Name: Regulacja wzrostu komórek Schwanna za pomocą nanosekundowego pulsacyjnego pola elektrycznego do regeneracji nerwów obwodowych in vitro (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-03T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Poznaj metodę stymulacji komórek Schwanna za pomocą nanosekundowego pulsacyjnego pola elektrycznego (nsPEF) do regeneracji nerwów obwodowych in vitro. Badanie wykazuje zwiększoną proliferację i migrację komórek przy niskich skutkach ubocznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana przez National Key Scientific Instrument and Equipment Development Project (NO.82027803).

1. Rozmrażanie kriokonserwowanych komórek RSC96
<ol>
	<li>Rozmrozić kriowial zawierający 1 ml zawiesiny komórkowej przez szybkie wytrząsanie go w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, a następnie dodać do probówki wirówkowej zawierającej 4-6 ml kompletnej pożywki hodowlanej i dobrze wymieszać.</li>
	<li>Wirować przy 1000 x g przez 3-5 minut, odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 3 ml kompletnej pożywki hodowlanej.</li>
	<li>Dodać zawiesinę komórkową do kolby hodowlanej (lub naczynia) zawierającej 6-8 ml kompletnej pożywki hodowlanej i inkubować w temperaturze 37 °C przez noc.</li>
	<li>Następnego dnia obserwuj wzrost i gęstość komórek pod mikroskopem.</li>
</ol>
2. Przejście komórki:
UWAGA: Jeśli gęstość komórek osiągnie 80%-90%, jest gotowa do przejścia.
<ol>
	<li>Wyrzuć pożywkę hodowlaną i przepłucz komórki 1-2 razy solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) bez jonów wapnia i magnezu.</li>
	<li>Dodać 0,25% (w/v) trypsyny-0,53 mM EDTA do kolby hodowlanej (1-2 ml dla kolby T25, 2-3 ml dla kolby T75) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 1-2 minuty.</li>
	<li>Obserwuj oderwanie komórek pod mikroskopem. Jeśli większość komórek stanie się okrągła i oderwie, szybko zwróć kolbę do obszaru roboczego, delikatnie postukaj w kolbę i dodaj 3-4 ml pożywki hodowlanej zawierającej 10% FBS, aby zatrzymać trawienie.</li>
	<li>Wymieszać zawartość, odessać roztwór i odwirować przy 1000 x g przez 5 minut. Następnie wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki, dodając 1-2 ml świeżej pożywki hodowlanej i delikatnie pipetując.</li>
	<li>Przenieść zawiesinę komórek do nowej kolby T25 w stosunku 1:2 i dodać 7 ml pożywki hodowlanej.</li>
</ol>
3. Działanie urządzenia nsPEF
<ol>
	<li>Ponownie zawiesić komórki RSC96 w 1 ml pożywki hodowlanej DMEM i przenieść je do naczyń kolorymetrycznych z elektrodami po obu stronach.</li>
	<li>Włącz wyłącznik zasilania.</li>
	<li>Dostosuj parametry, obracając pokrętło na instrumencie, aby zmienić natężenie pola elektrycznego. Natężenia ustalone w tym badaniu to 5 kV/cm, 10 kV/cm, 20 kV/cm i 40 kV/cm.</li>
	<li>Ostrożnie obracaj elektrody, aż pojawią się iskry, pozwalając ogniwom na otrzymanie 5 impulsów nsPEF zgodnie z ustawionym natężeniem pola przed natychmiastowym oddzieleniem dwóch elektrod. Po tym leczeniu należy pobrać komórki grupy eksperymentalnej poddane działaniu nsPEF i nieleczone komórki grupy kontrolnej, aby wykonać odpowiednio sekcje 4-6 po pewnym okresie hodowli komórkowej (1 dzień w tym doświadczeniu).</li>
</ol>
4. Test do liczenia komórek-8 (CCK-8)
<ol>
	<li>Przygotuj zawiesinę komórkową o określonym stężeniu z komórek RSC96 stymulowanych stymulacją elektryczną. Dodać 100 μl zawiesiny komórkowej do każdego dołka 96-dołkowej płytki do hodowli komórek. Biorąc pod uwagę wymagania testu CCK-8, kontroluj całkowitą liczbę komórek w zestawie odczynników od 1 x 103 do 1 x 106.</li>
	<li>Weź 10 μl roztworu CCK-8 z zestawu i dodaj go do 96-dołkowej płytki do hodowli komórkowej. Inkubować w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C przez dodatkowe 30 minut do 4 godzin.</li>
	<li>Zmierzyć absorbancję. Użyj pomiaru podwójnej długości fali z długością fali wykrywania 430-490 nm i długością fali odniesienia 600-650 nm.</li>
	<li>Określ natężenie pola dla kolejnych eksperymentów na podstawie eksperymentalnych wyników proliferacji komórek. Wybierz komórki o dobrej proliferacji do kolejnych eksperymentów.</li>
</ol>
5. Test zarysowania komórek
<ol>
	<li>W każdym dołku płytki sześciodołkowej wysiewaj 3 x 105 komórek o łącznej objętości 2 ml na studzienkę. Około 72 godziny później komórki przykryją studnię. Przeprowadzić test oddzielnie na grupie eksperymentalnej i kontrolnej.</li>
	<li>Użyj końcówki pipety, aby narysować poziomą linię na dnie dołka hodowli. Upewnij się, że końcówka pipety jest trzymana pionowo i staraj się unikać jej przechylania.</li>
	<li>Odessać pożywkę hodowlaną i przemyć PBS 2-3 razy.</li>
	<li>Dodaj 2 ml pożywki bez surowicy do każdego dołka.</li>
	<li>Umieścić płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C. Rób zdjęcia pod czterokrotnym powiększeniem mikroskopu odwróconego po 0 godzinach i 24 godzinach, aby obserwować zmiany w migracji komórek.</li>
</ol>
6. Immunofluorescencja
<ol>
	<li>Przepuszczalność komórek:
	<ol>
		<li>Po delikatnym pipetowaniu zawiesin komórkowych do szalek hodowlanych, narysuj kółka pisakiem histologicznym w miejscach, w których komórki są równomiernie rozmieszczone na szkiełku nakrywkowym. Grupę kontrolną i różne grupy eksperymentalne należy traktować oddzielnie.</li>
		<li>Dodać 50-100 μl roztworu roboczego do przepuszczalności (0,25-0,5% Triton X-100) i inkubować w temperaturze pokojowej (RT) przez 20 min. Przemyć trzykrotnie PBS przez 5 min za każdym razem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Blokowanie surowicy: Dodaj 3% BSA w okręgach, aby równomiernie pokryć tkankę. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut.</li>
	<li>Inkubacja przeciwciał pierwotnych: Delikatnie usunąć roztwór blokujący i dodać odpowiednio rozcieńczone przeciwciało pierwszorzędowe (pochodzenia mysiego, rozcieńczone w stosunku 1:300) do studzienek komórkowych. Umieścić płytkę do hodowli komórkowej w wilgotnym pojemniku i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Inkubacja przeciwciał wtórnych: Umieść płytkę komórkową na shakerze i myj ją trzy razy przez 5 minut za każdym razem. Dodać odpowiednie przeciwciało drugorzędowe (kozie przeciwciało anty-mysie znakowane CY3, rozcieńczone w stosunku 1:300) i inkubować w temperaturze pokojowej przez 50 minut.</li>
	<li>Barwienie jądrowe DAPI:
	<ol>
		<li>Umieścić szkiełko nakrywkowe w PBS (pH 7,4) na shakerze i myć trzy razy przez 5 minut za każdym razem.</li>
		<li>Po delikatnym wysuszeniu szkiełka dodać roztwór barwiący DAPI (2 μg/ml, 0,5 ml na okrąg) do kręgów i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut w ciemnym pomieszczeniu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Montaż: Umieścić szkiełko nakrywkowe w PBS (pH 7,4) na wytrząsarce i myć trzy razy przez 5 minut za każdym razem. Po delikatnym wysuszeniu szkiełka nakrywkowego należy uszczelnić szkiełko nakrywkowe środkiem montażowym zapobiegającym blaknięciu w celu fluorescencji.</li>
	<li>Akwizycja obrazu: wzbudzić DAPI na długości fali 330-380 nm i wykryć emisję przy 420 nm; wzbudzić przy 465-495 nm i wykryć emisję przy 515-555 nm dla AF488; wzbudzić przy 510-560 nm i wykryć emisję przy 590 nm dla CY3; wzbudzić przy 608-648 nm i wykryć emisję przy 672-712 nm dla CY5.</li>
</ol>

Enhancing Peripheral Nerve Regeneration with nsPEF-Stimulated Schwann Cells

<ol><li>Jing, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+of+electrical+stimulation+with+different+electric-field+intensities+in+the+regulation+of+the+differentiation+of+PC12+cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Study of electrical stimulation with different electric-field intensities in the regulation of the differentiation of PC12 cells.</a> ACS Chem Neurosci. 10 (1), 348-357 (2018).</li>
<li>Nocera, G., Jacob, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+Schwann+cell+plasticity+involved+in+peripheral+nerve+repair+after+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of Schwann cell plasticity involved in peripheral nerve repair after injury.</a> Cell Mol Life Sci. 77, 3977-3989 (2020).</li>
<li>Aguilar, Z. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAguilar%2C+Z+%22Nanomaterials+for+Medical+Applications%22">Nanomaterials for Medical Applications</a>. , Newnes. (2012).</li>
<li>Xie, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+functional+Schwann+cells+from+adipose-derived+stem+cells+in+defined+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of functional Schwann cells from adipose-derived stem cells in defined conditions.</a> Cell Cycle. 16 (9), 841-851 (2017).</li>
<li>Rosenbalm, T. N., Levi, N. H., Morykwas, M. J., Wagner, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+stimulation+via+repeated+biphasic+conducting+materials+for+peripheral+nerve+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mater+Sci+Mater+Med%22%5BJournal%5D)">Electrical stimulation via repeated biphasic conducting materials for peripheral nerve regeneration.</a> J Mater Sci Mater Med. 34 (11), 1-18 (2023).</li>
<li>Daly, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+and+characterization+of+multiple+biomaterial+conduits+for+peripheral+nerve+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Comparison and characterization of multiple biomaterial conduits for peripheral nerve repair.</a> Biomaterials. 34 (34), 8630-8639 (2013).</li>
<li>Lee, B. -K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((End-to-side+neurorrhaphy+using+an+electrospun+PCL%2Fcollagen+nerve+conduit+for+complex+peripheral+motor+nerve+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">End-to-side neurorrhaphy using an electrospun PCL/collagen nerve conduit for complex peripheral motor nerve regeneration.</a> Biomaterials. 33 (35), 9027-9036 (2012).</li>
<li>Kim, V., Gudvangen, E., Kondratiev, O., Redondo, L., Xiao, S., Pakhomov, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peculiarities+of+neurostimulation+by+intense+nanosecond+pulsed+electric+fields%3A+how+to+avoid+firing+in+peripheral+nerve+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Peculiarities of neurostimulation by intense nanosecond pulsed electric fields: how to avoid firing in peripheral nerve fibers.</a> Int J Mol Sci. 22 (13), 7051(2021).</li>
<li>Assinck, P., Duncan, G. J., Hilton, B. J., Plemel, J. R., Tetzlaff, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+transplantation+therapy+for+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cell transplantation therapy for spinal cord injury.</a> Nat Neurosci. 20 (5), 637-647 (2017).</li>
<li>Chen, Y. Y., McDonald, D., Cheng, C., Magnowski, B., Durand, J., Zochodne, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axon+and+Schwann+cell+partnership+during+nerve+regrowth%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuropathol+Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Axon and Schwann cell partnership during nerve regrowth.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 64 (7), 613-622 (2005).</li>
<li>Yi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tau+modulates+Schwann+cell+proliferation%2C+migration+and+differentiation+following+peripheral+nerve+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Tau modulates Schwann cell proliferation, migration and differentiation following peripheral nerve injury.</a> J Cell Sci. 132 (6), (2019).</li>
<li>Min, Q., Parkinson, D. B., Dun, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migrating+Schwann+cells+direct+axon+regeneration+within+the+peripheral+nerve+bridge%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Migrating Schwann cells direct axon regeneration within the peripheral nerve bridge.</a> Glia. 69 (2), 235-254 (2021).</li>
<li>Zhang, Y., Zhao, Q., Chen, Q., Xu, L., Yi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+control+of+peripheral+nerve+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Transcriptional control of peripheral nerve regeneration.</a> Mol Neurobiol. 60 (1), 329-341 (2023).</li>
<li>Nishi, M., Kawata, M., Azmitia, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trophic+interactions+between+brain-derived+neurotrophic+factor+and+S100%CE%B2+on+cultured+serotonergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Trophic interactions between brain-derived neurotrophic factor and S100β on cultured serotonergic neurons.</a> Brain Res. 868 (1), 113-118 (2000).</li>
<li>Gu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-sc8+inhibits+Schwann+cell+proliferation+and+migration+by+targeting+EGFR%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">miR-sc8 inhibits Schwann cell proliferation and migration by targeting EGFR.</a> PLoS One. 10 (12), e0145185(2015).</li>
<li>Dong, H. -L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AMPK+regulates+mitochondrial+oxidative+stress+in+C2C12+myotubes+induced+by+electrical+stimulations+of+different+intensities%5BTitle%5D)+AND+%22Nan+Fang+Yi+Ke+Da+Xue+Xue+Bao%22%5BJournal%5D)">AMPK regulates mitochondrial oxidative stress in C2C12 myotubes induced by electrical stimulations of different intensities.</a> Nan Fang Yi Ke Da Xue Xue Bao. 38 (6), 742-747 (2018).</li>
<li>Beebe, S. J., Blackmore, P. F., White, J., Joshi, R. P., Schoenbach, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanosecond+pulsed+electric+fields+modulate+cell+function+through+intracellular+signal+transduction+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Meas%22%5BJournal%5D)">Nanosecond pulsed electric fields modulate cell function through intracellular signal transduction mechanisms.</a> Physiol Meas. 25 (4), 1077(2004).</li>
<li>Haberkorn, I., Siegenthaler, L., Buchmann, L., Neutsch, L., Mathys, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+single-cell+bioconversion+efficiency+by+harnessing+nanosecond+pulsed+electric+field+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Adv%22%5BJournal%5D)">Enhancing single-cell bioconversion efficiency by harnessing nanosecond pulsed electric field processing.</a> Biotechnol Adv. 53, 107780(2021).</li>
<li>Ruiz-Fernández, A. R., Campos, L., Gutierrez-Maldonado, S. E., Núñez, G., Villanelo, F., Perez-Acle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanosecond+pulsed+electric+field+%28nsPEF%29%3A+Opening+the+biotechnological+Pandora%27s+box%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Nanosecond pulsed electric field (nsPEF): Opening the biotechnological Pandora's box.</a> Int J Mol Sci. 23 (11), 6158(2022).</li>
<li>Nuccitelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First-in-human+trial+of+nanoelectroablation+therapy+for+basal+cell+carcinoma%3A+proof+of+method%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Dermatol%22%5BJournal%5D)">First-in-human trial of nanoelectroablation therapy for basal cell carcinoma: proof of method.</a> Exp Dermatol. 23 (2), 135-137 (2014).</li>
<li>Nuccitelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-thermal+nanoelectroablation+of+UV-induced+murine+melanomas+stimulates+an+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Pigment+Cell+Melanoma+Res%22%5BJournal%5D)">Non-thermal nanoelectroablation of UV-induced murine melanomas stimulates an immune response.</a> Pigment Cell Melanoma Res. 25 (5), 618-629 (2012).</li>
<li>Carr, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nanosecond+pulsed+electric+field+%28nsPEF%29+can+affect+membrane+permeabilization+and+cellular+viability+in+a+3D+spheroids+tumor+model%5BTitle%5D)+AND+%22Bioelectrochemistry%22%5BJournal%5D)">A nanosecond pulsed electric field (nsPEF) can affect membrane permeabilization and cellular viability in a 3D spheroids tumor model.</a> Bioelectrochemistry. 141, 107839(2021).</li>
<li>Hornef, J., Edelblute, C. M., Schoenbach, K. H., Heller, R., Guo, S., Jiang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermal+analysis+of+infrared+irradiation-assisted+nanosecond-pulsed+tumor+ablation%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Thermal analysis of infrared irradiation-assisted nanosecond-pulsed tumor ablation.</a> Sci Rep. 10 (1), 5122(2020).</li>
<li>Zuo, K. J., Gordon, T., Chan, K. M., Borschel, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+stimulation+to+enhance+peripheral+nerve+regeneration%3A+Update+in+molecular+investigations+and+clinical+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Electrical stimulation to enhance peripheral nerve regeneration: Update in molecular investigations and clinical translation.</a> Exp Neurol. 332, 113397(2020).</li>
<li>Juckett, L., Saffari, T. M., Ormseth, B., Senger, J. -L., Moore, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+electrical+stimulation+on+nerve+regeneration+following+peripheral+nerve+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">The effect of electrical stimulation on nerve regeneration following peripheral nerve injury.</a> Biomolecules. 12 (12), 1856(2022).</li>
<li>Jessen, K. R., Mirsky, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+regulation+of+myelination%3A+relevance+for+development%2C+injury%2C+and+demyelinating+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Negative regulation of myelination: relevance for development, injury, and demyelinating disease.</a> Glia. 56 (14), 1552-1565 (2008).</li>
<li>Chen, Z. -L., Yu, W. -M., Strickland, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Peripheral regeneration.</a> Annu Rev Neurosci. 30, 209-233 (2007).</li>
<li>Yin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutaneous+papilloma+and+squamous+cell+carcinoma+therapy+utilizing+nanosecond+pulsed+electric+fields+%28nsPEF%29%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Cutaneous papilloma and squamous cell carcinoma therapy utilizing nanosecond pulsed electric fields (nsPEF).</a> PloS One. 7 (8), e43891(2012).</li>
<li>Qi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoexcited+wireless+electrical+stimulation+elevates+nerve+cell+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+Surf+B+Biointerfaces%22%5BJournal%5D)">Photoexcited wireless electrical stimulation elevates nerve cell growth.</a> Colloids Surf B Biointerfaces. 220, 112890(2022).</li>
<li>Mi, Y., Liu, Q., Li, P., Xu, J., Yang, Q., Tang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gold+nanorods+combined+with+low-intensity+nsPEFs+enhance+antimelanoma+efficacy+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Targeted gold nanorods combined with low-intensity nsPEFs enhance antimelanoma efficacy in vitro.</a> Nanotechnology. 31 (35), 355102(2020).</li>
<li>Ho, T. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogels%3A+Properties+and+applications+in+biomedicine%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Hydrogels: Properties and applications in biomedicine.</a> Molecules. 27 (9), 2902(2022).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Jak donoszono, w ostatnich latach zastosowanie nsPEF odnotowało gwałtowny wzrost. nsPEF działa wysoce ukierunkowanie tylko na pożądany obszar, zapewniając wystarczającą ilość energii do leczenia bez powodowania dodatkowych uszkodzeń termicznych, dzięki czemu jest bezpieczniejszy dla ludzkiego organizmu28. Te cechy dają mu obiecujące perspektywy translacyjne w leczeniu nowotworów i regeneracji nerwów. Jednak niektóre badania sugerują pewne ograniczenia nsPEF. W porównaniu z badaniami materiałowymi, ES jest ograniczony przez zewnętrzne źródła zasilania i przewody29. Co więcej, niedawne badanie dowiodło, że podawanie okołooperacyjnej lidokainy jako środka przeciwbólowego znacznie zmniejsza poprawę regeneracji nerwów związaną z ES25. Obawy te mogą stanowić wyzwanie dla przyszłych badań in vivo. 
Wykorzystaliśmy wyłącznie nsPEF do stymulacji komórek RSC96. Komórki poddane stymulacji o niskiej intensywności wykazywały zauważalne zmiany. Jednak czas trwania efektu stymulacji wywołanego przez nsPEF jest stosunkowo krótki, około 3 dni, zgodnie z wynikami eksperymentalnymi. W przyszłości można rozważyć połączenie materiałów takich jak złote nanopręty i nanohydrożel, które mogą wzmocnić bioelektryczne efekty impulsowych pól elektrycznych, zwiększając w ten sposób bioelektryczne efekty impulsowych pól elektrycznych i opracowując bardziej ukierunkowane i skuteczne podejścia do leczenia30,31.
Oto kilka istotnych kwestii związanych z operacją eksperymentalną. W pierwszej kolejności przeprowadzono eksperyment CCK-8, w którym przebadano odpowiednie natężenie pola i czas hodowli komórek po stymulacji elektrycznej, aby zapisać kolejne etapy i praktyki eksperymentalne. W naszych warunkach instrumentalnych i eksperymentalnych odbiór pięciu impulsów sygnałów elektrycznych sprzyja maksymalizacji zmian komórkowych. Jeśli częstotliwość impulsów jest zbyt niska, stymulacja elektryczna odbierana przez komórki jest niewystarczająca do aktywacji proliferacji i innych reakcji. Z drugiej strony, nadmierna częstotliwość może prowadzić do nieodwracalnego uszkodzenia komórek. Podczas stymulacji elektrycznej należy zwrócić uwagę na odległość między elektrodami, aby utrzymać odpowiednią pozycję, aby zapewnić, że elektrody mogą zostać szybko oddzielone po określonej liczbie wstrząsów elektrycznych, aby zapobiec wpływowi większej liczby wstrząsów elektrycznych na wyniki eksperymentu. Po zakończeniu porażenia prądem przyrząd powinien być uziemiony na czas, aby uniknąć uszkodzenia instrumentu.
W tym badaniu nsPEF o niskim natężeniu pola skutecznie promował proliferację, migrację, syntezę i zdolność wydzielania odpowiednich czynników w SC. Chociaż podstawowy mechanizm nadal wymaga wyjaśnienia, badanie to dostarcza pozytywnego poglądu na stosowanie nsPEF do stymulowania proliferacji i migracji komórek. Taka proliferacja i migracja komórek indukowana przez nsPEF jest rzadkością19 w obecnych dziedzinach badań. Co więcej, w stymulację SC zaangażowanych jest wiele kluczowych czynników. W badaniu tym oceniano specyficzne białko markerowe i czynnik neurotroficzny S100β, czynniki transkrypcyjne Sox10, GFAP i składniki cytoszkieletu neuronalnego NF-H. Zmiany, którym ulegają w stymulacji nsPEF, mogą oceniać aktywność SC, poziom naprawy w nerwach obwodowych i rokowanie w wielu wymiarach. Wszystkie wyniki wykazały znaczącą stymulację SC i łagodne rokowanie przez nsPEF. W przyszłości przeprowadzimy więcej badań na modelach zwierzęcych i będziemy dalej badać wpływ różnych intensywności nsPEF na SC, aby określić optymalny tryb pro-różnicowej stymulacji polem elektrycznym.

Każdego roku, miliony ludzi są dotknięte urazami nerwów obejmujących zarówno obwodowy układ nerwowy (PNS), jak i ośrodkowy układ nerwowy (OUN)1. Badania wykazały, że zdolność naprawcza aksonów OUN jest dość ograniczona po urazach nerwów, podczas gdy PNS wykazuje zwiększoną pojemność ze względu na znaczną plastyczność SCs2. Niemniej jednak osiągnięcie pełnej regeneracji po urazach nerwów obwodowych pozostaje żmudne i nadal stanowi poważne wyzwanie dla zdrowia ludzkiego3,4. W dzisiejszych czasach autoprzeszczepy pozostają powszechną metodą leczenia, pomimo wad związanych z chorobowością miejsca dawczego i ograniczoną dostępnością5. Ta sytuacja skłoniła naukowców do zbadania alternatywnych terapii, w tym materials6, molecular factors7 i stymulacji elektrycznej (ES). Jako czynnik sprzyjający wzrostowi aksonów i regeneracji nerwów8, wybór odpowiedniej metody ES i zbadanie relacji między ES i SC stają się niezbędne.
SC są głównymi komórkami glejowymi PNS, odgrywającymi kluczową rolę w regeneracji PNS9,10. Po urazach nerwów obwodowych SC przechodzą szybką aktywację, rozległe przeprogramowanie2 i przejście ze stanu tworzącego mielinę do morfologii wspomagającej wzrost, aby przeprowadzić regenerację nerwu2. Znaczna proliferacja SC występuje na dystalnym końcu uszkodzonego nerwu, podczas gdy SC dystalnego kikuta ulega proliferacji i wydłużeniu, tworząc pasmo Bungnnera, które jest niezbędne do kierowania aksonami do wzrostu w kierunku narządu docelowego11. Co więcej, SC z bliższych i dystalnych pni nerwów migrują do mostka nerwowego, tworząc sznury SC promujące regenerację aksonów12. Ponadto wcześniejsze badania wykazały, że synteza i wydzielanie istotnych czynników związanych z SC zmienia się w przypadkach regeneracji nerwów obwodowych, w tym czynników transkrypcyjnych13, czynniki neurotroficzne14 i regulatory mielinizacji13. Dostarcza to również wskaźników do oceny aktywności SCs. Na ich podstawie szeroko zbadano promocję proliferacji, migracji, syntezy i wydzielania odpowiednich czynników SC w celu poprawy regeneracji nerwów obwodowych15.
Poprzednie badania wykazały możliwość wykorzystania ES do regeneracji nerwów1. Powszechnie akceptowanym wyjaśnieniem jest to, że ES może indukować depolaryzację błon komórkowych, zmieniać potencjał błony i wpływać na funkcje białek błonowych poprzez zmianę rozkładu ładunków na tych biomolekułach1. Jednak szeroko stosowany intensywny PEF może powodować silny ból, mimowolne skurcze mięśni i migotanie serca8. Zwiększa również aktywność kinazy kreatynowej (CK), zmniejsza siłę mięśni i indukuje rozwój opóźnionej bolesności mięśni (DOMS)16. nsPEF to nowa technika, która stymuluje badanych polami elektrycznymi o wysokim napięciu w ciągu nanosekundowego czasu trwania impulsu i jest stopniowo stosowana w badaniach na poziomie komórkowym17,18. Wcześniejsze badania wykazały, że możliwym uzasadnieniem nsPEF promującego proliferację komórek i aktywność organelli jest tworzenie nanoporów błonowych i aktywacja kanałów jonowych, co prowadzi do wzrostu cytoplazmatycznego stężenia Ca2+ 19. nsPEF wykorzystuje technologię mocy impulsów do ładowania błony komórkowej, wytwarzając impulsy charakteryzujące się krótkim czasem trwania, szybkim czasem narastania, dużą mocą i niską gęstością energii20. Te cechy sugerują, że nsPEF może być preferowanym trybem z minimalnymi skutkami ubocznymi stymulacji8. Ponadto nsPEF oferuje takie korzyści, jak minimalnie inwazyjne procedury, odwracalność, możliwość regulacji i nieniszczącość tkanek nerwowych w porównaniu z interwencjami chirurgicznymi. Jednym z głównych kierunków badań nad nsPEF w dziedzinie biomedycyny jest jego zastosowanie do ablacji tkanek nowotworowych za pomocą stymulacji wysokoenergetycznym polem elektrycznym21,22,23. Niektóre wyniki badań wskazują, że 12-nsPEF może stymulować nerwy obwodowe, nie powodując uszkodzeń24. Jednak obecnie istnieją ograniczone dowody dotyczące zastosowania nsPEF w dziedzinie regeneracji nerwów. Co więcej, stymulacja SC za pomocą nsPEF jest pionierską próbą, przyczyniającą się do dalszych badań in vivo i klinicznych. Badanie to ma na celu sprawdzenie, czy stymulacja nsPEF SC może wspomagać regenerację nerwów i stanowić wiarygodną podstawę do dalszych dogłębnych i systematycznych badań.

<table><tbody><tr><td>Medium do montażu zapobiegającego blaknięciu</td><td>Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD</td><td>G1401</td><td></td></tr><tr><td>Anti-GFAP MAb myszy</td><td>Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD</td><td>GB12100-100</td><td></td></tr><tr><td>Anty-neurofilamentowy ciężki polipeptyd mAb myszy</td><td>Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD</td><td>GB12144-100</td><td></td></tr><tr><td>Anti-S100 beta mAb myszy</td><td>Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD</td><td>GB14146-100</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD</td><td>GC305010</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko nakrywkowe</td><td>Jiangsu Shitai sprzęt eksperymentalny Co., LTD</td><td>10212432C</td><td></td></tr><tr><td>Koza anty-mysia IgG z oznaczeniem CY3</td><td>Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD</td><td>GB21302</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik do barwienia DAPI</td><td>Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD</td><td>G1012</td><td></td></tr><tr><td>Wytrząsarka</td> <td>odbarwiającaWuhan Xavier Biotechnology Co., LTD</td><td>DS-2S100</td><td></td></tr><tr><td>Zasilacz wysokiego napięcia dla nsPEF</td><td>Matsusada Precision Inc.</td><td>AU-60P1.6-L</td><td></td></tr><tr><td>Pióro histochemiczne</td><td>Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD</td><td>G6100</td><td></td></tr><tr><td>Płyn do łamania membrany</td><td>Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD</td><td>G1204</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko mikroskopowe</td><td>Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD</td><td>G6012</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka palmowa</td><td>Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD</td><td>MS6000</td><td></td></tr><tr><td>PBS w</td> <td>proszkuWuhan Xavier Biotechnology Co., LTD</td><td>G0002</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta</td><td>Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop z dodatnią fluorescencją</td><td>Nikon, Japonia</td><td>NIKON ECLIPSE C1</td><td></td></tr><tr><td>Królik Przeciwciało sprzężone anty-SOX10 / AF488</td><td>Beijing Bioss Biotechnology Co., LTD</td><td>BS-20563R-AF488</td><td></td></tr><tr><td>RSC96 Komórki Schwanna</td><td>Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD</td><td>STCC30007G-1</td><td></td></tr><tr><td>scanister</td><td>3DHISTECH</td><td>Pannoramic MIDI</td><td></td></tr><tr><td>Specjalny do nsPEF</td><td>Times Microwave Systems</td><td>M17/78-RG217</td><td></td></tr><tr><td>Mieszalnik turbinowy</td><td>Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD</td><td>MV-100</td><td></td></tr></tbody></table>

regulacja wzrostu komórek schwanna za pomocą nanosekundowego pulsacyjnego pola elektrycznego do regeneracji nerwów obwodowych in vitro

Regulating Schwann Cell Growth by Nanosecond Pulsed Electric Field for Peripheral Nerve Regeneration In Vitro

Komórki Schwanna (SCs) są komórkami mielinizującymi obwodowego układu nerwowego, odgrywającymi kluczową rolę w regeneracji nerwów obwodowych. Nanosekundowe impulsowe pole elektryczne (nsPEF) to nowa metoda mająca zastosowanie w elektrycznej stymulacji nerwów, która okazała się skuteczna w stymulowaniu proliferacji komórek i innych procesów biologicznych. Mając na celu ocenę, czy SC ulegają znaczącym zmianom pod wpływem nsPEF i pomoc w zbadaniu potencjału nowych metod regeneracji nerwów obwodowych, hodowane komórki RSC96 poddano stymulacji nsPEF przy napięciu 5 kV i 10 kV, a następnie kontynuowano hodowlę przez 3-4 dni. Następnie oceniono niektóre istotne czynniki wyrażane przez SC, aby wykazać skuteczną stymulację, w tym specyficzne białko markerowe, czynnik neurotroficzny i regulator mielinizacji. Reprezentatywne wyniki wykazały, że nsPEF znacząco zwiększa proliferację i migrację SC oraz zdolność do syntezy istotnych czynników, które pozytywnie wpływają na regenerację nerwów obwodowych. Jednocześnie niższa ekspresja GFAP wskazywała na łagodne rokowanie w przypadku uszkodzeń nerwów obwodowych. Wszystkie te wyniki pokazują, że nsPEF ma ogromny potencjał jako skuteczna metoda leczenia uszkodzeń nerwów obwodowych poprzez stymulację SC.

Niskonapięciowe impulsowe pola elektryczne stymulują proliferację komórek 
Zgodnie z testem CCK-8, tempo proliferacji RSC96 w grupie 5 kV/cm było znacznie szybsze niż w grupie kontrolnej. Jednak wraz ze wzrostem parametrów (20 kV/cm i 40 kV/cm), tempo proliferacji stało się niestabilne, a nawet niższe niż w grupie kontrolnej. Tempo proliferacji komórek RSC96 w grupie 40 kV/cm było znacznie niższe niż w grupie kontrolnej i grupie 5 kV/cm, wykazując istotną różnicę statystyczną (P &lt; 0.05). Ze względu na niespełnienie wymagań eksperymentalnych dotyczących proliferacji komórek, grupy 20 kV/cm i 40 kV/cm zostały wykluczone z kolejnych doświadczeń (Rycina 1).
Niskointensywne impulsowe pola elektryczne promują ekspresję S100β 
S100β, będące specyficznym białkiem markerowym komórek Schwanna (SCs), uczestniczy w różnych funkcjach, w tym w wydłużaniu neurytów i proliferacji aksonów14. Dodatkowo stwierdzono, że białko S100β działa jako czynnik neurotroficzny podczas rozwoju, a jego ekspresja wzrasta w przypadku urazów nerwów. Poprzednie badania wykazały, że S100β może współpracować z neurotroficznym czynnikiem pochodzenia mózgowego (BDNF) w celu regulacji różnych kaskad transdukcji sygnału i przyczyniać się do dojrzewania neuronów oraz wzrostu aksonów14,25. Pod mikroskopem, w testach migracji komórek we wszystkich grupach, zaobserwowano rozproszone, cytoplazmatyczne komórki S100β-dodatnie zaznaczone na czerwono (Rycyna 2A). Po trzech dniach hodowli zintegrowana gęstość optyczna (IOD) fluorescencji w grupie komórek RSC96 poddanych działaniu pola 5 kV/cm była znacząco wyższa niż w grupie kontrolnej i grupie 10 kV/cm, wykazując istotną różnicę statystyczną (***P &lt; 0,001; ****P &lt; 0,0001) (Rycina 2B).
Niskonapięciowe impulsowe pola elektryczne promują ekspresję NF-H 
NF-H oddziałuje z innymi filamentami pośrednimi, tworząc sieć, i jest głównym składnikiem neuronalnego cytoszkieletu. W badaniach migracji komórek we wszystkich grupach pod mikroskopem zaobserwowano rozproszone, cytoplazmatyczne komórki NF-H-dodatnie zaznaczone na czerwono (Ryc. 3A). Po trzech dniach hodowli zintegrowana gęstość optyczna (IOD) fluorescencji w grupie komórek RSC96 poddanych działaniu pola 5 kV/cm była znacząco wyższa niż w grupie kontrolnej oraz grupie 10 kV/cm, wykazując istotną różnicę statystyczną (*P&lt;0.05; **P &lt; 0.01) (Ryc. 3B).
Impulsowe pola elektryczne o niskim natężeniu regulują ekspresję GFAP 
Ekspresja kwaśnego białka włóknistego glejowego (GFAP) jest jednym z wskaźników aktywności astrocytów. Astrocyty wykazują początkowo proliferację reaktywną po uszkodzeniu nerwu, co w wczesnych etapach ma efekt ochronny. Jednak nadmierna proliferacja komórek glejowych może prowadzić do powstania blizn glejowych, co utrudnia łączność włókien neuronalnych26. Poprzednie badania wykazały, że dochodzi do reekspresji genów typowo wyrażanych podczas wzrostu aksonów, takich jak GFAP27. W badaniach migracji komórek we wszystkich grupach pod mikroskopem zaobserwowano rozproszone komórki GFAP-dodatnie w cytoplazmie, zaznaczone kolorem czerwonym (Rysunek 4A). Po trzech dniach hodowli zintegrowana gęstość optyczna (IOD) fluorescencji w grupie komórek RSC96 poddanych działaniu pola 5 kV/cm była znacząco niższa niż w grupie kontrolnej oraz grupie 10 kV/cm, wykazując istotną różnicę statystyczną (****P &lt; 0.0001; ***P &lt; 0.001) (Rysunek 4B).
Impulsowe pola elektryczne o niskim natężeniu promują ekspresję Sox10 
Sox10 jest stale eksprymowany w komórkach Schwanna (SCs) i stanowi kluczowy czynnik transkrypcyjny dla mielinizacji nerwów obwodowych13. W badaniach nad migracją komórek we wszystkich grupach pod mikroskopem zaobserwowano rozproszone, zielone komórki z cytoplazmatyczną ekspresją Sox10 (Rysunek 5A). Po 3 dniach hodowli średnia wartość szarości w grupie komórek RSC96 poddanych działaniu pola 5 kV/cm była znacząco wyższa niż w grupie kontrolnej oraz w grupie 10 kV/cm, wykazując istotną różnicę statystyczną (*P &lt; 0.05; *P &lt; 0.05) (Rysunek 5B).
Niskointensywne impulsowe pola elektryczne wspomagają migrację komórek 
Porównując szybkość migracji komórek RSC96 po 24 h testu zarysowania (scratch assay), zaobserwowano, że migracja komórek RSC96 w grupie 5 kV/cm była znacząco przyspieszona w porównaniu z grupą kontrolną oraz grupą 10 kV/cm (Rycina 6).
<img alt="Wykres słupkowy proliferacji komórek; wartości gęstości optycznej (O.D.), zmienne pola elektryczne, istotna zmiana." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66097/66097fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Test CCK8 proliferacji komórkowej komórek RSC96 stymulowanych przy 5 kV/cm, 10 kV/cm, 20 kV/cm i 40 kV/cm oraz grupy kontrolne. Wyniki przedstawiają średnią ± SD na podstawie ≥3 powtórzeń. NS nieistotne; *P &lt; 0.05; **P &lt; 0.01; **P &lt; 0.01 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66097/66097fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Mikroskopia immunofluorescencyjna białka S-100β z barwieniem DAPI oraz wykres słupkowy wyników fluorescencji." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66097/66097fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Ekspresja S100β w komórkach RSC96 stymulowanych napięciem 5 kV/cm, 10 kV/cm oraz w grupie kontrolnej. Wyniki przedstawiają średnią ± SD na podstawie ≥3 powtórzeń. ***P &lt; 0,001; ****P &lt; 0,0001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66097/66097fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Mikroskopia immunofluorescencyjna, ekspresja białka NF-H, efekt pola elektrycznego, intensywność fluorescencji." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66097/66097fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Ekspresja NF-H w komórkach RSC96 stymulowanych przy 5 kV/cm, 10 kV/cm oraz w grupach kontrolnych. Wyniki przedstawiają średnią ± SD na podstawie ≥3 powtórzeń. *P &lt; 0.05; **P &lt; 0.01. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66097/66097fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wyniki badania immunofluorescencji GFAP, obrazy mikroskopowe i wykres słupkowy przedstawiające intensywność fluorescencji." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66097/66097fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Ekspresja GFAP w komórkach RSC96 stymulowanych napięciem 5 kV/cm, 10 kV/cm oraz w grupie kontrolnej. Wyniki przedstawiają średnią ± SD na podstawie ≥3 powtórzeń. ****P &lt; 0,0001; ***P &lt; 0,001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66097/66097fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Obrazy z mikroskopu immunofluorescencyjnego dla barwienia Sox10, DAPI oraz obraz po nałożeniu (merge) w różnych warunkach." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66097/66097fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Ekspresja Sox10 w komórkach RSC96 stymulowanych napięciem 5 kV/cm, 10 kV/cm oraz w grupach kontrolnych. Wyniki przedstawiają średnią ± SD na podstawie ≥3 powtórzeń. *P &lt; 0.05; *P &lt; 0.05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66097/66097fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza migracji komórek; wyniki testu zarysowania; porównanie w 0 h i 24 h; zmienne pola elektryczne." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66097/66097fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6: Test zarysowania komórek RSC96 stymulowanych przy 5 kV/cm, 10 kV/cm oraz grupy kontrolne. Wyniki przedstawiają średnią ± SD na podstawie ≥3 powtórzeń. **P &lt; 0,01; ***P &lt; 0,001. Dane statystyczne oparto na zwykłej jednoczynnikowej analizie ANOVA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66097/66097fig06large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Tutaj prezentujemy protokół zastosowania nanosekundowego impulsowego pola elektrycznego (nsPEF) do stymulacji komórek Schwanna in vitro. Zdolność syntezy i wydzielania odpowiednich czynników i zmian w zachowaniu komórek potwierdziła udaną stymulację za pomocą nsPEF. Badanie pozytywnie ocenia metodę regeneracji nerwów obwodowych.

Regulacja wzrostu komórek Schwanna za pomocą nanosekundowego pulsacyjnego pola elektrycznego do regeneracji nerwów obwodowych in vitro

Schwann cells (SCs) are myelinating cells of the peripheral nervous system, playing a crucial role in peripheral nerve regeneration. Nanosecond Pulse ...

Nasze badania koncentrują się na promowaniu regeneracji nerwów obwodowych przez komórki Schwanna stymulowane nsPEF. Mamy nadzieję, że uda nam się opracować nowy sposób skutecznej aktywacji komórek Schwanna, ponieważ regeneracja nerwów jest w większości przypadków dość trudna. W innowacyjny sposób wykorzystujemy nanosekundowe impulsowe pole elektryczne, nsPEF do aktywacji komórek Schwanna.Cieszymy się, że nsPEF może być preferowanym sposobem regeneracji nerwów obwodowych przy minimalnych skutkach ubocznych stymulacji. Poza tym nasz protokół stanowi wiarygodną podstawę do dalszych dogłębnych i systematycznych badań. Nasze laboratorium będzie stale badać zastosowanie nsPEF.Jeśli chodzi o regenerację nerwów, zbudujemy modele zwierzęce, aby promować testy in vitro i ocenić bezpieczeństwo nsPEF in vitro. Ponieważ istnieją ograniczone dowody dotyczące zastosowania nsPEF w regeneracji nerwów obwodowych, mamy nadzieję, że uda nam się dokonać przełomu. Na początek umieść fiolkę krio zawierającą jeden mililitr zawiesiny komórek RSC96 w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza, szybko ją potrząsając.Przenieść zawiesinę komórkową do probówki wirówkowej zawierającej od czterech do sześciu mililitrów kompletnej pożywki hodowlanej i dobrze wymieszać. Odwirować probówkę o sile 1000 G przez trzy do pięciu minut, następnie wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w trzech mililitrach kompletnej pożywki hodowlanej. Teraz dodaj zawiesinę komórkową do kolby hodowlanej zawierającej od sześciu do ośmiu mililitrów kompletnej pożywki hodowlanej i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc.Gdy gęstość komórek osiągnie 80 do 90%, wyrzuć pożywkę hodowlaną i przepłucz komórki jeden do dwóch razy PBS bez jonów wapnia i magnezu. Następnie dodać 0,25% trypsyny, 0,53 milimolowego EDTA do kolby hodowlanej. Pod koniec inkubacji obserwuj oderwanie komórek pod mikroskopem.Gdy większość komórek stanie się okrągła i odłączona, szybko przywróć kolbę do obszaru roboczego i delikatnie w nią postukaj. Dodaj trzy do czterech mililitrów pożywki hodowlanej zawierającej 10% FBS, aby zatrzymać trawienie. Następnie dokładnie wymieszać zawartość kolby i odessać roztwór.Odwirować zawiesinę komórkową. Dodaj 1000 G przez pięć minut. Po odrzuceniu supernatantu ponownie zawiesić komórki w jednym do dwóch mililitrów świeżej pożywki hodowlanej, delikatnie pipetując.Przenieść zawiesinę komórek do nowej kolby T25 w stosunku jeden do dwóch i dodać siedem mililitrów pożywki hodowlanej. Aby rozpocząć ponowne zawieszanie hodowanych komórek RSC 96 w jednym mililitrze pożywki hodowlanej DMEM i przeniesienie ich do naczyń kolorymetrycznych z elektrodami po obu stronach. Włącz wyłącznik zasilania instrumentu i obróć pokrętło, aby ustawić intensywność pola elektrycznego.Ostrożnie obracaj elektrody, aż pojawią się iskry. Pozwala komórkom na otrzymanie pięciu impulsów nanosekundowych pulsacyjnych pól elektrycznych zgodnie z ustawionymi natężeniami pola. Po zabiegu należy natychmiast oddzielić dwie elektrody.Na początek weź elektrycznie stymulowane komórki RSC96 i dodaj 100 mikrolitrów komórek do każdej studzienki 96-dołkowej płytki do hodowli komórek. Weź 10 mikrolitrów roztworu CCK-8 z zestawu i dodaj go do 96-dołkowej płytki do hodowli komórek. Inkubować płytkę w inkubatorze dwutlenku węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dodatkowe 30 minut do czterech godzin.Wysiewaj trzy razy po 10 do piątych komórek w każdym dołku sześciodołkowej płytki o łącznej objętości dwóch mililitrów na studzienkę. Użyj końcówki do pipet, aby narysować poziomą linię na dnie dołka hodowli, trzymając końcówkę pionowo. Po usunięciu pożywki hodowlanej przemyj komórki PBS dwa do trzech razy.Dodaj dwa mililitry pożywki wolnej od surowicy do każdej studzienki, a następnie umieść płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Rób zdjęcia pod czterokrotnym powiększeniem odwróconego mikroskopu w godzinach zero i 24 godzinach, aby zaobserwować zmiany w migracji komórek. Test CCK-8 ujawnił, że komórki RSC96 namnażały się znacznie szybciej w grupie pięciu kilowoltów na centymetr w porównaniu z grupą kontrolną.Natomiast wyższe parametry prowadziły do niestabilnych temp proliferacji niż grupy kontrolne i pięć kilowoltów na centymetr. Test zarysowania wykazał, że tempo migracji komórek RSC96 w grupie pięciu kilowoltów na centymetr było znacznie szybsze niż w grupach kontrolnych i 10 kilowoltów na centymetr. Na początek weź stymulowane elektrycznie komórki RSC96 w szalkach hodowlanych.Następnie użyj pisaka histologicznego, aby narysować okręgi w miejscach, w których komórki są równomiernie rozmieszczone na szkiełku nakrywkowym. Dodaj 50 do 100 mikrolitrów roztworu roboczego do przepuszczalności do komórek i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Następnie umyj komórki trzykrotnie PBS przez pięć minut każda.Następnie dodaj 3% BSA w kółko, aby równomiernie pokryć tkankę i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Następnie delikatnie usuń roztwór blokujący i dodaj do komórek odpowiednio rozcieńczone przeciwciało pierwszorzędowe. Umieść płytkę do hodowli komórkowej w wilgotnym pudełku i inkubuj przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Następnie umyj komórki trzy razy PBS przez pięć minut każda, ciągle wstrząsając. Dodać odpowiednie przeciwciało drugorzędowe i inkubować w temperaturze pokojowej przez 50 minut. Pod koniec inkubacji umieścić szkiełko nakrywkowe w PBS i umyć je trzy razy, potrząsając przez pięć minut każdy.Następnie pozostaw szkiełko do wyschnięcia i dodaj roztwór barwiący DAPI do wysuszonego szkiełka. Na koniec uszczelnij wysuszone szkiełko nakrywkowe środkiem montażowym zapobiegającym blaknięciu w celu fluorescencji. Rejestruj obrazy przy użyciu określonych długości fal wzbudzenia i emisji.Dla Alexa Fluor 488 SCI 3 i SCI 5. Analiza mikroskopowa wykazała rozproszone cytoplazmatyczne komórki S100-Beta dodatnie na czerwono we wszystkich grupach. Zwiększoną zintegrowaną gęstość optyczną fluorescencji S100-Beta zaobserwowano w grupie pięciu kilowoltów na centymetr w porównaniu z grupą kontrolną i grupą 10 kilowoltów na centymetr.Komórki GFAP i Sox10 dodatnie z rozproszoną cytoplazmą obserwowano we wszystkich grupach podczas testów pełzania po komórkach. Jednak ekspresja GFAP była znacznie niższa w grupie pięciu kilowoltów na centymetr w porównaniu z grupami kontrolnymi i 10 kilowoltów na centymetr. Komórki RSC96 w grupie pięciu kilowoltów na centymetr wykazały znacznie wyższą średnią wartość szarości ekspresji Sox10, co sugeruje zwiększoną ekspresję Sox10.

regulating-schwann-cell-growth-nanosecond-pulsed-electric-field-for

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Niniejszy protokół demonstruje metody wykorzystywane do tworzenia środowisk 2D i 3D w specjalnie zaprojektowanych komorach elektrotaktycznych, które umożliwiają śledzenie komórek in vivo/ex vivo przy użyciu rejestracji time-lapse na poziomie pojedynczych komórek, w celu zbadania galwanotaksji/elektrotaksji oraz innych odpowiedzi komórkowych na elektryczne pola (EFs) prądu stałego (DC).

Sterowana polem elektrycznym migracja kierunkowa komórek progenitorowych neuronów w środowiskach 2D i 3D

Weźmy znieczulonego szczura z odsłoniętym nienaruszonym prawym nerwem kulszowym, który kontroluje ruch nóg i czucie.Wytnij segment nerwowy, tworząc szczelinę, przecinając aksony neuronów i zakłócając transmisję sygnału.Odcięte dystalne aksony pogarszają się, odrywając wyspecjalizowane komórki naprawy nerwów lub komórki Schwanna.Zszyj bioniczne rusztowanie nerwu przewodzącego, miękką rurkę z mikrokanałami, do epineurium, zewnętrznej warstwy nerwu, na obu odciętych końcach.Elektrody sparowane z...

Naprawa nerwów za pomocą bionicznego rusztowania przewodzącego w połączeniu ze stymulacją elektryczną

Źródło: Ino, D. et al., Transfer genów in vivo do komórek Schwanna w nerwie kulszowym gryzoni za pomocą elektroporacji. J. Vis. Exp. (2016)Ten film pokazuje transfer genów in vivo do komórek Schwanna nerwu kulszowego gryzoni za pomocą elektroporacji. Do nerwu wstrzykuje się plazmidowy roztwór barwnika DNA, a impulsy elektryczne ułatwiają wejście DNA. DNA później integruje się z genomem komórki, umożliwiając pomyślny transfer genów w komórkach Schwanna.

Transfer genów do komórek Schwanna nerwu kulszowego gryzoni za pomocą elektroporacji

Źródło: Han, J., et.al. Regulacja wzrostu komórek Schwanna za pomocą nanosekundowego pulsacyjnego pola elektrycznego do regeneracji nerwów obwodowych in vitro. J. Vis. Exp. (2024)Ten film pokazuje zastosowanie techniki nanosekundowego impulsowego pola elektrycznego (nsPEF) do modulowania wzrostu komórek Schwanna (SC). Szybkie impulsy elektryczne indukują przejściowe nanopory w błonach SC, ułatwiając napływ wapnia, który aktywuje szlaki sygnałowe napędzające proliferację SC, dedyferencjację i...

Regulacja wzrostu komórek Schwanna in vitro za pomocą techniki nanosekundowego pulsacyjnego pola elektrycznego

Źródło: Lee, Y., et.al. Przeszczep komórek Schwanna do przewodów PVDF-TrFE w celu zmostkowania przeciętych kikutów rdzenia kręgowego szczura w celu promowania regeneracji aksonów w poprzek luki. J. Vis. Exp. (2017)Ten film demonstruje zastosowanie piezoelektrycznego przewodu polimerowego wysianego komórkami Schwanna w celu promowania regeneracji aksonów w rdzeniu kręgowym szczura przeciętym przez sieć. Przewód zapewnia przewodnictwo strukturalne, a jego właściwości bioelektryczne stymulują...

Przewody wysiewane komórkami Schwanna do regeneracji aksonów po urazie rdzenia kręgowego

Zwoje korzenia grzbietowego (DRG) to struktury zawierające neurony czuciowe obwodowego układu nerwowego. Po dysocjacji mogą być hodowane wspólnie z komórkami macierzystymi pochodzącymi z tkanki tłuszczowej (ASC) podobnymi do SC, stanowiąc cenny model do badania regeneracji i mielinizacji nerwów in vitro, naśladując środowisko in vivo w miejscu urazu.

Neurony zwojów korzenia grzbietowego i zróżnicowane komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej: model wspólnej hodowli in vitro do badania regeneracji nerwów obwodowych

Tutaj prezentujemy technikę in vivo transferu genów do komórek Schwanna (SC) w nerwie kulszowym gryzoni. Ta prosta technika jest przydatna do badania mechanizmów sygnalizacyjnych zaangażowanych w rozwój i utrzymanie mielinizujących się SC.

In vivo (in vivo) Transfer genów do komórek Schwanna w nerwie kulszowym gryzoni za pomocą elektroporacji

Tutaj prezentujemy metodę oczyszczania fibroblastów i komórek Schwanna z nerwów czuciowych i ruchowych in vitro.

Oczyszczanie fibroblastów i komórek Schwanna z nerwów czuciowych i ruchowych in vitro

Ta metodologia ma na celu zilustrowanie mechanizmów, za pomocą których sygnały macierzy zewnątrzkomórkowej, takie jak sztywność substratu, skład białka i morfologia komórki, regulują fenotyp komórek Schwanna (SC).

Przygotowanie przestrajalnych mikrośrodowisk macierzy zewnątrzkomórkowej w celu oceny specyfikacji fenotypu komórek Schwanna

W tym badaniu prezentujemy protokół różnicowania nerwowych komórek macierzystych i progenitorowych (NPC) indukowanych wyłącznie przez stymulację impulsami prądu stałego (DC) w systemie mikroprzepływowym.

Różnicowanie neuronalnych komórek prekursorowych pod wpływem pola elektrycznego w urządzeniach mikroprzepływowych

To jest protokół chirurgicznego wszczepienia i obsługi bezprzewodowo zasilanego interfejsu dla nerwów obwodowych. Pokazujemy użyteczność tego podejścia na przykładach stymulatorów nerwów umieszczonych na nerwie kulszowym lub przeponowym szczura.

Implantacja i sterowanie bezprzewodowymi, bezbateryjnymi systemami do łączenia nerwów obwodowych

Poznaj metodę stymulacji komórek Schwanna za pomocą nanosekundowego pulsacyjnego pola elektrycznego (nsPEF) do regeneracji nerwów obwodowych in vitro. Badanie wykazuje zwiększoną proliferację i migrację komórek przy niskich skutkach ubocznych.

Regulacja wzrostu komórek Schwanna za pomocą nanosekundowego pulsacyjnego pola elektrycznego do regeneracji nerwów obwodowych in vitro (Wideo) | JoVE Journal

Regulacja wzrostu komórek Schwanna za pomocą nanosekundowego pulsacyjnego pola elektrycznego do regeneracji nerwów obwodowych in vitro

Przeglądaj więcej filmów