Wykorzystanie obrazowania żywych komórek do pomiaru wpływu patologicznych białek na transport aksonalny w pierwotnych neuronach hipokampa

Neurony polegają na dwukierunkowym transporcie ładunku wzdłuż aksonu w celu utrzymania funkcjonalnej synapsy i połączeń neurologicznych. Uważa się, że deficyty w transporcie są krytycznymi czynnikami przyczyniającymi się do patogenezy kilku chorób neurodegeneracyjnych. Naszym celem jest zidentyfikowanie mechanizmów, za pomocą których związane z chorobą modyfikacje białka tau zakłócają transport aksonalny.

Ustaliliśmy, że wiele patologicznych form białka tau zakłóca normalny transport aksonalny w neuronach ssaków. Efekt ten zależy od zmian w szlakach sygnałowych opartych na fosforylacji, które regulują transport aksonalny. Zakłócenia te stanowią potencjalny mechanizm neurotoksyczności indukowanej tau w chorobie.

Zmodyfikowane formy określonych białek mogą zakłócać normalny szybki transport aksonalny w wielu chorobach neurodegeneracyjnych. Jednak nie do końca rozumiemy mechanizmy leżące u podstaw tych efektów. Zapewnia to powtarzalny i prosty protokół do określenia, w jaki sposób ekspresja białek związanych z chorobą wpływa na szybki transport aksonalny w neuronach ssaków.

Protokół ten zapewnia powtarzalny test transportu aksonalnego w pierwotnych neuronach ssaków, który można łatwo modyfikować w celu uwzględnienia różnych białek ładunkowych wraz z ekspresją białek będących przedmiotem zainteresowania z określonymi modyfikacjami patologicznymi. Pozwala również na celowe wyciszenie innych komponentów szlaku w celu przetestowania określonych szczegółów mechanistycznych. Aby rozpocząć, należy pokryć szkiełko ze szklanym dnem z czterema dołkami, dodając 750 mikrolitrów roztworu poli-d-lizyny do każdej studzienki.

Inkubować szkiełko przez noc w temperaturze pokojowej. Po inkubacji umyć szkiełko czterokrotnie sterylną wodą dejonizowaną, wysuszyć na powietrzu i przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza, jeśli nie zostanie natychmiast użyte. Następnie wykonaj sekcję szczeniąt myszy.

Zaczynając od otworu wielkiego, użyj nożyczek do mikropreparacji, aby przeciąć skórę i czaszkę wzdłuż linii środkowej. Upewnij się, że dolna końcówka nożyczek jest skierowana pod kątem do czaszki, aby uniknąć uszkodzenia tkanki mózgowej. Usuń leżącą na wierzchu skórę i ostrożnie usuń czaszkę, aby odsłonić mózg.

Użyj kleszczy, aby przytrzymać usta lub nos i obróć czaszkę tak, aby mózg był skierowany w dół nad szalką Petriego wypełnioną 0,9% solą fizjologiczną. Wyłóż mózg z czaszki i przetnij nerwy i pień mózgu, aby uwolnić mózg do soli fizjologicznej. Umieścić szalkę Petriego pod mikroskopem preparacyjnym.

Aby wypreparować hipokamp, najpierw włóż nożyczki w linię środkową mózgu, ustaw nożyczki pod takim kątem, aby górne ostrze wypychało jedną z półkul mózgowych na zewnątrz i przetnij, aby oddzielić półkulę od obszarów podkorowych. Wykonaj pionowe przecięcie przez korę, tak aby kora czołowa była przednia, a hipokamp znajdował się z tyłu miejsca cięcia. Włóż dolną końcówkę nożyczek do powstałego otworu i ostrożnie przetnij wzdłuż wierzchołka kory, zatrzymując się na tylnym końcu.

Za pomocą kleszczy ostrożnie odchyl korę i zakończ tylne cięcie. W tym momencie hipokamp powinien przypominać kształt półksiężyca. Ostrożnie przytnij pozostałą korę, aby utrzymać kształt półksiężyca hipokampa.

Następnie usuń opony mózgowe z hipokampa za pomocą kleszczy i nożyczek. Pokrój hipokamp na cztery równe części i umieść je w 15-mililitrowej stożkowej tubie z lodowatym buforem bez wapnia i magnezu. Zacznij od wypreparowania hipokampa z embrionalnego mózgu myszy i umieść wypreparowaną tkankę w lodowatym buforze wolnym od wapnia i magnezu lub CMF.

Następnie wyjmij CMF i spłucz tkankę cztery razy świeżym zimnym CMF, delikatnie obracając probówkę między płukaniami. Następnie dodaj przefiltrowany 0,125% roztwór tripsin i inkubuj przez 15 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, mieszając co pięć minut. Po inkubacji usunąć roztwór trypsyny i przemyć dwa razy lodowatym CMF.

Następnie dodaj trzy mililitry roztworu inaktywującego trypsynę. Następnie, aby oddzielić komórki, rozcieraj 30 razy, używając dwóch sekundowych zaciągnięć igłą o rozmiarze 14 przymocowaną do trzymililitrowej strzykawki. Kontynuuj rozcieranie z dwoma sekundowymi zaciągnięciami 30 razy za pomocą igły o rozmiarze 15, następnie 20 razy za pomocą igły o rozmiarze 16, a następnie 20 razy za pomocą igły o rozmiarze 18.

Następnie wykonaj trzy sekundy pobrania za pomocą igły o rozmiarze 21 15 razy, aby zakończyć dysocjację komórek. Sprawdź, czy nie ma grudek komórek, umieszczając kroplę zawiesiny komórek na szkiełku mikroskopowym. Następnie przefiltruj pięć mililitrów FBS za pomocą filtra strzykawkowego o wielkości 0,22 mikrona.

Delikatnie ułóż zawiesinę komórek na FBS w stożkowej probówce o pojemności 15 mililitrów. Odwiruj komórki w temperaturze 200 G w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut. Usunąć FBS i ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze ciepłego, wolnego od antybiotyków podłoża neuropodstawowego.

Rozcieńczyć zawiesinę komórkową w 0,4% błękitu trytrynowego i uzyskać liczbę komórek. Umieść komórki w 750 mikrolitrach bezantybiotykowego podłoża neurobazalnego we wstępnie podgrzanym, czterokomorowym szkiełku pokrytym poli-d-lizyną. Inkubuj komórki w komorze o kontrolowanej wilgotności w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2.

Przygotuj się do obrazowania za pomocą mikroskopu konfokalnego dwa dni po transfekcji pierwotnych neuronów hipokampa. Podgrzej nasadkę komory żywej komórki, 60-krotny substancjum i olej do soczewek do 37 stopni Celsjusza i zrównoważ komorę do 5% CO2. Za pomocą okularów zidentyfikuj transfekowane neurony w kanale zawierającym białko ładunku.

Następnie kliknij skanowanie, aby zobrazować neurony i zidentyfikować początkowy segment aksonu kanału Psi Five. Ustaw pole widzenia na prostokątne pole o wymiarach 32 na 128 pikseli i przesuń je, aby zobrazować obszar aksonu o wielkości od 50 do 150 mikronów dystalny od początkowego segmentu aksonu. Zapisz kierunek transportu ładunku i orientację zwrotu z inwestycji, a następnie naciśnij Zapisz jako, aby zapisać go jako plik.

Zwróć uwagę, że kropki na polu pojawią się u góry i po prawej stronie na kolejnych obrazach. Zapisz stronę obrazu najbliższą ciału komórki i stronę najbliższą końcowi aksonu, aby zapewnić prawidłową orientację polilinii kimografu. Ustaw moc lasera 561 na 1,40, otwór na 7,8, rozmiar na 128 pikseli do kwadratu, a prędkość na 32 klatki na sekundę.

Dostosuj wzmocnienie, aby zwizualizować transport pojedynczych pęcherzyków ładunkowych bez zasłaniania ich sygnałem tła. Wybierz narysuj prostokątny ROI z menu rozwijanego ROI i narysuj ROI tak, aby obejmował całe pole view. Następnie kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz użyj jako stymulacji ROI S1. Następnie w zakładce Ustawienia ND kliknij na Pobierz obraz, aby pobrać obraz referencyjny przed stymulacją.

Następnie ustaw stymulację na ROI S1, interwał na brak opóźnienia, czas trwania 1,64 sekundy i pętle na siedem. Następnie kliknij pobierz obraz, aby zebrać obraz referencyjny po stymulacji. Wybierz oczekiwanie, bez pozyskiwania, dwie minuty, aby zapewnić okres rekonwalescencji dla ładunku fluorescencyjnego w celu ponownego zapełnienia wybielonego zwrotu z inwestycji.

Wybierz akwizycję, interwał, bez opóźnienia, czas trwania pięć minut, pętle 8, 615. Kliknij przycisk zastosuj ustawienia stymulacji na karcie ustawień ND, a następnie uruchom teraz. Zbierz również filmy transportowe z co najmniej dwóch neuronów do analizy.

Zresetuj pole widzenia do całego obrazu, a następnie zbierz obraz całego neuronu w kanałach 561 i 647, z dołączonym polem ROI. Zapisz współrzędne XY, w których wykonano obraz, w celu potwierdzenia ekspresji białka po utrwaleniu. Przy użyciu tego protokołu przeprowadzono obrazowanie żywych komórek transfekowanego neuronu wyrażającego białko ładunku mA-synaptofizynę.

Oznaczono również zewnętrzną domenę neurofaszyny w początkowym segmencie aksonu. Obrazowanie transportu ładunków wykonano w obszarze aksonalnym będącym przedmiotem zainteresowania. Co więcej, analiza immunofluorescencyjna po obrazowaniu potwierdziła koekspresję białka tau i mA-synaptofizyny.