Name: Multianalitowy test syntetycznego biomarkera moczu za pośrednictwem CRISPR-Cas do przenośnej diagnostyki (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-08T14:40:00.000+00:00
Duration: 4 min 33 s
Description: Poznaj wieloanalityczny test syntetycznych biomarkerów moczu oparty na CRISPR-Cas do przenośnej diagnostyki nowotworowej. Ta metoda wykrywa aktywność proteaz związanych z guzami z wysoką czułością.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było częściowo wspierane przez Koch Institute Support Grant numer P30-CA14051 z National Cancer Institute (Swanson Biotechnology Center), Core Center Grant P30-ES002109 z National Institute of Environmental Health Sciences, Koch Institute's Marble Center for Cancer Nanomedicine, Koch Institute Frontier Research Program za pośrednictwem Kathy and Curt Marble Cancer Research Fund, oraz Virginia and D. K. Ludwig Fund for Cancer Research (Fundusz Badań nad Rakiem Wirginii i D. K. Ludwiga). A.E.V.H. jest wspierany przez stypendium na szkolenie przeddoktoranckie finansowane przez NIH (T32GM130546). S.N.B. jest badaczem w Instytucie Medycznym Howarda Hughesa. L.H. jest wspierany przez nagrodę K99/R00 Pathway to Independence Award przyznawaną przez National Cancer Institute oraz fundusze na rozpoczęcie działalności przez Boston University.

Wszystkie badania na zwierzętach są zatwierdzane przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) w instytucji autora. Do prawidłowego przeprowadzenia tych eksperymentów wymagane są standardowe obiekty opieki nad zwierzętami, w tym komory hodowlane, sterylne kaptury, znieczulenie i etyczne zakończenie eutanazji. Wszystkie eksperymenty są przeprowadzane zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi i krajowymi oraz nadzorowane przez personel weterynaryjny w placówce. Samice myszy BALB/c, wykorzystywane do eksperymentów, są pozyskiwane ze źródła komercyjnego (patrz tabela materiałów) i są w wieku od 6 do 8 tygodni na początku badania. Sekwencje dla specjalnie zsyntetyzowanego DNA, crRNA, sond substratowych peptydowych na bazie FRET i peptydów czujnikowych przedstawiono w tabeli uzupełniającej 1.
1. Wybór substratu peptydowego aktywowanego proteazą
<ol>
	<li>Zbierz i przygotuj próbki tkanek ze zdrowych płuc lub tkanki płucnej z guzkami nowotworowymi zgodnie z wcześniej opublikowanym raportem13.
	<ol>
		<li>Homogenizować tkanki we wstępnie schłodzonej soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS, pH 7,4) (200 mg tkanki/ml PBS) za pomocą probówek dysocjacyjnych do tkanek w celu automatycznej dysocjacji tkanek na zawiesiny jednokomórkowe.</li>
		<li>Odwirować homogenację tkanki w temperaturze 6 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Zachować supernatant w nowej probówce.</li>
		<li>Odwirować supernatant przy 14 000 x g przez 25 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Zmierz stężenie białka za pomocą zestawu do oznaczania białek kwasu bicinchoninowego (BCA) (patrz tabela materiałów).</li>
		<li>Dodać PBS do próbki, aby przygotować roztwór o stężeniu 0,33 mg/ml.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oceń aktywność proteolityczną, wykonując poniższe czynności.
	<ol>
		<li>Na płytce 384-dołkowej dodaj 5 μl, 6 μM sond substratu peptydowego na bazie FRET do każdej studzienki. Dla każdej sondy przeprowadzić reakcję w trzech egzemplarzach. 
		UWAGA: Sonda substratu peptydowego na bazie FRET zawiera krótką sekwencję peptydową (6-8 aminokwasów, zaprojektowaną tak, aby była specyficzna dla docelowej proteazy lub grupy proteaz) zakończoną parą fluoroforów i wygaszaczy. Dwie sondy FRET są opisane w tabeli uzupełniającej 1 jako przykład. Pełną bibliotekę sond można znaleźć w Hao et al.13.</li>
		<li>Wirować płytkę dołka przez 10 s w temperaturze pokojowej przy 180 x g, aby upewnić się, że sondy znajdują się na dnie płytki.</li>
		<li>Dodaj 25 μl 0,33 mg/ml próbki tkanki lub 40 μM rekombinowanej proteazy13 do każdego dołka. 
		UWAGA: Końcowe stężenie próbki tkanki lub rekombinowanej proteazy może wymagać optymalizacji zgodnie z ich wewnętrzną aktywnością proteolityczną. Na przykład tkanki o wysokim stopniu proteolityczności, takie jak jelita, mogą wymagać wyższych współczynników rozcieńczenia, aby umożliwić monitorowanie początkowego rozszczepienia enzymatycznego.</li>
		<li>Krótko odwirować płytkę studzienkową o sile 180 x g (w temperaturze pokojowej) w celu wymieszania sond i lizatów tkankowych.</li>
		<li>Natychmiast rozpocznij wykrywanie rozszczepienia sondy, mierząc fluorescencję za pomocą czytnika płytek w temperaturze 37 °C co 2 minuty przez 1 godzinę (λ ex: 485 nm; λem: 535 nm) w celu monitorowania rozszczepienia. 
		UWAGA: Użyj odpowiednich długości fal wzbudzenia i emisji dla określonych par fluoroforów i wygaszaczy. W przypadku tego badania parametry (λex: 485 nm i λem: 535 nm) są ustalane dla fluoroforu FAM.</li>
		<li>Aby przeanalizować dane pomiarowe fluorescencji, wykorzystaj pakiet Python (patrz tabela materiałów) do analizy kinetyki enzymów dostępny pod adresem https://github.com/nharzallah/NNanotech-Kinetic. Ten skrypt oblicza początkową prędkość reakcji (V0) przy użyciu nachylenia dopasowania liniowego pierwszych 8-10 początkowych punktów czasowych.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Formułowanie i charakterystyka czujnika
<ol>
	<li>Zsyntetyzuj koniugat DNA i peptydu aktywowanego proteazą (PAP).
	<ol>
		<li>Inkubować 20-merowe fosforopianowane DNA z grupą 3'-DBCO (1,1 eq., patrz tabela materiałów) z zakończonymi azydkami PAP z C-końcowym końcem cysteiny w 100 mM buforze fosforanowym (pH 7,0) w temperaturze pokojowej przez >4 h. W przypadku pozostawienia na noc inkubować w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Oczyść produkt za pomocą systemu wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) wyposażonego w kolumnę idealną dla biomolekuł (patrz Tabela materiałów). Ustaw gradient HPLC tak, aby zaczynał się od 5% buforu A (0,05% TFA w H2O), utrzymuj izokratyczny przez 20 minut i osiągnij 80% bufor B (0,05% TFA, 99,95% acetonitrylu) przez 65 minut przy natężeniu przepływu 0,3 ml min-1 i zbierz sprzężony produkt z czasem retencji po ~31 min.</li>
		<li>Walidację oczyszczonych koniugatów za pomocą spektrometrii mas z desorpcją/jonizacją czasu przelotu wspomaganą matrycą (MALDI-TOF) przy użyciu kwasu α-cyjano-4-hydroksycynamonowego jako matrycy14(patrz tabela materiałów).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zsyntetyzuj kodowane w DNA nanoczujniki oparte na aktywności.
	<ol>
		<li>Rozpuścić 2 mg wielowartościowego PEG (40 kDa, 8-ramienny, patrz tabela materiałów) z grupą maleimidowo-reaktywną w 1 ml 100 mM buforu fosforanowego (pH 7,0) i filtrze (odcięcie: 0,2 μm).</li>
		<li>Dodaj koniugaty DNA-peptyd zakończone cysteiną (2 równanie, patrz tabela materiałów) do PEG i reaguj w temperaturze pokojowej przez >4 godziny. W przypadku pozostawienia na noc inkubować w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Usunąć niesprzężone materiały za pomocą chromatografii wykluczania wielkości z dostępną w handlu kolumną o matrycy kompozytowej dektran-agaroza na szybkiej chromatografii cieczowej białek (FPLC) (patrz tabela materiałów). Badaj próbki w PBS i monitoruj absorbancję przy 260 nm dla DNA i 280 nm dla peptydu.</li>
		<li>Zsyntetyzowane nanoczujniki skoncentrować za pomocą odśrodkowych rurek filtracyjnych (MWCO = 10 kDa) zgodnie z prędkością zalecaną przez producenta (patrz tabela materiałów).</li>
		<li>Określić ilościowo stężenie DNA za pomocą zestawu do oznaczania ssDNA (patrz tabela materiałów) i czytnika płytek przy λex: 485 nm i λem: 535 nm. Przechowywać nanoczujniki w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Scharakteryzuj kodowane przez DNA nanoczujniki oparte na aktywności.
	<ol>
		<li>Pomiar hydrodynamicznej wielkości cząstek nanoczujników kodowanych DNA za pomocą dynamicznego rozpraszania światła (DLS). 
		UWAGA: Oczekiwany zakres rozmiarów nanosensorów to 15-50 nm, przy średniej wielkości 20-30 nm. Jeśli pożądany jest ograniczony zakres rozmiarów, FPLC (w kroku 2.3) można użyć do wyizolowania węższych frakcji o różnej masie cząsteczkowej.</li>
		<li>Skoncentrować nanoczujniki do 0,5 mg/ml (na podstawie stężenia DNA) za pomocą odśrodkowych probówek filtrujących (MWCO = 10 kDa) i załadować próbki na miedzianą siatkę pokrytą folią węglową, zamontowaną na uchwycie kriotermicznym. Obserwuj morfologię za pomocą kriogenicznej transmisyjnej mikroskopii elektronowej (200 kV, powiększenie 10 000-60 000)14.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Wstrzykiwanie czujnika i zbieranie moczu
<ol>
	<li>Zbierz mocz do pomiaru wyjściowego.
	<ol>
		<li>Umieść mysz w niestandardowej komorze obudowy (patrz rysunek uzupełniający 1) z 96-dołkową płytką jako podstawą.</li>
		<li>Unieruchomić mysz i delikatnie uciskać pęcherz, aby usunąć pozostały mocz na płytkę.</li>
		<li>Odpipetować zebrany mocz (~100-200 μL) z płytki 96-dołkowej do probówki o pojemności 1,5 ml po założeniu myszy na normalną obudowę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ustal przedkliniczny model guza mysiego.
	<ol>
		<li>Zaszczepić 6 do 8-tygodniowych samic myszy BALB/c przez wstrzyknięcie dożylne linią komórkową MC26-Fluc wykazującą ekspresję lucyferazy (100 tys. komórek/mysz) (patrz Tabela Materiałów). Monitoruj progresję guza co tydzień za pomocą systemu obrazowania fluorescencyjnego in vivo. 
		UWAGA: Widoczne obciążenie guzem wskazane sygnałem luminescencyjnym występuje około 2 tygodnia po wstrzyknięciu tej konkretnej linii komórkowej. Dokładnie sprawdzaj zwierzęta z nowotworem podczas progresji guza w regularnych odstępach czasu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wstrzyknij nanoczujniki w różnych punktach czasowych po implantacji guza.
	<ol>
		<li>Przygotować roztwór do wstrzykiwań (maksymalna objętość 200 μl) zawierający nanoczujniki o stężeniu 1 nmol za pomocą kodu kreskowego DNA w sterylnym PBS.</li>
		<li>Wstrzyknąć dożylnie 200 μl roztworu czujnika w PBS każdej eksperymentalnej myszy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pobrać próbki moczu od zdrowych myszy kontrolnych i z nowotworem po 1 godzinie od wstrzyknięcia czujnika, jak opisano w krokach 1.1-1.3. 
	UWAGA: Świeże próbki moczu można bezpośrednio przetworzyć do analizy kodów kreskowych DNA lub natychmiast zamrozić na lodzie.</li>
</ol>
4. Wykrywanie kodów kreskowych DNA metodą CRISPR: oparte na fluorescencji
<ol>
	<li>Używaj świeżych próbek moczu lub rozmrażaj zamrożone próbki na lodzie. Odwirować próbki moczu o masie 800 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Połączyć odczynniki z Tabeli Dodatkowej 2, na końcu dodać enzym Cas12a (patrz Tabela Materiałów) i delikatnie wymieszać reakcję, pipetując w górę i w dół. Inkubować reakcję w temperaturze 37 °C przez 30 minut.</li>
	<li>Przeprowadzić reakcję reporterową, jak pokazano w tabeli uzupełniającej 3, w trzech egzemplarzach, używając iloczynu z kroku 2. Dodaj reakcję z kroku 2 na końcu i szybko przynieś do czytnika płytek.</li>
	<li>Wykryć aktywację LbaCas12a, mierząc fluorescencję za pomocą czytnika płytek w temperaturze 37 °C co 2 minuty przez 3 godziny (λ np. 485 nm i λem: 535 nm) w celu monitorowania kinetyki rozszczepienia reportera DNA.</li>
	<li>Aby przeanalizować dane pomiarowe fluorescencyjne, wykorzystaj pakiet Python do analizy kinetyki enzymów dostępny pod adresem https://github.com/nharzallah/NNanotech-Kinetic. Ten skrypt oblicza początkową prędkość reakcji (V0) przy użyciu nachylenia dopasowania liniowego pierwszych 8-10 początkowych punktów czasowych.</li>
</ol>
5. Wykrywanie kodów kreskowych DNA metodą CRISPR: papierowe
<ol>
	<li>Odwirować próbki moczu o masie 800 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. 
	UWAGA: Uruchom próbki moczu w celu równoległego wykrywania CRISPR na bazie fluorescencji i na papierze.</li>
	<li>Połączyć odczynniki z tabeli uzupełniającej 2. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 min. 
	UWAGA: Ten etap inkubacji jest identyczny z tym w przypadku wykrywania CRISPR opartego na fluorescencji.</li>
	<li>Przeprowadź reakcję reporterową za pomocą reportera DNA znakowanego biotyną FAM do testu przepływu bocznego na pasku papieru (patrz Tabela materiałów). Połączyć odczynniki z Tabeli Uzupełniającej 4 na płytce 96-dołkowej, używając produktu opisanego w kroku 2. Przykryć folią aluminiową i inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 h. 
	UWAGA: Wybierz optymalny czas inkubacji zgodnie z monitorowaniem kinetyki w czasie rzeczywistym w opisanym powyżej teście wykrywania CRISPR opartym na fluorescencji.</li>
	<li>Do świeżego dołka na 96-dołkowej płytce dodać 80 μl PBS. Dodać 20 μl próbki z kroku 3 do tego dołka.</li>
	<li>Umieść jeden boczny pasek papieru w każdym dołku i poczekaj, aż płyn dotrze do górnej części paska (<5 min). Zwrócić uwagę na wygląd kontrolki i/lub pasma (pasm) próbki na pasku papieru.</li>
	<li>Zrób zdjęcie bocznego pasa przepływu i określ ilościowo intensywność pasma za pomocą ImageJ.</li>
</ol>

CRISPR-Cas Synthetic Urine Biomarker Test for Cancer Diagnostics

<ol><li>Soleimany, A. P., Bhatia, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-based+diagnostics%3A+an+emerging+paradigm+for+disease+detection+and+monitoring%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Activity-based diagnostics: an emerging paradigm for disease detection and monitoring.</a> Trends Mol Med. 26 (5), 450-468 (2020).</li>
<li>Muir, R. K., Guerra, M., Bogyo, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-based+diagnostics%3A+recent+advances+in+the+development+of+probes+for+use+with+diverse+detection+modalities%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Activity-based diagnostics: recent advances in the development of probes for use with diverse detection modalities.</a> ACS Chem Biol. 17 (2), 281-291 (2022).</li>
<li>Heitzer, E., Haque, I. S., Roberts, C. E. S., Speicher, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+and+future+perspectives+of+liquid+biopsies+in+genomics-driven+oncology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Current and future perspectives of liquid biopsies in genomics-driven oncology.</a> Nat Rev Genet. 20 (2), 71-88 (2019).</li>
<li>Dudani, J. S., Warren, A. D., Bhatia, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harnessing+protease+activity+to+improve+cancer+care%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Canc+Biol%22%5BJournal%5D)">Harnessing protease activity to improve cancer care.</a> Annu Rev Canc Biol. 2, 353-376 (2018).</li>
<li>Hanahan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hallmarks+of+cancer%3A+new+dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">Hallmarks of cancer: new dimensions.</a> Cancer Discov. 12 (1), 31-46 (2022).</li>
<li>Quail, D. F., Joyce, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microenvironmental+regulation+of+tumor+progression+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis.</a> Nat Med. 19 (11), 1423-1437 (2013).</li>
<li>Kwong, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+biomarkers%3A+a+twenty-first+century+path+to+early+cancer+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Synthetic biomarkers: a twenty-first century path to early cancer detection.</a> Nat Rev Cancer. 21 (10), 655-668 (2021).</li>
<li>Kirkpatrick, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urinary+detection+of+lung+cancer+in+mice+via+noninvasive+pulmonary+protease+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Urinary detection of lung cancer in mice via noninvasive pulmonary protease profiling.</a> Sci Transl Med. 12 (537), eaaw0262(2020).</li>
<li>Warren, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease+detection+by+ultrasensitive+quantification+of+microdosed+synthetic+urinary+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Disease detection by ultrasensitive quantification of microdosed synthetic urinary biomarkers.</a> J Am Chem Soc. 136 (39), 13709-13714 (2014).</li>
<li>Kwong, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass-encoded+synthetic+biomarkers+for+multiplexed+urinary+monitoring+of+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Mass-encoded synthetic biomarkers for multiplexed urinary monitoring of disease.</a> Nat Biotechnol. 31 (1), 63-70 (2013).</li>
<li>Chen, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas12a+target+binding+unleashes+indiscriminate+single-stranded+DNase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity.</a> Science. 360 (6387), 436-439 (2018).</li>
<li>Choi, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Renal+clearance+of+quantum+dots%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Renal clearance of quantum dots.</a> Nat Biotechnol. 25 (10), 1165-1170 (2007).</li>
<li>Hao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas-amplified+urinary+biomarkers+for+multiplexed+and+portable+cancer+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas-amplified urinary biomarkers for multiplexed and portable cancer diagnostics.</a> Nat Nanotechnol. 18 (7), 798-807 (2023).</li>
<li>Hao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microenvironment-triggered+multimodal+precision+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Mater%22%5BJournal%5D)">Microenvironment-triggered multimodal precision diagnostics.</a> Nat Mater. 20 (10), 1440-1448 (2021).</li>
<li>Ghanta, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5%27-Modifications+improve+potency+and+efficacy+of+DNA+donors+for+precision+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">5'-Modifications improve potency and efficacy of DNA donors for precision genome editing.</a> Elife. 10, e72216(2021).</li>
<li>Bekkevold, C. M., Robertson, K. L., Reinhard, M. K., Battles, A. H., Rowland, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dehydration+parameters+and+standards+for+laboratory+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Assoc+Lab+Anim+Sci%22%5BJournal%5D)">Dehydration parameters and standards for laboratory mice.</a> J Am Assoc Lab Anim Sci. 52 (3), 233-239 (2013).</li>
</ol>

S.N.B., L.H. i R.T.Z. są wymienieni jako wynalazcy w zgłoszeniu patentowym związanym z treścią tej pracy. S.N.B. posiada udziały w Glympse Bio, Satellite Bio, Lisata Therapeutics, Port Therapeutics, Intergalactic Therapeutics, Matrisome Bio i jest dyrektorem w Vertex; Doradza firmie Moderna i otrzymuje sponsorowane fundusze na badania od firm Johnson & Johnson, Revitope i Owlstone.

Prezentowana jest tutaj wysoce konfigurowalna platforma do multipleksowanego wykrywania raka z przenośnym testem moczu, który ocenia aktywność proteolityczną związaną z chorobą za pomocą minimalnie inwazyjnego wstrzykiwanego czujnika. Po aktywacji przez proteazy nowotworowe rozszczepienie substratu peptydowego jest amplifikowane poprzez uwalnianie kodu kreskowego DNA do moczu. Syntetyczne reportery DNA w próbce moczu można odczytać za pomocą wtórnej amplifikacji enzymatycznej za pośrednictwem CRISPR-Cas przy uży...

Pomimo znacznego wysiłku włożonego w zidentyfikowanie biomarkerów nowotworowych, takich jak białka i DNA, pole diagnostyki raka zostało nadwyrężone przez ich niską liczebność lub szybką degradację w krążeniu1. Jako strategia uzupełniająca, bioinżynieryjne biomarkery syntetyczne, które selektywnie reagują na cechy choroby w celu generowania wzmocnionych sygnałów, reprezentują nowe drogi w kierunku dokładnej i dostępnej diagnostyki2,3. Aby ułatwić wykrywanie, te syntetyczne biomarkery wykorzystują mechanizmy aktywacji zależne od nowotworu, takie jak amplifikacja enzymatyczna, w celu wytworzenia analitów o ulepszonym stosunku sygnału do szumu4. W tym przypadku klasa enzymów związanych z rakiem, proteazy, jest wykorzystywana do aktywacji wstrzykiwanych czujników w nanoskali, aby uwolnić reportery chorób wykrywalne w płynach biologicznych, takich jak krew lub mocz 5,6. W świetle niejednorodności guza, opracowanie panelu czujników aktywowanych proteazą pozwala na testy wieloanalitowe, które łączą różne zdarzenia rozszczepienia proteazy w "sygnaturę choroby" w celu oceny częstości występowania i progresji raka w bardziej szczegółowy, multipleksowany sposób.
Opracowano syntetyczne biomarkery aktywowane proteazą, które składają się z substratów peptydowych sprzężonych z powierzchnią obojętnego nośnika7. Po wstrzyknięciu in vivo peptydy te są przenoszone do guza, po czym enzymatyczne rozszczepienie przez proteazy nowotworowe uwalnia reportery do krwi lub moczu w celu wykrycia. Detekcja multipleksowa z syntetycznymi biomarkerami aktywowanymi proteazą wymaga, aby każdy syntetyczny biomarker w koktajlu był oznaczony unikalnym molekularnym kodem kreskowym. W tym celu opracowano różne podejścia, w tym masowe kody kreskowe i reportery kodowane ligandem8,9,10. W przeciwieństwie do tych metod multipleksowania, które mogą być ograniczone do kilku różnych możliwości sygnału, kodowanie kreskowe DNA zapewnia znacznie więcej kombinacji, zgodnie z wysoką złożonością i niejednorodnością stanów chorobowych człowieka. Aby rozszerzyć multipleksowalność syntetycznych biomarkerów, czujniki są oznaczane kodami kreskowymi poprzez oznaczanie każdego reportera unikalną sekwencją DNA do wykrywania za pomocą nukleazy CRISPR-Cas w celu wzmocnienia sygnału biofluidycznego ex vivo. Te kody kreskowe jednoniciowego DNA (ssDNA) są zaprojektowane tak, aby wiązały się z komplementarnymi przewodnikiem RNA CRISPR (crRNA), aktywując aktywną przez cel aktywność nukleazy pobocznej CRISPR-Cas12a11. Ta aktywność nukleazy może być wykorzystana do rozszczepienia reporterowej nici DNA wykrytej za pomocą kinetyki fluorescencji lub za pomocą pasków papieru.
Oprócz molekularnej amplifikacji za pomocą proteaz (in vivo) i CRISPR-Cas (ex vivo), kolejną kluczową cechą syntetycznych biomarkerów aktywowanych proteazą jest wykorzystanie farmakokinetyki nanomateriałów do zwiększenia stężenia sygnału diagnostycznego w biopłynach10. Jednym z podejść jest zastosowanie nośnika nanocząstek w celu wydłużenia czasu krążenia sprzężonych powierzchniowo substratów peptydowych. Dendrymer glikolu polietylenowego (PEG) jest wybierany jako nanonośnik o stosunkowo małej średnicy hydrodynamicznej i wielowartościowości w celu zwiększenia dostarczania do nowotworów. Chociaż jest wystarczająco mały, aby sprzyjać dostarczaniu guza, rozmiar nośnika PEG jest większy niż odcięcie o rozmiarze ~5 nm bariery filtracyjnej kłębuszków nerkowych, dzięki czemu tylko rozszczepione substraty peptydowe mogą zostać usunięte do moczu, wykorzystując filtrację wielkości przez nerki12. W tym protokole przedstawiono wieloetapowy przepływ pracy dotyczący syntezy i zastosowania nanoczujników opartych na aktywności opartych na kodach kreskowych DNA w przedklinicznym modelu mysim, podkreślając konfigurację wieloanalitowego testu syntetycznych biomarkerów moczu za pośrednictwem CRISPR-Cas, który został zastosowany przez tę grupę do klasyfikacji statusu choroby w mysich modelach wielu typów raka13. Dzięki wszechstronnej zasadzie konstrukcyjnej, wszystkie trzy funkcjonalne komponenty nanoczujnika - nanonośnik (polimer PEG), moduł reagujący na bodźce (substrat aktywowany proteazą) i reporter biofluidyczny (kod kreskowy DNA) - mogą być precyzyjnie wymieniane zgodnie z potrzebami specyficznymi dla aplikacji, co pozwala na modułowość poprzez dostosowanie specyfiki docelowej i uwalniania.

<table><tbody><tr><td>10x NEB Buffer 2.1</td><td>New England Biolabs</td><td>B6002SVIAL</td><td></td></tr><tr><td>20-merowe reportery fosforopianowanego DNA z grupą 3'-</td><td>DBCO IDT</td><td></td><td>Niestandardowy</td></tr><tr><td>system wysokosprawnej chromatografii cieczowej DNA Agilent 1100 z kolumną Vydac 214TP510 C4</td><td>&nbsp; Agilent</td><td></td><td>HPLC</td></tr><tr><td>&Auml; Szybka chromatografia cieczowa białek KTA (FPLC)</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td>Probówki</td></tr><tr><td>ultrawirówkowe FPLC Amicon (MWCO = 10 kDa)</td><td>EMD milipory</td><td></td><td>Dostępne różne objętości</td></tr><tr><td>PAP zakończone azydem z C-końcem cysteiny</td><td>CPC Scientific</td><td></td><td>Custom peptydy</td></tr><tr><td>crRNAs&nbsp;</td><td>IDT</td><td></td><td>Patrz Tabela uzupełniająca 1</td></tr><tr><td>Kriogeniczna transmisyjna mikroskopia elektronowa</td><td>JEM-2100F</td><td>JEOL</td><td>cyroTEM</td></tr><tr><td>Koniugaty DNA-peptyd zakończone cysteiną</td><td>CPC Scientific</td><td></td><td>Niestandardowy peptyd</td></tr><tr><td>Dynamiczne rozpraszanie światła (DLS)</td><td></td><td></td><td>DLS</td></tr><tr><td>EnGen LbaCas12a (Cpf1), 100 &micro; M</td><td>New England Biolabs</td><td>M0653T</td><td></td></tr><tr><td>Zwierzęta doświadczalne</td><td>Taconic Biosciences</td><td>BALB/cAnNTac</td><td>6&ndash; 8 i cienkie; tygodni</td></tr><tr><td>wieku probówki gentleMACS C</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-237</td><td>homogenizacja tkanek</td></tr><tr><td>HybriDetect Uniwersalny zestaw do oznaczania przepływu bocznego</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>MGHD 1</td><td></td></tr><tr><td>Desorpcja/jonizacja laserowa wspomagana matrycą&ndash; czas lotu (MALDI&ndash; TOF) spektrometria mas&nbsp;</td><td>Bruker</td><td></td><td>Microflex MALDI&ndash; Linia</td></tr><tr><td></td><td></td><td>komórkowa TOF MC26-Fluc</td><td>Kenneth K. Tanabe Laboratory, Massachusetts General Hospital</td></tr><tr><td>wielowartościowy PEG (40 kDA, 8-ramienny) z grupą maleimidowo-reaktywną</td><td>JenKem</td><td>A10020-1 / 8ARM(TP)-MAL-40K,1 g</td><td></td></tr><tr><td>Python, wersja 3.9</td><td></td><td></td><td>https://www.python.org/</td></tr> <tr><td>Quant-iT Zestaw do oznaczania ssDNA OliGreen i odczynnik Quant-iT OliGreen ssDNA</td><td>Invitrogen</td><td>O11492</td><td>Zestaw do oznaczania ssDNA</td></tr><tr><td>ssDNA FAM-T10-Quencher i&nbsp; Podłoża reporterskie FAM-T10-Biotyna</td><td>IDT</td><td></td><td>Custom DNA</td></tr><tr><td>Superdex 200 Increase 10/300 GL</td><td>kolumna GE Healthcare</td><td>GE28-9909-44</td><td>Do</td></tr><tr><td>czytnika płytek FPLC Tecan Infinite Pro M200</td><td>Tecan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ThermoFisher Pierce BCA Zestaw do oznaczania białek</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr></tbody></table>

multianalitowy test syntetycznego biomarkera moczu za pośrednictwem crispr-cas do przenośnej diagnostyki

CRISPR-Cas-mediated Multianalyte Synthetic Urine Biomarker Test for Portable Diagnostics

Stworzenie syntetycznych biomarkerów do rozwoju precyzyjnej diagnostyki umożliwiło wykrywanie chorób za pomocą ścieżek wykraczających poza te używane do tradycyjnych pomiarów płynów biologicznych. Biomarkery syntetyczne na ogół wykorzystują reportery, które dostarczają czytelnych sygnałów w płynie biologicznym, aby odzwierciedlić zmiany biochemiczne w lokalnym mikrośrodowisku choroby podczas występowania i progresji choroby. Stężenie farmakokinetyczne reporterów i biochemiczne wzmocnienie sygnału chorobowego mają zasadnicze znaczenie dla osiągnięcia wysokiej czułości i swoistości w teście diagnostycznym. W tym przypadku platforma diagnostyczna raka jest budowana przy użyciu jednego formatu syntetycznych biomarkerów: nanoczujników opartych na aktywności przenoszących chemicznie stabilizowane reportery DNA, które mogą być uwalniane przez nieprawidłowe sygnatury proteolityczne w mikrośrodowisku guza. Syntetyczne DNA jako narzędzie do zgłaszania chorób daje możliwość multipleksowania dzięki zastosowaniu go jako kodu kreskowego, co pozwala na odczyt wielu sygnatur proteolitycznych jednocześnie. Reportery DNA uwalniane do moczu są wykrywane za pomocą nukleaz CRISPR poprzez hybrydyzację z RNA CRISPR, które z kolei wytwarzają sygnał fluorescencyjny lub kolorymetryczny po aktywacji enzymu. W tym protokole konstruowane są nanoczujniki oparte na kodach kreskowych DNA, a ich zastosowanie jest zilustrowane w przedklinicznym mysim modelu raka jelita grubego z przerzutami. System ten jest wysoce modyfikowalny zgodnie z biologią choroby i generuje wiele sygnałów chorobowych jednocześnie, zapewniając kompleksowe zrozumienie charakterystyki choroby dzięki minimalnie inwazyjnemu procesowi wymagającemu jedynie podania nanosensora, pobrania moczu i testu papierowego, który umożliwia diagnostykę w miejscu opieki nad pacjentem.

Wybór peptydowych substratów aktywowanych przez proteazy 
Aby zaprojektować sensory odzwierciedlające zmiany w aktywności proteolitycznej tkanki, w pierwszej kolejności charakteryzuje się aktywność proteaz w tkance przy użyciu biblioteki sond peptydowych13 (Rysunek 1). Świeże i mrożone próbki tkanek mogą dostarczyć istotnych informacji o aktywności proteolitycznej mikrośrodowiska guza poprzez połączenie próbek tkanek z sondami FRET zaprojektowanymi...

Ten protokół opisuje wieloanalitowy test syntetycznego biomarkera moczu za pośrednictwem CRISPR-Cas, który umożliwia diagnostykę raka w miejscu opieki nad pacjentem poprzez analizę ex vivo aktywności proteazy związanej z nowotworem.

Multianalitowy test syntetycznego biomarkera moczu za pośrednictwem CRISPR-Cas do przenośnej diagnostyki

Creating synthetic biomarkers for the development of precision diagnostics has enabled detection of disease through pathways beyond those used for ...

Heart Lab opracowuje narzędzia molekularne i komórkowe do precyzyjnego śledzenia i kontrolowania biologii chorób. Wykorzystujemy specjalne informacje o chorych tkankach, aby pomóc w projektowaniu responsywnych narzędzi do wykrywania, obrazowania i leczenia zaburzeń heterogennych. Płyny biologiczne stanowią wygodną możliwość wykrywania i oceny chorób, ale często są one ograniczone przez małe ilości odpowiednich analitów.W związku z tym znaczna część tej dziedziny poszukuje strategii wzmacniania sygnałów związanych z chorobą w celu poprawy czułości testów diagnostycznych, takich jak BCR i plazma powierzchniowa w rezonansie. Zamiast polegać na endogennych biomarkerach chorób w krążeniu, nasze podejście wykorzystuje syntetyczne biomarkery do raportowania aktywności choroby po uwolnieniu z wstrzykniętych nanoczujników. Nasze syntetyczne biomarkery to chemicznie stabilizowane kody kreskowe DNA, które pozwalają na jednoczesne wykrywanie wielu sygnałów mikrośrodowiskowych choroby i identyfikację za pomocą odpowiedniego kodu kreskowego.

crispr-cas-mediated-multianalyte-synthetic-urine-biomarker-test-for

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Czujniki „e-DNA”, czyli bezodczynnikowe biosensory elektrochemiczne, które wykazują wysoką skuteczność nawet podczas bezpośredniej analizy krwi i innych złożonych matryc, zostały zaadaptowane do wykrywania szerokiego zakresu analitów w postaci kwasów nukleinowych, białek i małych cząsteczek. W niniejszej pracy przedstawiamy ogólną procedurę wytwarzania i stosowania takich czujników.

Wytwarzanie elektrochemicznych biosensorów DNA do bezodczynnikowej detekcji kwasów nukleinowych, białek i małych cząsteczek

Platforma mikroprzepływowego biosensoru została zaprojektowana i wykonana przy użyciu taniej technologii fotorezystu z suchą folią do szybkiej i czułej kwantyfikacji różnych analitów. Ten jednorazowy system pozwala na elektrochemiczny odczyt testów enzymatycznych immobilizowanych na chipie za pomocą techniki stop-flow.

Elektrochemiczna platforma biosensorów mikroprzepływowych oparta na suchym filmie fotorezystu: produkcja urządzenia, przygotowanie testu na chipie i obsługa systemu

Proteazy są ściśle regulowanymi enzymami zaangażowanymi w podstawowe procesy biologiczne, a rozregulowana aktywność proteazy napędza postęp złożonych chorób, takich jak rak. Celem tej metody jest stworzenie nanoczujników, które mierzą aktywność proteazy in vivo, wytwarzając sygnał rozszczepienia, który jest wykrywalny w moczu gospodarza i dyskryminuje chorobę.

Nanoczujniki do wykrywania aktywności proteazy in vivo w diagnostyce nieinwazyjnej

Tutaj opisujemy wysokoprzepustową metodę kompleksowego nadzoru nad narkotykami, która pozwala na lepszą rozdzielczość i wykrywanie dużych paneli nadużywanych narkotyków i ich metabolitów, z kontrolą jakości opartą na wielosegmentowej elektroforezie kapilarnej i spektrometrii mas.

Wysokowydajny i kompleksowy nadzór nad lekami za pomocą wielosegmentowej elektroforezy kapilarnej i spektrometrii mas

Analiza moczu za pomocą paska to szybka i niedroga metoda oceny własnego stanu zdrowia. Przedstawiamy metodę wykonywania dokładnej, taniej analizy moczu za pomocą paskowego wskaźnika ciśnieniowego, która usuwa podstawowe źródła błędów związane z tradycyjnymi protokołami zanurzania i wycierania i jest na tyle prosta, że może być wykonywana przez laików w domu.

Niedroga, kontrolowana objętość analiza moczu za pomocą paska do testów domowych

Dostęp do zdecentralizowanej, taniej i wydajnej diagnostyki, która może być wdrożona w społeczności do zdecentralizowanych testów, jest kluczowy dla walki z globalnymi kryzysami zdrowotnymi. W tym manuskrypcie opisano, jak zbudować papierową diagnostykę sekwencji wirusowego RNA, które można wykryć za pomocą przenośnego czytnika optycznego.

Badanie projektowe i wdrożeniowe w celu opracowania i walidacji pacjenta w papierowej diagnostyce przełącznika Toehold

W tej pracy opracowano szybką, czułą i przenośną metodę wykrywania Candidatus Liberibacter asiaticus, opartą na amplifikacji polimerazy rekombinazy w połączeniu z CRISPR-Cas12a.

Wykrywanie Candidatus Liberibacter asiaticus do stosowania w terenie za pomocą amplifikacji polimerazy rekombinazy w połączeniu z CRISPR-Cas12a

Prezentujemy protokół, który łączy amplifikację polimerazy rekombinazy z systemem CRISPR/Cas12a do wykrywania śladów wirusów DNA i tworzy przenośną mikroskopię smartfonów z klasyfikacją wspomaganą sztuczną inteligencją do wykrywania wirusów DNA w miejscu opieki nad pacjentem.

System detekcji wirusów DNA oparty na RPA-CRISPR/Cas12a-SPM i głębokim uczeniu

Tutaj prezentujemy krok po kroku przygotowanie premiksowanej, liofilizowanej amplifikacji izotermicznej opartej na rekombinazie i reakcji opartych na Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR), które mogą być wykorzystane do wykrywania biomarkerów kwasów nukleinowych patogenów chorób zakaźnych lub innych markerów genetycznych.

Diagnostyka oparta na CRISPR w miejscu opieki nad pacjentem z wstępnie zmieszanymi i liofilizowanymi odczynnikami

Tutaj opisujemy prostą i szybką procedurę wykrywania DNA z patogenów pszczół, takich jak Lotmaria passim i Nosema ceranae, przy użyciu lizy komórek gotowej do amplifikacji, amplifikacji polimerazy rekombinazy i testów CRISPR/Cas12a.

Wykrywanie DNA pasożytów trypanosomatydów i Nosema ceranae na miejscu poprzez alkaliczną lizę sprzężoną z systemem RPA/CRISPR/Cas12a

Poznaj wieloanalityczny test syntetycznych biomarkerów moczu oparty na CRISPR-Cas do przenośnej diagnostyki nowotworowej. Ta metoda wykrywa aktywność proteaz związanych z guzami z wysoką czułością.

Multianalitowy test syntetycznego biomarkera moczu za pośrednictwem CRISPR-Cas do przenośnej diagnostyki

Przeglądaj więcej filmów