków dość trudna. W innowacyjny sposób wykorzystujemy nanosekundowe impulsowe pole elektryczne, nsPEF do aktywacji komórek Schwanna.

Cieszymy się, że nsPEF może być preferowanym sposobem regeneracji nerwów obwodowych przy minimalnych skutkach ubocznych stymulacji. Poza tym nasz protokół stanowi wiarygodną podstawę do dalszych dogłębnych i systematycznych badań. Nasze laboratorium będzie stale badać zastosowanie nsPEF.

Jeśli chodzi o regenerację nerwów, zbudujemy modele zwierzęce, aby promować testy in vitro i ocenić bezpieczeństwo nsPEF in vitro. Ponieważ istnieją ograniczone dowody dotyczące zastosowania nsPEF w regeneracji nerwów obwodowych, mamy nadzieję, że uda nam się dokonać przełomu. Na początek umieść fiolkę krio zawierającą jeden mililitr zawiesiny komórek RSC96 w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza, szybko ją potrząsając.

Przenieść zawiesinę komórkową do probówki wirówkowej zawierającej od czterech do sześciu mililitrów kompletnej pożywki hodowlanej i dobrze wymieszać. Odwirować probówkę o sile 1000 G przez trzy do pięciu minut, następnie wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w trzech mililitrach kompletnej pożywki hodowlanej. Teraz dodaj zawiesinę komórkową do kolby hodowlanej zawierającej od sześciu do ośmiu mililitrów kompletnej pożywki hodowlanej i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc.

Gdy gęstość komórek osiągnie 80 do 90%, wyrzuć pożywkę hodowlaną i przepłucz komórki jeden do dwóch razy PBS bez jonów wapnia i magnezu. Następnie dodać 0,25% trypsyny, 0,53 milimolowego EDTA do kolby hodowlanej. Pod koniec inkubacji obserwuj oderwanie komórek pod mikroskopem.

Gdy większość komórek stanie się okrągła i odłączona, szybko przywróć kolbę do obszaru roboczego i delikatnie w nią postukaj. Dodaj trzy do czterech mililitrów pożywki hodowlanej zawierającej 10% FBS, aby zatrzymać trawienie. Następnie dokładnie wymieszać zawartość kolby i odessać roztwór.

Odwirować zawiesinę komórkową. Dodaj 1000 G przez pięć minut. Po odrzuceniu supernatantu ponownie zawiesić komórki w jednym do dwóch mililitrów świeżej pożywki hodowlanej, delikatnie pipetując.

Przenieść zawiesinę komórek do nowej kolby T25 w stosunku jeden do dwóch i dodać siedem mililitrów pożywki hodowlanej. Aby rozpocząć ponowne zawieszanie hodowanych komórek RSC 96 w jednym mililitrze pożywki hodowlanej DMEM i przeniesienie ich do naczyń kolorymetrycznych z elektrodami po obu stronach. Włącz wyłącznik zasilania instrumentu i obróć pokrętło, aby ustawić intensywność pola elektrycznego.

Ostrożnie obracaj elektrody, aż pojawią się iskry. Pozwala komórkom na otrzymanie pięciu impulsów nanosekundowych pulsacyjnych pól elektrycznych zgodnie z ustawionymi natężeniami pola. Po zabiegu należy natychmiast oddzielić dwie elektrody.

Na początek weź elektrycznie stymulowane komórki RSC96 i dodaj 100 mikrolitrów komórek do każdej studzienki 96-dołkowej płytki do hodowli komórek. Weź 10 mikrolitrów roztworu CCK-8 z zestawu i dodaj go do 96-dołkowej płytki do hodowli komórek. Inkubować płytkę w inkubatorze dwutlenku węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dodatkowe 30 minut do czterech godzin.

Wysiewaj trzy razy po 10 do piątych komórek w każdym dołku sześciodołkowej płytki o łącznej objętości dwóch mililitrów na studzienkę. Użyj końcówki do pipet, aby narysować poziomą linię na dnie dołka hodowli, trzymając końcówkę pionowo. Po usunięciu pożywki hodowlanej przemyj komórki PBS dwa do trzech razy.

Dodaj dwa mililitry pożywki wolnej od surowicy do każdej studzienki, a następnie umieść płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Rób zdjęcia pod czterokrotnym powiększeniem odwróconego mikroskopu w godzinach zero i 24 godzinach, aby zaobserwować zmiany w migracji komórek. Test CCK-8 ujawnił, że komórki RSC96 namnażały się znacznie szybciej w grupie pięciu kilowoltów na centymetr w porównaniu z grupą kontrolną.

Natomiast wyższe parametry prowadziły do niestabilnych temp proliferacji niż grupy kontrolne i pięć kilowoltów na centymetr. Test zarysowania wykazał, że tempo migracji komórek RSC96 w grupie pięciu kilowoltów na centymetr było znacznie szybsze niż w grupach kontrolnych i 10 kilowoltów na centymetr. Na początek weź stymulowane elektrycznie komórki RSC96 w szalkach hodowlanych.

Następnie użyj pisaka histologicznego, aby narysować okręgi w miejscach, w których komórki są równomiernie rozmieszczone na szkiełku nakrywkowym. Dodaj 50 do 100 mikrolitrów roztworu roboczego do przepuszczalności do komórek i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Następnie umyj komórki trzykrotnie PBS przez pięć minut każda.

Następnie dodaj 3% BSA w kółko, aby równomiernie pokryć tkankę i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Następnie delikatnie usuń roztwór blokujący i dodaj do komórek odpowiednio rozcieńczone przeciwciało pierwszorzędowe. Umieść płytkę do hodowli komórkowej w wilgotnym pudełku i inkubuj przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Następnie umyj komórki trzy razy PBS przez pięć minut każda, ciągle wstrząsając. Dodać odpowiednie przeciwciało drugorzędowe i inkubować w temperaturze pokojowej przez 50 minut. Pod koniec inkubacji umieścić szkiełko nakrywkowe w PBS i umyć je trzy razy, potrząsając przez pięć minut każdy.

Następnie pozostaw szkiełko do wyschnięcia i dodaj roztwór barwiący DAPI do wysuszonego szkiełka. Na koniec uszczelnij wysuszone szkiełko nakrywkowe środkiem montażowym zapobiegającym blaknięciu w celu fluorescencji. Rejestruj obrazy przy użyciu określonych długości fal wzbudzenia i emisji.

Dla Alexa Fluor 488 SCI 3 i SCI 5. Analiza mikroskopowa wykazała rozproszone cytoplazmatyczne komórki S100-Beta dodatnie na czerwono we wszystkich grupach. Zwiększoną zintegrowaną gęstość optyczną fluorescencji S100-Beta zaobserwowano w grupie pięciu kilowoltów na centymetr w porównaniu z grupą kontrolną i grupą 10 kilowoltów na centymetr

Komórki GFAP i Sox10 dodatnie z rozproszoną cytoplazmą obserwowano we wszystkich grupach podczas testów pełzania po komórkach. Jednak ekspresja GFAP była znacznie niższa w grupie pięciu kilowoltów na centymetr w porównaniu z grupami kontrolnymi i 10 kilowoltów na centymetr. Komórki RSC96 w grupie pięciu kilowoltów na centymetr wykazały znacznie wyższą średnią wartość szarości ekspresji Sox10, co sugeruje zwiększoną ekspresję Sox10.