Name: Przenośny papierowy test immunologiczny w połączeniu z aplikacją na smartfony do kolorymetrycznego i ilościowego wykrywania antygenu dengi NS1 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-26T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min
Description: Poznaj przenośny papierowy test immunologiczny z aplikacją mobilną do wykrywania antygenu NS1 wirusa dengi w próbkach surowicy. Ta metoda poprawia czułość diagnostyki w warunkach ograniczonych zasobów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

M.H.P. z wdzięcznością dziękuje za fundusz badawczy z Universitas Islam Indonesia (UII). Autorzy wyrażają wdzięczność panu Nutchanonowi Ninyawee za jego cenną wiedzę i pomoc w trakcie tworzenia aplikacji mobilnej oraz jego wkład w powstanie manuskryptu. Ponadto autorzy doceniają wsparcie finansowe udzielone przez Tajlandzki Fundusz Badań Naukowych i Innowacji (TSRI), Fundusz Badań Podstawowych: Rok podatkowy 2023 (nr projektu. FRB660073/0164) w ramach Programu Inteligentna Opieka Zdrowotna Uniwersytetu Technologicznego Króla Mongkuta w Thonburi.

Komisja Etyki Komisji Rewizyjnej Instytucji, Departament Medyczny Królewskiej Armii Tajlandii, Szpital Phramongkutklao, Bangkok, Tajlandia (IRBRTA 1218/2562) wyraziła zgodę. Przeprowadzając to badanie, przestrzegaliśmy wszystkich niezbędnych przepisów etycznych.
1. Produkcja papierowego testu immunologicznego
UWAGA: Papierowy test immunologiczny został wyprodukowany zgodnie z wcześniej ustalonymi metodami36,37, oraz tajlandzki wniosek patentowy nr 19010081638.
<ol>
	<li>Projekt i rysunek wzoru: Zaprojektuj papierowe urządzenie analityczne (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A,B) z 18 wzorami woskowymi PAD na komputerze. 
	UWAGA: Konstrukcja jest specyficzna i przeznaczona do papieru o rozmiarze A5. Liczba tabletów PAD jest zależna od rozmiaru papieru, zgodnie z wymaganiami użytkownika.</li>
	<li>Wydrukuj zaprojektowany wzór na papierze celulozowym za pomocą drukarki woskowej (Tabela materiałów).</li>
	<li>Papier zadrukowany woskiem należy roztopić w piecu laboratoryjnym przez 75 s w temperaturze 150 °C. Następnie przechowuj go w pudełku z krzemionką, aż będzie potrzebny do kolejnych kroków.</li>
	<li>Nałóż 0,5 μl 0,025% poli-L-lizyny (PLL) zarówno na obszar testowy, jak i kontrolny. Inkubować w temperaturze pokojowej (RT) przez 2 minuty w pojemniku z krzemionką, a następnie podgrzewać w piecu w temperaturze 65 °C przez 5 minut.</li>
	<li>Nałożyć 0,5 μl z 1 μg μL-1 koziego przeciwciała anty-mysiego IgG na obszar kontrolny i 0,5 μl z 1 μg μL-1 przeciwciała wychwytującego na obszar testowy. Pozostaw krople do wyschnięcia w pudełku z żelem krzemionkowym w temperaturze pokojowej przez 30 minut.</li>
	<li>Nanieść 2 μl buforu blokującego na obszar próbki, 3 μl na obszar sprzężonego i 2 μl na obszar wykrywania. Pozostaw krople do wyschnięcia w temperaturze pokojowej w pudełku z żelem krzemionkowym przez 30 minut.</li>
	<li>Nanieść 2 μl roztworu kompleksu nanocząstka-przeciwciało złota (AuNPs-Ab) na obszar koniugatu i pozostawić do wyschnięcia w pudełku z żelem krzemionkowym w temperaturze pokojowej przez 30 minut.</li>
</ol>
2. Montaż papierowego testu immunologicznego
<ol>
	<li>Ostrożnie usuń folię ochronną z odwrotnej strony samoprzylepnej plastikowej karty nośnej, aby odsłonić klej.</li>
	<li>Wyrównaj obrobiony papier celulozowy z samoprzylepną plastikową kartą podkładową i mocno dociśnij obie warstwy do siebie. 
	UWAGA: Unikaj dotykania pola hydrofilowego, aby zminimalizować ryzyko zanieczyszczenia lub uszkodzenia urządzenia.</li>
	<li>Nałóż folię z tworzywa sztucznego, aby pokryć papier i dociśnij je do siebie.</li>
	<li>Wytnij żądany kawałek urządzeń za pomocą nożyczek z arkuszy całkowicie zmontowanych urządzeń.</li>
	<li>DEN-NS1-PADs (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C) są teraz gotowe do użycia. Aby zapewnić długotrwałą stabilność, przechowuj je w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
3. Przygotowanie koniugatu AuNPs-Ab
UWAGA: AuNPs-Ab został przygotowany zgodnie z wcześniejszym opisem Prabowo et al.36.
<ol>
	<li>Połącz 10 μl 1 mg przeciwciała anty-NS1 1 ml w PBS, 1 ml koloidu 40 nm AuNPs i 0,1 ml 0,1 M buforu boranowego (pH 8,5).</li>
	<li>Obracać mieszaninę z prędkością 50 obr./min przez 60 minut i inkubować w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Zastosuj 0,1 ml 10 mg mL-1 BSA w BBS, obracaj z prędkością 50 obr./min i inkubuj w temperaturze RT przez 15 minut.</li>
	<li>Odwirować roztwór o sile 20,187 × g i temperaturze 4 °C przez 30 minut.</li>
	<li>Ostrożnie odpipetować i oddzielić supernatant od wytrąconego AuNPs-Ab.</li>
	<li>Zawiesić AuNPs-Ab w 500 μl BBS i zdyspergować go za pomocą sonikacji.</li>
	<li>Powtórzyć wirowanie w temperaturze 20,187 × g i temperaturze 4 °C przez 30 min. 
	UWAGA: Powtórz procesy dyspersji i wirowania 3x.</li>
	<li>Dodać 50 μl sprzężonego buforu do zawiesiny, przygotowując ją do nałożenia na obszar koniugatu.</li>
</ol>
4. Tworzenie aplikacji mobilnych
<ol>
	<li>Rozwój przetwarzania obrazów i uczenia maszynowego
	<ol>
		<li>Zbierz zestaw danych dla nadzorowanego modelu obrazu, zbierając ponad 900 obrazów DEN-NS1-PAD z autofokusem, rejestrując różne warunki, takie jak różne stężenia, marki aparatów (12-13 megapikseli), obroty (90° i 180°) i ustawienia oświetlenia. Celuj w 30 obrazów w każdych określonych warunkach.</li>
		<li>Oznacz podstawową prawdę, identyfikując i dodając adnotacje do dwóch obszarów zainteresowania jako obszarów testowych i kontrolnych na zebranych obrazach do uczenia nadzorowanego.</li>
		<li>Zaprojektuj algorytm identyfikujący pasek tła. Zlokalizuj linię środkową między regionem testowym i kontrolnym, oblicz jej punkt środkowy i ustal kwadratowy obszar proporcjonalny do średniego rozmiaru dwóch głównych obszarów, zachowując tę samą orientację obrotową.</li>
		<li>Utwórz model segmentacji obrazu, korzystając z zestawu danych i etykiet prawdy podstawowej z kroków 4.1.1 i 4.1.2, aby wytrenować model segmentacji obrazu w celu identyfikacji obszarów zainteresowania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Algorytm aplikacji
	<ol>
		<li>Zastosuj wytrenowany model segmentacji obrazu do nowych obrazów, aby automatycznie zlokalizować regiony testowe, kontrolne i tła.</li>
		<li>Użyj podstawowych technik przetwarzania obrazu, aby uzyskać pojedynczą wartość intensywności dla każdego z trzech obszarów zainteresowania (test, kontrola i tło).</li>
		<li>Przekształć obraz w reprezentację tablicy 3D (kanał y, x), aby uzyskać dostęp do wartości pikseli.</li>
		<li>Przekonwertuj obraz na skalę szarości, uśredniając wartości RGB i zastosuj odwrócenie za pomocą formuły (255-x).</li>
		<li>Znormalizuj wartości obszaru testowego i kontrolnego, odejmując wartość obszaru tła.</li>
		<li>Użyj wcześniej ustalonej krzywej kalibracyjnej, aby obliczyć stężenie NS1.</li>
		<li>Klasyfikuj wyniki jako dodatnie lub ujemne na podstawie wartości odcięcia 0,1103 uzyskanej ze znormalizowanej intensywności skali szarości37.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Krzywa kalibracyjna i czułość
<ol>
	<li>Przygotować próbkę NS1 w surowicy ludzkiej do kalibracji o stężeniach 0, 0,1, 0,2, 0,4, 0,6, 0,8 i 1,0 μg mL-1.</li>
	<li>Upuść 50 μl każdego stężenia na obszar próbki i wykonaj pomiary w trzech egzemplarzach.</li>
	<li>Pozwól, aby próbki całkowicie wsiąkły do urządzenia, co może zająć 20-30 minut, aby uzyskać wyniki.</li>
	<li>Rób zdjęcia urządzenia za pomocą aparatu cyfrowego lub smartfona po 5 minutach inkubacji.</li>
	<li>Analizuj obszary testowe i kontrolne za pomocą ImageJ i niestandardowej aplikacji mobilnej.</li>
	<li>Skonstruuj krzywą kalibracyjną na podstawie danych z ImageJ i aplikacji mobilnej.</li>
	<li>Obliczyć granicę ślepej próby (LOB), granicę wykrywalności (LOD) i granicę oznaczalności (LOQ) za pomocą równań (1-3) poniżej: 
	LOB = średnia danych zerowych + 1:645* ð (odchylenie standardowe danych zerowych) (1) 
	LOD = LOB +1:645*ð (odchylenie standardowe danych dotyczących najniższego stężenia) (2) 
	LOQ = średnia danych zerowych + 10*ð (odchylenie standardowe danych zerowych) (3)</li>
</ol>
6. Przeprowadzanie papierowego testu immunologicznego z próbkami klinicznymi
<ol>
	<li>Pobrać i przetworzyć 300 μl krwi obwodowej od 30 pacjentów w pierwszym dniu hospitalizacji do fioletowych górnych probówek EDTA, zgodnie z dobrymi praktykami klinicznymi.</li>
	<li>Odwirować krew o sile 2,884 × g i temperaturze 4 °C przez 20 minut.</li>
	<li>Przenieś płynny składnik (osocze) do czystej rurki polipropylenowej za pomocą pipety.</li>
	<li>Natychmiast przechowywać osocze w zamrażarce w temperaturze -20 °C w celu późniejszej analizy.</li>
	<li>Nanieś 20 μl osocza na obszar próbki na górze urządzenia. Następnie dodać 30 μl buforu do przemywania (0,05% v/v Tween 20 w 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem).</li>
	<li>Pozwól, aby próbka całkowicie wsiąkła do urządzenia, co może zająć 20-30 minut, aby uzyskać wyniki.</li>
	<li>Rób zdjęcia urządzenia za pomocą aparatu cyfrowego lub smartfona po 5 minutach inkubacji w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Analizuj obszary testowe i kontrolne za pomocą ImageJ i niestandardowej aplikacji mobilnej.</li>
</ol>
7. Kwantyfikacja za pomocą aplikacji mobilnej
UWAGA: Intensywność papierowego testu immunologicznego jest analizowana w aplikacji mobilnej (Rysunek 2).
<ol>
	<li>Otwórz opracowaną aplikację mobilną na smartfonie.</li>
	<li>Wybierz opcję Użyj aparatu lub Przekaż z galerii, aby wybrać lub przekazać źródło danych. Zrób to, przechwytując kamerę lub wybierając obraz z galerii urządzenia.</li>
	<li>Przejdź do sekcji analitycznej i dotknij przycisku Analizuj na ekranie.</li>
	<li>Poczekaj, aż aplikacja przeanalizuje dane i wyświetli wyniki.</li>
</ol>

Smartphone-Integrated Dengue NS1 Paper-Based Diagnostic Device

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Jednym z ważnych parametrów konstrukcyjnych systemu czytników opartego na smartfonach jest możliwość zapewnienia powtarzalnego przetwarzania obrazowego próbek. W tym badaniu, dla uproszczenia i wygody, obrazy zostały wykonane z trzech różnych marek smartfonów z aparatami 12-13 MP bez użycia pudełka do obrazowania lub akcesoriów. Zmienne warunki przechwytywania obrazu, takie jak rozdzielczość aparatu, czas robienia obrazu, warunki oświetleniowe i środowisko, mogą wpływać na intensywność kolorów punktów testowych i kontrolnych na urządzeniu. Wpływ różnych czasów przechwytywania obrazu na oświetlenie i suszenie PAD na intensywność sygnału urządzeń został zminimalizowany dzięki zastosowaniu znormalizowanych intensywności sygnału, które pozostały spójne na obrazach zarejestrowanych w różnych momentach36. Odejmowanie sygnału tła pojawiło się jako strategia mająca na celu zwiększenie dokładności pomiarów intensywności kolorów, skutecznie łagodząc wpływ warunków oświetleniowych. Nasze odkrycie jest zgodne z wcześniejszymi badaniami podkreślającymi skuteczność technik odejmowania linii bazowej lub tła w minimalizowaniu skutków środowiskowych39,40.
Trwająca debata na temat wyższości stosowania urządzenia do obrazowania lub metody bez akcesoriów ma implikacje dla przetwarzania obrazu39,41. Skrzynka do obrazowania może zwiększyć niezawodność wyników przetwarzania obrazowania poprzez zminimalizowanie zmian w warunkach obrazowania 41,42,43. W tym badaniu wykorzystaliśmy aplikację mobilną opartą na uczeniu maszynowym w chmurze do przetwarzania obrazu. To podejście wykorzystuje uczenie maszynowe w ramach platformy opartej na chmurze do automatycznego klasyfikowania, wyodrębniania i wzbogacania danych obrazu. Aplikacja skutecznie zidentyfikowała i przetworzyła obszar zainteresowania na obrazach, obejmujący tło, strefy testowe i kontrolne. Ten krok miał kluczowe znaczenie dla rozróżnienia między tymi strefami38. Wcześniejsze badania sugerują, że przetwarzanie obrazów z wykorzystaniem uczenia maszynowego daje lepszą klasyfikację wyników dla próbek kontrolnych i testowych 43,44,45. W tym badaniu zastosowanie stałej lokalizacji i odejmowania tła wygenerowało spójny sygnał tła z celulozy μPADs, zwiększając spójność i dokładność klasyfikacji odczytów dostarczanych przez aplikację mobilną40,43.
Jeśli chodzi o konsekwentne wyniki w demonstrowaniu testu immunologicznego opartego na papierze, metoda wytwarzania odgrywa ważną rolę. W poprzednim badaniu36 zbadano kilka warunków optymalizacji metody projektowania i wytwarzania DEN-NS1-PAD, takich jak stężenia PLL, substancji blokującej i przeciwciała NS1. Urządzenie z powodzeniem przetestowało NS1 w buforze, hodowli komórkowej i surowicy ludzkiej, zarówno pod względem jakościowym, jak i ilościowym.
Efekty matrycowe wynikające ze składników surowicy mogą zakłócać granicę wykrywalności urządzenia podczas badania próbek surowicy. Wyniki wskazują jednak, że opracowany test immunologiczny może z powodzeniem wykrywać stężenia NS1 w próbkach surowicy, uzyskując wyniki porównywalne z komercyjnym RDT (Tabela 2). Zaobserwowano widoczne wyniki za pomocą oględzin i aplikacji mobilnej (ryc. 4), co podkreśliło skuteczność testu w testach surowicy. Chociaż wyższa lepkość surowicy może mieć wpływ na czas analizy, nie utrudnia interpretacji wyników36. Korzystanie z aplikacji mobilnej może zapewnić bardziej pozytywne wyniki testów próbek, ponieważ korzystanie z aplikacji mobilnej znacznie poprawia czułość testowania próbek46. Warto zauważyć, że potrzebne są dalsze porównania z testami molekularnymi, takimi jak RT-PCR 15,47,48 dla dengi NS1, aby określić potencjalne wyniki fałszywie dodatnie lub fałszywie ujemne.
Zauważalne ograniczenie tego badania pojawia się, gdy rozważa się bardziej złożoną matrycę próbki, taką jak krew. Składniki obecne we krwi mogą rzeczywiście zakłócać granicę wykrywalności urządzenia. W takich przypadkach zastosowanie dodatkowych wkładek chłonnych w celu zwiększenia absorpcji bufora biegowego stanowi potencjalne rozwiązanie. Ta modyfikacja może wspomagać krzepnięcie krwi, wykorzystując właściwości hemostylowe celulozy poprzez wpływ na płytki krwi49. Inne podejście polega na nałożeniu 4% (w/v) kropli soli fizjologicznej na podkładkę z próbką w celu poprawy krzepliwości krwi. Wcześniejsze badania wykazały, że sole takie jak chlorek wapnia i chlorek sodu indukują krzepnięcie czerwonych krwinek (RBC)50,51. Na+ może destabilizować zawieszenie erytrocytów we krwi poprzez tłumienie podwójnej warstwy elektrycznej na powierzchni erytrocytów i zmniejszanie odpychania ładunku między krwinkami czerwonymi. Ponadto wysokie stężenie soli indukuje również agregację krwi52. Co więcej, ładunek przeciwjonowo-walencyjny Na+ tłumi grubość naładowanej podwójnej warstwy RBC, prowadząc do agregacji opróżnionych RBC. Dodatek 4% (w/v) roztworu soli fizjologicznej (NaCl) ułatwia separację osocza na bibułie celulozowej51. Konieczna jest jednak staranna optymalizacja stężenia soli fizjologicznej, aby uniknąć wywoływania niepożądanych skutków dla agregacji krwi i agregacji nanocząstek złota53,54.
Komercyjne drukarki woskowe zapewniały idealne połączenie kosztów i prostoty prototypowania. Ponieważ drukarki te zostały wycofane z produkcji w 2016 r., wymagane były alternatywne metody wytwarzania, takie jak druk atramentowy55, sitodruk56 i fotolitografia57. Biurowa drukarka tonera jest dobrym kandydatem do produkcji μPAD. Żywica poliestrowa zawarta w tonerze tworzy hydrofobowe wzory w temperaturze 200 °C przez 60 minut w różnych wzorach58.
W badaniach wykorzystano przeciwciało NS1 serotyp drugi, zgodnie ze specyfikacją firmy. Odkryliśmy jednak, że przeciwciało to oddziałuje również ze wszystkimi serotypami36,37. Czułość wykrywania DENV-4 jest niższa (87,5%) w porównaniu z innymi serotypami. Czułość DENV-1 i DENV-2 wynosi około 88,89%, a dla DENV-3 100%37. Wyniki te są zgodne z wcześniejszymi badaniami, które również wykazały niższą wrażliwość RDT na DENV-4 w porównaniu z innymi serotypami59. Ogólna czułość urządzenia wynosi ~88,89%, przy swoistości około 86,67%. Warto zauważyć, że rzeczywista czułość DEN-NS1-PAD może przewyższać komercyjną RDT. Jednak RDT wykazuje dodatnią wartość predykcyjną (PPV) na poziomie 84,62% i dokładność na poziomie 87,67%. Warto zauważyć, że DEN-NS1-PAD działał lepiej w wykrywaniu infekcji dengą w ciągu pierwszych 5-6 dni, podczas gdy RDT jest skuteczny tylko w ciągu pierwszych 5 dni37.
Podsumowując, połączenie przenośnego papierowego testu immunologicznego (DEN-NS1-PAD) z aplikacją na smartfony jest bardzo obiecujące w pomiarze dengi NS1. Aplikacja mobilna znacznie zwiększa czułość i skuteczność ilościowego oznaczania NS1 w próbkach surowicy w porównaniu z obserwacją gołym okiem. Korzyści płynące z aplikacji mobilnej obejmują skrócony czas analizy, łatwość obsługi i kompatybilność z różnymi urządzeniami smartfonów, pozycjami i warunkami oświetleniowymi. Potrzebne jest jednak dalsze ulepszenie, aby poprawić czułość i wydajność. Tymczasem modyfikacja papierowego testu immunologicznego jest konieczna, aby poprawić jego wydajność w przypadku próbek krwi. Ponadto wymagana jest kompleksowa ocena DEN-NS1-PAD w celu wykrywania dengi przy użyciu większej liczby serotypów pierwotnego zakażenia i wybranych próbek pobranych od różnych pacjentów (dzieci i dorosłych).

Zakażenie wirusem dengi (DENV) jest najszybciej rozprzestrzeniającą się chorobą przenoszoną przez komary1, a ponad 390 milionów ludzi jest zarażonych 96 milionami objawowych infekcji, 2 miliony przypadków ciężkiej choroby i ponad 25 000 zgonów rocznie występuje na świecie1,2. Według Światowej Organizacji Zdrowia (WHO) szacuje się, że 3,9 miliarda ludzi jest zagrożonych dengą; ~70% mieszka w krajach Azji i Pacyfiku, głównie w Azji Południowo-Wschodniej3. W 2019 roku liczba przypadków dengi zgłoszonych do WHO wyniosła 4,2 miliona, a Tajlandia przyczyniła się do co najmniej 136 000 przypadków dengi i 144 przypadków zgonów z powodu zakażenia dengą4. Epidemia dengi w Tajlandii występuje w porze deszczowej, od kwietnia do grudnia, zarówno na obszarach miejskich, jak i wiejskich, zwłaszcza w obszarze północno-wschodnim.
Infekcje DENV mają różne objawy kliniczne, począwszy od objawów subklinicznych, łagodnej gorączki denga (DF) do ciężkiej gorączki krwotocznej dengi (DHF). Główną cechą ciężkiego stanu DHF jest zwiększona przepuszczalność naczyń krwionośnych, po której następuje wstrząs i dysfunkcja narządów1. Zrozumienie szlaku molekularnego, który może powodować przeciek naczyniowy, jest bardzo ważne w opracowywaniu skutecznych metod leczenia dengi. Niestrukturalne białko dengi 1 (NS1) jest glikoproteiną wydzielaną podczas wczesnej infekcji wirusowej5,6 i działa jako kofaktor replikacji wirusowego RNA7. NS1 może wyzwalać uwalnianie cytokin i przyczyniać się do przeciekania naczyń krwionośnych poprzez wiązanie się z receptorem toll-like 4 (TLR4) i glikokaliksem śródbłonkowym8,9. Badania in vitro wykazały, że NS1 oddziałuje z komórkami śródbłonka i indukuje apoptozę. Ten stan może przyczyniać się do dysfunkcji śródbłonka i nieszczelności naczyniowej10. Poziomy antygenu NS1, skorelowane z poziomami interleukiny (IL)-10 w surowicy, były znacznie zwiększone u pacjentów z ciężką chorobą kliniczną11. Denga NS1 przyczynia się również do patogenezy choroby poprzez indukcję IL-10 i tłumienie odpowiedzi limfocytów T specyficznych dla DENV12,13. Ponadto białko NS1 dengi było związane z ciężką kliniczną chorobą, a stężenie NS1 > 600 ng mL-1 w pierwszych 3 dniach choroby było związane z rozwojem DHF14.
Trwałość antygenu NS1 dengi u pacjentów z DHF może być wykorzystana jako marker ciężkiej postaci dengi6. Istnieje kilka metod wykrywania NS1 w próbkach klinicznych, takich jak test immunoenzymatyczny (ELISA) i szybki test15. Złotym standardem pomiaru stężenia białek NS1 w warunkach klinicznych jest metoda ELISA. Jednak metoda ELISA jest kosztowna i wymaga wykwalifikowanego personelu oraz zaplecza laboratoryjnego16. W związku z tym nadal trwają prace nad technologią wykrywania i ilościowego oznaczania białek NS1 w teście przyłóżkowym (POCT). W ciągu ostatniej dekady testy immunologiczne oparte na papierze, takie jak testy przepływu bocznego (LFA) i mikroprzepływowe urządzenia analityczne oparte na papierze (μPADs), stały się popularne jako testy diagnostyczne ze względu na ich prostotę, szybkość, niekoszt i swoistość17,18,19. W papierowym teście immunologicznym do generowania sygnałów użyto kilku etykiet, takich jak nanocząstki złota (AuNPs)20, nanocząstki magnetyczne21,22, kropki kwantowe23 i materiały fluorescencyjne24,25. AuNP są najczęstszymi etykietami stosowanymi w papierowych testach immunologicznych ze względu na ich niedrogie koszty produkcji, łatwość wytwarzania, stabilność i prosty odczyt. Obecnie testy przepływu bocznego (LFA) dla dengi NS1 są powszechnie stosowane w warunkach klinicznych26,27. Jednak konwencjonalne wykrywanie etykiet LFA zwykle odbywa się gołym okiem i zapewnia tylko wyniki jakościowe.
W ciągu ostatniej dekady, ponad 5 miliardów smartfonów było szeroko używanych na całym świecie, a istnieje potencjał do rozwoju przenośnego wykrywania28,29. Smartfony mają wielofunkcyjne możliwości, takie jak wbudowane czujniki fizyczne, procesory wielordzeniowe, aparaty cyfrowe, porty USB, porty audio, łączność bezprzewodowa i oprogramowanie użytkowe, dzięki czemu nadają się do użytku na różnych platformach biosensorów30. Ponadto technologie bezprzewodowe umożliwiają szybkie przesyłanie danych i mogą być wykorzystywane do monitorowania w czasie rzeczywistym i na miejscu31. Mudanyali i in. połączyli papierowy test immunologiczny i smartfony, aby opracować przenośną, bezsprzętową, szybką, tanią i przyjazną dla użytkownika platformę POCT dla malarii, gruźlicy i HIV32. Ling i wsp. opisali test przepływu bocznego w połączeniu z kamerą smartfona w celu ilościowego wykrycia aktywności fosfatazy alkalicznej w mleku33. Hou i wsp. opracowali również oparty na smartfonie, dwumodalny system obrazowania dla ilościowych sygnałów z barwy lub fluorescencji w teście przepływu bocznego34. Ponadto użycie smartfona jako czytnika kolorymetrycznego i ilościowego może poprawić czułość, podczas gdy gołym okiem nie można z całą pewnością zgłosić obecności target35.
Prezentując przełom w diagnostyce dengi, DEN-NS1-PAD36,37,38 (zwane dalej urządzeniem) oferuje przenośne i wydajne rozwiązanie. Wykorzystując technologię opartą na papierze mikroprzepływowym drukowanym woskiem, urządzenie to określa ilościowo NS1 z wysoką czułością i swoistością poprzez przetwarzanie obrazu. Aby jeszcze bardziej zwiększyć jego użyteczność, opracowaliśmy przyjazną dla użytkownika aplikację na smartfony do odczytu kolorymetrycznego i ilościowego. Walidacja kliniczna z wykorzystaniem próbek pobranych od pacjentów ze szpitali w Tajlandii podkreśla jej natychmiastowy wpływ na ocenę pacjenta w czasie rzeczywistym. Nasza innowacja stanowi kluczowy postęp w usprawnionym zarządzaniu dengą w miejscu opieki nad pacjentem, obiecując zrewolucjonizowanie diagnostyki w środowiskach opieki zdrowotnej o ograniczonych zasobach.

<table><tbody><tr><td>Materiały</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,1 M sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS, pH 7,2)&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BBS zawierający 0,1% Tween 20, 10% sacharozy i 1% kazeiny&nbsp;</td><td></td><td></td><td>&nbsp; obszar sprzężony traktowany i blokujący bufor</td></tr><tr><td>soli fizjologicznej buforowanej boranem (BBS) (25 mM boranu sodu i 150 mM chlorku sodu o pH 8,2) uzupełniony 1% BSA&nbsp;</td><td></td><td></td><td>bufor płuczący podczas procesu koniugacji AuNPs z przeciwciałem</td></tr><tr><td>Kwas borowy</td><td>Merck</td><td>10043-35-3</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca frakcja albuminy V (BSA)&nbsp; &nbsp;</td><td>PAA Lab GmbH (Niemcy)</td><td>K41-001&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Kazeina</td><td>Merck</td><td>9005-46-3</td><td></td></tr><tr><td>Bibuła chromatograficzna klasy 2&nbsp;</td><td>GE Opieka zdrowotna</td><td>3002-911&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Przezroczysta folia laminowana</td><td>3M (sklepy papiernicze)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wodorofosforan disodowy</td><td>Merck</td><td>7558-79-4</td><td></td></tr><tr><td>Podwójna taśma boczna</td><td>Sklepy papiernicze</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kozie przeciwciało anty-mysie IgG&nbsp;</td><td>MyBiosource (USA)</td><td>MBS435013</td><td></td></tr><tr><td>Nanocząstki złota (40 nm)&nbsp; &nbsp;</td><td>Serve Science Co., Ltd. (Tajlandia)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ludzkie przeciwciało poliklonalne IgG&nbsp; &nbsp;</td><td>Merck</td><td>AG711-M</td><td></td></tr><tr><td>Mysie przeciwciało monoklonalne przeciwko dendze NS1&nbsp;</td><td>MyBiosource (USA)</td><td>MBS834415</td><td></td></tr><tr><td>Mysie przeciwciało monoklonalne przeciwko dendze NS1&nbsp;</td><td>MyBiosource (USA)</td><td>MBS834236</td><td></td></tr><tr><td>Antygeny serotypu 2 NS1</td><td>MyBiosource (USA)</td><td>MBS 568697</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1X zawierające 0,1% Tween 20 został użyty jako</td><td></td><td></td><td>bufor elucyjny</td></tr><tr><td>Plastikowa karta nośna 10x30 cm</td><td>Pacific Biotech Co., Ltd. (Tajlandia)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-lizyna (PLL)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4832</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Merck</td><td>104936</td><td></td></tr><tr><td>Monofosforan potasu</td><td>Merck</td><td>104877</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Merck</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Tetraboran sodu&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1303-96-4</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Merck</td><td>57-50-1</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>9005-64-5</td><td></td></tr><tr><td>Instruments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CytationTM 5 czytnik wielomodowy</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Telefony komórkowe</td><td>Huawei Y7, iPhone 11, Samsung a20</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Skaner fotograficzny</td><td>Epson Perfection V30</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Piekarnik</td><td>Memmert</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Drukarka woskowa&nbsp;</td><td>Oprogramowanie Xerox ColorQube 8880-PS</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Could AutoML Vision Object Detection Documentation</td><td>Google Cloud</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institute of Health, Bethesda, MD, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie</td><td></td><td></td><td></td> Inkscape 0.91</tr></tbody></table>

przenośny papierowy test immunologiczny w połączeniu z aplikacją na smartfony do kolorymetrycznego i ilościowego wykrywania antygenu dengi ns1

Portable Paper-Based Immunoassay Combined with Smartphone Application for Colorimetric and Quantitative Detection of Dengue NS1 Antigen

Zakażenie wirusem dengi (DENV), które jest przenoszone przez komary Aedes, jest głównym problemem zdrowia publicznego w krajach tropikalnych i subtropikalnych. Przy rocznej zapadalności wynoszącej około 10 milionów przypadków i 20 000-25 000 zgonów, szczególnie wśród dzieci, istnieje pilne zapotrzebowanie na praktyczne narzędzia diagnostyczne. Obecność niestrukturalnego białka dengi 1 (NS1) we wczesnym okresie infekcji została powiązana z uwalnianiem cytokin, wyciekiem naczyniowym i dysfunkcją śródbłonka, co czyni go potencjalnym markerem ciężkiej postaci dengi. 
Papierowe testy immunologiczne, takie jak testy przepływu bocznego (LFA) i mikroprzepływowe urządzenia analityczne oparte na papierze (PADs) zyskały popularność jako testy diagnostyczne ze względu na ich prostotę, szybkość, taniość, specyficzność i łatwość interpretacji. Jednak konwencjonalne testy immunologiczne na papierze do wykrywania dengi NS1 zazwyczaj opierają się na oględzinach, dając tylko wyniki jakościowe. Aby rozwiązać to ograniczenie i zwiększyć czułość, zaproponowaliśmy wysoce przenośny test wykrywania dengi NS1 na papierowym urządzeniu analitycznym (PAD), a mianowicie DEN-NS1-PAD, który integruje aplikację na smartfony jako czytnik kolorymetryczny i ilościowy. System rozwoju umożliwia bezpośrednią kwantyfikację stężeń NS1 w próbkach klinicznych. 
Próbki surowicy i krwi pobrane od pacjentów zostały wykorzystane do zademonstrowania działania prototypu systemu. Wyniki uzyskano natychmiast i można je wykorzystać do oceny klinicznej, zarówno w dobrze wyposażonych placówkach opieki zdrowotnej, jak i w placówkach o ograniczonych zasobach. To innowacyjne połączenie papierowego testu immunologicznego z aplikacją na smartfony stanowi obiecujące podejście do lepszego wykrywania i oznaczania ilościowego antygenu NS1 dengi. Zwiększając czułość w stopniu wykraczającym poza możliwości gołego oka, system ten ma ogromny potencjał w zakresie usprawnienia procesu podejmowania decyzji klinicznych w leczeniu gorączki denga, szczególnie w odległych lub niedostatecznie obsługiwanych obszarach.

Wybór metody wykonania jest kluczowy dla zapewnienia powtarzalnych wyników analiz w papierowych urządzeniach do testów immunoenzymatycznych. W naszym badaniu przeanalizowano różne procesy produkcyjne i materiały w kontekście demonstracji papierowego testu immunoenzymatycznego. Wybrana przez nas metoda wykorzystuje system druku woskowego do tworzenia barier hydrofobowych w papierowych urządzeniach mikroprzepływowych. Podejście to wyróżnia się prostotą, szybkością i spójnymi wynikami. Warto zauważyć, że oferuje ono zaletę w postaci uniknięcia stosowania odczynników fotorezystowych, które mogą zakłócać adsorpcję białek i zwiększać hydrofobowość papieru celulozowego. Ponadto druk woskowy zapewnia spójne wymiary kanałów przepływowych, co przyczynia się do powtarzalności wyników analizy.
Po utworzeniu barier hydrofobowych, na powierzchnię papieru celulozowego naniesiono niezbędne odczynniki do analizy immunologicznej. Dzięki adsorpcji elektrostatycznej, PLL wspomógł immobilizację biomolekuł poprzez oddziaływanie zarówno z dodatnim ładunkiem grup funkcyjnych amin, jak i ujemnie naładowanym przeciwciałem. Krok ten ułatwia modyfikację i immobilizację przeciwciał oraz nakładanie koniugatów znakownik-przeciwciało podczas procesów wytwarzania. Co istotne, etap ten może być przeprowadzany równolegle. Montaż urządzeń do papierowych analiz immunologicznych (DEN-NS1-PAD, pokazany na Rysunku 1A) kończy się przez nałożenie zmodyfikowanego papieru na klejącą plastikową kartę podkładową i zalaminowanie go folią plastikową.
Głównym celem niniejszego badania jest opracowanie przyjaznej dla użytkownika metody wykorzystującej smartfon do pomiaru stężeń białka NS1. Podejście to mogłoby zostać zastosowane jako urządzenie do testów w punkcie opieki (POCT) zarówno w warunkach domowych, jak i klinicznych. Biorąc pod uwagę szeroki zakres stężeń NS1 w surowicy pacjentów, na podstawie wyników tych eksperymentów zastosowano proste modele liniowe. Dla każdego stężenia NS1 przygotowano zestaw danych obejmujący trzy urządzenia testowe. Zdjęcia urządzeń wykonano za pomocą smartfona przy standardowych ustawieniach i optymalnych warunkach oświetlenia, co wyeliminowało potrzebę stosowania ciemnej komory. Strefa testowa PAD zawiera mysie przeciwciało monoklonalne przeciwko NS1 wirusa denga, natomiast strefa kontrolna zawiera kozie przeciwciało anty-mysie IgG. W formacie testu kanapkowego (sandwich assay) wyższym stężeniom NS1 w próbkach odpowiada zwiększona intensywność czerwonego koloru w strefie testowej. W przeciwieństwie do niej, intensywność koloru w strefie kontrolnej pozostaje stosunkowo stała. Rycina 1B przedstawia nieprzetworzone obrazy ze smartfona, które umożliwiają korzystną obserwację wizualną bez konieczności stosowania specjalistycznego sprzętu.
Za pomocą dedykowanej aplikacji mobilnej znormalizowaliśmy intensywności i obliczyliśmy proste modele liniowe dla stężeń dodanego białka NS1 w próbkach surowicy – współczynnik korelacji (r2) uzyskany z aplikacji mobilnej. Współczynnik korelacji (r2) uzyskany z aplikacji mobilnej wyniósł 0,92 (Rysunek 3), co było zgodne z oczekiwaniami. Podejście oparte na smartfonie okazało się skuteczniejsze od obserwacji gołym okiem, znacząco zwiększając czułość o 178%. Dodatkowo, dla znormalizowanych intensywności obliczono granicę tła (LoB), granicę wykrywalności (LoD) oraz granicę oznaczalności (LoQ), jak przedstawiono w Tabeli 1.
W celu wykazania praktycznej funkcjonalności urządzeń DEN-NS1-PAD w warunkach klinicznych wykorzystano rzeczywiste próbki kliniczne. Papierowy test immunochemiczny generował jakościowe odczyty kolorystyczne w ciągu 20-30 min, co pozwalało na wizualne określenie wyników negatywnych lub pozytywnych. Do urządzenia wprowadzono próbki surowicy od pacjentów z podejrzeniem dengi. Rysunek 4 ilustruje i porównuje wyniki uzyskane za pomocą urządzenia oraz komercyjnego szybkiego testu diagnostycznego (RDT). Tabela 2 podsumowuje wyniki odczytów wizualnych oraz systemu opartego na smartfonie. Komercyjny RDT oraz badane urządzenie dały podobne wyniki, z siedmioma wynikami pozytywnymi i 23 negatywnymi w odczycie wizualnym. Z kolei system odczytu oparty na smartfonie, zastosowany wyłącznie do urządzenia, wykazał dziewięć wyników pozytywnych i 21 negatywnych w próbkach klinicznych.
<img alt="Schemat chromatografii ilustrujący proces przepływu z oznaczonymi strefami aplikacji próbki." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66130/66130fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Zdjęcia zaprojektowanego i wykonanego urządzenia DEN-NS1-PAD. (A,B) Pojedynczy kanał z hydrofobowej bariery z woskowego wzoru przedstawiony w trzech stanach (C) przed oraz (D,E) po wprowadzeniu roztworu próbki do wyznaczonego obszaru, pokazujący odpowiednio (D) wynik negatywny i (E) wynik dodatni. Roztwór próbki przemieszcza się przez kanał (patrz strzałka), wchodząc w interakcję ze składnikami w kluczowych miejscach: AuNPs-Ab w strefie koniugatu, przeciwciałem anty-NS1 w strefie testowej (co wskazuje na dodatni wynik badania NS1 w kierunku dengi) oraz anty-mysim IgG w strefie kontrolnej. Wyniki są łatwo widoczne gołym okiem i mogą być ilościowo określone za pomocą przetwarzania obrazu z użyciem skanera płaskiego lub kamery smartfona. Skrót: AuNPs-Ab = koniugat nanocząsteczek złota z przeciwciałem. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66130/66130fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Ekrany aplikacji Dengue NS1 PAD przedstawiające analizę krok po kroku i wyniki: od wprowadzania danych do wyświetlania wyników." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66130/66130fig02v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Zrzuty ekranu telefonu z aplikacji mobilnej. (A) Ekran użytkownika aplikacji na system Android uruchomionej na urządzeniu mobilnym, (B) wyświetlanie ekranu aplikacji, (C) menu główne aplikacji, w którym użytkownicy mogą wybrać korzystanie z aparatu lub przesłanie obrazu z galerii, (D) wyświetlanie powiązanego obrazu do testowania, (E) wyświetlanie czasu odliczania do analizy, (F) wyświetlanie wyników testu, w tym intensywności strefy testowej i kontrolnej, decyzji o zakażeniu (dodatni/ujemny) oraz stężenia NS1 w próbce. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66130/66130fig02largev2.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres regresji liniowej znormalizowanego sygnału w funkcji stężenia NS1, y=0,3701x+0,0128, r²=0,9248." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66130/66130fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Liniowa krzywa kalibracyjna dla detekcji NS1 w surowicy. Urządzenie zostało wykorzystane, a obrazy zinterpretowano poprzez przetwarzanie za pomocą aplikacji opartej na danych ze smartfona. Słupki błędów przedstawiają ±1 odchylenie standardowe, n = 3. Skróty: T = obszar testowy; C = obszar kontrolny. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66130/66130fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wyniki chromatografii; test jodowo-skrobiowy; diagramy i wykres słupkowy przedstawiający analizę częstotliwości." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66130/66130fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Obraz DEN-NS1-PAD z analizy próbek klinicznych. W papierowym immunoanalizie wykorzystano surowicę (50 µL). (A) przykład wyniku negatywnego, (B) wyniki pozytywne, (C) wyniki ogólne i porównanie testu RDT z immunoanalizą na podłożu papierowym. Skróty: RDT = szybki test diagnostyczny; Pos = pozytywny; Neg = negatywny. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66130/66130fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Parametr</td>
			<td>Gołym okiem</td>
			<td>Aplikacja mobilna</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Granica pustej próby (LoB)</td>
			<td>-</td>
			<td>43,15 ng mL-1-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Granica wykrywalności (LoD)</td>
			<td>200 ng mL-1</td>
			<td>112,19 ng/mL-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Granica ilościowego oznaczania (LoQ)</td>
			<td>-</td>
			<td>373,58 ng/mL-1</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: LoB, LoD i LoQ uzyskane za pomocą ImageJ oraz aplikacji mobilnej dla wzorca kalibracji danych NS1 w surowicy.Skróty: LoB = granica tła; LoD = granica wykrywalności; LoQ = granica oznaczalności.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody >
		<tr >
			<td rowspan="2">Nr pacjenta</td>
			<td colspan="2">Gołym okiem</td>
			<td >Aplikacja smartfona</td>
			<td >ImageJ</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >RDT</td>
			<td colspan="3">Papierowy test immunoanalizy</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1</td>
			<td >-</td>
			<td >-</td>
			<td >-</td>
			<td >-</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >2</td>
			<td >-</td>
			<td >-</td>
			<td >-</td>
			<td >-</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >3</td>
			<td >-</td>
			<td >-</td>
			<td >-</td>
			<td >-</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >4</td>
			<td >-</td>
			<td >-</td>
			<td >-</td>
			<td >-</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >5</td>
			<td >-</td>
			<td >-</td>
			<td >-</td>
			<td >-</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >6</td>
			<td >-</td>
			<td >-</td>
			<td >-</td>
			<td >-</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >7</td>
			<td >-</td>
			<td >-</td>
			<td >-</td>
			<td >-</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >8</td>
			<td >-</td>
			<td >-</td>
			<td >-</td>
			<td >-</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >9</td>
			<td >+</td>
			<td >+</td>
			<td >+</td>
			<td >+</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >10</td>
			<td >-</td>
			<td >-</td>
			<td >+</td>
			<td >+</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >11</td>
			<td >-</td>
			<td >-</td>
			<td >-</td>
			<td >-</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >12</td>
			<td >+</td>
			<td >+</td>
			<td >+</td>
			<td >+</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >13</td>
			<td >-</td>
			<td >-</td>
			<td >-</td>
			<td >-</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >14</td>
			<td >-</td>
			<td >-</td>
			<td >-</td>
			<td >-</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >15</td>
			<td >-</td>
			<td >-</td>
			<td >-</td>
			<td >-</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >16</td>
			<td >+</td>
			<td >+</td>
			<td >+</td>
			<td >+</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >17</td>
			<td >+</td>
			<td >+</td>
			<td >+</td>
			<td >+</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >18</td>
			<td >-</td>
			<td >-</td>
			<td >-</td>
			<td >-</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >19</td>
			<td >-</td>
			<td >-</td>
			<td >-</td>
			<td >-</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >20</td>
			<td >-</td>
			<td >-</td>
			<td >-</td>
			<td >-</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >21</td>
			<td >+</td>
			<td >+</td>
			<td >+</td>
			<td >+</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >22</td>
			<td >+</td>
			<td >+</td>
			<td >+</td>
			<td >+</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >23</td>
			<td >-</td>
			<td >-</td>
			<td >-</td>
			<td >-</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >24</td>
			<td >+</td>
			<td >+</td>
			<td >+</td>
			<td >+</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >25</td>
			<td >-</td>
			<td >-</td>
			<td >-</td>
			<td >-</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >26</td>
			<td >-</td>
			<td >-</td>
			<td >-</td>
			<td >-</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >27</td>
			<td >-</td>
			<td >-</td>
			<td >-</td>
			<td >-</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >28</td>
			<td >-</td>
			<td >-</td>
			<td >-</td>
			<td >-</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >29</td>
			<td >-</td>
			<td >-</td>
			<td >-</td>
			<td >-</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >30</td>
			<td >-</td>
			<td >-</td>
			<td >+</td>
			<td >+</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Porównanie wyników odczytu wizualnego i systemu odczytu opartego na smartfonie dla próbek surowicy. (+) i (-) oznaczają odpowiednio pozytywną i negatywną interpretację wyników.

Wychodząc naprzeciw pilnym potrzebom diagnostycznym dengi, przedstawiamy zintegrowane z aplikacją na smartfony papierowe urządzenie analityczne Dengue NS1 (DEN-NS1-PAD) do ilościowego określania stężenia antygenu dengi NS1 w próbkach klinicznych surowicy/krwi. Ta innowacja usprawnia zarządzanie dengą, wspomagając podejmowanie decyzji klinicznych w różnych placówkach opieki zdrowotnej, nawet tych o ograniczonych zasobach.

Przenośny papierowy test immunologiczny w połączeniu z aplikacją na smartfony do kolorymetrycznego i ilościowego wykrywania antygenu dengi NS1

Dengue virus (DENV) infection, which is transmitted by Aedes mosquitoes, is a major public health concern in tropical and subtropical countries. With an ...

Zakres badań polega na wykrywaniu dengi za pomocą specyficznego biomarkera, NS1, za pomocą papierowego urządzenia analitycznego. Nasze badania koncentrują się na opracowaniu prostego, taniego, czułego i specyficznego urządzenia do wykrywania dengi. Opracowaliśmy również aplikację na smartfony, aby poprawić czułość i pomiar NS1 w rzeczywistej próbce.Naszą wrażliwością jest opracowanie metody wytwarzania metody mikroprzepływowej w oparciu o naszą formułę PEC Stosowanie tej innowacyjnej techniki ma na celu ucieleśnienie komercjalizacji różnych projektów PEC, oferując skalowalne rozwiązania dla zastosowań. Nasze badania łączą PEC z aplikacją na smartfony, co jest bardzo obiecujące dla pomiaru dengi NS1. Aplikacja mobilna znacznie zwiększyła czułość i skuteczność kwalifikacji NS1 w próbkach surowicy w porównaniu z obserwacją gołym okiem.Protokół ten jest prosty, tani i powtarzalny w produkcji PEC do wykrywania dengi NS1. PEC jest czuły i specyficzny do wykrywania dengi NS1 i zwiększa czułość po połączeniu ze smartfonem. Naszym celem jest poprawa wydajności testów na dengę NS1 z próbkami krwi, ocena typów komórek zakażeń krzyżowych i inkubacja ich w papierowych urządzeniach do leczenia wielu chorób.Zajęcie się trendem kultury technologicznej ma kluczowe znaczenie dla udanej komercjalizacji w zakresie wszystkich badań przesiewowych i opieki medycznej. Na początek zaprojektuj na komputerze papierowe urządzenie analityczne z 18 wzorami wosku. Wydrukuj ten wzór na papierze celulozowym za pomocą drukarki woskowej.Rozpuść papier zadrukowany woskiem w piecu laboratoryjnym przez 75 sekund w temperaturze 150 stopni Celsjusza. Po stopieniu przechowuj papier w pudełku z krzemionką do dalszego użycia. Następnie odpipetuj 0,5 mikrolitra 0,025% polilizyny zarówno do obszaru testowego, jak i kontrolnego urządzenia.Następnie inkubuj urządzenie w piekarniku w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez pięć minut. Nałożyć 0,5 mikrolitra odpowiedniego roztworu przeciwciała na obszary kontrolne i testowe. Pozostaw krople do wyschnięcia w temperaturze pokojowej w pudełku z żelem krzemionkowym przez 30 minut.Następnie nałóż bufor blokujący do sprzężonego próbki i obszarów detekcji. Pozostaw te krople do wyschnięcia w temperaturze pokojowej w pudełku z żelem krzemionkowym przez 30 minut. Połącz 10 mikrolitrów przeciwciała anty NS1 w PBS z jednym mililitrem 40 nanomolowych nanocząstek złota koloidowego.Następnie dodaj 0,1 mililitra 0,1 molowego buforu boranowego. Obracaj mieszaninę z prędkością 50 obr./min przez 60 minut. Odpipetować 0,1 mililitra BSA w BBS do mieszaniny.Obróć ponownie przed inkubacją. Odwirować roztwór o sile 20, 187 g w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 30 minut. Następnie ostrożnie supernatant z osadu wytrącić roztwór przeciwciała nanocząstek złota.Ponownie zawiesić osad w 500 mikrolitrach BBS. Następnie należy poddać roztwór sonikacji, aby rozproszyć nanocząstki. Po odwirowaniu dodać 50 mikrolitrów sprzężonego buforu do zawiesiny.Następnie odpipetować dwa mikrolitry roztworu kompleksu przeciwciał z nanocząstkami złota do obszaru sprzężonego. Aby zmontować papierowy test immunologiczny, ostrożnie usuń folię ochronną z odwrotnej strony samoprzylepnej plastikowej karty nośnej, aby odsłonić klej. Dopasuj obrobiony papier celulozowy do samoprzylepnej plastikowej karty nośnej i dociśnij.Nałóż folię z tworzywa sztucznego na papier i dociśnij folię i papier do siebie, aby uzyskać pokrytą powierzchnię. Zaprojektowano jednokanałowe urządzenie do testów immunologicznych i wyprodukowano roztwór próbki przechodzący przez kanał i wchodzący w interakcję ze składnikami w kluczowych punktach, co dało widoczny wynik diagnostyczny. Na początek przenieś 300 mikrolitrów krwi obwodowej od 30 pacjentów w pierwszym dniu hospitalizacji do fioletowych górnych probówek EDTA.Odwirować krew w temperaturze 2884 G w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 20 minut. Przenieś osocze do czystej rurki polipropylenowej. Następnie nałóż 20 mikrolitrów osocza na obszar próbki urządzenia do testu immunologicznego.Teraz odpipetować 30 mikrolitrów buforu do przemywania na obszar próbki. Po pozostawieniu próbki do całkowitego obudzenia się do urządzenia, przechwyć obrazy urządzenia za pomocą smartfona. Analizuj obszary testowe i kontrolne za pomocą obrazu J i niestandardowej aplikacji mobilnej, aby określić ilościowo intensywność testu w aplikacji mobilnej.Uruchom opracowaną aplikację mobilną na smartfonie, wybierz użyj aparatu lub prześlij z galerii, aby wybrać lub przesłać źródło danych. Teraz przejdź do sekcji analiz i naciśnij analizuj. Aplikacja przetworzy teraz dane i wyświetli wyniki.Papierowe urządzenie do testów immunologicznych było w stanie szybko zdiagnozować dengę, podobnie jak w przypadku dostępnego na rynku testu diagnostycznego.

portable-paper-based-immunoassay-combined-with-smartphone-application

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Obecna diagnostyka multipleksowa do wykrywania wirusów Zika, chikungunya i denga wymaga skomplikowanego przygotowania próbek i kosztownego oprzyrządowania, a także jest trudna do użycia w środowiskach o niskich zasobach. Pokazujemy diagnostykę, która wykorzystuje amplifikację izotermiczną z sondami z przemieszczonymi niciami specyficznymi dla celu, aby wykryć i zróżnicować te wirusy z wysoką czułością i swoistością.

Multipleksowana platforma diagnostyczna oparta na amplifikacji izotermicznej do wykrywania wirusów Zika, Chikungunya i Denga 1

Analiza moczu za pomocą paska to szybka i niedroga metoda oceny własnego stanu zdrowia. Przedstawiamy metodę wykonywania dokładnej, taniej analizy moczu za pomocą paskowego wskaźnika ciśnieniowego, która usuwa podstawowe źródła błędów związane z tradycyjnymi protokołami zanurzania i wycierania i jest na tyle prosta, że może być wykonywana przez laików w domu.

Niedroga, kontrolowana objętość analiza moczu za pomocą paska do testów domowych

Membrane-based lateral flow immunochromatographic strips (ICSs) are useful tools for low-cost self-diagnosis and have been efficiently applied to toxin, ...

Opracowanie pasa immunochromatograficznego z przepływem bocznym do szybkiego i ilościowego wykrywania związków drobnocząsteczkowych

Tutaj opisujemy protokół przygotowania nanokulek kropek kwantowych (QDNB) i wykrywania biomarkerów choroby za pomocą pasków do testów immunologicznych opartych na przepływie bocznym opartych na QDNB. Wyniki testu można ocenić jakościowo przy oświetleniu światłem UV i zmierzyć ilościowo za pomocą fluorescencyjnego czytnika pasków w ciągu 15 minut.

Fluorescencyjny test immunologiczny przepływu bocznego oparty na nanokulkach kropek kwantowych

Niniejszy protokół opisuje prostą metodę opartą na zastosowaniu taśmy klejącej do pobierania próbek z powierzchni pomidorów oraz innych świeżych produktów rolnych, a następnie szybką detekcję całych komórek Salmonella przy użyciu fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH).

Połączenie pobierania próbek za pomocą taśmy klejącej i fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ w celu szybkiego wykrywania Salmonella na świeżych produktach rolnych

Technologia detekcji kolorymetrycznej ampliPHOX jest przedstawiona jako niedroga alternatywa dla detekcji fluorescencyjnej w macierzach mikroukładów. W oparciu o fotopolimeryzację, ampliPHOX wytwarza stałe polimerowe plamki widoczne gołym okiem w zaledwie kilka minut. Wyniki są następnie obrazowane i automatycznie interpretowane za pomocą prostego, a zarazem wydajnego pakietu oprogramowania.

Kolorymetryczna detekcja ampliPHOX na mikrotablicy DNA do wykrywania grypy

Wykorzystując postępy w opracowywaniu fluoroforów oraz technologii obrazowania, opracowano prostą metodę znakowania wirusa dengi barwnikami Alexa Fluor w celu wizualizacji wczesnych oddziaływań między wirusem a komórką.

Wizualizacja wirusa dengi za pomocą znakowania Alexa Fluor

Tutaj opisujemy dwa testy do pomiaru aktywacji dopełniacza indukowanej przez przeciwciała przeciwko czerwonym krwinkom. Główną przewagą nad obecnymi testami jest ich ilościowy i łatwy w interpretacji charakter.

Metody ilościowego wykrywania indukowanej przez przeciwciała aktywacji dopełniacza na krwinkach czerwonych

Nienaruszone kompleksy HLA/peptydowe klasy I są wydalane przez komórki rakowe, co stanowi potencjalnie istotny biomarker raka. Wykorzystując technologię czujników bezznacznikowych i przeciwciała monoklonalne naśladujące receptor limfocytów T, demonstrowano wykrywanie wydalanych kompleksów MIF/HLA-A*02:01 w supernatantach komórkowych MDA-MB-231, wzbogaconej surowicy ludzkiej i osoczu pacjenta, co umożliwiło opracowanie nowej platformy diagnostycznej raka.

Wykrywanie biomarkerów ludzkiego antygenu leukocytów w raku piersi z wykorzystaniem technologii biosensorów bez znaczników

Tutaj prezentujemy protokoły do szybkiego badania i charakteryzowania enzymów pod kątem aktywności przeciwdrobnoustrojowej. Test dyfuzji mikroszkiełkowej i test uwalniania barwnika wykorzystują docelowe substraty bakteryjne do jakościowej i ilościowej oceny aktywności enzymatycznej.

Testy jakościowe i ilościowe do wykrywania i charakterystyki białkowych środków przeciwdrobnoustrojowych

Poznaj przenośny papierowy test immunologiczny z aplikacją mobilną do wykrywania antygenu NS1 wirusa dengi w próbkach surowicy. Ta metoda poprawia czułość diagnostyki w warunkach ograniczonych zasobów.

Przenośny papierowy test immunologiczny w połączeniu z aplikacją na smartfony do kolorymetrycznego i ilościowego wykrywania antygenu dengi NS1 (Wideo) | JoVE Journal

Przenośny papierowy test immunologiczny w połączeniu z aplikacją na smartfony do kolorymetrycznego i ilościowego wykrywania antygenu dengi NS1

Przeglądaj więcej filmów