Name: Wytwarzanie siatki powinowactwa do streptawidyny do przygotowania próbek z mikroskopii krioelektronowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-29T14:20:00.000+00:00
Duration: 4 min 51 s
Description: Poznaj protokół wytwarzania siatki powinowactwa do streptawidyny dla mikroskopii krioelektronowej. Ta metoda stabilizuje próbki biotynowane, redukuje denaturację białek i eliminuje problem preferowanej orientacji cząsteczek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

T.C. był wspierany przez grant szkoleniowy z zakresu biofizyki molekularnej Narodowego Instytutu Ogólnych Nauk Medycznych GM-08295 oraz stypendium badawcze dla absolwentów National Science Foundation w ramach grantu numer DGE 2146752. R.G. i B.H. byli wspierani przez grant National Institute of Health R21-GM135666 przyznany R.G. i B.H. Praca ta została częściowo sfinansowana z grantu National Institute of General Medical Sciences R35-GM127018 przyznanego E.N. E.N. jest badaczem Instytutu Medycznego Howarda Hughesa.

Fabrication of Streptavidin Affinity Grids for Cryo-EM Structural Studies

<ol><li>Glaeser, R. M., Nogales, E., Chiu, W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGlaeser%2C+RM+%22Single-particle+Cryo-EM+of+Biological+Macromolecules.+IOP+Publishing%22">Single-particle Cryo-EM of Biological Macromolecules. IOP Publishing</a>. , IOP Publishing. Bristol, UK. (2021).</li>
<li>Carragher, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+outcomes+when+optimizing+%27standard%27+sample+preparation+for+single-particle+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Current outcomes when optimizing 'standard' sample preparation for single-particle cryo-EM.</a> Journal of Microscopy. 276 (1), 39-45 (2019).</li>
<li>Drulyte, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Approaches+to+altering+particle+distributions+in+cryo-electron+microscopy+sample+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D-Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Approaches to altering particle distributions in cryo-electron microscopy sample preparation.</a> Acta Crystallographica Section D-Structural Biology. 74, 560-571 (2018).</li>
<li>Noble, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Routine+single+particle+cryoEM+sample+and+grid+characterization+by+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Routine single particle cryoEM sample and grid characterization by tomography.</a> eLife. 7, e34257(2018).</li>
<li>Patel, A., Toso, D., Litvak, A., Nogales, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+graphene+oxide+coating+improves+cryo-EM+sample+preparation+and+data+collection+from+tilted+grids%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Efficient graphene oxide coating improves cryo-EM sample preparation and data collection from tilted grids.</a> bioRxiv. , (2021).</li>
<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((General+and+robust+covalently+linked+graphene+oxide+affinity+grids+for+high-resolution+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">General and robust covalently linked graphene oxide affinity grids for high-resolution cryo-EM.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (39), 24269-24273 (2020).</li>
<li>Pantelic, R. S., Meyer, J. C., Kaiser, U., Baumeister, W., Plitzko, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Graphene+oxide%3A+A+substrate+for+optimizing+preparations+of+frozen-hydrated+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Graphene oxide: A substrate for optimizing preparations of frozen-hydrated samples.</a> Journal of Structural Biology. 170 (1), 152-156 (2010).</li>
<li>Williams, R. C., Glaeser, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrathin+carbon+support+films+for+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Ultrathin carbon support films for electron microscopy.</a> Science. 175 (4025), 1000-1001 (1972).</li>
<li>Han, B. -G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+shelf-life+streptavidin+support-films+suitable+for+electron+microscopy+of+biological+macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Long shelf-life streptavidin support-films suitable for electron microscopy of biological macromolecules.</a> Journal of Structural Biology. 195 (2), 238-244 (2016).</li>
<li>Han, B. -G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopy+of+biotinylated+protein+complexes+bound+to+streptavidin+monolayer+crystals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Electron microscopy of biotinylated protein complexes bound to streptavidin monolayer crystals.</a> Journal of Structural Biology. 180 (1), 249-253 (2012).</li>
<li>Domínguez-Martín, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures+of+a+phycobilisome+in+light-harvesting+and+photoprotected+states%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structures of a phycobilisome in light-harvesting and photoprotected states.</a> Nature. 609 (7928), 835-845 (2022).</li>
<li>Kasinath, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JARID2+and+AEBP2+regulate+PRC2+in+the+presence+of+H2AK119ub1+and+other+histone+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">JARID2 and AEBP2 regulate PRC2 in the presence of H2AK119ub1 and other histone modifications.</a> Science. 371 (6527), eabc3393(2021).</li>
<li>Lahiri, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3.1+structure+of+yeast+RNA+polymerase+II+elongation+complex+stalled+at+a+cyclobutane+pyrimidine+dimer+lesion+solved+using+streptavidin+affinity+grids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">3.1 structure of yeast RNA polymerase II elongation complex stalled at a cyclobutane pyrimidine dimer lesion solved using streptavidin affinity grids.</a> Journal of Structural Biology. 207 (3), 270-278 (2019).</li>
<li>Marr, C. R., Benlekbir, S., Rubinstein, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+carbon+films+with+%7E+500nm+holes+for+cryo-EM+with+a+direct+detector+device%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Fabrication of carbon films with ~ 500nm holes for cryo-EM with a direct detector device.</a> Journal of Structural Biology. 185 (1), 42-47 (2014).</li>
<li>Levine, M. J., Schwarz, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+guidelines+for+producing+molecular+assemblies+by+Langmuir-Blodgett+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chemical+Education%22%5BJournal%5D)">Experimental guidelines for producing molecular assemblies by Langmuir-Blodgett techniques.</a> Journal of Chemical Education. 65 (7), 638(1988).</li>
<li>Zheng, S. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MotionCor2%3A+anisotropic+correction+of+beam-induced+motion+for+improved+cryo-electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy.</a> Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).</li>
</ol>

Nasz protokół opisuje, jak tworzyć i wykorzystywać siatki powinowactwa streptawidyny oraz jak przetwarzać dane zawierające sygnał dyfrakcyjny streptawidyny. W protokole znajduje się kilka krytycznych kroków, które wymagają szczególnej uwagi.
Nieudane partie siatki można przypisać kilku typowym błędom. Najczęstszym źródłem błędów jest stosowanie przestarzałych lub złej jakości odczynników. Szczególnie ważne jest przygotowanie biotynylowanego roztworu lipidowego dokładnie tak, jak opisano w protokole. Ponadto wszelkie zanieczyszczenia, takie jak pozostałości detergentów na sprzęcie laboratoryjnym lub naturalnie obecne oleje na skórze, mogą wpływać na jakość kryształów streptawidyny, a tym samym na jakość uzyskanych obrazów. Dlatego zaleca się wykonanie trzech cykli mycia kratek przed pierwszym odparowaniem węgla w celu usunięcia ewentualnych zanieczyszczeń środkami powierzchniowo czynnymi od producenta kratki (krok 2.1). Ponadto zaobserwowano, że zanieczyszczenie lub zanieczyszczenie oleju rycynowego utrudnia tworzenie się kryształów na siatce.
Tworzenie i zbieranie monowarstwy lipidowej to zadanie, które należy przećwiczyć kilka razy, aby wyczuć małe objętości lipidów. Nie jest niczym niezwykłym, że ten etap kończy się niepowodzeniem przez pierwsze dwa lub trzy razy, zanim będzie można wytworzyć odpowiednią monowarstwę lipidową, co ostatecznie znajduje odzwierciedlenie w jakości kryształów streptawidyny, które są widoczne w ujemnie barwionych siatkach (Figura 4C).
Ważne jest, aby nigdy nie dopuścić do zamoczenia tylnej strony (złota, strona lipidowa) siatki podczas procesu produkcji siatki (kroki 3.12-3.20). W przypadku, gdy tył ulegnie zamoczeniu, zaleca się wyrzucenie siatki. Może to spowodować pojawienie się dużych pęcherzyków lipidowych, które zaburzają jakość obrazu (ryc. 5D) (wiersz 3, tabela 1). Pęcherzyki lipidowe można również zaobserwować z powodu niewystarczającego mycia po nałożeniu monowarstwy lipidowej (krok 3.13). Zaleca się trzy kolejne płukania buforem krystalizacyjnym po dotknięciu monowarstwy lipidowej przed dodaniem streptawidyny.
Po odparowaniu cienkiej warstwy węgla na siatki osadzone w trehalozie, tylna strona siatki może być mokra bez szkody dla jakości sieci. Na przykład zwilżanie tylnej strony jest często obserwowane, gdy bufor próbki zawiera nawet minimalne ilości detergentu. Zwilżanie tylnej strony przez próbkę może powodować niespecyficzne wiązanie próbek z cienką warstwą węglową na odwrocie, co zmniejsza skuteczność zapobiegania dyfuzji cząstek do granicy faz powietrze-woda lub stosowanie wiązania powinowactwa do strategii oczyszczania w sieci. Jeśli to możliwe, dodać próbkę do siatki przy braku detergentu. Detergent i inne dodatki mogą być następnie dodawane podczas etapów mycia kratki lub dodawane w ostatnim etapie przed witryfikacją. Jest to jedno z ograniczeń w stosowaniu siatek powinowactwa do streptawidyny; Jeśli jednak celem jest poprawa orientacji preferencyjnej, przygotowanie próbki za pomocą, w tym detergentu, zostało przeprowadzone z powodzeniem11.
Częstym źródłem błędu może być wiek sieci w odniesieniu do obu etapów parowania węgla (etap 2.3 i etap 3.21). W tym protokole zalecany okres oczekiwania wynosi 5-7 dni po odparowaniu węgla z tyłu przed użyciem siatek streptawidyny do krio-EM. Gdy siatki są używane zbyt wcześnie po wyprodukowaniu, zaobserwowano, że sieć i monowarstwa lipidowa mobilizują się z otworów siatki. Podobną obserwację można poczynić, gdy siatki są zbyt stare i są używane po sześciu miesiącach (rysunek 5A) (wiersz 1, tabela 1). Stawiamy hipotezę, że tę obserwację tłumaczy się zmianami hydrofobowości nośnika węglowego, który jest stosowany do stabilizacji monowarstwy lipidowej i kryształów streptawidyny. Dodatkowo, sieci streptawidyny mogą wydawać się mozaikowe (Rysunek 5B) (Wiersz 3, Tabela 1) i pęknięte zarówno w barwieniu ujemnym, jak i krio-EM, jeśli monowarstwa zostanie nałożona na siatki, w których pierwsza warstwa parowania węgla (krok 2.3) nie zestarzała się wystarczająco.
Dodatkowym częstym źródłem błędu może być kruchość monowarstwy krystalicznej streptawidyny (monowarstwa lipidowa sama w sobie jest płynna i może odwracalnie rozszerzać się lub ściskać). Odparowanie węgla z tyłu (krok 3.21) zapewnia krytyczną stabilność zarówno monowarstwy, jak i sieci streptawidyny podczas procesu adsorpcji, płukania i krio-EM. W przypadku braku wystarczającego parowania węgla do tylnej strony siatki, sieci streptawidyny często wydają się rozdrobnione po osuszeniu/zamrożeniu (Rysunek 5C) (Wiersz 2, Tabela 1). W tym protokole sugerujemy użycie jednostronnej automatycznej zamrażarki wgłębnej do jednostronnego bibuły. Metoda ta pozwala uzyskać wysoce powtarzalne warunki blottingu, które zachowują sieć streptawidyny podczas procesu zamrażania i pozwalają na usprawnioną optymalizację parametrów aplikacji próbki i blottingu. Alternatywnie, w połączeniu z ręcznym osuszaniem zastosowano inne zautomatyzowane urządzenia do zamrażania wgłębnego. Aby to zrobić, rzeczywista funkcja blottingu jest wyłączona w ustawieniach urządzenia, a zamiast tego siatka jest osuszana, sięgając pęsetą trzymającą bibułę przez boczne wejście. Ta metoda może osiągnąć wysokiej jakości wyniki dla laboratoriów bez jednostronnego urządzenia do blottingu i zamrażania wgłębnego; Jednak odtwarzalność między sieciami jest wyzwaniem.
Chociaż stosowanie siatek powinowactwa do streptawidyny ma wiele zalet, należy wziąć pod uwagę pewne ograniczenia tej metody. Ze względu na charakter zabiegu, zwykle nie jest możliwa ocena jakości sieci streptawidyny, dopóki cały proces nie zostanie zakończony. Sugeruje się szybkie sprawdzenie jakości każdej partii za pomocą negatywnego zabarwienia przed zamrożeniem próbek. Ze względu na sygnał dostarczany przez sieć streptawidyny do surowych obrazów, w niektórych przypadkach może być trudno ocenić, na podstawie samych obrazów, czy istnieje wystarczająca liczba nienaruszonych, rozproszonych cząstek. Z tego samego powodu przetwarzanie w locie danych krio-EM podczas akwizycji danych nie jest możliwe, chyba że procedura odejmowania sygnału streptawidyny została włączona do potoku wstępnego przetwarzania danych. Ponieważ sygnał streptawidyny jest zwykle odejmowany od obrazów z korekcją ruchu, a nie od samych klatek, polerowanie bayesowskie, zaimplementowane w popularnych pakietach oprogramowania, może się nie powieść przy użyciu opisanych procedur odejmowania. W związku z tym zaleca się wykonywanie korekcji ruchu w wielu łatach, aby zminimalizować ruch cząstek od początku przetwarzania danych16.
Pomimo tych ograniczeń, siatki powinowactwa do streptawidyny mają wiele zalet. Dwie główne zalety, jakie zapewniają siatki powinowactwa streptawidyny w porównaniu ze standardowymi kratkami krioelektromagnetycznymi z otwartymi otworami, to sposób ochrony próbek z granicy faz powietrze-woda i koncentracji próbek o niskiej obfitości (10-100 nM) na siatce. Inne warstwy nośne, takie jak węgiel i tlenek grafenu, mogą być również wykorzystywane jako strategie przezwyciężania tych wąskich gardeł związanych z przygotowaniem próbek. W jednym z przykładów siatki powinowactwa streptawidyny były jedynym rozwiązaniem pozwalającym uzyskać nienaruszoną rekonstrukcję interakcji białko-kwas nukleinowy, która była niezgodna z podejściami do sieciowania. 12
Kolejną ważną zaletą, jaką zapewniają siatki powinowactwa do streptawidyny, jest rozwiązanie dla próbek, które adsorbują się z innymi warstwami nośnymi, takimi jak węgiel lub tlenek grafenu, z preferowanymi orientacjami, które utrudniają uzyskanie rekonstrukcji 3D próbki będącej przedmiotem zainteresowania. Losowa biotynylacja próbek przy użyciu dostępnych na rynku zestawów pozwala na losowe przyłączenie próbki będącej przedmiotem zainteresowania do monowarstwy streptawidyny w celu uzyskania większej liczby potencjalnych widoków w celu pokonania tego wyzwania.
Ponadto siatki powinowactwa streptawidyny oferują zalety, które są unikalne dla siatek opartych na powinowactwie. Wysokie powinowactwo i swoistość interakcji streptawidyna-biotyna pozwala na sprzężenie siatek powinowactwa streptawidyny z innymi przepływami pracy, które obejmują biotynę w celu oczyszczenia kompleksów będących przedmiotem zainteresowania. W jednym z opublikowanych przykładów autorzy unieruchomili kompleks na siatkach powinowactwa do streptawidyny i inkubowali partnera wiążącego o nieznanej stechiometrii w dużym nadmiarze. Po zmyciu niezwiązanego białka otrzymano prawidłowo złożony superkompleks, który można było natychmiast przeanalizować za pomocą cryo-EM11. Jednym z możliwych przyszłych zastosowań może być połączenie znaczników białkowych wiążących streptawidynę, systemu Avi-tag lub metod znakowania zbliżeniowego z siatkami powinowactwa streptawidyny w celu ekstrakcji pojedynczych białek i/lub kompleksów białkowych bezpośrednio ze źródeł rekombinowanych lub endogennych bez standardowych skomplikowanych schematów oczyszczania.
Dostarczając ten protokół, laboratoria powinny być w stanie łatwo odtworzyć wytwarzanie siatek powinowactwa streptawidyny i ustalić je jako bardziej powszechnie używane narzędzie do analizy strukturalnej kompleksów białkowych za pomocą cryo-EM.

Kriomikroskopia elektronowa (cryo-EM) zrewolucjonizowała dziedzinę biologii strukturalnej, umożliwiając makromolekularne określanie struktury dużych, elastycznych i niejednorodnych próbek, które wcześniej były niedostępne dla krystalografii rentgenowskiej lub magnetycznego rezonansu jądrowego1. Metoda ta polega na błyskawicznym zamrażaniu makrocząsteczek w roztworze w celu wytworzenia cienkiej warstwy szklistego lodu, którą można następnie zobrazować za pomocą mikroskopu elektronowego. W ostatnich latach znaczące postępy zarówno w sprzęcie mikroskopowym, jak i oprogramowaniu do przetwarzania obrazu jeszcze bardziej rozszerzyły rodzaje próbek odpowiednich do określania struktury w wysokiej rozdzielczości za pomocą cryo-EM.
Niemniej jednak, przygotowanie cienkich, zeszklonych próbek pozostaje jednym z najbardziej krytycznych etapów w określaniu struktury makromolekularnej za pomocą cryo-EM. Próbki biologiczne są często dynamiczne, kruche, podatne na denaturację, a czasami są dostępne tylko w niewielkich ilościach do badań krioelektromagnetycznych. Podczas procesu blottingu cząstki te oddziałują z hydrofobowym interfejsem powietrze-woda, co może skutkować preferowanymi przez cząstki orientacjami, demontażem delikatnych kompleksów, częściową lub całkowitą denaturacją próbki i agregacją2,3,4. Stosowanie detergentów lub innych środków powierzchniowo czynnych, sieciowanie chemiczne i adsorpcja próbek do warstw nośnych są powszechnymi strategiami konserwacji próbek biologicznych podczas procesu zamrażania. Warstwy nośne, takie jak tlenek grafenu5,6,7 lub węgiel amorficzny8 również działają w celu koncentracji cząstek na siatce poprzez adsorpcję, gdy próbka jest dostępna w ograniczonych ilościach. Metody te nie są jednak ani ogólne, ani niezawodne, a optymalizacja przygotowania sieci może być niezwykle czasochłonna lub całkowicie się nie powiedzieć.
siatki powinowactwa streptawidyny9,10 zostały opracowane w celu przezwyciężenia tych niedociągnięć i zapewnienia łagodnej i ogólnie stosowanej metody sekwestracji kompleksu zainteresowania i ochrony go przed interfejsem powietrze-woda. Siatki te wykorzystują dwuwymiarową (2D) sieć krystaliczną streptawidyny wyhodowaną na monowarstwie biotynylowanych lipidów na siatce. Po tym, jak same próbki zostaną poddane biotynylacji (często rzadko i losowo, co oznacza średnio jedną biotynę na kompleks), można je nałożyć na siatkę pokrytą streptawidyną. Ponieważ adsorpcja próbki opiera się na niezwykle wysokim powinowactwie między streptawidyną a biotyną, z tymi siatkami można stosować stężenia próbek tak niskie, jak 10 nM. Dostępne na rynku zestawy do biotynylacji białek i biotynylowane startery do kompleksów zawierających DNA sprawiają, że stosunkowo łatwo jest dołączyć niezbędne ugrupowania biotyny do większości interesujących nas próbek. Oprócz zagęszczenia próbki i trzymania jej z dala od szkodliwego interfejsu powietrze-woda podczas blottingu, losowa biotynylacja jednej lub tylko kilku reszt lizyny może znacznie poprawić zakres orientacji cząsteczki będącej przedmiotem zainteresowania na siatce krio-EM, jak wykazano w wielu badaniach11. Podczas gdy sygnał z leżącego pod spodem kryształu streptawidyny jest obecny na surowych obrazach, schematy przetwarzania danych obejmujące filtrację Fouriera ostrych odbić Bragga od kryształu można łatwo usunąć podczas wczesnego przetwarzania danych, co ostatecznie umożliwia rekonstrukcję próbki o wysokiej rozdzielczości11,12,13. W tym przypadku zapewniony jest zoptymalizowany protokół krok po kroku do solidnej produkcji siatek powinowactwa streptawidyny i późniejszego wykorzystania w eksperymentach krio-EM. Oczekuje się, że dostarczony protokół zostanie ukończony w ciągu 2 tygodni (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A). Pierwsze części protokołu opisują przygotowanie odczynników, wstępną obróbkę siatek i pierwsze etapy odparowywania węgla. Następnie opisano instrukcje dotyczące przygotowania monowarstwy lipidowej i wzrostu kryształów streptawidyny na siatkach EM. Dodatkowo podano instrukcje dotyczące stosowania siatek powinowactwa do streptawidyny w eksperymentach z barwieniem ujemnym i krio-EM. Na koniec przedstawiono procedury usuwania sygnału streptawidyny z mikrofotografii po uzyskaniu danych kriogenicznych.

<table><tbody><tr><td>Sól sodowa 1,2-dipalmitoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloamino-N-(biotynylo)&nbsp;</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>870285P</td><td>Występuje w postaci proszku. Rozpuścić w stężeniu 1&ndash; 10 mg/ml&nbsp; w rozpuszczalniku chloroform/metanol/woda, 65:35:8 v/v i przechowywać w podwielokrotnościach jednorazowego użytku w temperaturze -80 °; C</td></tr><tr><td>200 proof czysty etanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-678-005</td><td></td></tr><tr><td>5 &mu; L Strzykawka Hamiltona&nbsp;</td><td>Hamilton</td><td>87930</td><td>5 & mikro; L Strzykawka mikrolitrowa Model 75 RN, mała wyjmowana igła, 26 G, 2 cale, styl punktowy 2</td></tr><tr><td>Olej rycynowy</td><td>Sigma Adrich</td><td>259853</td><td></td></tr><tr><td>Naczynia do hodowli komórkowych nieobrobione (35 mm)</td><td>Bio Basic</td><td>SP22146</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>650471</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-trehaloza dwuwodny, ze skrobi, &ge; 99%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9449</td><td></td></tr><tr><td>DUMONT Pęseta antykapilarna odwrócona (samozamykająca) Biologia Grade</td><td>Ted Pella</td><td>510-5NM</td><td></td></tr><tr><td>HPLC Grade Metanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A452-4</td><td></td></tr><tr><td>Leica EM ACE600 Wysokopróżniowa powlekarka do napylania</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica EM GP2 Automatyczna zamrażarka wgłębna</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Quantifoil R 2/1 Au300&nbsp;</td><td>Quantifoil</td><td>Q84994</td><td></td></tr><tr><td>Steptavidin</td><td>New England Bioscience</td><td>N7021S</td><td>Występuje w postaci roztworu 1 mg/ml. Rozcieńczyć do końcowego stężenia 0,5 mg / ml w buforze krystalizacyjnym o końcowym stężeniu trehalozy 10%. Może być zamrożony w 25&ndash; 50 &mu; Porcje L</td></tr><tr><td>Talk w proszku&nbsp;</td><td>Carolina</td><td>896060</td><td></td></tr><tr><td>Bibuła filtracyjna Whatman Grade 1</td><td>Cytiva</td><td>1001-085</td><td></td></tr></tbody></table>

wytwarzanie siatki powinowactwa do streptawidyny do przygotowania próbek z mikroskopii krioelektronowej

Streptavidin-Affinity Grid Fabrication for Cryo-Electron Microscopy Sample Preparation

Siatki powinowactwa streptawidyny dostarczają strategii do pokonania wielu powszechnie spotykanych wyzwań związanych z przygotowaniem próbek z mikroskopii krioelektronowej (cryo-EM), w tym denaturacji próbki i preferencyjnych orientacji, które mogą wystąpić ze względu na interfejs powietrze-woda. Siatki powinowactwa do streptawidyny są jednak obecnie wykorzystywane przez kilka laboratoriów krio-EM, ponieważ nie są dostępne na rynku i wymagają starannego procesu wytwarzania. Dwuwymiarowe kryształy streptawidyny są hodowane na biotynylowanej monowarstwie lipidowej, która jest nakładana bezpośrednio na standardowe dziurowęglowe siatki krio-EM. Interakcja o wysokim powinowactwie między streptawidyną a biotyną pozwala na późniejsze wiązanie biotynylowanych próbek, które są chronione przed granicą faz powietrze-woda podczas przygotowywania próbek krio-EM. Ponadto siatki te zapewniają strategię koncentracji próbek dostępnych w ograniczonych ilościach i oczyszczania interesujących kompleksów białkowych bezpośrednio na siatkach. W tym miejscu przedstawiono krok po kroku, zoptymalizowany protokół do solidnego wytwarzania siatek powinowactwa streptawidyny do stosowania w eksperymentach krio-EM i barwienia ujemnego. Dodatkowo dołączony jest przewodnik rozwiązywania problemów dla często doświadczanych wyzwań, aby korzystanie z siatek powinowactwa streptawidyny było bardziej dostępne dla większej społeczności krio-EM.

Po odparowaniu węgla w kroku 3.21 (zazwyczaj po jednym tygodniu), siatki powinowactwa do streptawidyny można wykorzystać do przygotowania próbek do cryo-EM lub barwienia negatywowego zgodnie z procedurami opisanymi w krokach 4 i 5. Na Rysunku 4A przedstawiono reprezentatywny mikrograf biotynilowanej próbki zamrożonej przy użyciu siatek powinowactwa do streptawidyny, wykonany za pomocą detektora K3 na Titan Krios przy powiększeniu 81 000X i rozmiarze piksela 1,05 Å. Pomyślne utworzenie sieci rozpoznaje się po ciągłym wzorze siatki pojawiającym się w tle obrazu. Można to łatwiej zaobserwować dzięki wzorowi dyfrakcyjnemu widocznemu w szybkiej transformacie Fouriera (FFT) przedstawionej na Rysunku 4A (po prawej). Po zebraniu danych, zgodnie z procedurą opisaną w kroku 6 niniejszego protokołu, sygnał pochodzący z sieci streptawidyny może zostać programowo zamaskowany w celu uzyskania mikrografu po odjęciu (Rysunek 4B), który można wykorzystać w kolejnych etapach przetwarzania danych. FFT na Rysunku 4B (po prawej) pokazuje, że wzór dyfrakcyjny zaobserwowany na Rysunku 4A (po prawej) został pomyślnie usunięty z oryginalnego obrazu.
Rycina 4C przedstawia przykładową mikrofotografię biotynilowanej próbki związanej z siatkami powinowactwa do streptawidyny i barwionej negatywnie za pomocą formatu uranylowego, wykonaną na mikroskopie Tecnai 12 przy powiększeniu 49 000x i rozmiarze piksela 1,6 Å. Siatki przygotowano zgodnie z procedurą opisaną w kroku 4 niniejszego protokołu, pozostawiając grubszą warstwę barwnika.
Występuje kilka typowych obserwacji w przypadku niepowodzenia procedury przygotowania siatek z streptawidyną, które zostały opisane szerzej w sekcji dyskusji i Tabela 1. Rycina 5 przedstawia kilka przykładów tych obserwacji. Rycina 5A przedstawia mikrografię negatywnie barwionej siatki powinowactwa do streptawidyny, pochodzącej z partii przygotowanej ponad sześć miesięcy wcześniej. Monowarstwa oddzieliła się od otworów w folii węglowej siatek Quantifoil i wykazuje wymiary zbliżone do średnicy otworów w siatce. Rysunek 5B przedstawia przykład kryształów streptawidyny o wysokiej mozaikowości, które ulegają łatwym zaburzeniom podczas procedur przygotowania próbek. Rycina 5C przedstawia reprezentatywną mikrofotografię z siatki powinowactwa do streptawidyny, na której warstwa węgla naniesiona metodą odparowania w kroku 3.21 jest zbyt cienka lub została pominięta. Sieć streptawidyny uległa fragmentacji podczas procesu przygotowania próbki do krio-EM. Rycina 5D przedstawia siatkę do powinowactwa streptawidynowego barwioną negatywnie, która jest zanieczyszczona pęcherzykami lipidowymi, co prawdopodobnie wynika z niewystarczających przemyć w kroku 3.13 lub zamoczenia złotej strony siatki podczas kroków 3.13-3.20. Należy odnieść się do sekcji dyskusji i Tabela 1 w celu opracowania strategii pozwalających przezwyciężyć te powszechne problemy.
<img alt="Biotynilacja monowarstwy lipidowej, schemat wzrostu kryształów streptawidyny, przygotowanie do cryo-EM." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66197/66197fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Schemat procedury wytwarzania siatek powinowactwa do streptawidyny. (A) Ogólny harmonogram procedury wytwarzania siatek powinowactwa do streptawidyny. Cała procedura może zostać ukończona w ciągu dwóch tygodni, wymagając dwóch etapów naparowania węgla oraz jednego tygodnia przerwy po każdym z nich, aby węgiel mógł odpowiednio „dojrzeć”. (B) Powiększony widok pola siatki powinowactwa do streptawidyny, przedstawiający warstwy tworzące siatkę po zakończeniu procesu wytwarzania, w tym standardową siatkę do cryo-EM ze złotymi pręcikami i dziurkową folią węglową, pierwszą naparowaną warstwę węgla, monowarstwę lipidową, 2D-kryształ streptawidyny oraz naparowaną z tyłu warstwę wspierającą z węgla. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/66197fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Proces krystalizacji monowarstwy lipidowej i streptawidyny; schematy eksperymentalnej konfiguracji krok po kroku." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66197/66197fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Krystalizacja monowarstwy lipidowej i streptawidyny (A) Zdjęcia demonstrujące sposób prawidłowego tworzenia monowarstwy lipidowej w małej płytce Petriego z wykorzystaniem talku do stworzenia bariery dla oleju rycynowego, co pozwala na utrzymanie stałego ciśnienia powierzchniowego podczas formowania monowarstwy lipidowej. (B) Zdjęcia demonstrujące sposób hodowli kryształów streptawidyny na siatkach do krio-EM. Najpierw stronę węglową siatek dotyka się do monowarstwy lipidowej, a następnie wykonuje trzy kolejne przemycia w buforze krystalizacyjnym. Dodaje się streptawidynę, a siatki inkubuje się w komorze wilgotnościowej przez 2 h. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/66197fig02large.jpg" target="_blank">Aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Kroki przetwarzania i parametry mikrografii w przestrzeni Fouriera; konfiguracja skryptu MATLAB i odejmowanie sieci." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66197/66197fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Przykładowe parametry dla pliku process_subtraction.cfg służące do odejmowania sieci streptawidyny z mikrografii (krok 6). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/66197fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Mikroskopia elektronowa, nieodjęty mikrograf vs. FFT; odejmowanie sieci i analiza z barwieniem negatywowym." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66197/66197fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Reprezentatywne wyniki pomyślnego wykonania siatek powinowactwa do streptawidyny. (A) Mikrograf Cryo-EM kompleksów biotynilowanego białka/nukleosomu przygotowanych z użyciem własnoręcznie wykonanych siatek powinowactwa do streptawidyny. Po prawej stronie pokazano FFT, które przedstawia wzór dyfrakcyjny kryształu streptawidyny. (B) Ten sam mikrograf co w panelu A po zastosowaniu procedury odejmowania sieci w celu usunięcia sygnału z 2D kryształu streptawidyny z oryginalnego obrazu. (C) Przykład mikrografu uzyskanego z barwienia negatywowego biotynilowanej próbki związanej z siatkami powinowactwa do streptawidyny. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/66197fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Obrazy z kriomikroskopii elektronowej struktur samoorganizujących się białek; dołączono szczegóły paska skali." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66197/66197fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Reprezentatywne wyniki nieudanej preparatyki siatek z powinowactwem do streptawidyny. (A) Mikrograf pokazujący mobilizację monowarstwy streptawidyny z otworów siatki w przypadku siatek starszych niż sześć miesięcy. (B) Mikrograf pokazujący sieci streptawidyny o wysokiej mozaikowości, które są łatwo uszkadzane podczas procedur przygotowania próbek zarówno do cryo-EM, jak i do barwienia negatywowego. (C) Mikrograf pokazujący fragmentację sieci streptawidyny podczas przygotowania próbki do cryo-EM, gdy warstwa naparowania węgla w kroku 3.21 jest zbyt cienka lub została pominięta. (D) Reprezentatywny mikrograf zanieczyszczony pęcherzykami lipidowymi, prawdopodobnie w wyniku niewystarczającego przemywania w kroku 3.13 lub zamoczenia złotej strony siatki podczas kroków 3.13-3.20. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/66197fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Tabela 1: Przewodnik rozwiązywania problemów w celu przezwyciężenia typowych trudności występujących podczas nieudanej produkcji siatek powinowactwa do streptawidyny. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/Table%201.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Plik uzupełniający z kodem 1: lsub.m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/lsub.zip" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Pomocniczy plik kodu 2: process_subtration.sh <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/process_subtraction.zip" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Dodatkowy plik kodu 3: process_subtraction.cfg <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/process_subtraction3.zip" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Dodatkowy plik z kodem 4: bg_drill_hole.m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/bg_drill_hole.zip" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Dodatkowy plik z kodem 5: bg_FastSubtract_standard.m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/bg_FastSubtract_standard.zip" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Plik uzupełniający z kodem 6: bg_Pick_Amp_masked_standard.m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/bg_Pick_Amp_masked_standard.zip" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Dodatkowy plik z kodem 7: bg_push_by_rot.m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/bg_push_by_rot.zip" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Plik uzupełniający z kodem 8: ReadMRC.m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/ReadMRC.zip" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Pomocniczy plik kodu 9: WriteMRC.m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/WriteMRC.zip" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Plik z dodatkowym kodem 10: WriteMRCHeader.m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/WriteMRCHeader.zip" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Protokół krok po kroku do wytwarzania siatek powinowactwa streptawidyny jest dostępny do wykorzystania w badaniach strukturalnych trudnych próbek makromolekularnych za pomocą mikroskopii krioelektronowej.

Wytwarzanie siatki powinowactwa do streptawidyny do przygotowania próbek z mikroskopii krioelektronowej

Streptavidin affinity grids provide strategies to overcome many commonly encountered cryo-electron microscopy (cryo-EM) sample preparation challenges, ...

W ostatnim czasie dokonano wielu postępów technologicznych w cryo-EM, w tym postęp w samym sprzęcie mikroskopowym, który poprawia ogólną jakość obrazów, a także rozwój oprogramowania używanego do przetwarzania obrazów krio-EM, które może zacząć radzić sobie z dużymi ilościami niejednorodności obecnych w wielu próbkach. Przygotowanie próbek pozostaje jednym z największych wąskich gardeł w krio-EM. Ilość próbki może być ograniczona, a białka mają tendencję do adsorpcji na hydrofobowym granicy faz powietrze-woda podczas witryfikacji.Może to prowadzić do denaturacji próbki, rozpadu większych kompleksów białkowych i preferowanych orientacji cząstek, które są obecne na obrazach krio-EM. Siatki te wykorzystują oddziaływanie o wysokim powinowactwie między streptawidyną a biotyną do wiązania biotynylowanych próbek i ochrony ich przed hydrofobowym interfejsem powietrze-woda. Możemy pracować z bardzo małymi ilościami próbek, a losowa biotynylacja próbek oferuje strategię przezwyciężenia problemów z orientacją preferencyjną, które można zaobserwować przy użyciu innych warstw nośnych.Na początek wyczyść obszar stołu 70% etanolem, a następnie kilkakrotnie przepłucz szklaną strzykawkę o pojemności pięciu mikrolitrów chloroformem. Umyj kratki odparowane węglem 100% etanolem tuż przed użyciem. Wysuszyć kratki na czystej bibule filtracyjnej.W międzyczasie umyj każdą pęsetę antykapilarną 100% chloroformem, a następnie 100% etanolem. Przygotuj trzy 50-mikrolitrowe krople buforu krystalizacyjnego po czystej stronie Parafilmu dla każdej siatki, która ma być przygotowana. Napełnij pokrywkę buforem krystalizacyjnym i przetrzyj powierzchnię 35-milimetrowej, niepowlekanej szalki Petriego papierem do soczewek.Rozsyp wystarczającą ilość talku klasy naukowej na obwodzie szalki Petriego. Zanurz końcówkę pipety o pojemności 200 mikrolitrów w oleju rycynowym, aby zebrać średniej wielkości kroplę. Przyłóż kroplę do powierzchni bufora na szalce Petriego.Przepłukać szklaną strzykawkę o pojemności pięciu mikrolitrów dwukrotnie rozpuszczonym lipidem przed pobraniem podwielokrotności. Następnie delikatnie przyłóż wiszącą 0,5-mikrolitrową kroplę lipidu do powierzchni oleju rycynowego, tworząc pośrodku monowarstwę lipidową. Przygotuj talerz z kilkoma sekwencyjnymi kroplami płynu.Podnieś siatkę za pomocą pęsety antykapilarnej tak, aby proste ramię pęsety i strona siatki odparowana przez węgiel były skierowane w stronę monowarstwy. Aby przenieść monowarstwę, przyłóż odparowaną przez węgiel stronę siatki do monowarstwy na jedną do dwóch sekund. Przyłóż kulistą pokrywę buforu kolejno do trzech 50-mikrolitrowych kropli buforu krystalizacyjnego umieszczonych na Parafilmie.Dodać cztery mikrolitry streptawidyny do pozostałej kulistej pokrywy buforu na siatce. Inkubować siatkę w temperaturze pokojowej przez dwie godziny w komorze wilgotnościowej. Przygotuj 300-mikrolitrową kroplę buforu do płukania po czystej stronie Parafilmu.Umieść siatkę na 300-mikrolitrowej kropli buforu do płukania, aby umyć niezwiązaną streptawidynę. Aby podnieść siatkę, wbij w kroplę załamane ramię suchej pęsety antykapilarnej. Osusz siatkę bibułą filtracyjną, połóż ją złotą stroną do dołu i susz przez 15 do 20 minut.Po wysuszeniu odwróć siatkę tak, aby złota strona była skierowana do góry. Umieść kratki w parowniku węglowym, aby dodać cienką warstwę węgla na złotą stronę siatki. Mikrofotografia biotynylowanej próbki zamrożonej za pomocą siatek powinowactwa do streptawidyny wykazała ciągły wzór siatki w tle.Wzór dyfrakcyjny w szybkiej transformacie Fouriera dodatkowo potwierdził udane formowanie się sieci. Po zebraniu danych kriogenicznych, sygnał dostarczony przez sieć streptawidyny może być obliczeniowo zamaskowany w celu uzyskania odjętego mikrografu. Wyniki szybkiej transformaty Fouriera wykazały, że wzór dyfrakcyjny streptawidyny został pomyślnie usunięty.

streptavidin-affinity-grid-fabrication-for-cryo-electron-microscopy

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Protokół opisuje wysokoprzepustowe podejście do wyznaczania struktur białek błonowych z wykorzystaniem krio-tomografii elektronowej oraz trójwymiarowego przetwarzania obrazów. Obejmuje on szczegóły przygotowania preparatów, gromadzenia danych, ich przetwarzania i interpretacji, a kończy się opracowaniem reprezentatywnego celu dla tej metody, jakim jest glikoproteina otoczki HIV-1. Procedury obliczeniowe zostały zaprojektowane w sposób umożliwiający badaczom i studentom pracę zdalną oraz wkład w...

Wyznaczanie struktur molekularnych glikoprotein otoczki HIV z wykorzystaniem krioelektronowej tomografii i zautomatyzowanego uśredniania subtomogramów

Przedstawiono instrument i metody do przygotowania objętości próbek o rozmiarach nanolitrów do transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Nie są wymagane żadne etapy papierowego blottingu, co pozwala uniknąć szkodliwych konsekwencji, jakie może to mieć dla białek, znacznie zmniejszając utratę próbki i umożliwiając analizę lizatu pojedynczej komórki do wizualnej proteomiki.

Zminiaturyzowane przygotowanie próbki do transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Tutaj przedstawiono protokół opisujący etapy przygotowania próbki i zbierania danych wymagane w kriogenicznej tomografii rentgenowskiej (SXT) do obrazowania ultrastruktury całych komórek kriokonserwowanych w rozdzielczości połowy tonu 25 nm.

Kartograficzny opis 3D komórki za pomocą kriomiękkiej tomografii rentgenowskiej

Protokół przedstawiony tutaj opisuje użycie Spotiton, nowatorskiego systemu robotycznego, do dostarczenia dwóch interesujących próbek na samozasłaniającą się, nanodrucianą siatkę, które mieszają się przez minimum 90 ms przed zeszkleniem w płynnym kriogenie.

Przygotowanie mikroskopowej siatki krioelektronowej do badań rozdzielczych w czasie przy użyciu nowatorskiego systemu robotycznego, Spotiton

Ten artykuł zawiera szczegółowy protokół przygotowania siatek próbek w temperaturach tak wysokich jak 70 °C, przed zamrożeniem zanurzeniowym do eksperymentów krio-EM.

Przygotowanie wysokotemperaturowych siatek na próbki do Cryo-EM

Tutaj prezentujemy proces frezowania wiązki jonów z korelacją 3D, który kieruje przygotowaniem próbek komórkowych do tomografii krioelektronowej. Pozycja 3D fluorescencyjnie znakowanych białek będących przedmiotem zainteresowania jest najpierw określana za pomocą mikroskopii kriofluorescencyjnej, a następnie kierowana do mielenia. Protokół jest odpowiedni dla komórek ssaków, drożdży i bakterii.

Przygotowanie próbki za pomocą korelacyjnego mielenia wiązki jonów w 3D do tomografii krioelektronowej o wysokiej rozdzielczości

Technika peel-blot to metoda przygotowania siatki cryo-EM, która pozwala na rozdzielanie wielowarstwowych i skoncentrowanych próbek biologicznych na pojedyncze warstwy w celu zmniejszenia grubości, zwiększenia koncentracji próbki i ułatwienia przetwarzania obrazu.

Technika peel-blot: metoda przygotowania próbek cryo-EM w celu oddzielenia pojedynczych warstw od wielowarstwowych lub skoncentrowanych próbek biologicznych

Ta metoda zapewnia dostępny i elastyczny protokół do przygotowania siatek mikroskopii elektronowej (EM) do kriotomografii komórkowej in situ oraz korelacyjnej mikroskopii świetlnej i elektronowej (CLEM).

Przygotowanie próbki do kriotomografii in situ komórek ssaków

Tutaj opisujemy protokół stosowania pojedynczej monowarstwy grafenu na siatkach mikroskopii elektronowej i jak przygotować je do użycia w określaniu struktury krioEM.

Wytwarzanie jednowarstwowych siatek pokrytych grafenem do mikroskopii krioelektronowej

Ten protokół przedstawia praktyczną metodę wykorzystującą Methanocaldococcus jannaschii (MjsHSP16.5) jako przykład rozwiązania problemu nierównomiernego rozkładu cząstek poprzez optymalizację przygotowania próbki, stanowiąc punkt odniesienia dla badaczy do efektywnego wyjaśniania struktur makromolekularnych za pomocą kriogenicznej mikroskopii elektronowej (cryo-EM).

Optymalizacja przygotowania próbek do kriogenicznej mikroskopii elektronowej

Poznaj protokół wytwarzania siatki powinowactwa do streptawidyny dla mikroskopii krioelektronowej. Ta metoda stabilizuje próbki biotynowane, redukuje denaturację białek i eliminuje problem preferowanej orientacji cząsteczek.

Wytwarzanie siatki powinowactwa do streptawidyny do przygotowania próbek z mikroskopii krioelektronowej

Przeglądaj więcej filmów