Name: Wykorzystanie obrazowania żywych komórek do pomiaru wpływu patologicznych białek na transport aksonalny w pierwotnych neuronach hipokampa (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-22T14:20:00.000+00:00
Duration: 10 min 38 s
Description: Poznaj metodę obrazowania żywych komórek do badania wpływu patologicznych białek tau na transport aksonalny w pierwotnych neuronach hipokampa myszy. Protokół ten pozwala analizować mechanizmy neurodegeneracyjne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Chelsea Tiernan i Kyle'owi Christensenowi za ich wysiłki w rozwijaniu i optymalizacji aspektów tych protokołów. Praca ta była wspierana przez granty National Institutes of Health (NIH) R01 NS082730 (N.M.K.), R01 AG044372 (N.M.K.), R01 AG067762 (N.M.K.) i F31 AG074521 (R.L.M.); NIH/National Institute on Aging, Michigan Alzheimer's Disease Research Center Grant 5P30AG053760 (N.M.K. i BC); Biuro Asystenta Sekretarza Obrony ds. Zdrowia poprzez Nagrodę Recenzowanego Programu Badawczego nad Chorobą Alzheimera W81XWH-20-1-0174 (B.C.); Granty badawcze Alzheimer's Association 20-682085 (B.C.); oraz Fundacja Rodziny Secchia (N.M.K.).

Visualizing Proteins in Primary Hippocampal Neurons by Live&#45;Cell Imaging

<ol><li>Kneynsberg, A., Combs, B., Christensen, K., Morfini, G., Kanaan, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+degeneration+in+tauopathies%3A+disease+relevance+and+underlying+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Axonal degeneration in tauopathies: disease relevance and underlying mechanisms.</a> Front Neurosci. 11, 572(2017).</li>
<li>Combs, B., Mueller, R. L., Morfini, G., Brady, S. T., Kanaan, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tau+and+axonal+transport+misregulation+in+tauopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Tau and axonal transport misregulation in tauopathies.</a> Adv Exp Med Biol. 1184, 81-95 (2019).</li>
<li>Brady, S. T., Morfini, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+motor+proteins%2C+axonal+transport+deficits+and+adult-onset+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">Regulation of motor proteins, axonal transport deficits and adult-onset neurodegenerative diseases.</a> Neurobiol Dis. 105, 273-282 (2017).</li>
<li>Morfini, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+transport+defects+in+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Axonal transport defects in neurodegenerative diseases.</a> J Neurosci. 29 (41), 12776-12786 (2009).</li>
<li>Brady, S. T., Lasek, R. J., Allen, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+axonal+transport+in+extruded+axoplasm+from+squid+giant+axon%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Fast axonal transport in extruded axoplasm from squid giant axon.</a> Science. 218 (4577), 1129-1131 (1982).</li>
<li>LaPointe, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+amino+terminus+of+tau+inhibits+kinesin-dependent+axonal+transport%3A+implications+for+filament+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">The amino terminus of tau inhibits kinesin-dependent axonal transport: implications for filament toxicity.</a> J Neurosci Res. 87 (2), 440-451 (2009).</li>
<li>Kanaan, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenic+forms+of+tau+inhibit+kinesin-dependent+axonal+transport+through+a+mechanism+involving+activation+of+axonal+phosphotransferases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Pathogenic forms of tau inhibit kinesin-dependent axonal transport through a mechanism involving activation of axonal phosphotransferases.</a> J Neurosci. 31 (27), 9858-9868 (2011).</li>
<li>Kanaan, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+in+the+amino+terminus+of+tau+prevents+inhibition+of+anterograde+axonal+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Aging%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation in the amino terminus of tau prevents inhibition of anterograde axonal transport.</a> Neurobiol Aging. 33 (4), 826.e15-826.e30 (2012).</li>
<li>Pigino, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+fast+axonal+transport+is+a+pathogenic+mechanism+for+intraneuronal+amyloid+beta%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Disruption of fast axonal transport is a pathogenic mechanism for intraneuronal amyloid beta.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (14), 5907-5912 (2009).</li>
<li>Morfini, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenic+huntingtin+inhibits+fast+axonal+transport+by+activating+JNK3+and+phosphorylating+kinesin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Pathogenic huntingtin inhibits fast axonal transport by activating JNK3 and phosphorylating kinesin.</a> Nat Neurosci. 12 (7), 864-871 (2009).</li>
<li>Morfini, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+fast+axonal+transport+by+pathogenic+SOD1+involves+activation+of+p38+MAP+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Inhibition of fast axonal transport by pathogenic SOD1 involves activation of p38 MAP kinase.</a> PLoS One. 8 (6), e65235(2013).</li>
<li>Combs, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frontotemporal+lobar+dementia+mutant+tau+impairs+axonal+transport+through+a+protein+phosphatase+1gamma-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Frontotemporal lobar dementia mutant tau impairs axonal transport through a protein phosphatase 1gamma-dependent mechanism.</a> J Neurosci. 41 (45), 9431-9451 (2021).</li>
<li>Christensen, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphomimetics+at+Ser199%2FSer202%2FThr205+in+tau+impairs+axonal+transport+in+rat+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Phosphomimetics at Ser199/Ser202/Thr205 in tau impairs axonal transport in rat hippocampal neurons.</a> Mol Neurobiol. 60 (6), 3423-3438 (2023).</li>
<li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Culturing hippocampal neurons.</a> Nat Protoc. 1 (5), 2406-2415 (2006).</li>
<li>Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+hippocampal+neurons+from+prenatal+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice.</a> J Vis Exp. (65), 3634(2012).</li>
<li>Neumann, S., Chassefeyre, R., Campbell, G. E., Encalada, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KymoAnalyzer%3A+a+software+tool+for+the+quantitative+analysis+of+intracellular+transport+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">KymoAnalyzer: a software tool for the quantitative analysis of intracellular transport in neurons.</a> Traffic. 18 (1), 71-88 (2017).</li>
<li>Cox, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+isoform-specific+tau+aggregates+suggests+a+common+toxic+mechanism+involving+similar+pathological+conformations+and+axonal+transport+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Aging%22%5BJournal%5D)">Analysis of isoform-specific tau aggregates suggests a common toxic mechanism involving similar pathological conformations and axonal transport inhibition.</a> Neurobiol Aging. 47, 113-126 (2016).</li>
<li>Tiernan, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudophosphorylation+of+tau+at+S422+enhances+SDS-stable+dimer+formation+and+impairs+both+anterograde+and+retrograde+fast+axonal+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Pseudophosphorylation of tau at S422 enhances SDS-stable dimer formation and impairs both anterograde and retrograde fast axonal transport.</a> Exp Neurol. 283 (Pt A), 318-329 (2016).</li>
<li>Mueller, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tau%3A+a+signaling+hub+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Tau: a signaling hub protein.</a> Front Mol Neurosci. 14, 647054(2021).</li>
<li>Hedstrom, K. L., Ogawa, Y., Rasband, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AnkyrinG+is+required+for+maintenance+of+the+axon+initial+segment+and+neuronal+polarity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">AnkyrinG is required for maintenance of the axon initial segment and neuronal polarity.</a> J Cell Biol. 183 (4), 635-640 (2008).</li>
<li>Basu, H., Schwarz, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((QuoVadoPro%2C+an+autonomous+tool+for+measuring+intracellular+dynamics+using+temporal+variance%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">QuoVadoPro, an autonomous tool for measuring intracellular dynamics using temporal variance.</a> Curr Protoc Cell Biol. 87 (1), e108(2020).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Istnieje coraz więcej dowodów na to, że wiele patologicznych białek związanych z różnymi zaburzeniami neurodegeneracyjnymi zakłóca szybki transport aksonalny w neuronach. Stanowi to potencjalny wspólny mechanizm neurotoksyczności w tych chorobach. Aby lepiej zrozumieć proces, w którym białka te zakłócają transport, potrzebujemy narzędzi i modeli, które pozwolą nam odpowiedzieć na konkretne pytania. Opisana tutaj metoda pozwala na zbadanie mechanizmów zaangażowanych przez patologiczne białka w celu negatywnego wpływu na t...

Neurony polegają na dwukierunkowym transporcie ładunku wzdłuż aksonu, aby utrzymać funkcjonalne synapsy i łączność neuronową. Uważa się, że deficyty transportu aksonalnego są kluczowymi czynnikami przyczyniającymi się do patogenezy kilku chorób neurodegeneracyjnych, w tym choroby Alzheimera (AD) i innych tauopatii, choroby Parkinsona, stwardnienia zanikowego bocznego i choroby Huntingtona1,2,3. Rzeczywiście, patologiczne modyfikacje kilku białek związanych z chorobą negatywnie wpływają na transport (przegląd w 4). Opracowanie metod badania mechanizmów, za pomocą których patologiczne białka wywierają toksyczność w chorobie, jest niezbędne do zrozumienia zaburzeń neurodegeneracyjnych i zidentyfikowania potencjalnych celów interwencji terapeutycznej.
Kilka ważnych spostrzeżeń na temat transportu aksonów, w tym odkrycie konwencjonalnej kinezyny, zależnych od kinaz i fosfataz szlaków regulujących białka motoryczne oraz mechanizmów, za pomocą których patologiczne białka zakłócają regulację transportu aksonów, zostało dokonanych przy użyciu modelu izolowanej aksoplazmy kałamarnicy4,5. Perfuzja aksoplazmy kałamarnicy z patologicznymi formami białka tau hamuje następczy szybki transport aksonalny (FAT), efekt zależny od ekspozycji domeny aktywującej fosfatazę tau, która aktywuje fosfatazę białkową 1 (PP1)6,7,8. PP1 aktywuje kinazę syntazy glikogenu 3 (GSK3), która z kolei fosforyluje łańcuchy lekkie kinezyny, powodując uwolnienie ładunku. Innym patologicznym białkiem w chorobie Alzheimera jest β amyloidu. Oligomeryczne formy β amyloidu hamują dwukierunkowy FAT poprzez kinazę kazeinową 2, która fosforyluje łańcuchy lekkie kinezyny9. Co więcej, patologiczne białko huntingtyny zawierające ekspansję poliglutaminy i rodzinny mutant SOD1 sprzężony z ALS zakłócają transport aksonalny w aksoplazmie kałamarnicy poprzez odpowiednio N-końcową kinazę c-Jun i aktywność kinazy białkowej aktywowanej mitogenem p3810,11.
Chociaż model aksoplazmy kałamarnicy nadal jest cennym narzędziem w zrozumieniu wpływu patologicznych białek na transport aksonalny, ograniczony dostęp do sprzętu i próbek uniemożliwia jego szersze zastosowanie. Opracowaliśmy test transportu z wykorzystaniem obrazowania pierwotnych neuronów pierwotnych gryzoni (myszy i szczurów) za pomocą mikroskopii konfokalnej żywych komórek. Model ten reprezentuje łatwe w adaptacji i manipulację podejście oparte na neuronach ssaków, wykorzystujące powszechnie dostępne źródła komórek i systemy mikroskopowe. Na przykład różne patologiczne białka (np. zawierające modyfikacje związane z chorobą) są wyrażane w celu określenia, w jaki sposób określone modyfikacje tych białek wpływają na transport w aksonach. Podobnie, różne fluorescencyjnie znakowane białka ładunkowe mogą być wykorzystane do zbadania zmian specyficznych dla ładunku. Co więcej, podstawowe mechanizmy molekularne są badane stosunkowo łatwo poprzez ukierunkowanie na ekspresję (tj. knockdown lub nadekspresję) wybranych białek, które mogą pośredniczyć w tych efektach. Metodę tę można również łatwo dostosować do pierwotnych neuronów pochodzących z szerokiej gamy modeli zwierzęcych.
Przedstawiamy szczegółowy protokół opisujący test transportu aksonów przez żywe komórki, który był wcześniej używany w pierwotnych neuronach hipokampa, aby pokazać, że zmutowane białka tau są związane z otępieniami płata czołowo-skroniowego (FTLD; P301L lub R5L tau) zwiększają częstotliwość pauz znakowanych fluorescencyjnie białek ładunkowych dwukierunkowo12. Co więcej, powalenie izoformy PP1γ uratowało efekty pauzy12. Zapewnia to wsparcie dla modelu patologicznego zakłócenia wywołanego przez tau, w którym pośredniczy nieprawidłowa aktywacja szlaku sygnałowego zainicjowanego przez PP1, jak opisano powyżej6,7,12. W osobnym badaniu wykazaliśmy, że pseudofosforylacja tau w S199 / S202 / T205 (patogenny fosfoepitop AT8 istotny dla tauopatii) zwiększyła częstotliwość pauzy ładunku i prędkość odcinka następczego. Efekty te były zależne od N-końcowej domeny aktywującej fosfatazę tau13. Przykłady te podkreślają użyteczność tego modelu w identyfikacji mechanizmów tego, jak patologiczne białka zakłócają transport aksonów w neuronach ssaków.
Ten artykuł zawiera szczegółowy opis metody, zaczynając od zbierania, dysocjacji i hodowli pierwotnych mysich neuronów hipokampa, następnie transfekcji neuronów z białkami cargo połączonymi z białkiem fluorescencyjnym, a na końcu obrazowania żywych komórek i analizy obrazu. Pokazujemy, w jaki sposób ta metoda jest wykorzystywana do badania wpływu zmodyfikowanego tau na dwukierunkowy transport białka związanego z pęcherzykami, synaptofizyny, jako przykładu. Istnieje jednak elastyczność w białku patogennym i białku ładunku transportowego, co sprawia, że jest to wszechstronne podejście do badania transportu aksonalnego.

<table><tbody><tr><td>0,4% błękit trypanowy</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>1,7 ml probówki do mikrowirówek</td><td>DOT</td><td>RN1700-GMT</td><td></td></tr><tr><td>2,5% trypsyna</td><td>Gibco</td><td>15090-046</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka 3 ml z igłą 21 G</td><td>Fisher</td><td>14-826-84</td><td></td></tr><tr><td>10 ml plastikowa strzykawka</td><td>Fisher</td><td>14-823-2A</td><td></td></tr><tr><td>Igła 14 G</td><td>Fisher</td><td>14-817-203</td><td></td></tr><tr><td>Igła 15 G</td><td>Medline</td><td>SWD200029Z</td><td></td></tr><tr><td>16 G Fisher</td><td></td><td>14-817-104</td><td></td></tr><tr><td>Igła 18 G</td><td>Fisher</td><td>14-840-97</td><td></td></tr><tr><td>Igła 22 G</td><td>Fisher</td><td>14-840-90</td><td></td></tr><tr><td>32% paraformaldehyd</td><td>Fisher</td><td>50-980-495</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 647 kozia anty-królik IgG (H+L)</td><td>Invitrogen</td><td>A21244</td><td>RRID:AB_2535813</td></tr><tr><td>Amfoterycyna B</td><td>Gibco</td><td>15290-026</td><td></td></tr><tr><td>Kleszczyki do kapsułek Arruga Micro Embryonic, zakrzywione; 4"&nbsp;</td>Suplement B-27 <td>do autoklawu</td> <td>Roboz</td><td>RS-5163</td></tr><tr><td>(50x), bez surowicy</td><td>Gibco</td><td>A3582801</td><td></td></tr><tr><td>BioCoat 24-well Poly D lysine plates&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>08-774-124</td><td></td></tr><tr><td>kwas borowy</td><td>Sigma</td><td>B6768-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek wapnia</td><td>Sigma</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>Castroviejo 3 1/2 "Długie 8 x 0,15 mm Ostre nożyczki</td><td>Autoklaw Roboz</td><td>RS-5658</td><td></td></tr><tr><td>Urządzenie</td><td></td><td></td> do liczenia komórek <td>automatyczne lub ręczne</td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny z mocowaniem</td> <td>do komory żywych komórek</td><td></td><td></td></tr><tr>Oprogramowanie <td></td><td></td><td></td><td>do obrazowania konfokalnego</td></tr><tr><td>D-(+)-glukoza</td><td>Sigma</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>DNaza I (Worthington)</td><td>Fisher</td><td>NC9185812</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco</td><td>Gibco</td><td>14200-075</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Fisher</td><td>O2783-100</td><td></td></tr><tr><td>Fatal-Plus Rozwiązanie</td><td>Vortech Pharmaceuticals, LTD</td><td>NDC 0298-9373-68</td><td>pentobarbital sodu; można stosować inne zatwierdzone metody eutanazji&nbsp;</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Invitrogen</td><td>16000044</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór odczynnika gentamycyny</td><td>Gibco</td><td>15710-072</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>substytut glutaminy</td></tr><tr><td>Zbilansowany roztwór soli Hanksa</td><td>Gibco</td><td>24020-117</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ wersja 1.51n</td><td>ImageJ</td><td></td><td>Life-Line wersja 2017 30 maja: https://imagej.net/software/fiji/downloads</td></tr><tr><td>KymoAnalyzer (wersja 1.01)</td><td>Pakiet Encalada Lab</td><td></td><td>zawiera wszystkie 6 makr: https://www.encalada.scripps.edu/kymoanalyzer</td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000</td><td>Invitrogen</td><td>100022050</td><td>Stosowanie z odczynnikiem zwiększającym transfekcję P3000</td></tr><tr><td>Chlorek magnezu</td><td>Fisher</td><td>AC223211000</td><td></td></tr><tr><td>Hydrat MES</td><td>Sigma</td><td>M8250</td><td></td></tr><tr><td>Mikronożyczki preparacyjne 3,5" proste ostre/ostre</td><td>autoklaw Roboz</td><td>RS-5910</td><td></td></tr><tr><td>medium</td><td>Gibco</td><td>A3582901</td><td></td></tr><tr><td>Neurofascin (A12/18) Mysz IgG2a</td><td>UC Davis/NIH NeuroMab</td><td>75-172</td><td>RRID:AB_2282826; 250 ng/mL; Działa w neuronach szczurów, NIE w neuronach myszy</td></tr><tr><td>Neurofascin 186 (D6G60) Sygnalizacja komórkowa IgG królika</td><td></td><td>15034</td><td>RRID: AB_2773024; 500 ng / ml; Działa w neuronach myszy, nie testowaliśmy na neuronach szczurów</td></tr><tr><td>surowica nowonarodzonych cieląt</td><td>Gibco</td><td>16010-167</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Gibco</td><td>31985-062</td><td></td></tr><tr><td>P3000</td><td>Invitrogen</td><td>100022057</td><td></td></tr><tr><td>szalka Petriego, szkło 100 x 10 mm</td><td>Fisher</td><td>08-748B</td><td>Do preparacji; autoklaw</td></tr><tr><td>szalka Petriego, szkło 100 x 20 mm</td><td>Fisher</td><td>08-748D</td><td>Aby umieścić rogi macicy w; autoklaw</td></tr><tr><td>Poli-D-lizyna</td><td>Sigma</td><td>P7886-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Polipropylenowe stożkowe probówki wirówkowe (15 ml)</td><td>Fisher</td><td>14-955-238</td><td></td></tr><tr><td>Polipropylenowe stożkowe probówki wirówkowe (50 ml)</td><td>Fisher</td><td>14-955-238</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Fisher</td><td>P217-500</td><td></td></tr><tr><td>Octan sodu</td><td>Sigma</td><td>S5636</td><td></td></tr><tr><td>dekahydrat boranu sodu</td><td>VWR</td><td>MK745706</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki operacyjne z prostym ostrzem Blunt/Sharp</td><td>Fisher</td><td>13-810-2</td><td>autoklaw</td></tr><tr><td>Filtry strzykawkowe, 0,22 i mikro; m</td><td>VWR</td><td>514-1263</td><td></td></tr><tr><td>Kleszczyki opatrunkowe do kciuków, ząbkowane, 4,5"</td><td>Autoklaw</td><td>Roboz RS-8100</td><td></td></tr> <tr><td>i mikro-slajd 4-dołkowy szklane dno</td><td>Ibidi</td><td>80427</td><td></td></tr></tbody></table>

wykorzystanie obrazowania żywych komórek do pomiaru wpływu patologicznych białek na transport aksonalny w pierwotnych neuronach hipokampa

Using Live&#45;Cell Imaging to Measure the Effects of Pathological Proteins on Axonal Transport in Primary Hippocampal Neurons

Dwukierunkowy transport ładunków wzdłuż aksonu jest kluczowy dla utrzymania funkcjonalnych synaps, połączeń neuronowych i zdrowych neuronów. Transport aksonalny jest zakłócony w wielu chorobach neurodegeneracyjnych, a neurony projekcyjne są szczególnie wrażliwe ze względu na konieczność transportu materiałów komórkowych na duże odległości i utrzymania znacznej masy aksonalnej. Patologiczne modyfikacje kilku białek związanych z chorobą negatywnie wpływają na transport, w tym tau, β amyloidu, α-synukleiny, dysmutazy ponadtlenkowej i huntingtyny, zapewniając potencjalny wspólny mechanizm, za pomocą którego patologiczne białka wywierają toksyczność w chorobie. Metody badania tych toksycznych mechanizmów są niezbędne do zrozumienia zaburzeń neurodegeneracyjnych i identyfikacji potencjalnych interwencji terapeutycznych.
Tutaj hodowane pierwotne neurony hipokampa gryzoni są współtransfekowane z wieloma plazmidami w celu zbadania wpływu patologicznych białek na szybki transport aksonalny za pomocą obrazowania konfokalnego żywych komórek fluorescencyjnie znakowanych białek ładunku. Zaczynamy od zbioru, dysocjacji i hodowli pierwotnych neuronów hipokampa od gryzoni. Następnie dokonujemy kotransfekcji neuronów za pomocą plazmidowych konstruktów DNA w celu ekspresji znakowanego fluorescencyjnie białka ładunkowego i tau typu dzikiego lub zmutowanego (używanego jako przykład patologicznych białek). Aksony są identyfikowane w żywych komórkach za pomocą przeciwciała, które wiąże zewnątrzkomórkową domenę neurofaszyny, białko początkowego segmentu aksonu, a obszar aksonalny będący przedmiotem zainteresowania jest obrazowany w celu pomiaru fluorescencyjnego transportu ładunku.
Korzystając z KymoAnalyzer, swobodnie dostępnego makra ImageJ, szczegółowo charakteryzujemy prędkość, częstotliwość pauz i kierunkową gęstość ładunku w transporcie aksonalnym, na wszystkie te czynniki może mieć wpływ obecność patologicznych białek. Dzięki tej metodzie identyfikujemy fenotyp zwiększonej częstotliwości pauzy ładunku związany z ekspresją patologicznego białka tau. Dodatkowo, wyciszające geny konstrukty shRNA mogą zostać dodane do mieszanki transfekcyjnej w celu przetestowania roli innych białek w pośredniczeniu w zakłóceniach transportu. Protokół ten można łatwo dostosować do stosowania z innymi białkami związanymi z chorobami neurodegeneracyjnymi i jest powtarzalną metodą badania mechanizmów, w jaki sposób białka te zakłócają transport aksonalny.

Wykorzystując te metody, scharakteryzowaliśmy transport aksonalny w obecności białka tau typu dzikiego lub form związanych z chorobą, aby zbadać potencjalne mechanizmy neurotoksyczności indukowanej patologicznym białkiem tau w przebiegu choroby12,13. Oprogramowanie KymoAnalyzer oblicza i agreguje szereg różnych parametrów ze wszystkich kymografów znajdujących się w danym folderze. Prędkości transportu są obliczane zarówno dla ładunku w ruchu (prędkość segmentowa)...

Tutaj pokazujemy, jak połączyć transfekcję pierwotnych neuronów gryzoni hipokampa z obrazowaniem konfokalnym żywych komórek, aby przeanalizować patologiczne efekty wywołane przez białka na transport aksonalny i zidentyfikować szlaki mechanistyczne pośredniczące w tych efektach.

Wykorzystanie obrazowania żywych komórek do pomiaru wpływu patologicznych białek na transport aksonalny w pierwotnych neuronach hipokampa

Bidirectional transport of cargos along the axon is critical for maintaining functional synapses, neural connectivity, and healthy neurons. Axonal ...

Neurony polegają na dwukierunkowym transporcie ładunku wzdłuż aksonu w celu utrzymania funkcjonalnej synapsy i połączeń neurologicznych. Uważa się, że deficyty w transporcie są krytycznymi czynnikami przyczyniającymi się do patogenezy kilku chorób neurodegeneracyjnych. Naszym celem jest zidentyfikowanie mechanizmów, za pomocą których związane z chorobą modyfikacje białka tau zakłócają transport aksonalny.Ustaliliśmy, że wiele patologicznych form białka tau zakłóca normalny transport aksonalny w neuronach ssaków. Efekt ten zależy od zmian w szlakach sygnałowych opartych na fosforylacji, które regulują transport aksonalny. Zakłócenia te stanowią potencjalny mechanizm neurotoksyczności indukowanej tau w chorobie.Zmodyfikowane formy określonych białek mogą zakłócać normalny szybki transport aksonalny w wielu chorobach neurodegeneracyjnych. Jednak nie do końca rozumiemy mechanizmy leżące u podstaw tych efektów. Zapewnia to powtarzalny i prosty protokół do określenia, w jaki sposób ekspresja białek związanych z chorobą wpływa na szybki transport aksonalny w neuronach ssaków.Protokół ten zapewnia powtarzalny test transportu aksonalnego w pierwotnych neuronach ssaków, który można łatwo modyfikować w celu uwzględnienia różnych białek ładunkowych wraz z ekspresją białek będących przedmiotem zainteresowania z określonymi modyfikacjami patologicznymi. Pozwala również na celowe wyciszenie innych komponentów szlaku w celu przetestowania określonych szczegółów mechanistycznych. Aby rozpocząć, należy pokryć szkiełko ze szklanym dnem z czterema dołkami, dodając 750 mikrolitrów roztworu poli-d-lizyny do każdej studzienki.Inkubować szkiełko przez noc w temperaturze pokojowej. Po inkubacji umyć szkiełko czterokrotnie sterylną wodą dejonizowaną, wysuszyć na powietrzu i przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza, jeśli nie zostanie natychmiast użyte. Następnie wykonaj sekcję szczeniąt myszy.Zaczynając od otworu wielkiego, użyj nożyczek do mikropreparacji, aby przeciąć skórę i czaszkę wzdłuż linii środkowej. Upewnij się, że dolna końcówka nożyczek jest skierowana pod kątem do czaszki, aby uniknąć uszkodzenia tkanki mózgowej. Usuń leżącą na wierzchu skórę i ostrożnie usuń czaszkę, aby odsłonić mózg.Użyj kleszczy, aby przytrzymać usta lub nos i obróć czaszkę tak, aby mózg był skierowany w dół nad szalką Petriego wypełnioną 0,9% solą fizjologiczną. Wyłóż mózg z czaszki i przetnij nerwy i pień mózgu, aby uwolnić mózg do soli fizjologicznej. Umieścić szalkę Petriego pod mikroskopem preparacyjnym.Aby wypreparować hipokamp, najpierw włóż nożyczki w linię środkową mózgu, ustaw nożyczki pod takim kątem, aby górne ostrze wypychało jedną z półkul mózgowych na zewnątrz i przetnij, aby oddzielić półkulę od obszarów podkorowych. Wykonaj pionowe przecięcie przez korę, tak aby kora czołowa była przednia, a hipokamp znajdował się z tyłu miejsca cięcia. Włóż dolną końcówkę nożyczek do powstałego otworu i ostrożnie przetnij wzdłuż wierzchołka kory, zatrzymując się na tylnym końcu.Za pomocą kleszczy ostrożnie odchyl korę i zakończ tylne cięcie. W tym momencie hipokamp powinien przypominać kształt półksiężyca. Ostrożnie przytnij pozostałą korę, aby utrzymać kształt półksiężyca hipokampa.Następnie usuń opony mózgowe z hipokampa za pomocą kleszczy i nożyczek. Pokrój hipokamp na cztery równe części i umieść je w 15-mililitrowej stożkowej tubie z lodowatym buforem bez wapnia i magnezu. Zacznij od wypreparowania hipokampa z embrionalnego mózgu myszy i umieść wypreparowaną tkankę w lodowatym buforze wolnym od wapnia i magnezu lub CMF.Następnie wyjmij CMF i spłucz tkankę cztery razy świeżym zimnym CMF, delikatnie obracając probówkę między płukaniami. Następnie dodaj przefiltrowany 0,125% roztwór tripsin i inkubuj przez 15 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, mieszając co pięć minut. Po inkubacji usunąć roztwór trypsyny i przemyć dwa razy lodowatym CMF.Następnie dodaj trzy mililitry roztworu inaktywującego trypsynę. Następnie, aby oddzielić komórki, rozcieraj 30 razy, używając dwóch sekundowych zaciągnięć igłą o rozmiarze 14 przymocowaną do trzymililitrowej strzykawki. Kontynuuj rozcieranie z dwoma sekundowymi zaciągnięciami 30 razy za pomocą igły o rozmiarze 15, następnie 20 razy za pomocą igły o rozmiarze 16, a następnie 20 razy za pomocą igły o rozmiarze 18.Następnie wykonaj trzy sekundy pobrania za pomocą igły o rozmiarze 21 15 razy, aby zakończyć dysocjację komórek. Sprawdź, czy nie ma grudek komórek, umieszczając kroplę zawiesiny komórek na szkiełku mikroskopowym. Następnie przefiltruj pięć mililitrów FBS za pomocą filtra strzykawkowego o wielkości 0,22 mikrona.Delikatnie ułóż zawiesinę komórek na FBS w stożkowej probówce o pojemności 15 mililitrów. Odwiruj komórki w temperaturze 200 G w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut. Usunąć FBS i ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze ciepłego, wolnego od antybiotyków podłoża neuropodstawowego.Rozcieńczyć zawiesinę komórkową w 0,4% błękitu trytrynowego i uzyskać liczbę komórek. Umieść komórki w 750 mikrolitrach bezantybiotykowego podłoża neurobazalnego we wstępnie podgrzanym, czterokomorowym szkiełku pokrytym poli-d-lizyną. Inkubuj komórki w komorze o kontrolowanej wilgotności w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2.Przygotuj się do obrazowania za pomocą mikroskopu konfokalnego dwa dni po transfekcji pierwotnych neuronów hipokampa. Podgrzej nasadkę komory żywej komórki, 60-krotny substancjum i olej do soczewek do 37 stopni Celsjusza i zrównoważ komorę do 5% CO2. Za pomocą okularów zidentyfikuj transfekowane neurony w kanale zawierającym białko ładunku.Następnie kliknij skanowanie, aby zobrazować neurony i zidentyfikować początkowy segment aksonu kanału Psi Five. Ustaw pole widzenia na prostokątne pole o wymiarach 32 na 128 pikseli i przesuń je, aby zobrazować obszar aksonu o wielkości od 50 do 150 mikronów dystalny od początkowego segmentu aksonu. Zapisz kierunek transportu ładunku i orientację zwrotu z inwestycji, a następnie naciśnij Zapisz jako, aby zapisać go jako plik.Zwróć uwagę, że kropki na polu pojawią się u góry i po prawej stronie na kolejnych obrazach. Zapisz stronę obrazu najbliższą ciału komórki i stronę najbliższą końcowi aksonu, aby zapewnić prawidłową orientację polilinii kimografu. Ustaw moc lasera 561 na 1,40, otwór na 7,8, rozmiar na 128 pikseli do kwadratu, a prędkość na 32 klatki na sekundę.Dostosuj wzmocnienie, aby zwizualizować transport pojedynczych pęcherzyków ładunkowych bez zasłaniania ich sygnałem tła. Wybierz narysuj prostokątny ROI z menu rozwijanego ROI i narysuj ROI tak, aby obejmował całe pole view. Następnie kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz użyj jako stymulacji ROI S1. Następnie w zakładce Ustawienia ND kliknij na Pobierz obraz, aby pobrać obraz referencyjny przed stymulacją.Następnie ustaw stymulację na ROI S1, interwał na brak opóźnienia, czas trwania 1,64 sekundy i pętle na siedem. Następnie kliknij pobierz obraz, aby zebrać obraz referencyjny po stymulacji. Wybierz oczekiwanie, bez pozyskiwania, dwie minuty, aby zapewnić okres rekonwalescencji dla ładunku fluorescencyjnego w celu ponownego zapełnienia wybielonego zwrotu z inwestycji.Wybierz akwizycję, interwał, bez opóźnienia, czas trwania pięć minut, pętle 8, 615. Kliknij przycisk zastosuj ustawienia stymulacji na karcie ustawień ND, a następnie uruchom teraz. Zbierz również filmy transportowe z co najmniej dwóch neuronów do analizy.Zresetuj pole widzenia do całego obrazu, a następnie zbierz obraz całego neuronu w kanałach 561 i 647, z dołączonym polem ROI. Zapisz współrzędne XY, w których wykonano obraz, w celu potwierdzenia ekspresji białka po utrwaleniu. Przy użyciu tego protokołu przeprowadzono obrazowanie żywych komórek transfekowanego neuronu wyrażającego białko ładunku mA-synaptofizynę.Oznaczono również zewnętrzną domenę neurofaszyny w początkowym segmencie aksonu. Obrazowanie transportu ładunków wykonano w obszarze aksonalnym będącym przedmiotem zainteresowania. Co więcej, analiza immunofluorescencyjna po obrazowaniu potwierdziła koekspresję białka tau i mA-synaptofizyny.

using-live-cell-imaging-to-measure-effects-pathological-proteins-on

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Obrazowanie żywych komórek jest szczególnie użyteczne podczas badania dynamiki transportu organelli. W niniejszym materiale opisujemy protokół obrazowania na żywo pęcherzyków o gęstym rdzeniu w hodowlach neuronów z wykorzystaniem szerokopolowej mikroskopii fluorescencyjnej. Protokół ten jest elastyczny i może zostać dostosowany do obrazowania innych organelli, takich jak mitochondria, endosomy i peroksysomy.

Obrazowanie na żywo pęcherzyków o gęstym rdzeniu w pierwotnych hodowlach neuronów hipokampa

Opisujemy protokół umożliwiający obrazowanie mitochondriów w żywych neuronach za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej przez dłuższy czas. Obrazowanie w wydłużonych przedziałach czasowych osiągnięto dzięki ekspresji białka fluorescencyjnego skierowanego do mitochondriów za pomocą lentiwirusa oraz zastosowaniu niedrogiego inkubatora nakładanego na stolik mikroskopu, który został zaprojektowany i zbudowany w naszym laboratorium.

Neuromodulacja i transport mitochondriów: obrazowanie żywych neuronów hipokampa w długich odstępach czasu

Niniejszy raport opisuje zastosowanie obrazowania żywych komórek oraz technik fotowybielania w celu określenia ekspresji powierzchniowej, szlaków transportu i kinetyki ruchu egzogennych białek znakowanych pH-wrażliwym białkiem GFP w błonie plazmatycznej neuronów.

Dyfuzja boczna i egzocytoza białek błonowych w hodowlach neuronów oceniane za pomocą metody odzyskiwania fluorescencji oraz fotowybielania z utratą fluorescencji

Axonalny transport BDNF, czynnika neurotroficznego, jest krytyczny dla przetrwania i funkcjonowania kilku populacji neuronów. Niektóre zaburzenia zwyrodnieniowe charakteryzują się zaburzeniem struktury i funkcji aksonów.  Zademonstrowaliśmy techniki stosowane do badania żywego transportu QD-BDNF w komorach mikroprzepływowych przy użyciu neuronów pierwotnych.

Obrazowanie w czasie rzeczywistym transportu aksonalnego BDNF znakowanego kropkami kwantowymi w neuronach pierwotnych

Endocytoza pęcherzyków synaptycznych jest wykrywana za pomocą mikroskopii świetlnej pHluoryny połączonej z białkiem pęcherzyków synaptycznych oraz za pomocą mikroskopii elektronowej wychwytu pęcherzyków.

Pomiar endocytozy pęcherzyków synaptycznych w hodowanych neuronach hipokampa

Tutaj przedstawiono protokół do badania wczesnych skutków β amyloidu (Aβ) w mózgu.  To pokazuje, że Aβ indukuje endocytozę za pośrednictwem klatryny i zapadanie się stożków wzrostu aksonów. Protokół jest przydatny w badaniu wczesnego wpływu Aβ na stożki wzrostu aksonów i może ułatwić zapobieganie chorobie Alzheimera.

Wizualizacja zapadania się stożka wzrostu aksonów i wczesnych efektów β amyloidu w hodowanych neuronach myszy

Tutaj opisaliśmy protokół ilościowego badania montażu i struktury początkowych segmentów aksonów (AIS) neuronów hipokampa, które nie mają wstępnie zmontowanego AIS z powodu braku gigantycznej ankyryny-G.

Wykorzystanie pierwotnych hodowanych neuronów hipokampa do badania składania początkowych segmentów aksonów

Opisano dwie powiązane metody wizualizacji zdarzeń subkomórkowych wymaganych do transmisji synaptycznej. Protokoły te umożliwiają monitorowanie w czasie rzeczywistym dynamiki napływu presynaptycznego wapnia i fuzji błony pęcherzyków synaptycznych przy użyciu obrazowania żywych komórek neuronów hodowanych in vitro.

Fluorescencyjny pomiar funkcji synaptycznych w czasie rzeczywistym w modelach stwardnienia zanikowego bocznego

Korzystając z transgenicznych myszy fluorescencyjnych, opisano szczegółowe protokoły do oceny in vivo transportu aksonalnego endosomów sygnałowych i mitochondriów w obrębie aksonów motorycznych i czuciowych nienaruszonego nerwu kulszowego u żywych zwierząt.

Rozszerzenie zestawu narzędzi do obrazowania in vivo transportu aksonalnego

Prezentujemy tutaj protokół, jak przygotować pierwotne hodowle komórek glejowych, astrocytów i mikrogleju z kory mózgowej szczurów do obrazowania poklatkowego wewnątrzkomórkowego Ca2+ do badań nad patofizjologią stwardnienia zanikowego bocznego w modelu szczurzym hSOD1G93A.

Pierwotne kultury astrocytów szczurów i mikrogleju oraz ich zastosowanie w badaniu stwardnienia zanikowego bocznego

Poznaj metodę obrazowania żywych komórek do badania wpływu patologicznych białek tau na transport aksonalny w pierwotnych neuronach hipokampa myszy. Protokół ten pozwala analizować mechanizmy neurodegeneracyjne.

Wykorzystanie obrazowania żywych komórek do pomiaru wpływu patologicznych białek na transport aksonalny w pierwotnych neuronach hipokampa (Wideo) | JoVE Journal

Wykorzystanie obrazowania żywych komórek do pomiaru wpływu patologicznych białek na transport aksonalny w pierwotnych neuronach hipokampa

Przeglądaj więcej filmów