Generowanie i dalsza analiza transkryptomów pojedynczych komórek i jąder w organoidach mózgowych

Opracowujemy i optymalizujemy modele organoidów w celu zastosowania ich do modelowania chorób. Naszym celem jest zrozumienie mechanizmu molekularnego leżącego u podstaw rozwoju i progresji choroby. Pracujemy w ścisłej współpracy z laboratorium Nikolausa Rajewsky'ego, który opracowuje i stosuje pojedyncze komórki i specjalne technologie, aby zrozumieć, w jaki sposób RNA reguluje ekspresję genów w zdrowiu i chorobie.

W ostatnich latach organoidy mózgowe stały się platformami eksperymentalnymi i translacyjnymi do badania chorób specyficznych dla pacjenta. Dlatego nie jest zaskakujące, że najnowsze osiągnięcia mają na celu poprawę złożoności modeli organoidów mózgowych. Na przykład, jesteśmy teraz w stanie generować organoidy specyficzne dla regionu mózgu, a także używać organoidów mózgowych do zespołów wieloorganoidowych.

Wdrożono również różne metody wprowadzania komórek unaczyniających i odpornościowych do organoidów mózgowych. Obecnie jedną z najbardziej zaawansowanych technologicznie technologii, których używamy w tym laboratorium, jest transkryptomika przestrzenna, która umożliwia ocenę ekspresji genów w nienaruszonej tkance. Ma to kluczowe znaczenie dla zrozumienia, w jaki sposób profile ekspresji genów różnych typów komórek różnią się w różnych regionach w obrębie jednej tkanki.

Innym niedawnym postępem, który został dokonany, jest multiomika jednokomórkowa, która umożliwia analizę wielu modułów pojedynczej komórki, co daje bardziej holistyczne podejście do analizy tych komórek. Wykorzystujemy organoidy mózgowe oraz metody transkryptomiki pojedynczej komórki i przestrzennej, aby zrozumieć mechanizmy leżące u podstaw chorób człowieka, takich jak zespół Leigha i opryszczkowe zapalenie mózgu. Ponadto opracowaliśmy wysokorozdzielczą i opłacalną metodę transkryptomiki przestrzennej o nazwie Open-ST.

Porównaliśmy i zoptymalizowaliśmy metodę sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki i pojedynczego jądra, aby zrozumieć, jak dobrze radzą sobie one z odzyskiwaniem typu komórki w tkance organoidowej mózgu. Na początek zbierz do pięciu organoidów ludzkiego mózgu wygenerowanych z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych w jednym dołku na 6-dołkowej płytce. Odessać nadmiar pożywki hodowlanej i raz umyć organoidy PBS.

Za pomocą skalpela dokładnie zmiel organoidy. Dodaj mieszankę enzymów 1 do zmielonych organoidów i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 20% tlenem i 5% dwutlenkiem węgla przy 90 obr./min przez 10 do 15 minut. Wymieszaj zawiesinę organoidów za pomocą końcówki pipety o pojemności 1 000 mikrolitrów.

Następnie dodaj mieszankę enzymów 2 i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 do 15 minut. Zatrzymaj dysocjację, dodając 10 mililitrów roztworu zatrzymującego. Przefiltruj zawiesinę komórek na sitku do komórek o średnicy 70 mikronów.

Odwirować przefiltrowaną zawiesinę komórkową o masie 300 g przez 10 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 4 mililitrach zimnego 0,04% BSA. Teraz przefiltruj zawiesinę komórek na sitku o wielkości 40 mikronów i policz komórki na liczniku komórek.

Odwirować wymaganą ilość zawiesiny komórek. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w pożywce NSB Plus zgodnie z instrukcją zestawu scRNA-Seq na bazie mikrofluidyki. Na początek przenieś cztery organoidy ludzkiego mózgu wygenerowane z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych do 6-dołkowej płytki zawierającej schłodzony PBS.

Pokrój każdy organoid na cztery części. Za pomocą nożyczek odetnij końcówkę końcówki do pipety o pojemności 1 000 mikrolitrów i użyj jej do przeniesienia kawałków organoidów do 2-mililitrowego leżaczka. Całkowicie odessać PBS i dodać 1 mililitr buforu do lizy NP40.

Odbić organoidy trzy razy za pomocą tłuczka A, a następnie tłuczka B. Przenieść zawiesinę do 15-mililitrowej probówki wirówkowej. Umyj leżaczek 1 mililitrem buforu do lizy i przenieś roztwór do probówki wirówkowej. Po 5 minutach inkubacji w temperaturze pokojowej odwirować zawiesinę organoidową o masie 500 g przez 5 minut.

Odessać supernatant pozostawiając 50 mikrolitrów w probówce. Dodaj 1 mililitr pożywki NSB Plus do probówki i po 5 minutach wymieszaj, aby ponownie zawiesić granulkę. Po przygotowaniu gradientu Percoll w probówce, nałóż na nią zawiesinę organoidu.

Następnie odwirować warstwową zawiesinę organoidową o masie 500 g przez 5 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w pożywce NSB Plus. Przefiltrować roztwór jąder na sitku do komórek o wielkości 40 mikronów.

Następnie wybarwić jądra za pomocą DAPI i policzyć je w komorze Neubauera. Odwirować wymaganą ilość roztworu jąder i ponownie zawiesić osad w pożywce NSB Plus zgodnie z instrukcją zestawu snRNA-Seq na bazie mikrofluidyki.