Name: Badanie leukocytów peroksydazo-dodatnich w nasieniu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-19T14:15:00.000+00:00
Duration: 4 min 36 s
Description: Poznaj protokół analizy leukocytów peroksydazo-dodatnich w nasieniu w andrologii. Metoda łączy pomiary manualne i automatyczne z systemem CASA, zwiększając szybkość i obniżając koszty badań płodności męskiej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy są wdzięczni Laboratorium Andrologii Centrum Medycyny Rozrodu, Trzeciemu Szpitalowi Stowarzyszonemu Uniwersytetu Sun Yat-sen, za udostępnienie zaplecza do tego badania. Przygotowanie tego artykułu nie było zaangażowane w żadne fundusze.

Badanie to zostało przeanalizowane i zatwierdzone przez Komisję Etyki Medycznej Trzeciego Szpitala Filiacyjnego Uniwersytetu Sun Yat-sen.
1. Przygotowanie roztworu roboczego
<ol>
	<li>Przygotuj następujące odczynniki niezbędne do sporządzenia roztworu roboczego: roztwór substratu orto-toluidyny, nasycony roztwór chlorku amonu (NH4Cl), roztwór soli dwusodowej kwasu etylenodiaminotetraoctowego (Na2EDTA) o stężeniu 148 mmol/L oraz 6% (v/v) roztwór nadtlenku wodoru. Umieść je na stole laboratoryjnym w temperaturze pokojowej (RT) wraz z niezbędnymi narzędziami, takimi jak pipety transferowe (1000 µL, 200 µL, 10 µL) i statywy na probówki. 
	UWAGA: Przed pracą z wyżej wymienionymi odczynnikami zapoznaj się z kartą charakterystyki (SDS).</li>
	<li>Przygotuj nieprzezroczystą brązową butelkę na odczynniki, aby przechowywać sporządzony roztwór roboczy i chronić go przed działaniem światła.</li>
	<li>Przenieś odczynniki do nieprzezroczystej brązowej butelki zgodnie z poniższymi proporcjami:
	<ol>
		<li>Użyj pipety transferowej 200 µL i ustaw skalę na 100 µL, obracając pokrętłem. Następnie przenieś 100 µL roztworu NH4Cl do nieprzezroczystej brązowej butelki.</li>
		<li>Wymień końcówkę pipety i za pomocą wspomnianej pipety 200 µL przenieś 100 µL roztworu Na2EDTA 148 mmol/L do nieprzezroczystej brązowej butelki. Następnie delikatnie wymieszaj poprzez pipetowanie, aby dokładnie zhomogenizować roztwór.</li>
		<li>Użyj pipety transferowej 1000 µL i ustaw skalę na 900 µL, obracając pokrętłem. Następnie przenieś 900 µL roztworu substratu orto-toluidyny do nieprzezroczystej brązowej butelki, delikatnie wymieszaj poprzez pipetowanie i dokładnie zhomogenizuj roztwór.</li>
		<li>Użyj pipety transferowej 10 µL i ustaw skalę na 5 µL, obracając pokrętłem. Następnie przenieś 5 µL 6% (v/v) roztworu nadtlenku wodoru do nieprzezroczystej brązowej butelki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Użyj pipety transferowej 1000 µL i ustaw skalę na 1000 µL, obracając pokrętłem. Wymień końcówkę pipety, delikatnie wymieszaj poprzez pipetowanie i dokładnie zhomogenizuj roztwór w nieprzezroczystej brązowej butelce.</li>
	<li>Gotowy do użycia roztwór roboczy przechowuj w nieprzezroczystej brązowej butelce w temperaturze RT, z dala od światła. Roztwór roboczy pozostaje aktywny przez 24 h.</li>
	<li>Każda próbka nasienia wymaga 900 µL roztworu roboczego. Upewnij się, że ilość roztworu roboczego przygotowywanego każdego dnia odpowiada liczbie próbek badanych w ciągu dnia.</li>
</ol>
2. Przygotowanie próbki nasienia
<ol>
	<li>Przed pobraniem próbki nasienia należy upewnić się, że pacjent zachował wstrzemięźliwość od ejakulacji przez okres od 2 do 7 dni, zgodnie z wymogami podręcznika laboratoryjnego Światowej Organizacji Zdrowia (WHO) dotyczącego badania i przetwarzania ludzkiego nasienia (5. wyd.)8. Preferowaną metodą pozyskiwania próbek nasienia jest masturbacja. Aby zwiększyć dokładność badania, należy poinstruować pacjenta, aby zebrał cały ejakulat.</li>
	<li>Włączyć statyw z termostatem i wstępnie podgrzać go do 37 °C, aby zapewnić prawidłowy przebieg późniejszego upłynnienia próbki nasienia.</li>
	<li>Po otrzymaniu próbki nasienia pacjenta należy starannie zapisać szczegółowe informacje, w tym kod identyfikacyjny, czas pobrania, czas wstrzemięźliwości oraz inne istotne dane, na zewnętrznej ściance pojemnika polimerowego.</li>
	<li>Umieścić pojemnik polimerowy z próbką nasienia na statywie z termostatem podgrzanym do 37 °C, co sprzyja upłynnieniu nasienia.</li>
	<li>Pobrać próbkę nasienia do pipety polimerowej i co 5 min obserwować stan upłynnienia, aż do momentu całkowitego upłynnienia próbki nasienia.</li>
	<li>Jeśli próbka nasienia nie upłynniła się całkowicie w ciągu 30 min, nie należy jeszcze przystępować do badania; należy odczekać kolejne 30 min. Jeżeli nasienie nadal nie jest całkowicie upłynnione po 60 min, należy dodać taką samą objętość roztworu buforu fosforanowego w celu uzyskania rozcieńczenia 1:1 i delikatnie wymieszać, aby wspomóc upłynnienie.</li>
	<li>Po dokładnym wymieszaniu i ujednorodnieniu, w pełni upłynnioną próbkę nasienia należy zachować do dalszych procedur badawczych.</li>
</ol>
3. Barwienie leukocytów nadtlenkowych i analiza oryginalnej próbki nasienia
<ol>
	<li>Przed pobraniem próbki, używając pipety polimerowej, należy wielokrotnie pipetować i dokładnie homogenizować badaną próbkę nasienia.</li>
	<li>Użyć pipety transferowej 200 µL i ustawić skalę na 100 µL poprzez obrót pokrętła. Wymienić końcówkę pipety, a następnie przenieść 100 µL próbki nasienia do probówki wirówkowej.</li>
	<li>Użyć pipety transferowej 1000 µL i ustawić skalę na 900 µL poprzez obrót pokrętła. Wymienić końcówkę pipety, a następnie przenieść 900 µL wyżej wspomnianego roztworu roboczego do probówki wirówkowej.</li>
	<li>Za pomocą pipety transferowej 1000 µL wielokrotnie pipetować i dokładnie homogenizować odczynnik, składający się z próbki nasienia i roztworu roboczego.</li>
	<li>Umieścić probówkę wirówkową w statywie do probówek na wstrząsarze dwuwymiarowym i poddać ciągłemu mieszaniu przy 200 rpm przez 30 min w RT.</li>
	<li>Podczas oczekiwania na reakcję barwienia, przeanalizować próbkę nasienia za pomocą systemu CASA, aby określić stężenie spermatozoon w oryginalnej próbce nasienia znajdującej się w polimerowym pojemniku.
	<ol>
		<li>Włączyć zasilanie systemu CASA i dwukrotnie kliknąć ikonę SCA SCOPE, aby otworzyć oprogramowanie aplikacyjne.</li>
		<li>Przed pobraniem próbki, ponownie wielokrotnie pipetować i dokładnie homogenizować oryginalną próbkę nasienia za pomocą pipety polimerowej.</li>
		<li>Użyć pipety transferowej 10 µL i ustawić skalę na 10 µL poprzez obrót pokrętła. Wymienić końcówkę pipety, pobrać 10 µL oryginalnej próbki nasienia i umieścić ją w komorze zliczającej SCA. Odczekać 60 s, aż próbka nasienia przestanie dryfować.</li>
		<li>Umieścić komorę zliczającą SCA w uchwycie na próbki systemu CASA i wprowadzić dane pacjenta w oknie dialogowym oprogramowania aplikacyjnego w celu przygotowania do formalnego badania.</li>
		<li>Zbadać oryginalną próbkę nasienia w komorze zliczającej SCA za pomocą systemu CASA, klikając przycisk Start, i zapisać niezbędne dane, takie jak stężenie spermatozoon.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Obserwacja leukocytów i spermatozoów wykazujących aktywność peroksydazy
<ol>
	<li>Użyć pipety transferowej 1000 µL i ustawić skalę na 1000 µL, obracając pokrętłem. Wymienić końcówkę pipety, a następnie kilkakrotnie pipetować w celu dokładnego zhomogenizowania odczynnika, składającego się z próbki nasienia i roztworu roboczego w probówce wirówkowej, po zakończeniu 30-minutowego procesu reakcji.</li>
	<li>Użyć pipety transferowej 10 µL i ustawić skalę na 10 µL, obracając pokrętłem. Wymienić końcówkę pipety, pobrać 10 µL wyżej wspomnianego odczynnika i nanieść go do komory do liczenia plemników. Na koniec przykryć komorę do liczenia plemników dedykowanym szkiełkiem nakrywnym.</li>
	<li>Umieścić komorę do liczenia plemników na stoliku mikroskopu i włączyć mikroskop optyczny z dwoma okularami 10x. Następnie odczekać 60 s, aż próbka odczynnika przestanie dryfować.</li>
	<li>W czasie oczekiwania przełączyć rewolwer mikroskopu na obiektyw 10x. Następnie kolejno regulować pokrętłem grubego i drobnego ustawiania ostrości. Na koniec obserwować plemniki i komórki okrągłe przy powiększeniu 10×10.</li>
	<li>Po wyznaczeniu pola widzenia do analizy, przełączyć rewolwer mikroskopu na obiektyw 40x i obserwować plemniki oraz brązowe leukocyty dodatnie pod kątem peroksydazy przy powiększeniu 10 × 40.</li>
	<li>Użyć elektronicznego systemu liczbowego, aby policzyć co najmniej 200 plemników oraz liczbę brązowych leukocytów dodatnich pod kątem peroksydazy w odpowiednich polach.</li>
</ol>
5. Obliczanie stężenia leukocytów pozytywnych pod kątem peroksydazy
<ol>
	<li>Oblicz stężenie leukocytów wykazujących aktywność peroksydazy, korzystając z następującego wzoru: 
	<img alt="Wzór na stosunek leukocytów do spermatozoonów, Równanie, Analiza stężenia, Diagram edukacyjny" src="/files/ftp_upload/66211/66211eq01v2.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 1"></li>
</ol>

Analysis of Semen for Peroxidase-Positive Leukocyte Cells

<ol><li>Agarwal, A., Mulgund, A., Hamada, A., Chyatte, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+unique+view+on+male+infertility+around+the+globe%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Biol+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">A unique view on male infertility around the globe.</a> Reprod Biol Endocrinol. 13, 37(2015).</li>
<li>Sharlip, I. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Best+practice+policies+for+male+infertility%5BTitle%5D)+AND+%22Fertil+Steril%22%5BJournal%5D)">Best practice policies for male infertility.</a> Fertil Steril. 77 (5), 873-882 (2002).</li>
<li>Choy, J. T., Eisenberg, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Male+infertility+as+a+window+to+health%5BTitle%5D)+AND+%22Fertil+Steril%22%5BJournal%5D)">Male infertility as a window to health.</a> Fertil Steril. 110 (5), 810-814 (2018).</li>
<li>Pellati, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genital+tract+infections+and+infertility%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Obstet+Gynecol+Reprod+Biol%22%5BJournal%5D)">Genital tract infections and infertility.</a> Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 140 (1), 3-11 (2008).</li>
<li>Rivero, M. J., Kulkarni, N., Thirumavalavan, N., Ramasamy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+and+management+of+male+genital+tract+infections+in+the+setting+of+male+infertility%3A+an+updated+review%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Urol%22%5BJournal%5D)">Evaluation and management of male genital tract infections in the setting of male infertility: an updated review.</a> Curr Opin Urol. 33 (3), 180-186 (2023).</li>
<li>Long, S., Kenworthy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Round+cells+in+diagnostic+semen+analysis%3A+A+guide+for+laboratories+and+clinicians%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Biomed+Sci%22%5BJournal%5D)">Round cells in diagnostic semen analysis: A guide for laboratories and clinicians.</a> Br J Biomed Sci. 79, 10129(2022).</li>
<li>Johanisson, E., Campana, A., Luthi, R., de Agostini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+%27round+cells%27+in+semen+analysis%3A+a+comparative+study%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Reprod+Update%22%5BJournal%5D)">Evaluation of 'round cells' in semen analysis: a comparative study.</a> Hum Reprod Update. 6 (4), 404-412 (2000).</li>
<li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WHO+Laboratory+Manual+for+the+Examination+and+Processing+of+Human+Semen.+5th+edn%5BTitle%5D)+AND+%22World+Health+Organization%22%5BJournal%5D)">WHO Laboratory Manual for the Examination and Processing of Human Semen. 5th edn.</a> World Health Organization. , (2010).</li>
<li>Domes, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+incidence+and+effect+of+bacteriospermia+and+elevated+seminal+leukocytes+on+semen+parameters%5BTitle%5D)+AND+%22Fertil+Steril%22%5BJournal%5D)">The incidence and effect of bacteriospermia and elevated seminal leukocytes on semen parameters.</a> Fertil Steril. 97 (5), 1050-1055 (2012).</li>
<li>Aziz, N., Agarwal, A., Lewis-Jones, I., Sharma, R. K., Thomas, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+associations+between+specific+sperm+morphological+defects+and+leukocytospermia%5BTitle%5D)+AND+%22Fertil+Steril%22%5BJournal%5D)">Novel associations between specific sperm morphological defects and leukocytospermia.</a> Fertil Steril. 82 (3), 621-627 (2004).</li>
<li>Alahmar, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+oxidative+stress+in+male+infertility%3A+An+updated+review%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hum+Reprod+Sci%22%5BJournal%5D)">Role of oxidative stress in male infertility: An updated review.</a> J Hum Reprod Sci. 12 (1), 4-18 (2019).</li>
<li>Schlegel, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+and+treatment+of+infertility+in+men%3A+AUA%2FASRM+guideline+Part+I%5BTitle%5D)+AND+%22J+Urol%22%5BJournal%5D)">Diagnosis and treatment of infertility in men: AUA/ASRM guideline Part I.</a> J Urol. 205 (1), 36-43 (2021).</li>
<li>Ricci, G., Presani, G., Guaschino, S., Simeone, R., Perticarari, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+detection+in+human+semen+using+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Reprod%22%5BJournal%5D)">Leukocyte detection in human semen using flow cytometry.</a> Hum Reprod. 15 (6), 1329-1337 (2000).</li>
<li>Brunner, R. J., Demeter, J. H., Sindhwani, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+of+guidelines+for+the+evaluation+and+treatment+of+leukocytospermia+in+male+infertility%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Mens+Health%22%5BJournal%5D)">Review of guidelines for the evaluation and treatment of leukocytospermia in male infertility.</a> World J Mens Health. 37 (2), 128-137 (2019).</li>
<li>Amulic, B., Cazalet, C., Hayes, G. L., Metzler, K. D., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+function%3A+from+mechanisms+to+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Neutrophil function: from mechanisms to disease.</a> Annu Rev Immunol. 30, 459-489 (2012).</li>
<li>Khan, A. A., Alsahli, M. A., Rahmani, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloperoxidase+as+an+active+disease+biomarker%3A+recent+biochemical+and+pathological+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Sci+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Myeloperoxidase as an active disease biomarker: recent biochemical and pathological perspectives.</a> Med Sci (Basel). 6 (2), 33(2018).</li>
<li>Khan, A. A., Rahmani, A. H., Aldebasi, Y. H., Aly, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+and+pathological+studies+on+peroxidases+-an+updated+review%29%5BTitle%5D)+AND+%22Glob+J+Health+Sci%22%5BJournal%5D)">Biochemical and pathological studies on peroxidases -an updated review).</a> Glob J Health Sci. 6 (5), 87-98 (2014).</li>
<li>Liu, W. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloperoxidase-derived+hypochlorous+acid+promotes+ox-LDL-induced+senescence+of+endothelial+cells+through+a+mechanism+involving+beta-catenin+signaling+in+hyperlipidemia%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Myeloperoxidase-derived hypochlorous acid promotes ox-LDL-induced senescence of endothelial cells through a mechanism involving beta-catenin signaling in hyperlipidemia.</a> Biochem Biophys Res Commun. 467 (4), 859-865 (2015).</li>
<li>Nicholls, S. J., Hazen, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloperoxidase+and+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Myeloperoxidase and cardiovascular disease.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 25 (6), 1102-1111 (2005).</li>
<li>Wolff, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biologic+significance+of+white+blood+cells+in+semen%5BTitle%5D)+AND+%22Fertil+Steril%22%5BJournal%5D)">The biologic significance of white blood cells in semen.</a> Fertil Steril. 63 (6), 1143-1157 (1995).</li>
<li>Chen, Y., Hashiguchi, N., Yip, L., Junger, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypertonic+saline+enhances+neutrophil+elastase+release+through+activation+of+P2+and+A3+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Hypertonic saline enhances neutrophil elastase release through activation of P2 and A3 receptors.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 290 (4), C1051-C1059 (2006).</li>
<li>Weiss, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+destruction+by+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Tissue destruction by neutrophils.</a> N Engl J Med. 320 (6), 365-376 (1989).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Ortoto-toluidyna i nadtlenek wodoru mają właściwości światłoczułe i mogą rozkładać się pod wpływem światła. Aby zapewnić skuteczność odczynników testowych, zaleca się, aby przygotowany płyn roboczy był przechowywany w ciemnym miejscu. 
Próbki nasienia w naturalny sposób wykazują niejednorodne cechy. W procesie przygotowania próbek nasienia prawidłowa ocena stanu upłynnienia nasienia i dokładna homogenizacja próbek nasienia przed każdym pobraniem próbki mają kluczowe znaczenie dla poprawy wiarygodności wyników badań. Próbki nasienia ulegają całkowitemu upłynnieniu w ciągu 15 minut. Należy rozważyć homogenizację mechaniczną lub trawienie enzymatyczne, jeśli nie uległy one całkowitemu upłynnieniu po 60 minutach. Bardziej jednorodne próbki nasienia można uzyskać, delikatnie potrząsając pojemnikiem na próbkę w sposób ciągły podczas procesu skraplania za pomocą dwuwymiarowej wytrząsarki8.
Metoda badawcza przedstawiona w tym artykule ma zalety prostoty, szybkości i opłacalności. Jednak w pewnych okolicznościach może to nie być korzystne: peroksydaza jest przechowywana w granulkach azurofilowych, które po aktywacji zostaną wydzielone do przestrzeni międzykomórkowej poprzez degranulację lub cytopempsis 21,22. W związku z tym neutrofile mogą nie plamić się i nie można ich zidentyfikować. W takich przypadkach konieczne staje się powtórzenie procesu barwienia lub nawet wymaganie od pacjenta oddania nowej próbki nasienia do ponownego badania. Aby zminimalizować tę sytuację, zaleca się wykorzystanie świeżych próbek nasienia, gdy tylko jest to możliwe, przy minimalnym czasie umieszczania i delikatnym procesie homogenizacji. Metoda ta pozwala jedynie na identyfikację aktywnych chorób lub zakażeń i nie pozwala na identyfikację chorób w późniejszych stadiach, takich jak infekcje przewlekłe16. Ponadto inne typy leukocytów o niższej zawartości peroksydazy, takie jak limfocyty, makrofagi i monocyty, stwarzają trudności w barwieniu tą metodą; w związku z tym uzyskanie wiarygodnych wyników można osiągnąć poprzez zastosowanie barwienia immunohistochemicznego antygenu leukocytarnego (np. CD45).
Zgodnie z piątym wydaniem podręcznika WHO, tradycyjne barwienie dodatnią mieloperoksydazą (test Endtza) wymaga mikroskopowego zliczenia co najmniej 200 leukocytów peroksydazo-dodatnich na płytce do liczenia komórek krwi w celu obliczenia ich stężenia8. W porównaniu z tradycyjnym ręcznym testem Endtza, protokół ten wprowadza dane o stężeniu plemników uzyskane przez detekcję CASA, łącząc metody ręczne i automatyczne. Aby obliczyć stężenie leukocytów peroksydazo-dodatnich, pod mikroskopem policzono co najmniej 200 plemników i leukocytów w odpowiednim polu widzenia. Ponieważ stężenie plemników w nasieniu jest znacznie większe niż w leukocytach, potrzeba było mniej czasu na policzenie 200 plemników w porównaniu do zliczenia 200 leukocytów peroksydazo-dodatnich.
Pacjenci z ciężką oligospermią, kryptozoospermią i azoospermią często stają przed wyzwaniami związanymi z policzeniem wystarczającej liczby plemników. W takich przypadkach stężenie leukocytów dodatnich pod względem peroksydazy można bezpośrednio obliczyć za pomocą płytki do liczenia krwinek, zgodnie z opisem w instrukcji dołączonej do płytki. Dodatkowo, w przypadku pacjentów, którzy nie wymagają CASA lub laboratoriów bez sprzętu CASA, płytka do liczenia krwinek może być również wykorzystana do określenia stężenia leukocytów peroksydazo-dodatnich.

Niepłodność stała się globalnym problemem zdrowia publicznego, dotykającym około 15% par w wieku rozrodczym. Czynniki męskie są odpowiedzialne za około 50% wszystkich przypadków niepłodności, a prawie 20% do 30% można przypisać wyłącznie czynnikom męskim1,2,3. Zakażenia męskich dróg rodnych (MGTI) stanowią jedną z istotnych przyczyn niepłodności męskiej, odpowiadając za około 15% przypadków4,5.
Większość osób ma leukocyty w swoim nasieniu, stanowiące 13% komórek niespermatozoa, przy czym zróżnicowane proporcje to neutrofile 12%, makrofagi 0,9% i limfocyty 0,1%6,7. Zgodnie z podręcznikiem laboratoryjnym Światowej Organizacji Zdrowia (WHO) dotyczącym badania i przetwarzania nasienia ludzkiego (wyd. 5), leukocytospermia jest zwykle definiowana jako obecność leukocytów >1 × 106 komórek/ml w nasieniu8. Ten stan może być spowodowany wieloma czynnikami, takimi jak toksyny środowiskowe, nadużywanie substancji, żylaki powrózka nasiennego, MGTI itp., które potencjalnie prowadzą do nieprawidłowego wzrostu stężenia leukocytów w nasieniu9. Leukocyty mogą podnosić poziom reaktywnych form tlenu (ROS) w nasieniu, powodując peroksydację lipidów i uszkodzenia oksydacyjne białka i DNA, co skutkuje zmniejszoną ruchliwością plemników, zwiększonymi nieprawidłowościami morfologicznymi plemników, podwyższonym wskaźnikiem fragmentacji DNA plemników, upośledzeniem funkcji akrosomów plemników, a nawet negatywnym wpływem na rozwój zarodka10,11.
Obecnie, androlodzy często decydują się na badanie okrągłych komórek w nasieniu lub elastazy w osoczu nasienia podczas rozpoznawania zapalenia dróg rodnych. Jednak często trudno jest odróżnić złuszczone komórki spermatogenne od komórek nabłonka dróg rodnych, które nie przyczyniają się do zmniejszenia masowego i niepotrzebnego stosowania antybiotyków6. Ta ostatnia metoda badania jest stosunkowo skomplikowana i czasochłonna, z powolnym raportowaniem wyników, co nie jest korzystne dla wczesnej diagnozy i leczenia chorób takich jak MGTI. Amerykańskie Towarzystwo Urologiczne (AUA) sugeruje, że dalsze różnicowanie między leukocytami a złuszczonymi komórkami z dróg rodnych powinno być dokonywane, gdy stężenie okrągłych komórek w analizie nasienia jest większe niż 1 × 106 komórek/ml12. Niektóre laboratoria andrologiczne wykorzystują cytometrię przepływową13 lub antygen leukocytów (np. CD45) immunocytochemię14 do badania leukocytów. Chociaż metody te są precyzyjne, są drogie i czasochłonne, co utrudnia wdrożenie kliniczne na dużą skalę, zwłaszcza w krajach rozwijających się.
Peroksydaza jest szeroko rozpowszechniona w różnych typach komórek i odgrywa kluczową rolę w odporności na uszkodzenia spowodowane stresem oksydacyjnym. Mieloperoksydaza (MPO) należy do podrodziny peroksydaz, która ulega ekspresji w komórkach odpornościowych. Największą ekspresję występuje w granulkach azurofilowych neutrofili15,16, a także w limfocytach17,18, monocytach i makrofagach19. Stężenie leukocytów, zwłaszcza neutrofili, w nasieniu można uzyskać, badając okrągłe komórki, które są peroksydazo-dodatnie7,20. Aby proces badania leukocytów w nasieniu był ekonomiczny, wygodny i wydajny, przeprojektowaliśmy metodę badania. Dzięki systemowi komputerowej analizy nasienia (CASA) stężenie leukocytów można uzyskać w ciągu 60 minut. Ta nowa metoda obniża koszty badania i czas oczekiwania pacjentów na uzyskanie wyników, odciąża laborantów, a także skraca okres oczekiwania lekarza na diagnozę i leczenie.

<table><tbody><tr><td>148 mmol/L roztwór disodowy (Na2EDTA) kwasu etylenodiaminotetraoctowego)</td><td>ShenZhen HuaKang Biomedical Engineering Co., LTD</td><td>20230301</td><td>Agentia B</td></tr><tr><td>6% (v/v) roztwór nadtlenku wodoru</td><td>ShenZhen HuaKang Biomedical Engineering Co., LTD</td><td>20230301</td><td>Agentia</td></tr><tr><td>D Automatyczny analizator klasy plemników &ndash; ZAKRES SCA&nbsp;</td><td>Microptic S.L.</td><td>1222996; Typ modelu: SCA-SCOPE-H</td><td>Sprzęt do komputerowej analizy nasienia (CASA)</td></tr><tr><td>Jednorazowa rurka odśrodkowa (1,5 ml)</td><td>Zhejiang Gongdong Medical Equipment Co., LTD</td><td>2210009</td><td>Rurka odśrodkowa do procesu barwienia</td></tr><tr><td>Jednorazowa pipeta transferowa (3 ml)</td><td>Jiangsu Kangjian Medical Supplies Co., LTD</td><td>20221101</td><td>Pipeta na bazie polimeru</td></tr><tr><td>Licznik elektroniczny</td><td>Brak</td><td></td> Brak <td>A licznik wielokanałowy</td></tr><tr><td>Wagi elektroniczne</td><td>Shanghai Liangping Instrument Co., LTD</td><td>D9008084</td><td>MAX = 100 g, e = 10 d, d = 0,01 g</td></tr><tr><td>Komora licząca</td><td>Makler</td><td>Makler MQ30004</td><td>0,01 sq.mm, 10 &mu; </td></tr><tr><td>m głęboki mikroskop optyczny</td><td>Olympus</td><td>3G41067201307</td><td>CX31, 10 i razy; 40</td></tr><tr><td>Roztwór substratu orto-toluidyny</td><td>ShenZhen HuaKang Biomedical Engineering Co., LTD</td><td>20230301</td><td>Agentia C</td></tr><tr><td>Końcówki do pipet (1 ml)</td> <td>Coming Life Sciences (Wujiang) Co., Ltd</td><td>02923205</td><td>1000 końcówek / sztukę, 5 sztuk / opakowanie</td></tr><tr><td>Końcówki do pipet (10 i mikro; L)</td> <td>Nadchodzące nauki przyrodnicze (Wujiang) Co., Ltd</td><td>00323961</td><td>1000 końcówek / jednostkę, 20 sztuk / opakowanie</td></tr><tr><td>Końcówki do pipet (200 i mikro; L)</td> <td>Nadchodzące nauki przyrodnicze (Wujiang) Co., Ltd</td><td>32822810</td><td>1000 końcówek / jednostkę, 20 sztuk / skrzynkę</td></tr><tr><td>Roztwór nasyconego chlorku amonu (NH4Cl)</td><td>ShenZhen HuaKang Biomedical Engineering Co., LTD</td><td>20230301</td><td>Agentia</td></tr><tr><td>A Komora licząca SCA</td><td>Microptic SL</td><td>102230608</td><td>10 & mikro; m, 2 komory</td></tr><tr><td>Pojemnik na próbkę nasienia</td><td>Jiangsu Kangjian Medical Supplies Co., LTD</td><td>20230701</td><td>Pojemnik na bazie polimeru na próbkę nasienia</td></tr><tr><td>Stół termostatyczny</td><td>Shenzhen MIAOQUAN Instrument Co., LTD</td><td>MQ30004</td><td>MQ-300</td></tr><tr><td>Pipeta transferowa (10 &micro; L)</td><td>Eppendoff</td><td>3121000.015</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta transferowa (1000 &micro; L)</td><td>Eppendoff</td><td>3121000.12</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta transferowa (200 &micro; L)</td><td>Eppendoff</td><td>3121000.082</td><td></td></tr><tr><td>Dwuwymiarowy shaker</td><td>DragonLab</td><td>822000010000</td><td>VC5A002205</td></tr></tbody></table>

badanie leukocytów peroksydazo-dodatnich w nasieniu

The Examination of Peroxidase-Positive Leukocytes in Semen

Leukocytospermia może prowadzić do zmniejszenia ruchliwości plemników, zwiększenia nieprawidłowości morfologicznych plemników, podwyższonego wskaźnika fragmentacji DNA plemników, upośledzenia funkcji akrosomów plemników, a nawet zaburzonego rozwoju embrionalnego. Jest to powszechna choroba andrologiczna w praktyce klinicznej i jedna z ważnych przyczyn niepłodności męskiej. Ustalając, czy istnieje zapalenie męskich dróg rodnych, androlodzy często decydują się na badanie okrągłych komórek lub elastazy osocza nasienia w nasieniu jako kliniczną podstawę diagnostyczną. Jednak na badanie okrągłych komórek łatwo wpływają złuszczone komórki spermatogenne i komórki nabłonka dróg rodnych, które nie przyczyniają się do zmniejszenia masowego i niepotrzebnego stosowania antybiotyków. Jednocześnie proces wykrywania elastazy jest stosunkowo skomplikowany, czasochłonny i powolny w raportowaniu wyników, co nie jest korzystne dla wczesnej diagnostyki i leczenia chorób, takich jak infekcje męskich dróg rodnych (MGTI). W innowacyjny sposób zastosowaliśmy badanie leukocytów peroksydazo-dodatnich w nasieniu wspomaganym systemem komputerowej analizy nasienia (CASA) jako kryterium diagnostyczne leukocytospermii, skutecznie rozwiązując te problemy. Badanie to wymaga jedynie dodania do próbki płynu eksploatacyjnego składającego się z czterech odczynników, a całkowity czas reakcji w temperaturze pokojowej można kontrolować w ciągu 20-30 minut. Dzięki późniejszemu rozmazowi i badaniu mikroskopowemu można uzyskać stężenie leukocytów peroksydazo-dodatnich w nasieniu w ciągu łącznie 60 minut, co można wykorzystać do zdiagnozowania, czy istniało zapalenie męskiego układu rozrodczego.

Po zastosowaniu wyżej wymienionej procedury odczynnik w probówce do wirówki często przyjmuje półprzezroczysty, opalizujący wygląd (Rycina 1). Wykrycie wyraźnego brązowego koloru wskazuje na potencjalną degranulację leukocytów, co może prowadzić do zabarwienia cieczy. W konsekwencji proces barwienia może zakończyć się niepowodzeniem, co czyni koniecznym ponowne barwienie lub pobranie nowej próbki nasienia do ponownego badania21.
Leukocyty wykazujące aktywność peroksydazy miały brązową barwę, co kontrastowało z niebarwionymi zwykłymi komórkami okrągłymi (Rycina 2, preparat standardowy). Następnie policzono każdy plemnik i brązowy leukocyt w aktualnym polu widzenia mikroskopu, po czym przesunięto preparat do zupełnie nowego pola w celu kontynuowania obserwacji i zliczania. Aby zapewnić optymalną dokładność, konieczne jest policzenie minimum 200 plemników oraz leukocytów obecnych w odpowiadającym im polu widzenia.
<img alt="Probówka do PCR trzymana w rękawiczce; przygotowanie do eksperymentu amplifikacji DNA w biologii molekularnej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66211/66211fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Roztwór reagentów. Reagent dopełniający proces reakcji jest półprzezroczystą, opalizującą cieczą. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66211/66211fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza nasienia, barwienie orto-toluidyną, obraz mikroskopowy, podkreślający aktywność peroksydazy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66211/66211fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Obserwacja pod mikroskopem optycznym (preparat zwykły). (A) Leukocyt peroksydazo-dodatni oraz (B) zwykła komórka obła obserwowane pod mikroskopem optycznym przy powiększeniu 10 x 40. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66211/66211fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Ten artykuł przedstawia ekonomiczny i efektywny protokół badania leukocytów peroksydazo-dodatnich w nasieniu. Za pomocą systemu komputerowej analizy nasienia (CASA) stężenie leukocytów peroksydazo-dodatnich w nasieniu można uzyskać w ciągu łącznie 60 minut, skutecznie poprawiając wydajność laboratorium andrologicznego i andrologów.

Badanie leukocytów peroksydazo-dodatnich w nasieniu

Leukocytospermia can lead to decreased spermatozoa motility, increased spermatozoa morphological abnormalities, elevated spermatozoa DNA fragmentation ...

Medycyna rozrodu mężczyzn jest moim głównym celem badawczym, a nasz protokół przede wszystkim zajmuje się kwestiami szybkości i kosztów analizy leukocytów peroksydazo-dodatnich w nasieniu. Nasienie jest z natury niejednorodne, co naprawdę wpływa na stabilność wyników badania nasienia. Dlatego ważne jest, aby przed badaniem upewnić się, że nasienie jest upłynnione i dokładnie wymieszane.Nasz protokół łączy ręczne i automatyczne pomiary w celu obliczenia stężenia leukocytów poprzez wykorzystanie koncentracji plemników, co oszczędza czas i jest bardziej opłacalne w porównaniu z klasyfikacją liczenia leukocytów. Aby rozpocząć, zbierz odczynniki do przygotowania roztworu roboczego i umieść je w temperaturze pokojowej. Przygotuj również nieprzezroczystą butelkę do przechowywania roztworu roboczego i chroń go przed światłem.Następnie przenieś 100 mikrolitrów roztworu chlorku amonu do nieprzezroczystej butelki z odczynnikiem za pomocą pipety transferowej o pojemności 200 mikrolitrów. Przenieść również 100 mikrolitrów roztworu EDTA sodu do butelki z odczynnikiem i wymieszać przez pipetowanie. Następnie dodać 900 mikrolitrów roztworu substratu ortotoluidyny do nieprzezroczystej butelki z odczynnikiem i delikatnie wymieszać przez pipetowanie.Następnie przenieś pięć mikrolitrów roztworu nadtlenku wodoru do butelki z odczynnikiem. Za pomocą pipety transferowej o pojemności 1000 mikrolitrów delikatnie wymieszaj roztwór, pipetując. Aby przygotować próbki nasienia, włącz podstawkę o stałej temperaturze i podgrzej ją do 37 stopni Celsjusza.Należy również wytarować wagę pod kątem masy pojemnika na bazie polimeru. Po otrzymaniu próbki nasienia zważyć próbkę i zanotować szczegółowe informacje, takie jak kod identyfikacyjny, czas pobrania, czas abstynencji na zewnętrznej ściance pojemnika na bazie polimeru. Następnie umieść próbkę nasienia na stojaku o stałej temperaturze w celu upłynnienia nasienia.Pobrać próbkę nasienia do pipety na bazie polimeru i sprawdzać pod kątem upłynnienia co pięć minut przez 30 minut, aż próbka nasienia zostanie całkowicie upłynniona. Na początek należy upłynnić pobrane próbki ludzkiego nasienia i dokładnie je homogenizować za pomocą pipety Pasteura. Następnie przenieś 100 mikrolitrów próbki nasienia do probówki wirówkowej.Do tej probówki dodaj 900 mikrolitrów roztworu barwiącego. Kilkakrotnie wymieszać przez pipetowanie i dokładnie homogenizować reagent. Umieść probówkę na dwuwymiarowej wytrząsarce w celu ciągłego mieszania przy 200 obr./min przez 30 minut w temperaturze pokojowej.W oczekiwaniu na reakcję stojącą należy przystąpić do analizy stężenia plemników za pomocą systemu CASA. Po włączeniu systemu kliknij dwukrotnie ikonę lunety SCA, aby otworzyć oprogramowanie aplikacji. Następnie dokładnie wymieszaj próbkę nasienia przez pipetowanie i przenieś do 10 mikrolitrów próbki w komorze zliczającej SCA.Odczekaj 60 sekund, aż próbka nasienia przestanie dryfować. Następnie umieść komorę zliczającą SCA na uchwycie próbki systemu CASA. W oprogramowaniu aplikacyjnym Wprowadź informacje o pacjencie w oknie dialogowym.Kliknij przycisk start, aby zarejestrować stężenie plemników w nasieniu. Następnie zatrzymaj wytrząsarkę po zakończeniu 30-minutowej reakcji barwienia. Przed analizą należy wymieszać zawartość probówki wirówkowej przez pipetowanie.Przenieś do 10 mikrolitrów reagenta do komory zliczania plemników i przykryj ją dedykowanym szklanym szkiełkiem nakrywkowym. Umieść komorę do liczenia plemników na stoliku mikroskopowym i włącz mikroskop optyczny. Następnie odczekaj 60 sekund, aż próbka reagenta przestanie dryfować.Pod obiektywem 10x wyreguluj kurs i pokrętła precyzyjnej regulacji, aby wybrać pole view. Następnie przełącz się na soczewkę obiektywową 40x i obserwuj plemniki i leukocyty dodatnie pod względem peroksydazy. Użyj elektronicznego systemu licznika, aby policzyć co najmniej 200 plemników i liczbę leukocytów peroksydazo-dodatnich w kolorze brązowym.Za pomocą tej techniki leukocyty dodatnie pod względem peroksydazy wybarwiono w próbce nasienia. Leukocyty dodatnie pod względem peroksydazy wykazywały brązowy odcień kontrastujący z niebarwionymi zwykłymi okrągłymi komórkami.

the-examination-of-peroxidase-positive-leukocytes-in-semen

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Ten protokół opisuje szybkie wzbogacanie leukocytów z małych próbek krwi w celu późniejszego specyficznego określenia aktywności halogenującej peroksydazy w komórkach. Metoda może być stosowana do materiału ludzkiego i innego niż ludzki i może przyczynić się do oceny nowych markerów stanu zapalnego.

Szybka i swoista ocena aktywności peroksydazy halogenującej w próbkach krwi wzbogaconej w leukocyty

Ten protokół opisuje szczegółową metodologię wykrywania lokalizacji H2O2 w plemnikach Solea senegalensis przy użyciu czułego fluorochromu DCFH-DA dla ROS, żywego barwnika mitochondriów dla mitochondriów i DAPI dla wizualizacji jąder, odpowiednio. Protokół przeznaczony jest do wykonania w ciągu 2 godzin na świeżych lub rozmrożonych plemnikach.

Ocena wewnątrzkomórkowego lokalizacji reaktywnych form tlenu w plemnikach Solea senegalensis

Ta praca opisuje standaryzację metody uzyskiwania oczyszczonych populacji komórek rozrodczych z tkanki jąder różnych gatunków ssaków. Jest to prosty protokół, który łączy mechaniczną dysocjację jąder, barwienie za pomocą Hoechst-33342 i jodku propidyny oraz sortowanie FACS, z szerokim zastosowaniem w badaniach porównawczych biologii rozrodu mężczyzn.

Ustandaryzowane podejście do wielogatunkowego oczyszczania męskich komórek rozrodczych ssaków za pomocą mechanicznej dysocjacji tkanek i cytometrii przepływowej

Tutaj prezentujemy metodologie oceny integralności błony plemników, cechy komórkowej związanej z kompetencją zapłodnienia plemników. Opisujemy trzy techniki fluorymetrycznej oceny błon plemników: jednoczesne barwienie za pomocą specyficznych sond fluorescencyjnych, mikroskopię fluorescencyjną oraz zaawansowaną cytometrię przepływową dedykowaną plemnikom. Przedstawiono również przykłady łączenia metodyk.

Techniki fluorymetryczne do oceny błon plemników

W tym artykule staramy się opisać wydajność techniki wirowania w gradiacji gęstości i jej zastosowanie w badaniach nad fizjologią plemników.

Pobieranie nasienia o zróżnicowanej jakości za pomocą wirowania w gradiacji gęstości

Prezentowany tutaj jest protokół wzbogacania spermatocytów pachytenowych, okrągłych spermatyd i wydłużania spermatyd z jąder dorosłych myszy za pomocą nieciągłego gradientu gęstości albuminy surowicy bydlęcej za pomocą standardowego sprzętu laboratoryjnego.

Wzbogacanie spermatocytów pachytenowych i spermatydów z jąder myszy przy użyciu standardowego sprzętu laboratoryjnego

Tutaj prezentujemy prostą i skuteczną metodę izolowania żywych mejotycznych i postmejotycznych komórek rozrodczych od jąder dorosłych myszy. Korzystając z barwnika wiążącego DNA o niskiej cytotoksyczności, wzbudzonego fioletem i sortowania komórek aktywowanego fluorescencją, można wyizolować wysoce wzbogacone populacje komórek spermatogennych do wielu dalszych zastosowań.

Izolacja mysich komórek spermatogennych za pomocą fioletowo-wzbudzonego, przepuszczalnego dla komórek barwnika wiążącego DNA

Obecny protokół dostarcza praktycznego rozwiązania, które pozwala na pomiar apoptozy, potencjału błony mitochondrialnej i uszkodzeń DNA w plemnikach ludzkich za pomocą pojedynczego cytometru.

Analiza cytometryczna przepływowa biomarkerów do wykrywania wad funkcjonalnych plemników ludzkich

Ten artykuł opisuje krok po kroku procedurę tworzenia modelu niedokrwienia/nawrócenia krążenia jądra w celu wytworzenia możliwego do powtórzenia modelu skrętu jądra w badaniach nad patologicznymi mechanizmami uszkodzenia niedokrwienia-nawrócenia krążenia w jądrze.

Zabezpieczenie skręconego jądra: szczurczy model uszkodzenia wywołanego niedokrwieniem-reperfuzją jądra

Opisano zestaw testowy (IMAP) służący do pogłębionej oceny zdolności słuchowych i poznawczych wpływających na umiejętności słuchania. Jest on szybki w przeprowadzeniu, przyjazny dla dzieci i wolny od zakłóceń językowych. Generowanie bodźców oraz zarządzanie protokołem są kontrolowane za pomocą platformy programowej (IHR-STAR), co zapewnia powtarzalność procedur.

Zrozumienie procesu słuchania: zestaw testów IMAP

Poznaj protokół analizy leukocytów peroksydazo-dodatnich w nasieniu w andrologii. Metoda łączy pomiary manualne i automatyczne z systemem CASA, zwiększając szybkość i obniżając koszty badań płodności męskiej.

Badanie leukocytów peroksydazo-dodatnich w nasieniu

Przeglądaj więcej filmów