Badanie leukocytów peroksydazo-dodatnich w nasieniu
19 stycznia 2024
Ten artykuł przedstawia ekonomiczny i efektywny protokół badania leukocytów peroksydazo-dodatnich w nasieniu. Za pomocą systemu komputerowej analizy nasienia (CASA) stężenie leukocytów peroksydazo-dodatnich w nasieniu można uzyskać w ciągu łącznie 60 minut, skutecznie poprawiając wydajność laboratorium andrologicznego i andrologów.
Medycyna rozrodu mężczyzn jest moim głównym celem badawczym, a nasz protokół przede wszystkim zajmuje się kwestiami szybkości i kosztów analizy leukocytów peroksydazo-dodatnich w nasieniu. Nasienie jest z natury niejednorodne, co naprawdę wpływa na stabilność wyników badania nasienia. Dlatego ważne jest, aby przed badaniem upewnić się, że nasienie jest upłynnione i dokładnie wymieszane.
Nasz protokół łączy ręczne i automatyczne pomiary w celu obliczenia stężenia leukocytów poprzez wykorzystanie koncentracji plemników, co oszczędza czas i jest bardziej opłacalne w porównaniu z klasyfikacją liczenia leukocytów. Aby rozpocząć, zbierz odczynniki do przygotowania roztworu roboczego i umieść je w temperaturze pokojowej. Przygotuj również nieprzezroczystą butelkę do przechowywania roztworu roboczego i chroń go przed światłem.
Następnie przenieś 100 mikrolitrów roztworu chlorku amonu do nieprzezroczystej butelki z odczynnikiem za pomocą pipety transferowej o pojemności 200 mikrolitrów. Przenieść również 100 mikrolitrów roztworu EDTA sodu do butelki z odczynnikiem i wymieszać przez pipetowanie. Następnie dodać 900 mikrolitrów roztworu substratu ortotoluidyny do nieprzezroczystej butelki z odczynnikiem i delikatnie wymieszać przez pipetowanie.
Następnie przenieś pięć mikrolitrów roztworu nadtlenku wodoru do butelki z odczynnikiem. Za pomocą pipety transferowej o pojemności 1000 mikrolitrów delikatnie wymieszaj roztwór, pipetując. Aby przygotować próbki nasienia, włącz podstawkę o stałej temperaturze i podgrzej ją do 37 stopni Celsjusza.
Należy również wytarować wagę pod kątem masy pojemnika na bazie polimeru. Po otrzymaniu próbki nasienia zważyć próbkę i zanotować szczegółowe informacje, takie jak kod identyfikacyjny, czas pobrania, czas abstynencji na zewnętrznej ściance pojemnika na bazie polimeru. Następnie umieść próbkę nasienia na stojaku o stałej temperaturze w celu upłynnienia nasienia.
Pobrać próbkę nasienia do pipety na bazie polimeru i sprawdzać pod kątem upłynnienia co pięć minut przez 30 minut, aż próbka nasienia zostanie całkowicie upłynniona. Na początek należy upłynnić pobrane próbki ludzkiego nasienia i dokładnie je homogenizować za pomocą pipety Pasteura. Następnie przenieś 100 mikrolitrów próbki nasienia do probówki wirówkowej.
Do tej probówki dodaj 900 mikrolitrów roztworu barwiącego. Kilkakrotnie wymieszać przez pipetowanie i dokładnie homogenizować reagent. Umieść probówkę na dwuwymiarowej wytrząsarce w celu ciągłego mieszania przy 200 obr./min przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
W oczekiwaniu na reakcję stojącą należy przystąpić do analizy stężenia plemników za pomocą systemu CASA. Po włączeniu systemu kliknij dwukrotnie ikonę lunety SCA, aby otworzyć oprogramowanie aplikacji. Następnie dokładnie wymieszaj próbkę nasienia przez pipetowanie i przenieś do 10 mikrolitrów próbki w komorze zliczającej SCA.
Odczekaj 60 sekund, aż próbka nasienia przestanie dryfować. Następnie umieść komorę zliczającą SCA na uchwycie próbki systemu CASA. W oprogramowaniu aplikacyjnym Wprowadź informacje o pacjencie w oknie dialogowym.
Kliknij przycisk start, aby zarejestrować stężenie plemników w nasieniu. Następnie zatrzymaj wytrząsarkę po zakończeniu 30-minutowej reakcji barwienia. Przed analizą należy wymieszać zawartość probówki wirówkowej przez pipetowanie.
Przenieś do 10 mikrolitrów reagenta do komory zliczania plemników i przykryj ją dedykowanym szklanym szkiełkiem nakrywkowym. Umieść komorę do liczenia plemników na stoliku mikroskopowym i włącz mikroskop optyczny. Następnie odczekaj 60 sekund, aż próbka reagenta przestanie dryfować.
Pod obiektywem 10x wyreguluj kurs i pokrętła precyzyjnej regulacji, aby wybrać pole view. Następnie przełącz się na soczewkę obiektywową 40x i obserwuj plemniki i leukocyty dodatnie pod względem peroksydazy. Użyj elektronicznego systemu licznika, aby policzyć co najmniej 200 plemników i liczbę leukocytów peroksydazo-dodatnich w kolorze brązowym.
Za pomocą tej techniki leukocyty dodatnie pod względem peroksydazy wybarwiono w próbce nasienia. Leukocyty dodatnie pod względem peroksydazy wykazywały brązowy odcień kontrastujący z niebarwionymi zwykłymi okrągłymi komórkami.
Przegląd
Niniejszy dokument przedstawia ekonomiczny i efektywny protokół do badania leukocytów o dodatniej peroksydazie w nasieniu. Protokół łączy środki manualne i automatyczne w celu obliczenia stężenia leukocytów, poprawiając efektywność laboratoriów andrologicznych.
Kluczowe komponenty badania
Dziedzina nauki
- Medycyna rozrodu męskiego
- Andrologia
- Protokoły laboratoryjne
Tło
- Analiza nasienia jest kluczowa dla oceny płodności mężczyzn.
- Nasienie jest heterogeniczne, co wpływa na stabilność analizy.
- Leukocyty o dodatniej peroksydazie są ważnymi wskaźnikami w nasieniu.
- Szybkość i koszt są istotnymi czynnikami w analizie nasienia.
Cel badania
- Opracowanie opłacalnego protokołu do analizy leukocytów w nasieniu.
- Poprawa szybkości analizy nasienia.
- Poprawa dokładności pomiarów stężenia leukocytów.
Zastosowane metody
- Wykorzystanie komputerowego systemu analizy nasienia (CASA).
- Przygotowanie roztworu roboczego do analizy.
- Środki manualne i automatyczne do obliczania stężenia leukocytów.
- Zabezpieczenie odpowiedniego upłynniania i mieszania próbek nasienia.
Główne wyniki
- Protokół umożliwia pomiar stężenia leukocytów w ciągu 60 minut.
- Wykazuje lepszą efektywność w warunkach laboratoryjnych.
- Oszczędności kosztów w porównaniu z tradycyjnymi metodami klasyfikacji.
- Zwiększona dokładność wyników dzięki dokładnej przygotowce próbek.
Wnioski
- Opracowany protokół jest efektywny i ekonomiczny w analizie nasienia.
- Rozwiązuje kluczowe wyzwania w laboratoriach andrologicznych.
- Przyszłe zastosowania mogą dalej poprawić oceny zdrowia rozrodczego mężczyzn.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Rapid and accurate quantification of peroxidase-positive leukocytes in semen addresses a critical bottleneck in male infertility diagnostics and reproductive tract inflammation assessment. This protocol leverages computer-assisted semen analysis (CASA) to deliver standardized, reproducible results within 60 minutes, supporting early-stage decision-making in reproductive health R&D. The streamlined workflow reduces ambiguity in inflammatory status, enabling more confident triage and portfolio prioritization in andrology research pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables precise interrogation of inflammatory mechanisms affecting sperm function and fertility.
- Supports biological de-risking by distinguishing true leukocytospermia from confounding cell types.
- Improves predictive confidence for downstream studies on male reproductive tract disorders.
Screening & Assay Development
- Facilitates preparation of validated semen samples for high-throughput screening of anti-inflammatory or fertility-modulating compounds.
- Delivers standardized, quantitative leukocyte counts suitable for assay reproducibility and cross-lab comparisons.
- Enables rapid turnaround, supporting scalable screening workflows in andrology research.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant endpoints by quantifying leukocyte-driven impairment of sperm function.
- Provides continuity from discovery to preclinical validation in male infertility and inflammation models.
- Supports risk-adjusted advancement of candidate interventions targeting reproductive tract inflammation.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates at the interface of early discovery and preclinical research, bridging diagnostic assessment with mechanistic studies in male reproductive health.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing on the impact of leukocytospermia on sperm quality and function.
- Screening: Provides reproducible, quantitative leukocyte measurements for assay development and compound evaluation.
- Analytics: Delivers objective readouts for comparing inflammatory status across samples and conditions.
- Translational Research: Supports biomarker alignment for preclinical models of male infertility and genital tract inflammation.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, scalable capability for ongoing andrology and reproductive health research portfolios.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in male infertility studies.
- Operational Value: Streamlines sample processing, reduces turnaround time, and enhances reproducibility.
- Strategic Value: Enables earlier, more informed go/no-go decisions in reproductive health R&D pipelines.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of candidate diagnostics and therapeutics targeting male reproductive tract inflammation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in semen handling, staining, and CASA system operation.
- Needs access to optical microscopy and computer-assisted semen analysis infrastructure.
- Demands cross-team standardization of sample preparation and data interpretation protocols.
- Adaptable to various semen sample types but may require optimization for non-standard matrices.
- Potential limitations include sample heterogeneity and the need for rigorous quality control in reagent preparation.
