Analiza ilościowa stabilizacji błony retikulum endoplazmatycznego (MAM) związanej z mitochondriami w neuronalnym modelu choroby Alzheimera (AD)
10 stycznia 2025
Tutaj opisujemy pomiar szybkości transportu aksonów konstytutywnych stabilizatorów błon retikulum endoplazmatycznego (ER) związanych z mitochondriami (MAM) poprzez zwiększanie lub utrzymywanie neurotoksycznego generowania β-amyloidu (Aβ) z neuronów choroby Alzheimera (AD) w czasie rzeczywistym, aby służyć jako bezpośredni i ilościowy wskaźnik do pomiaru stabilizacji MAM i wspomagania rozwoju terapii AD.
Staramy się ilościowo zmierzyć stabilność błon ER związanych z mitochondriami o różnej grubości lub szerokości szczelin, co jest ważne w regulacji patofizjologii kilku chorób neurodegeneracyjnych, w tym AD. Ostatnie badania nad błonami ER związanymi z mitochondriami, często nazywanymi MAM, opisały je jako jeden z kluczowych czynników inicjujących patologię amyloidu we wczesnym stadium choroby Alzheimera. Odkrycia doprowadziły do opracowania nowej hipotezy zwanej hipotezą MAM, która sugeruje, że choroba Alzheimera jest wyłącznie chorobą związaną z MAM.
Nasz protokół jest pierwszym, który zapewnia ilościowe narzędzie do pomiaru stabilizacji MAM w żywych komórkach, co do tej pory pozostawało wyzwaniem. Największą zaletą naszego protokołu jest to, że wykorzystuje on wewnętrzną dynamiczną właściwość mitochondriów do ilościowego pomiaru zmian w stabilizacji MAM po zaciśnięciu lub poluzowaniu szerokości szczeliny MAM w żywych komórkach.
W najbliższej przyszłości skupiamy się na ulepszeniu i zastosowaniu naszych najnowocześniejszych technik obrazowania żywych komórek i techniki kymograficznej do badań przesiewowych serii zatwierdzonych przez FDA syntetycznych lub naturalnych małocząsteczkowych modulatorów receptora MAM lub MAM związanego z receptorem sigma one, przy użyciu niedawno opracowanej platformy badań przesiewowych leków w kierunku choroby Alzheimera i zrozumienia ich mechanizmu działania.
[Narrator] Aby przetoczyć transfekcję komórek stabilizatorami MAM, zastąp mieszaninę jednojądrzastą szpiku kostnego dwoma mililitrami pożywki DMEM-F12 o temperaturze pokojowej w każdym dołku. Połączyć odczynnik nukleofektorowy z suplementem jeden w stosunku 4,5 do jednego. Dodać 100 mikrolitrów odczynnika nucleofector do mieszaniny. Następnie zwiruj roztwór DNA. Dodaj od jednego do pięciu mikrogramów DNA na zabieg do oddzielnych mililitrowych mikroprobówek wirówkowych dla każdej transfekcji. Po zaessaniu istniejących pożywek z komórek, umyj komórki raz 10 mililitrami PBS. Odessać PBS i dodać jeden mililitr akutazy bezpośrednio do komórek. Inkubuj komórki przez pięć do 10 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie delikatnie postukaj w bok naczynia, aby usunąć komórki. Pod mikroskopem sprawdź, czy komórki są rozluźnione i swobodnie przepływają. Zneutralizować substancje drażniące za pomocą 10 mililitrów pożywki DMEM-F12 i przenieść zawiesinę komórek do czystej 15-mililitrowej probówki. Następnie weź 10 mikrolitrów zawieszonych komórek i dodaj je do strony A komory do liczenia komórek. Następnie włóż stronę A napełnionej komory do głównego gniazda z przodu licznika komórek. Naciśnij przycisk Zmierz i zapisz liczbę komórek na mililitr. Odwirować wymaganą liczbę komórek przy 300 G przez pięć minut. Następnie ostrożnie odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 100 mikrolitrach mieszanki nukleofektorowej na każdą elektroporację. Następnie dodaj 100 mikrolitrów zawieszonej zawiesiny komórek do jednej z probówek zawierających DNA. Wymieszać, kilkakrotnie pipetując roztwór. Następnie przenieś mieszaninę komórek DNA do kuwety do elektroporacji i zamknij ją dołączoną pokrywką. Wybierz odpowiedni program nucleofector na urządzeniu. Natychmiast dodaj około 500 mikrolitrów DMEM z wstępnie napełnionej sześciodołkowej płytki do kuwety za pomocą sterylnych pipet. Delikatnie wymieszać raz i przenieść elektroporowane ogniwa i pożywkę do odpowiedniej studzienki. Aby rozpocząć, umieść sześciodołkową płytkę zawierającą komórki w komorze mikroskopu i dostosuj ostrość mikroskopu, aż komórki staną się widoczne. Aby przechwycić sygnał białka czerwonej fluorescencji, należy wzbudzić fluorofor za pomocą lasera o długości 594 nanometrów i ustawić emisję na 570 do 640 nanometrów. W przypadku białka zielonej fluorescencji należy użyć lasera o długości fali 488 nanometrów do wzbudzenia z emisją od 510 do 540 nanometrów. Przytnij obszar skanowania, aby dopasować go do aksonu. Mniejszy obszar skanowania skróci czas przetwarzania i uprości generowanie kimografii. Ustaw interwał na jedną klatkę na sekundę, a całkowity czas trwania na 181 sekund. Kliknij uruchom, aby rozpocząć proces. Prędkość aksonalna mitochondriów związanych z MAM 1X została zmniejszona o 50% w porównaniu z mitochondriami wolnymi i związanymi z MAM 9X. 26,6% mitochondriów MAM 1X było ruchomych w porównaniu z 53,82% mitochondriów wolnych i 44,79% mitochondriów MAM 9X. Ruch wsteczny był niższy dla mitochondriów MAM 1X niż mitochondriów Mito-RFP i mitochondriów MAM 9X. Ruch następczy mitochondriów MAM 1X był również zmniejszony w porównaniu z Mito-RFP. Stacjonarny odsetek mitochondriów MAM 1X był znacznie wyższy niż mitochondriów MAM 9X, co odzwierciedla zmniejszenie ruchliwości, podczas gdy ogólna szybkość mitochondriów MAM 1X była znacznie niższa niż mitochondriów MAM 9X.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia nowy protokół do ilościowego pomiaru stabilizacji błon retikulum endoplazmatycznego powiązanych z mitochondriami (MAMs) w żywych neuronach, szczególnie w kontekście choroby Alzheimera (AD). Metoda ta wykorzystuje obrazowanie w czasie rzeczywistym do oceny skutków powstawania neurotoksycznego β-amyloidu i ma na celu wsparcie rozwoju metod terapeutycznych w chorobie AD.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Choroby neurodegeneracyjne
Wprowadzenie
- Błonami siateczki śródplazmatycznej powiązanej z mitochondriami (MAMs) odgrywają kluczową rolę w inicjacji patologii amyloidowej w chorobie Alzheimera (AD).
- Hipoteza MAM sugeruje, że AD jest w swej istocie chorobą związaną z dysfunkcją MAM.
- Wcześniej brakowało ilościowych metod pomiaru stabilizacji MAM w żywych komórkach.
- Niniejsze badanie ma na celu wypełnienie tej luki przy użyciu innowacyjnych technik obrazowania.
Cel badania
- Opracowanie narzędzia ilościowego do oceny stabilizacji MAM w czasie rzeczywistym.
- Zbadanie wpływu syntetycznych i naturalnych małocząsteczkowych modulatorów na MAM.
- Zrozumienie podstawowych mechanizmów działania potencjalnych terapeutyków w chorobie AD.
Zastosowane metody
- W badaniu zastosowano najnowocześniejsze techniki obrazowania żywych komórek oraz kymografii.
- Model biologiczny obejmuje żywe komórki neuronalne poddane manipulacjom szerokości szczelin MAM.
- Nie wspomniano o żadnych przepływach pracy multiomicznych.
- Kluczowe etapy obejmują transfekcję komórek stabilizatorami MAM oraz rejestrację sygnałów fluorescencyjnych przez określony czas.
- Analizy koncentrują się na pomiarze szybkości transportu aksonalnego mitochondriów powiązanych z różnymi stanami MAM.
Główne wyniki
- Pomiary ilościowe wykazały istotne różnice w ruchliwości mitochondriów w komórkach o różnym stopniu stabilizacji MAM.
- Oceniono prędkość aksonalną mitochondriów związanych z MAM, co wskazało na ograniczoną ruchliwość w określonych warunkach eksperymentalnych.
- Wyniki te sugerują, że stabilizacja MAM ma głęboki wpływ na dynamikę mitochondriów, co może mieć znaczenie w procesach neurodegeneracyjnych.
Wnioski
- Niniejsze badanie wprowadza kluczową metodę pomiaru stabilizacji MAM, co jest niezbędne dla zrozumienia patologii AD.
- Mimo że nie wykorzystano analizy multiomicznej, wyniki dostarczają informacji istotnych dla opracowywania nowych strategii terapeutycznych w AD.
- Badanie podkreśla znaczenie MAM w utrzymaniu zdrowia neuronów oraz w przebiegu procesów chorobowych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ilościowa analiza stabilizacji MAM w żywych modelach neuronalnych wypełnia krytyczną lukę w badaniach nad wczesnym stadium choroby Alzheimera (AD), umożliwiając bezpośredni pomiar interakcji podkomórkowych zaangażowanych w inicjację choroby. Możliwość ta zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów terapeutycznych i wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego na etapie odkrywania leków. Ilościowe wyniki tej metody dostarczają informacji niezbędnych do selekcji i priorytetyzacji projektów w ramach programów badawczych nad chorobami neurodegeneracyjnymi.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia ilościową weryfikację hipotezy MAM w patogenezie AD.
- Wspiera funkcjonalną walidację celów poprzez pomiar wpływu stabilizacji MAM na dynamikę mitochondriów.
- Ułatwia mechanistyczną redukcję ryzyka poprzez rozróżnienie efektów wąskiej i szerokiej szczeliny MAM.
- Zapewnia pewność prognostyczną w procesie wdrażania celów związanych z MAM w programach badawczych nad neurodegeneracją.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Przygotowuje zwalidowane trójwymiarowe (3D) systemy neuronalne do przesiewania związków ukierunkowanego na stabilizację MAM.
- Zapewnia powtarzalne, ilościowe odczyty motylości mitochondriów w celu standaryzacji testu.
- Umożliwia wysokoprzepustowe przesiewanie (high-content screening) małocząsteczkowych modulatorów wpływających na MAM lub receptor sigma 1.
- Wspiera wiarygodną ocenę wpływu związków na dynamikę subkomórkową istotną dla choroby Alzheimera (AD).
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia dopasowanie fenotypów komórkowych istotnych dla choroby do rozwoju biomarkerów translacyjnych w AD.
- Zapewnia ciągłość przejścia od mechanistycznych spostrzeżeń na etapie odkrywania do przedklinicznej walidacji interwencji celowanych w MAM.
- Wspiera podejmowanie decyzji o rozwoju aktywów w chorobach neurodegeneracyjnych w oparciu o analizę ryzyka.
- Wzmacnia predykcyjną redukcję ryzyka poprzez powiązanie stabilizacji podkomórkowej z funkcjonalnymi efektami neuronalnymi.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum od odkrycia do badań przedklinicznych, umożliwiając testowanie hipotez, walidację celów oraz screening związków w modelach neuronalnych istotnych dla danej jednostki chorobowej.
- Biologia odkrywcza: Ilościowe określenie stabilizacji MAM w celu wyjaśnienia roli oddziaływań między siateczką śródplazmatyczną a mitochondriami w inicjacji choroby AD.
- Przesiewanie: Dostarcza zestandaryzowanych, ilościowych parametrów motoryki do oceny związków w trójwymiarowych układach neuronów.
- Analityka: Generuje dane kymograficzne i obrazy z żywych komórek w celu porównania dynamiki mitochondriów w różnych warunkach eksperymentalnych.
- Badania translacyjne: Łączy wnioski mechanistyczne z modelami przedklinicznymi poprzez powiązanie fenotypów komórkowych z progresją choroby.
- Wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę wielokrotnego użytku do badań przesiewowych i mechanistycznych w ramach portfeli badawczych nad neurodegeneracją.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celów terapeutycznych w chorobie Alzheimera.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje obrazowanie żywych komórek oraz analizę ilościową w celu uzyskania powtarzalnych i skalowalnych przepływów pracy.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie świadomych decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz efektywne kapitałowo rozwijanie programów dotyczących chorób neurodegeneracyjnych.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz wymianę doświadczeń między programami w ramach potoków badawczych nad neurodegeneracją.
Uwagi dotyczące implementacji
- Wymagana jest wiedza z zakresu obrazowania żywych komórek, kimografii oraz hodowli komórek nerwowych.
- Konieczny jest dostęp do mikroskopii fluorescencyjnej z kontrolą środowiska oraz aparatury FACS.
- Wymagana jest międzyzespołowa standaryzacja parametrów obrazowania i protokołów analizy ilościowej.
- Adaptacja do innych modeli chorób może wymagać optymalizacji systemów komórkowych i konstruktów stabilizujących MAM.
- Przepustowość może być ograniczona przez możliwości obrazowania i analizy w kontekście przesiewu na dużą skalę.
