Multipleksowa cykliczna immunohistochemia fluorescencyjna
26 stycznia 2024
Multipleksowa cykliczna immunohistochemia pozwala na wykrywanie in situ wielu markerów jednocześnie przy użyciu wielokrotnej inkubacji przeciwciał antygenowych, skanowania obrazu oraz dopasowywania i integracji obrazu. W tym miejscu przedstawiamy protokół operacyjny identyfikacji substratów komórek odpornościowych za pomocą tej technologii w próbkach raka płuc i sparowanych próbkach przerzutów do mózgu.
Wyzwaniem dla immunohistochemii jest wybór gatunków pierwszorzędowych i drugorzędowych przeciwciał monoklonalnych, aby uniknąć reaktywności krzyżowej i uzyskania lepszej swoistości i reputacji. Standaryzacja jest niezbędna do optymalizacji współczynnika rozcieńczenia przeciwciał. Tymczasem kolejnym wyzwaniem jest wyrównanie lokalizacji komórki zygoty i struktur subkomórkowych.
Zastosowanie tego protokołu jest zgodne z techniczną ewolucją rozmieszczenia trzech subpopulacji limfocytów, takich jak CD trzy dodatnie, CD trzy i CD osiem dodatnie oraz CD 20 dodatnie. Na podstawie liczby komórek C i ekspresji białka w konserwatywnych tkankach. Można również zaobserwować poziom nacieku limfocytarnego.
W naszym protokole przeciwciała parametryczne i przeciwciała drugorzędowe znakowane fluorescencyjnie pochodzące od różnych gatunków są rozcieńczane jako mieszanina, co czyni nas skutecznymi. Mieszanina ta zapewnia również specyficzne dopasowanie przeciwciała do antygenu. Zamierzamy skupić się na przeprogramowaniu mikrośrodowiska guza na przerzuty raka płuc do mózgu.
I interakcja międzykomórkowa między limfocytami naciekającymi nowotwór na komórkach nowotworowych. Na początek uzyskaj pierwotny guz płuc lub raka płuc, tkankę przerzutów do mózgu. Osadź tkankę nowotworową w sparowanych blokach parafinowych i za pomocą mikrotomu.
Pokrój go na odcinki o grubości czterech mikrometrów. Umieść sekcje w wodzie. Wybierz najlepszy za pomocą pęsety i przyklej go do szkiełka pokrytego polilizyną.
Aby zwiększyć przyczepność tkanek, inkubuj szkiełko w piekarniku w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez 30 minut. W celu odwodnienia zanurzyć szkiełko w ksylenie, a następnie w roztworach etanolu o malejących stężeniach. Następnie myj go zjonizowaną wodą przez trzy minuty.
Następnie zanurz szkiełko w roztworze buforowym cytrynianu sodu. Poddaj szkiełko działaniu wysokiej temperatury i ciśnienia w szybkowarze i pozwól mu ostygnąć do temperatury pokojowej w wodzie destylowanej przez trzy minuty. Na koniec umyj szkiełko trzy razy PBS przez pięć minut każdy.
Na początek zaopatrz się w przygotowane wcześniej preparaty zawierające skrawki tkanki nowotworowej. Przygotować mieszaninę roboczą przeciwciał pierwszorzędowych. Dodać kompleks przeciwciał na szkiełku i inkubować przez godzinę w temperaturze pokojowej.
Następnie umyj szkiełko trzykrotnie za pomocą 0,1%TWEEN PBS przez pięć minut. Przygotować mieszaninę przeciwciał fluorescencyjnych drugorzędowych. Dodaj go kroplami na szkiełko i inkubuj w temperaturze pokojowej przez godzinę.
Następnie wykonaj drugą rundę inkubacji przeciwciał pierwotnych w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę. Umyj szkiełko trzykrotnie 0,1%TWEEN PBS przez pięć minut każde i za pomocą bibuły filtracyjnej usuń nadmiar wody z obwodu tkanki. Podobnie wykonaj drugą rundę inkubacji przeciwciał wtórnych i umyj, jak pokazano wcześniej.
Teraz po minucie dodaj odczynnik nadmanganianu potasu do tkanki, płucz ją bieżącą wodą przez pięć minut. Wykonaj odwodnienie przy rosnącym stężeniu alkoholu. Na koniec dodaj DAPI, aby całkowicie pokryć sekcję tkanki i umieść szkiełko nakrywkowe do obrazowania wielospektralnego.
Multipleksowe obrazowanie immunofluorescencyjne wykazało obecność komórek CD 3 dodatnich, CD 8 dodatnich i CD 20 dodatnich w tkance przerzutów do mózgu raka płuc.
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia protokół wielokrotnej cyklicznej immunohistochemii, umożliwiający jednoczesną detekcję wielu markerów w próbkach raka płuca oraz przerzutów do mózgu. Metoda ta rozwiązuje problemy związane ze specyficznością przeciwciał i lokalizacją subpopulacji komórek odpornościowych.
Kluczowe komponenty badania
Dziedzina nauki
- Immunohistochemia
- Onkologia
- Neurobiologia
Wprowadzenie
- Immunohistochemia wymaga starannego doboru przeciwciał w celu zapobiegania reaktywności krzyżowej.
- Standaryzacja rozcieńczenia przeciwciał jest kluczowa dla uzyskania optymalnych wyników.
- Wyrównanie struktur komórkowych jest niezbędne do przeprowadzenia dokładnej analizy.
- Niniejszy protokół koncentruje się na subpopulacjach limfocytów w tkankach nowotworowych.
Cel badania
- Aby dostarczyć szczegółowy protokół dla multipleksowej cyklicznej immunohistochemii.
- Aby zwiększyć specyficzność wykrywania komórek odpornościowych w próbkach nowotworowych.
- Aby ułatwić badanie nacieku limfocytarnego w raku płuca i przerzutach do mózgu.
Zastosowane metody
- Wielokrotna inkubacja antygenu z przeciwciałem.
- Skanowanie i dopasowanie obrazów.
- Wykrywanie limfocytów wykazujących ekspresję CD3, CD8 oraz CD20.
- Analiza ekspresji białek w tkankach utrwalonych.
Główne wyniki
- Skuteczna identyfikacja substratów komórek immunologicznych w raku płuca.
- Wykazanie poziomu naciekania limfocytów.
- Efektywna wizualizacja wielu markerów immunologicznych.
- Standaryzacja poprawia powtarzalność i specyficzność.
Wnioski
- Protokół ten pozwala na lepsze zrozumienie odpowiedzi immunologicznych w nowotworach.
- Multipleksowa cykliczna immunohistochemia jest cennym narzędziem dla badaczy.
- Dalsze badania mogą opierać się na tej metodologii w ramach badań nad rakiem.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Multipleksowa cykliczna fluorescencyjna immunohistochemia umożliwia wysokotreściowe profilowanie przestrzenne subpopulacji komórek odpornościowych oraz białek docelowych w mikrośrodowisku guza, wspierając badania w zakresie onkologii translacyjnej i immunoterapii. Podejście to zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów oraz ograniczaniu ryzyka mechanistycznego poprzez ilościowe określanie infiltracji limfocytów i oddziaływań międzykomórkowych w tkankach istotnych klinicznie. Jej powtarzalność oraz zdolność do multipleksowania sprawiają, że jest ona kluczowym narzędziem w selekcji projektów z portfolio oraz podejmowaniu decyzji opartych na biomarkerach we wczesnych fazach odkrywania leków i w procesach translacyjnych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia analizę z rozdzielczością przestrzenną subpopulacji komórek odpornościowych i białek docelowych w tkankach nowotworowych.
- Wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez wyjaśnienie interakcji między układem odpornościowym a guzem oraz wzorców infiltracji limfocytów.
- Zwiększa pewność prognostyczną przy wyborze celu w programach immunoonkologicznych.
Przesiewy i opracowanie testów
- Przygotowuje zwalidowane systemy tkanek FFPE do późniejszej analizy markerów w technice multipleksowej.
- Standaryzuje dobór i rozcieńczenie przeciwciał w celu zapewnienia powtarzalności oraz wyników ilościowych.
- Umożliwia stosowanie niezawodnych, skalowalnych schematów postępowania w badaniach przesiewowych markerów immunologicznych i badaniach porównawczych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Dostosowuje profilowanie odpornościowe do modeli istotnych dla przebiegu choroby, takich jak tkanki raka płuc i przerzutów do mózgu.
- Wspiera opracowywanie biomarkerów translacyjnych poprzez ilościowe określanie podgrup limfocytów in situ.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkrycia po przedkliniczną walidację celów odpornościowych.
Integracja potoków i przepływów pracy
Ten schemat wieloparametrycznej immunohistochemii łączy wczesną fazę odkryć, walidację celów terapeutycznych oraz badania translacyjne, umożliwiając ilościowe, rozdzielone przestrzennie profilowanie immunologiczne w tkankach FFPE.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących dystrybucji komórek odpornościowych oraz przeprogramowania mikrośrodowiska guza.
- Przesiewy: Zapewniają powtarzalną, ilościową detekcję markerów w celu przygotowania testów i przeprowadzenia analiz porównawczych.
- Analityka: Dostarcza dane dotyczące liczby komórek i ekspresji białek, służące do porównań między różnymi warunkami.
- Badania translacyjne: Pozwalają na dopasowanie ilościowego oznaczania markerów odpornościowych do modeli chorób w celu zachowania ciągłości biomarkerów.
- Zastosowania instytucjonalne: Oferują zstandaryzowaną platformę multipleksową, którą można dostosować do różnych typów tkanek i pytań badawczych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celów immunologicznych.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność, standaryzację i skalowalność procesów profilowania immunologicznego.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go oraz efektywność kapitałową poprzez umożliwienie rzetelnej selekcji opartej na biomarkerach.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój zasobów w obszarze immunoonkologii.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy specjalistycznej z zakresu immunohistochemii, walidacji przeciwciał oraz obrazowania fluorescencyjnego.
- Wymaga dostępu do zwalidowanych przeciwciał, przetwarzania tkanek FFPE oraz infrastruktury do obrazowania wielospektralnego.
- Konieczna jest standaryzacja doboru przeciwciał, ich rozcieńczeń oraz protokołów obrazowania pomiędzy zespołami.
- Możliwe może być dostosowanie metody do różnych typów tkanek lub paneli markerów immunologicznych.
- Optymalizacja stosunku sygnału do szumu oraz unikanie reakcji krzyżowych są kluczowe dla uzyskania wiarygodnych wyników.
