Analiza ilościowa stabilizacji błony retikulum endoplazmatycznego (MAM) związanej z mitochondriami w neuronalnym modelu choroby Alzheimera (AD)
January 10th, 2025
Tutaj opisujemy pomiar szybkości transportu aksonów konstytutywnych stabilizatorów błon retikulum endoplazmatycznego (ER) związanych z mitochondriami (MAM) poprzez zwiększanie lub utrzymywanie neurotoksycznego generowania β-amyloidu (Aβ) z neuronów choroby Alzheimera (AD) w czasie rzeczywistym, aby służyć jako bezpośredni i ilościowy wskaźnik do pomiaru stabilizacji MAM i wspomagania rozwoju terapii AD.
Staramy się ilościowo zmierzyć stabilność błon ER związanych z mitochondriami o różnej grubości lub szerokości szczelin, co jest ważne w regulacji patofizjologii kilku chorób neurodegeneracyjnych, w tym AD. Ostatnie badania nad błonami ER związanymi z mitochondriami, często nazywanymi MAM, opisały je jako jeden z kluczowych czynników inicjujących patologię amyloidu we wczesnym stadium choroby Alzheimera. Odkrycia doprowadziły do opracowania nowej hipotezy zwanej hipotezą MAM, która sugeruje, że choroba Alzheimera jest wyłącznie chorobą związaną z MAM.
Nasz protokół jest pierwszym, który zapewnia ilościowe narzędzie do pomiaru stabilizacji MAM w żywych komórkach, co do tej pory pozostawało wyzwaniem. Największą zaletą naszego protokołu jest to, że wykorzystuje on wewnętrzną dynamiczną właściwość mitochondriów do ilościowego pomiaru zmian w stabilizacji MAM po zaciśnięciu lub poluzowaniu szerokości szczeliny MAM w żywych komórkach.
W najbliższej przyszłości skupiamy się na ulepszeniu i zastosowaniu naszych najnowocześniejszych technik obrazowania żywych komórek i techniki kymograficznej do badań przesiewowych serii zatwierdzonych przez FDA syntetycznych lub naturalnych małocząsteczkowych modulatorów receptora MAM lub MAM związanego z receptorem sigma one, przy użyciu niedawno opracowanej platformy badań przesiewowych leków w kierunku choroby Alzheimera i zrozumienia ich mechanizmu działania.
[Narrator] Aby przetoczyć transfekcję komórek stabilizatorami MAM, zastąp mieszaninę jednojądrzastą szpiku kostnego dwoma mililitrami pożywki DMEM-F12 o temperaturze pokojowej w każdym dołku. Połączyć odczynnik nukleofektorowy z suplementem jeden w stosunku 4,5 do jednego. Dodać 100 mikrolitrów odczynnika nucleofector do mieszaniny. Następnie zwiruj roztwór DNA. Dodaj od jednego do pięciu mikrogramów DNA na zabieg do oddzielnych mililitrowych mikroprobówek wirówkowych dla każdej transfekcji. Po zaessaniu istniejących pożywek z komórek, umyj komórki raz 10 mililitrami PBS. Odessać PBS i dodać jeden mililitr akutazy bezpośrednio do komórek. Inkubuj komórki przez pięć do 10 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie delikatnie postukaj w bok naczynia, aby usunąć komórki. Pod mikroskopem sprawdź, czy komórki są rozluźnione i swobodnie przepływają. Zneutralizować substancje drażniące za pomocą 10 mililitrów pożywki DMEM-F12 i przenieść zawiesinę komórek do czystej 15-mililitrowej probówki. Następnie weź 10 mikrolitrów zawieszonych komórek i dodaj je do strony A komory do liczenia komórek. Następnie włóż stronę A napełnionej komory do głównego gniazda z przodu licznika komórek. Naciśnij przycisk Zmierz i zapisz liczbę komórek na mililitr. Odwirować wymaganą liczbę komórek przy 300 G przez pięć minut. Następnie ostrożnie odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 100 mikrolitrach mieszanki nukleofektorowej na każdą elektroporację. Następnie dodaj 100 mikrolitrów zawieszonej zawiesiny komórek do jednej z probówek zawierających DNA. Wymieszać, kilkakrotnie pipetując roztwór. Następnie przenieś mieszaninę komórek DNA do kuwety do elektroporacji i zamknij ją dołączoną pokrywką. Wybierz odpowiedni program nucleofector na urządzeniu. Natychmiast dodaj około 500 mikrolitrów DMEM z wstępnie napełnionej sześciodołkowej płytki do kuwety za pomocą sterylnych pipet. Delikatnie wymieszać raz i przenieść elektroporowane ogniwa i pożywkę do odpowiedniej studzienki. Aby rozpocząć, umieść sześciodołkową płytkę zawierającą komórki w komorze mikroskopu i dostosuj ostrość mikroskopu, aż komórki staną się widoczne. Aby przechwycić sygnał białka czerwonej fluorescencji, należy wzbudzić fluorofor za pomocą lasera o długości 594 nanometrów i ustawić emisję na 570 do 640 nanometrów. W przypadku białka zielonej fluorescencji należy użyć lasera o długości fali 488 nanometrów do wzbudzenia z emisją od 510 do 540 nanometrów. Przytnij obszar skanowania, aby dopasować go do aksonu. Mniejszy obszar skanowania skróci czas przetwarzania i uprości generowanie kimografii. Ustaw interwał na jedną klatkę na sekundę, a całkowity czas trwania na 181 sekund. Kliknij uruchom, aby rozpocząć proces. Prędkość aksonalna mitochondriów związanych z MAM 1X została zmniejszona o 50% w porównaniu z mitochondriami wolnymi i związanymi z MAM 9X. 26,6% mitochondriów MAM 1X było ruchomych w porównaniu z 53,82% mitochondriów wolnych i 44,79% mitochondriów MAM 9X. Ruch wsteczny był niższy dla mitochondriów MAM 1X niż mitochondriów Mito-RFP i mitochondriów MAM 9X. Ruch następczy mitochondriów MAM 1X był również zmniejszony w porównaniu z Mito-RFP. Stacjonarny odsetek mitochondriów MAM 1X był znacznie wyższy niż mitochondriów MAM 9X, co odzwierciedla zmniejszenie ruchliwości, podczas gdy ogólna szybkość mitochondriów MAM 1X była znacznie niższa niż mitochondriów MAM 9X.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Niniejsza praca prezentuje nowatorski protokół do ilościowego pomiaru stabilizacji błon retikulum endoplazmatycznego związanych z mitochondriami (MAM) w żywych neuronach, szczególnie w kontekście choroby Alzheimera (AD). Metoda wykorzystuje obrazowanie w czasie rzeczywistym do oceny wpływu generowania neurotoksycznego β-amyloidu i ma na celu poprawę rozwoju terapii dla AD.
Kluczowe Elementy Badania
Obszar Nauki
- Neurobiologia
- Biologia Komórkowa
- Choroby neurodegeneracyjne
Tło
- Błony ER związane z mitochondriami (MAM) odgrywają kluczową rolę w inicjacji patologii amyloidowej w AD.
- Hipoteza MAM sugeruje, że AD to zasadniczo choroba związana z dysfunkcją MAM.
- Dotychczas brakowało ilościowych metod pomiaru stabilizacji MAM w żywych komórkach.
- Niniejsze badanie ma na celu wypełnienie tej luki za pomocą innowacyjnych technik obrazowania.
Cel Badania
- Opracowanie narzędzia ilościowego do oceny stabilizacji MAM w czasie rzeczywistym.
- Zbadanie wpływu syntetycznych i naturalnych modulatorów małych cząsteczek na MAM.
- Zrozumienie mechanizmów działania potencjalnych terapii AD.
Metody Użyte
- Badanie wykorzystuje najnowocześniejsze techniki obrazowania żywych komórek i kymograficzne.
- Model biologiczny obejmuje żywe komórki neuronalne poddawane manipulacjom szerokości szczeliny MAM.
- Nie wspomniano o przepływach multiomicznych.
- Kluczowe etapy obejmują transfekcję komórek stabilizatorami MAM i rejestrowanie sygnałów fluorescencyjnych przez określony czas trwania.
- Analizy koncentrują się na pomiarze prędkości transportu aksonalnego mitochondriów związanych z różnymi stanami MAM.
Główne Wyniki
- Pomiary ilościowe ujawniły znaczące różnice w ruchliwości mitochondriów w komórkach o różnej stabilizacji MAM.
- Oceniono prędkość aksonalną mitochondriów związanych z MAM, wskazując na zmniejszoną ruchliwość w określonych warunkach eksperymentalnych.
- Wyniki te sugerują, że stabilizacja MAM wywiera głęboki wpływ na dynamikę mitochondriów, co może mieć implikacje w procesach neurodegeneracyjnych.
Wnioski
- Niniejsze badanie ustanawia krytyczną metodę pomiaru stabilizacji MAM, która jest niezbędna do zrozumienia patologii AD.
- Chociaż nie przeprowadzono analizy multiomicznej, wyniki dostarczają wglądów istotnych dla opracowywania nowych strategii terapeutycznych dla AD.
- Badanie podkreśla znaczenie MAM w zdrowiu i szlakach chorobowych neuronów.
Najczęściej Zadawane Pytania
Executive Industry Relevance
Quantitative analysis of MAM stabilization in live neural models addresses a critical gap in early Alzheimer's disease (AD) research by enabling direct measurement of subcellular interactions implicated in disease initiation. This capability enhances predictive confidence in target validation and supports mechanistic de-risking at the discovery stage. The method's quantitative outputs inform portfolio triage and prioritization for neurodegenerative disease programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables quantitative interrogation of the MAM hypothesis in AD pathogenesis.
- Supports functional target validation by measuring the impact of MAM stabilization on mitochondrial dynamics.
- Facilitates mechanistic de-risking by distinguishing effects of tight versus loose MAM gap widths.
- Provides predictive confidence for advancing MAM-related targets in neurodegeneration pipelines.
Screening & Assay Development
- Prepares validated 3D neural systems for compound screening targeting MAM stabilization.
- Delivers reproducible, quantitative readouts of mitochondrial motility for assay standardization.
- Enables high-content screening of small molecule modulators affecting MAMs or sigma one receptor.
- Supports reliable evaluation of compound effects on subcellular dynamics relevant to AD.
Translational & Preclinical Research
- Aligns disease-relevant cellular phenotypes with translational biomarker development in AD.
- Provides continuity from discovery-stage mechanistic insights to preclinical validation of MAM-targeted interventions.
- Informs risk-adjusted advancement decisions for neurodegenerative disease assets.
- Strengthens predictive de-risking by linking subcellular stabilization to functional neuronal outcomes.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling hypothesis testing, target validation, and compound screening in disease-relevant neural models.
- Discovery Biology: Quantifies MAM stabilization to clarify the role of ER-mitochondria interactions in AD initiation.
- Screening: Provides standardized, quantitative motility metrics for compound evaluation in 3D neural systems.
- Analytics: Generates kymographic and live-cell imaging data to compare mitochondrial dynamics across experimental conditions.
- Translational Research: Bridges mechanistic findings to preclinical models by aligning cellular phenotypes with disease progression.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for screening and mechanistic studies in neurodegeneration research portfolios.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in AD target validation.
- Operational Value: Standardizes live-cell imaging and quantitative analysis for reproducible, scalable workflows.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient advancement of neurodegenerative disease programs.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and cross-program learning in neurodegeneration pipelines.
Implementation Considerations
- Requires expertise in live-cell imaging, kymography, and neural cell culture.
- Demands access to fluorescence microscopy with environmental control and FACS instrumentation.
- Necessitates cross-team standardization of imaging parameters and quantitative analysis protocols.
- Adaptation to other disease models may require optimization of cell systems and MAM stabilizer constructs.
- Throughput may be limited by imaging and analysis capacity in large-scale screening contexts.
