Name: Zestaw symulowanych formatów pożywek opartych na informacjach in situ do hodowli mikroorganizmów beztlenowych nabytych w środowisku (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-12T14:20:00.000+00:00
Duration: 7 min 56 s
Description: Poznaj metodę przygotowania pożywek dla wymagających mikroorganizmów beztlenowych z wykorzystaniem zmodyfikowanej techniki Hungary. Protokół ułatwia hodowlę trudnych szczepów z mikrobiologicznej ciemnej materii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną podkreślić rodowód informacji i mentoringu, które wpłynęły/rozwinęły te techniki na przestrzeni lat. Dr Hamilton-Brehm jako były doktorant, doktorant, a obecnie profesor ma dług wdzięczności wobec tych, którzy poświęcili czas na nauczanie technik beztlenowych: Dr Mike Adams, Dr. Gerti Schut, Dr. Jim Elkins, Dr Mircea Podar, dr Duane Moser i dr Brian Hedlund. Nature Conservancy i American Rivers wsparły te prace poprzez granty odpowiednio G21-026-CON-P i AR-CE21GOS373. Wszelkie opinie, ustalenia, wnioski lub zalecenia wyrażone w tym artykule są opiniami autorów i niekoniecznie odzwierciedlają poglądy Nature Conservancy lub American Rivers. Prace te zostały wsparte grantem z SIU Advanced Energy Institute, który z wdzięcznością dziękuje za finansowanie przyznane za pośrednictwem Advanced Energy Resource Board. NGS został wykonany przez LC Sciences.

In Situ Simulated Anaerobic Method for Culturing Environmental Microbes

<ol><li>Staley, J. T., Konopka, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+in+situ+activities+of+nonphotosynthetic+microorganisms+in+aquatic+and+terrestrial+habitats%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Measurement of in situ activities of nonphotosynthetic microorganisms in aquatic and terrestrial habitats.</a> Annu. Rev. Microbiol. 39 (1), 321-346 (1985).</li>
<li>Lloyd, K. G., Steen, A. D., Ladau, J., Yin, J., Crosby, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogenetically+novel+uncultured+microbial+cells+dominate+earth+microbiomes%5BTitle%5D)+AND+%22MSystems%22%5BJournal%5D)">Phylogenetically novel uncultured microbial cells dominate earth microbiomes.</a> MSystems. 3 (5), e00055(2018).</li>
<li>Rinke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+the+phylogeny+and+coding+potential+of+microbial+dark+matter%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Insights into the phylogeny and coding potential of microbial dark matter.</a> Nature. 499 (7459), 431-437 (2013).</li>
<li>Marcy, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+biological+%26%2334%3Bdark+matter%26%2334%3B+with+single-cell+genetic+analysis+of+rare+and+uncultivated+tm7+microbes+from+the+human+mouth%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Dissecting biological &#34;dark matter&#34; with single-cell genetic analysis of rare and uncultivated tm7 microbes from the human mouth.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104 (29), 11889-11894 (2007).</li>
<li>Giovannoni, S., Stingl, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+culturing+bacterioplankton+in+the%27omics%27+age%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The importance of culturing bacterioplankton in the'omics' age.</a> Nat. Rev. Microbiol. 5 (10), 820-826 (2007).</li>
<li>Stewart, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growing+unculturable+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Growing unculturable bacteria.</a> J. Bacteriol. 194 (16), 4151-4160 (2012).</li>
<li>Dedysh, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultivating+uncultured+bacteria+from+northern+wetlands%3A+Knowledge+gained+and+remaining+gaps%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Cultivating uncultured bacteria from northern wetlands: Knowledge gained and remaining gaps.</a> Front. Microbiol. 2, 184(2011).</li>
<li>Kaeberlein, T., Lewis, K., Epstein, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolating%26%2334%3B+uncultivable%26%2334%3B+microorganisms+in+pure+culture+in+a+simulated+natural+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Isolating&#34; uncultivable&#34; microorganisms in pure culture in a simulated natural environment.</a> Science. 296 (5570), 1127-1129 (2002).</li>
<li>Bomar, L., Maltz, M., Colston, S., Graf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+culturing+of+microorganisms+using+metatranscriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Directed culturing of microorganisms using metatranscriptomics.</a> mBio. 2 (2), e00012(2011).</li>
<li>Tyson, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-directed+isolation+of+the+key+nitrogen+fixer+Leptospirillum+ferrodiazotrophum+sp.+nov.+from+an+acidophilic+microbial+community%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Genome-directed isolation of the key nitrogen fixer Leptospirillum ferrodiazotrophum sp. nov. from an acidophilic microbial community.</a> Appl. Environ. Microbiol. 71 (10), 6319-6324 (2005).</li>
<li>Balch, W. E., Fox, G. E., Magrum, L. J., Woese, C. R., Wolfe, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methanogens%3A+Reevaluation+of+a+unique+biological+group%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Methanogens: Reevaluation of a unique biological group.</a> Microbiol. Rev. 43 (2), 260-296 (1979).</li>
<li>Merino, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subsurface+microbial+communities+as+a+tool+for+characterizing+regional-scale+groundwater+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Total+Environ%22%5BJournal%5D)">Subsurface microbial communities as a tool for characterizing regional-scale groundwater flow.</a> Sci. Total Environ. 842, 156768(2022).</li>
<li>Anderson, K. B., Creeping, J. C., Huggett, W. W. Process for the dissolution of coal, biomass and other organic solids in superheated water. U.S. patent 8,563,791. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://patentimages.storage.googleapis.com/23/49/97/e50f70357c62d8/US8563791.pdf">https://patentimages.storage.googleapis.com/23/49/97/e50f70357c62d8/US8563791.pdf</a> (2013).</li>
<li>Anderson, K. B., Crelling, J. C., Huggett, W. W., Perry, D. M. Production of organic materials using oxidative hydrothermal dissolution. U.S. patent 10,023,512. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://patentimages.storage.googleapis.com/a6/28/30/7f14a156b44bdf/US10023512.pdf">https://patentimages.storage.googleapis.com/a6/28/30/7f14a156b44bdf/US10023512.pdf</a> (2018).</li>
<li>Mullin, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+in+situ+mineral+colonization+by+microorganisms+in+a%7E+60+c+deep+continental+subsurface+aquifer%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Patterns of in situ mineral colonization by microorganisms in a~ 60 c deep continental subsurface aquifer.</a> Front. Microbiol. 11, 536535(2020).</li>
<li>Kozich, J. J., Westcott, S. L., Baxter, N. T., Highlander, S. K., Schloss, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+dual-index+sequencing+strategy+and+curation+pipeline+for+analyzing+amplicon+sequence+data+on+the+miseq+illumina+sequencing+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Development of a dual-index sequencing strategy and curation pipeline for analyzing amplicon sequence data on the miseq illumina sequencing platform.</a> Appl. Environ. Microbiol. 79 (17), 5112-5120 (2013).</li>
<li>Miller, T. L., Wolin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+serum+bottle+modification+of+the+hungate+technique+for+cultivating+obligate+anaerobes%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A serum bottle modification of the hungate technique for cultivating obligate anaerobes.</a> Appl Microbiol. 27 (5), 985-987 (1974).</li>
<li>Hamilton-Brehm, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermoanaerosceptrum+fracticalcis+gen.+nov.+sp.+nov.%2C+a+novel+fumarate-fermenting+microorganism+from+a+deep+fractured+carbonate+aquifer+of+the+us+great+basin%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Thermoanaerosceptrum fracticalcis gen. nov. sp. nov., a novel fumarate-fermenting microorganism from a deep fractured carbonate aquifer of the us great basin.</a> Front. Microbiol. 10, 2224(2019).</li>
<li>Hamilton-Brehm, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caldicellulosiruptor+obsidiansis+sp.+nov.%2C+an+anaerobic%2C+extremely+thermophilic%2C+cellulolytic+bacterium+isolated+from+obsidian+pool%2C+yellowstone+national+park%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Caldicellulosiruptor obsidiansis sp. nov., an anaerobic, extremely thermophilic, cellulolytic bacterium isolated from obsidian pool, yellowstone national park.</a> Appl. Environ. Microbiol. 76 (4), 1014-1020 (2010).</li>
<li>Hamilton-Brehm, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermodesulfobacterium+geofontis+sp.+nov.%2C+a+hyperthermophilic%2C+sulfate-reducing+bacterium+isolated+from+obsidian+pool%2C+yellowstone+national+park%5BTitle%5D)+AND+%22Extremophiles%22%5BJournal%5D)">Thermodesulfobacterium geofontis sp. nov., a hyperthermophilic, sulfate-reducing bacterium isolated from obsidian pool, yellowstone national park.</a> Extremophiles. 17 (2), 251-263 (2013).</li>
<li>Twigg, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidation-reduction+aspects+of+resazurin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Oxidation-reduction aspects of resazurin.</a> Nature. 155 (3935), 401-402 (1945).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konfliktu interesów.

Część tego protokołu dotycząca produkcji medium (sekcja 1) zawdzięcza swoją strukturę zmodyfikowanej technice hungate Millera i Wolina17, która jest szeroko stosowana od czasu jej publikacji. Praktyczność tego rozszerzonego protokołu wynika z jego opisowego charakteru i powiązania z pozyskiwaniem mikroorganizmów in situ . Butelki hodowlane zawierające symulowane pożywki przyjazne dla środowiska wykorzystano do pomyślnego wyhodowania następujących byłych członków "mikrobiologicznej ciemnej materii" nabytych in situ: beztlenowych bakterii podpowierzchniowych Thermoanaerosceptrum fracticalcis szczep DRI1318, Caldiatribacterium inferamans szczep SIUC1 (numer dostępu MT023787; manuskrypt w przygotowaniu) oraz Anaerothermus hephaesti szczep SIUC3 (numer dostępu MK618647; manuskrypt w przygotowaniu) oraz niescharakteryzowany szczep beztlenowej bakterii podpowierzchniowej DRI14 (numer dostępu KR708540).
Jednym z celów tego protokołu jest to, że jest on wysoce przystosowany do powierzchniowych i podpowierzchniowych środowisk beztlenowych oraz mikroorganizmów. Po pierwsze, zachęca się do zmiany składu podłoża w celu odzwierciedlenia składu środowiska będącego przedmiotem zainteresowania. Na przykład 3 000 mg/L NaCl można dodać do receptury podczas symulacji środowiska o stężeniach jonów 3 000 mg/L zarówno dla Na+, jak i Cl-; lub 650 ml piasku i 650 ml łupków można umieścić w bioreaktorze podczas symulacji środowiska, w którym stosunek objętości piaskowca do łupków wynosi 1:1. Po drugie, skład pożywki może być modyfikowany, aby stymulować wzrost określonych mikroorganizmów będących przedmiotem zainteresowania. W szczególności naiwne media, takie jak trzy media przedstawione w tym artykule, są przygotowane na takie modyfikacje i są od nich zależne. Przykłady węgla i źródeł energii obejmują fumaran18, pepton18, materię organiczną zawierającą celulozę19, octan20, ekstrakt drożdżowy19,20, ksylitol (szczep SIUC1), mrówczan (szczep SIUC3) i inne potencjalne źródła, takie jakH2/CO2, cytrynian i glukoza. Wreszcie, skład podłoża można zmienić w zależności od pożądanego badania. Na przykład głównym celem badania opisanego w sekcji dotyczącej wyników reprezentatywnych było odkrycie, w jaki sposób reprezentatywne podpowierzchniowe mikroorganizmy beztlenowe zareagowałyby na unikalną mieszaną zawiesinę organiczną (zawiesinę kolb kukurydzy przetworzoną za pomocą OHD13,14); W związku z tym jego receptura zawierała to źródło węgla zamiast bardziej konwencjonalnych opcji. Inne potencjalne poprawki do konkretnych badań obejmują dodawanie tworzyw sztucznych, kwasów i metali ciężkich lub innych ksenobiotyków do badań bioremediacji; dodanie opornych polimerów węglowych, takich jak celuloza i tworzywa sztuczne, w celu badań nad produktami zdepolimeryzowanymi o wartości dodanej; oraz dodawanie obornika i odpadów roślinnych do kompostu na małą skalę i innych badań rolniczych.
Jeśli pożądana jest analiza pożywki po redukcji, taka jak pomiary pH, potencjału oksydacyjno-redukcyjnego (ORP) i tlenu rozpuszczonego (DO), można to osiągnąć pośrednio, poświęcając reprezentatywną liczbę butelek z pożywką, aby z pewnością zrozumieć charakter tej partii. Po wystawieniu szczelnie zamkniętej butelki z podłożem na działanie powietrza zdecydowanie zaleca się, aby odczyty ORP i DO były wykonywane poniżej 1 minuty po otwarciu. Pomiary niezależne od tlenu (np. pH) można wykonać w trybie pilnym po pierwszym otwarciu. Wybredne mikroorganizmy beztlenowe zazwyczaj wymagają do wzrostu wartości ORP < -200 mV. Jeśli podłoże daje wartość ORP > -200 mV i/lub wartości DO >0,40 mg/L, można zastosować dodatkowy Na2S (0,1-0,2 g/L) lub inny reduktor (np. cytrynian tytanu, L-cysteinę, kwas askorbinowy) w celu dalszej redukcji pożywki.
Rezazuryna jest często używana jako wskaźnik tlenu (jak w tym protokole); Jednak dokładniej jest to wskaźnik redoks21, wskazujący na obecność tlenu pośrednio, gdy tlen zmienia potencjał redoks roztworu. Rezazuryna w roztworze początkowo ma niebieski kolor. Po wystawieniu na działanie środków redukujących roztwór nieodwracalnie zmienia kolor na różowy. Gdy roztwór jest dalej redukowany, odwracalnie zmienia się w bezbarwny i powraca do koloru różowego po utlenieniu. Autorzy zaobserwowali przypadki, w których zredukowane podłoża zawierające rezazurynę przesunęły się z niebieskiego na różowy, ale nie przesunęły się na bezbarwne. Jednak autorzy zaobserwowali również, że takie media często zmieniają się w bezbarwne po autoklawowaniu, a wydłużony czas spędzony na gotowaniu i płukaniu pożywki na ogół pozwala rezazurynie przejść do bezbarwnej postaci po dodaniu reduktorów. W razie potrzeby stężenie tlenu w pożywce można sprawdzić za pomocą sondy tlenu rozpuszczonego.
Wszystkie materiały potrzebne do uruchomienia tych bioreaktorów i same szklane bioreaktory wykonane na zamówienie nie przekroczyły ~5 tys. USD (przy założeniu, że sprzęt pomocniczy jest już dostępny, taki jak łaźnie wodne, pompy i inkubatory). Te techniki uprawy beztlenowej są ekonomicznie przyjazne w porównaniu z komercyjnymi automatycznymi bioreaktorami, których ceny mogą zaczynać się od 10 tys. > USD. Ponadto wiele komercyjnych bioreaktorów przechodzi na jednorazowe pojemniki reaktorów, co zmienia dynamikę porównań i nie jest opłacalne dla mniejszych laboratoriów badawczych/uniwersytetów, aby je stale wymieniać. Ponadto systemy komercyjne mogą mieć uprzedzenia chemiczne związane z produkcją (z powodu zastosowanych tworzyw sztucznych, smaru na uszczelkach/złączkach lub chemicznie uzdatnionej wody), które wpłyną na sukces hodowli wybrednych mikroorganizmów. Niski koszt, możliwość dostosowania i wszechstronność pobierania beztlenowej próbki środowiskowej w połączeniu z pożywką, którą można zaszczepić, co skutkuje generowaniem wzbogaceń do badań, znacznie zwiększa szanse na uzyskanie unikalnych mikroorganizmów.

Większość mikroorganizmów pozostaje niehodowlana; potwierdza to duża dysproporcja między komórkami obserwowana za pomocą mikroskopii, w przeciwieństwie do kilku mikroorganizmów, które udało się wyhodować za pomocą płytek agarowych. Staley i Konopka nazwali tę rozbieżność "Anomalią Wielkiej Liczby Płyt"1. Szacowana nieuwzględniona różnorodność jest poparta danymi metagenomicznymi i metatranskryptomicznymi pokazującymi wiele nowych rodzajów rozmieszczonych na krzywych liczebności rang z kilku różnych środowisk2. Mikroorganizmy, które zostały zaobserwowane (zazwyczaj przez losowe sekwencjonowanie społeczności drobnoustrojów), ale nie zostały wyhodowane, zostały określone jako "mikrobiologiczna ciemna materia"3,4.
W erze -omiki, hodowla mikroorganizmów pozostaje niezbędna do pełnej oceny danych genomowych i weryfikacji funkcji/fenotypu obecnych genów. Sekwencjonowanie hodowanych mikroorganizmów jest nadal jedynym sposobem na pewne uzyskanie kompletnych genomów, dopóki technologie takie jak metagenomika typu shotgun i genomy składane metagenomem ze środowiska nie staną się akceptowalnie nieomylne5. Oceny genomiczne w połączeniu z hodowanymi mikroorganizmami dostarczają silnych wniosków dla zrozumienia "mikrobiologicznej ciemnej materii". Wielu członków "mikrobiologicznej ciemnej materii" pełni kluczowe funkcje, które wpływają na obieg składników odżywczych i innych pierwiastków oraz produkcję cennych produktów naturalnych, wspierają systemy ekologiczne i świadczą usługi ekologiczne. Z medycznego punktu widzenia około połowa wszystkich obecnie wprowadzanych na rynek farmaceutyków to produkty i pochodne produktów z bakterii, a podejrzewa się, że profilowanie gatunków niehodowanych może ujawnić antybiotyki przyszłości. Aby uzyskać dostęp do tej niekulturalnej większości, należy zwiększyć różnorodność metodologii hodowli6. Wśród członków "mikrobiologicznej ciemnej materii" beztlenowe mikroorganizmy oligotroficzne są w dużej mierze niedostatecznie opisywane i prawdopodobnie posiadają cenne ekologicznie i przemysłowo szlaki biochemiczne7, co czyni je ważnymi celami hodowli. Jednak beztlenowe mikroorganizmy oligotroficzne są trudniejsze do hodowli niż ich tlenowe i kopiotroficzne odpowiedniki ze względu na często wymagany dłuższy czas inkubacji, wybredne warunki (np. szczególne niestandardowe temperatury in vitro) oraz stosowanie specjalistycznych receptur pożywek.
Obecne techniki rozwoju kultur członków "mikrobiologicznej ciemnej materii", w tym nowych beztlenowych oligotroficznych mikroorganizmów, znacznie poprawiły nasze zrozumienie i zwiększyły reprezentację tych mikroorganizmów w drzewie filogenetycznym. Obecne techniki wykorzystujące pożywki informacyjne do hodowli nowych mikroorganizmów (tj. pożywki, które uzyskuje się na podstawie wiedzy o mikroorganizmie lub mikroorganizmach będących przedmiotem zainteresowania) można podzielić na trzy odrębne metody. Pierwsza z metod polega na bezpośrednim usunięciu dyskretnej części środowiska w celu przeniesienia jej do komory hodowlanej in vitro, która zawiera już interesujące mikroorganizmy w membranie. Sekcja dyskretna (np. Woda morska) działa w celu zapewnienia mikroorganizmom będącym przedmiotem zainteresowania siedliska geochemicznego, z którego korzystają in situ, podczas gdy błona zatrzymuje ruch komórek w poprzek (komórki będące przedmiotem zainteresowania pozostaną w środku; obce komórki, które przybyły z sekcją dyskretną, pozostaną na zewnątrz). Poprzez włączenie związków naturalnie dostępnych dla mikroorganizmów docelowych w ich naturalnym środowisku, takie mikroorganizmy mogą być hodowane8. Druga metoda wykorzystuje metatranskryptomikę lub genomikę w celu wyjaśnienia możliwości metabolicznych, dostarczając wskazówek dotyczących zawężenia parametrów hodowli dla docelowego projektu pożywki. Takie podejście zapewnia profil ekofizjologiczny, który można wykorzystać do ukierunkowania na wzbogacanie określonych typów mikroorganizmów poza środowiskiem. Zapasy pożywki są dostosowane do zidentyfikowanych genów, które przypuszczalnie wspierają docelowe mikroorganizmy w celu zmniejszenia różnorodności wzbogacania,9,10. Jednym zastrzeżeniem jest to, że informacja genomiczna nie wnioskuje bezpośrednio o ekspresji genów, podczas gdy informacja transkryptomiczna tak.
Trzecia metoda obejmuje media informowane i symulowane przez środowisko, w odróżnieniu od pierwszej metody, która nie symuluje mediów, ale raczej wykorzystuje środowisko bezpośrednio jako źródło mediów. Ta trzecia metoda wymaga rekonesansu środowiskowego geochemii terenu zawierającego interesujące mikroorganizmy. Dzięki tej wiedzy identyfikowane są podstawowe składniki i parametry fizyczne w celu wytworzenia symulowanego podłoża opartego na informacjach środowiskowych. Pożywka jest następnie bezpośrednio infuzji osadu lub cieczy zawierającej mikroorganizmy z otoczenia do pożywki. Metoda ta ma szczególne znaczenie w przypadkach, gdy mikrobiolog zajmujący się hodowlą nie ma dostępu do wystarczających ilości środowiska źródłowego (wymaganych dla pierwszej metody) ani odpowiednich danych metatranskryptomicznych lub genomicznych (wymaganych dla drugiej metody).
Poniższy protokół jest przykładem trzeciej metody; jest on oparty na symulacji interesujących środowisk i ma na celu symulację. W protokole przedstawiono równolegle trzy receptury oparte na pożywkach ukierunkowanych na różne kultury mikroorganizmów beztlenowych nabyte w terenie. Trzy reprezentowane kultury to kultury mieszane pochodzące z gleby (zwane dalej kulturą mieszaną gleby), kultury mieszane pochodzące z odwiertu (zwane dalej kulturą mieszaną w odwiercie) oraz wyizolowany metanogen pochodzący z odwiertu (zwany dalej metanogenem izolowany w odwiercie). Tożsamości i ilości złożone w przepisach na podłoża udostępnione tutaj mają służyć jako przewodnik początkowy; Są w stanie i są zachęcani do dostosowywania się do środowiska czytelnika i interesujących go mikroorganizmów.

<table><tbody><tr><td>General Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 L butelka borokrzemianowa</td><td>Fisher Scientific</td> 1 ml strzykawka z końcówką Fisher Scientific <td></td><td></td></tr><tr><td>1 ml szklana pipeta</td><td>Fisher Scientific</td> 10 ml Butelka hodowlana Fisher Scientific <td></td><td></td></tr><tr><td>100 ml</td> Zaciskarka ręczna <td>Fisher Scientifc</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td> 20 mm <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientifc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>23 G Igła</td><td>Fisher Scientifc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>500 ml butelka borokrzemianowa</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aluminiowa uszczelka</td><td>Kaniula Fisher Scientifc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, długość 31,5 cm</td><td>Kaniula Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, długość 6 cm</td><td>Fisher Scientifc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Corer</td><td>Firma Giddings Machine Company&nbsp;</td><td></td><td>Zmontowany z części firmowych</td></tr><tr><td>Kolektor gazowy</td><td>Swagelok</td><td></td><td>Złożony z wielu różnych części</td></tr><tr><td>Zapalniczka</td><td>Lowe's</td> N2 gazowe Rękawice <td></td><td></td></tr><tr><td>nitrylowe</td><td></td> Airgas Fisher Scientific <td></td><td></td></tr><tr><td>Gumowy korek (do butelek GL45)</td><td>Glasgeratebau OCHS</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gumowy korek (do butelek hodowlanych)</td><td>Ace Glass</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mieszanie gorącej płyty</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Minerały śladowe</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Witaminy</td><td>ATCC ATCC</td><td></td><td></td></tr><<tr><td>strong>Materiały specyficzne dla bioreaktorów</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>#10 gumowy korek</td><td>Ace Glass</td><td></td><td></td></tr><tr><td>#7 gumowy korek</td> Strzykawka <td>Fisher Scientifc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 ml z końcówką typu luer lock</td><td>Fisher Scientifc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1/4" zawór kulowy z zadziorem do węża</td><td>Strzykawka Amazon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 ml z końcówką typu luer lock</td> Butelka borokrzemianowa <td>Fisher Scientifc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3,5 l</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5/16" - 1/4" adapter zadzioru węża dopasowanie</td><td>strzykawki Amazon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>60 ml z końcówką luer lock</td><td>Fisher Scientifc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>8 L borosillikate carboy</td><td>Allen Glass</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kątowe złącze węża do GL14 otwarta górna nasadka</td><td>Ace Glass</td><td>7623-20</td><td></td></tr><tr><td>Balloon</td><td>Party City</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bioreaktor borokrzemianowy</td><td>Allen Scientific Glass</td><td></td><td>Wykonane na zamówienie</td></tr><tr><td>Drill</td><td>Lowe's</td> Żeński łącznik adaptera luer lock Amazon GL14 otwarta górna nasadka Ace Glass 7621-04 GL18 otwarta górna nasadka Ace Glass 7621-08 GL45 otwarta górna nasadka Ace Glass z powłoką <td></td><td></td></tr> PTFE silikonowa <tr><td></td><td></td><td></td> przegroda do GL14 otwarta górna nasadka Ace <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> Szkło</td><td>7625-06</td><td></td></tr><tr><td>Przegroda silikonowa pokryta PTFE do GL18 otwarta górna nasadka</td><td>Ace Glass</td><td>7625-07</td><td></td></tr><tr><td>Stojak na pierścionki</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zacisk łańcuchowy</td> stojaka na pierścionki <td>Amazon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zacisk stojaka pierścieniowego</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rurki silikonowe; 1/4" średnica wewnętrzna, 1/2" od</td><td>Grainger</td><td>55YG13</td><td></td></tr><tr><td>Rurka silikonowa; 3/16" id, 3/8" od</td><td>Grainger</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Złącze proste do GL14 otwarta górna nasadka</td><td>Ace Glass</td><td>7623-22</td><td></td></tr><tr><td>Zawór trójdrogowy</td><td>Amazon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dwukierunkowy kran odcinający</td><td>Amazon Minipompa</td> o zmiennym przepływie o bardzo niskim przepływie VWR <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Łaźnia wodna</td><td>Fisher Scientifc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biała gumowa przegroda do rur o średnicy 13-18 mm</td><td>Ace Glass</td><td>9096-49</td><td></td></tr><tr><td>Drut</td><td>Lowe's</td> Opaska zaciskowa Lowe's <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

zestaw symulowanych formatów pożywek opartych na informacjach in situ do hodowli mikroorganizmów beztlenowych nabytych w środowisku

A Set of In Situ Informed Simulated Medium Formats for Culturing Environmentally Acquired Anaerobic Microorganisms

Zależne od kultury badania mikroorganizmów beztlenowych opierają się na kompetencjach metodologicznych. Metody te muszą stworzyć i utrzymać odpowiednie warunki wzrostu (np. pH i źródła węgla) dla mikroorganizmów beztlenowych, umożliwiając jednocześnie ekstrakcję próbek bez naruszania sztucznego środowiska. W tym celu metody, które opierają się na środowisku in situ i symulują je, mogą być bardzo pomocne w hodowli mikroorganizmów z tego środowiska. W tym miejscu przedstawiamy opartą na informacjach i symulacji metody beztlenowej in situ do hodowli mikroorganizmów naziemnych i podpowierzchniowych, kładąc nacisk na beztlenowe pobieranie próbek przy minimalnych zakłóceniach. Protokół ten szczegółowo opisuje produkcję konfigurowalnego płynnego podłoża beztlenowego oraz pozyskiwanie i hodowlę mikroorganizmów beztlenowych w środowisku in vitro. Protokół obejmuje również krytyczne komponenty bioreaktora beztlenowego wykorzystywanego do symulacji środowiskowych osadów i płynnych pożywek beztlenowych dla kultur nabytych w środowisku. Uwzględniliśmy wstępne dane z sekwencjonowania nowej generacji z utrzymywanego mikrobiomu przez cały okres życia bioreaktora, w którym aktywna kultura dynamicznie dostosowywała się w odpowiedzi na eksperymentalne źródło węgla.

Przedstawiamy tutaj wyniki badania z użyciem bioreaktora, w którym zastosowano opisaną w niniejszej pracy metodę przygotowania pożywki dla mieszanej kultury z otworu wiertniczego oraz metodę konfiguracji bioreaktora. Pożywka dla mieszanej kultury z otworu wiertniczego została zmodyfikowana tak, aby zawierała jako źródło węgla zawiesinę kolb kukurydzy poddanych utleniającemu rozpuszczaniu hydrotermalnemu (OHD)13,14. Zmodyfikowana pożywka dla mieszanej kultury z otworu wiertniczego była pompowana do bioreaktora przez 44 dni z prędkością 0,4 mL/min. W 23. dniu dodano inokulum pochodzące z otworu wiertniczego BLM-1 w regionie Death Valley w Nevadzie, USA15. Próbki cieczy z bioreaktora pobierano do butelki odbiorczej w dniach 1, 8, 15, 22, 23 (po inokulacji), 30, 37 i 44.
W celu monitorowania ogólnego stanu kultury szczepionki (oraz obecnych w osadzie bioreaktora mikroorganizmów, które przetrwały autoklawowanie przed inokulacją), pobierane próbki cieczy z bioreaktora poddawano bezpośrednim zliczeniom komórek. Bezpośrednie zliczanie komórek w pobranych próbkach cieczy przeprowadzono przy użyciu hemocytometru Petroffa-Hausera. Aby zidentyfikować składniki mikrobiologiczne bioreaktora, z próbek cieczy wyekstrahowano DNA, a następnie przeanalizowano geny 16S rRNA metodą sekwencjonowania następnej generacji (NGS). Dane NGS przetworzono wewnętrznie przy użyciu oprogramowania mothur zgodnie z procedurą MiSeq SOP16.
Przed inokulacją bezpośrednie zliczenia komórek często znajdowały się poniżej granicy wykrywalności (b.d.l.) wynoszącej 1,0 × 106 cells/mL. W 23. dniu (po inokulacji) odnotowano niską liczbę komórek wynoszącą 2,6 × 106 cells/mL, natomiast w kolejnych dniach 30., 37. i 44. liczby komórek przekraczały 1,0 × 107 cells/mL (Rysunek 3). Mimo że w dniach 1., 8. i 22. liczby komórek były poniżej granicy wykrywalności, w każdym punkcie czasowym wyekstrahowano DNA do analizy NGS, co wskazywało na podstawową obecność mikroorganizmów przedinokulacyjnych w osadzie, nawet po autoklawowaniu. Główny rodzaj obecny (określony na podstawie liczby odczytów w każdej jednostce taksonomicznej operacyjnej (OTU)) był stabilny w dniach 8., 15. i 22. i został zidentyfikowany jako Geobacillus. Po inokulacji szczepem BLM-1 w 23. dniu Geobacillus przestał dominować i pojawiły się nowe główne rodzaje wraz z wieloma rzadziej występującymi rodzajami, które w większości utrzymywały się do końca badania (Rysunek 4). Na tej podstawie wyciągnęliśmy wniosek, że inokulum BLM-1 było aktywną i dynamicznie zmieniającą się kulturą wewnątrz bioreaktora.
Dodatkowe badanie danych NGS ujawniło obecność przedstawicieli tzw. „mikrobiologicznej ciemnej materii” (microbial dark matter). Jako wskaźnik OTU zawierających członków „mikrobiologicznej ciemnej materii” przyjęto OTU z przypisanymi nazwami taksonomicznymi zawierającymi słowa „unclassified” (niezaklasyfikowane) lub „uncultured” (niehodowane). Dane NGS zebrano dla dnia 44. (ostatniego dnia po inokulacji mikroorganizmami z otworu wiertniczego BLM-1) i przefiltrowano tak, aby nie zawierały OTU, które posiadały odczyty w danych przed inokulacją (dni 1, 8, 15 lub 22), ponieważ te OTU najprawdopodobniej nie znajdowały się w inokulum. Przefiltrowane dane NGS z dnia 44. zawierały 1 844 OTU i 3 396 odczytów. Z tej liczby 366 OTU (20%) i 925 odczytów (27%) nie zostało zaklasyfikowanych na poziomie typu, a 1252 OTU (68%) i 2357 odczytów (69%) były niezaklasyfikowane lub niehodowane na poziomie rodzaju. Mimo krótkiego czasu trwania, w oparciu o ten wskaźnik, niniejsze badanie pilotażowe potwierdza potencjał bioreaktora z pożywkami dostosowanymi do warunków środowiskowych w hodowli przedstawicieli „mikrobiologicznej ciemnej materii”.
<img alt="Równowaga statyczna; schemat; kurek, proces obrotu, przyłącza GL; projekt zestawu eksperymentalnego." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66228/66228fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Schemat zaprojektowanego bioreaktora borokrzemianowego używanego do hodowli beztlenowych. (A) Widok bioreaktora z jednej strony. (B) Widok uzyskany po obróceniu A o 90° (zgodnie z ruchem wskazówek zegara) wokół osi z). (C) Widok bioreaktora z góry. Konstrukcja z płaszczem grzewczym umożliwia kontrolę temperatury za pomocą wody lub oleju. Dwa porty płaszcza są widoczne po prawej stronie widoku w B. Wewnętrzną komorę można wypełnić dowolnym rodzajem osadu lub pozostawić pustą w celu hodowli planktonicznej. Trzy porty pobierkowe (widoczne po prawej stronie widoku w A) umożliwiają pobieranie materiału z różnych głębokości kolumny bioreaktora. Standardowe otwory GL 45, 18 i 14 można uszczelnić za pomocą septa teflonowych lub butylowych, które zapewniają szczelność gazową przez okres od 1 do 6 miesięcy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66228/66228fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat stanu równowagi statycznej w systemie chromatografii filtracyjnej; monitory; przepływ cieczy; kolumna piaskowa." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66228/66228fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Zespół aktywnego bioreaktora. Szkło laboratoryjne przedstawione na zdjęciu od lewej do prawej to (A) butla 8 L, (B) bioreaktor (patrz Rysunek 1) oraz (C) butelka odbiorcza bez systemu pobierania próbek. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66228/66228fig02large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Wykres wzrostu komórek; dodanie inokulum; eksperyment z hodowlą mikrobową; stężenie komórek w funkcji czasu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66228/66228fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Bezpośrednie liczenie komórek w badaniu z użyciem bioreaktora. Populacje drobnoustrojów w bioreaktorze monitorowano przy użyciu komory liczbowej hemocytometru Petroffa-Hausera 0,02 mm. Inokulum dodano na początku 23. dnia. Liczba komórek w dniach 1, 8 i 22 była poniżej granicy wykrywalności. Efektywna granica wykrywalności bezpośredniego liczenia komórek wynosi 1 × 106 cells/mL. Skrót: b.d.l. = poniżej granicy wykrywalności. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66228/66228fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres słupkowy składu społeczności mikrobowej; liczba odczytów według dni, zaznaczono dodanie inokulum, pokazano różnorodność." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66228/66228fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Sekwencjonowanie nowej generacji (NGS) z bioreaktora. OTU przedstawiono na skumulowanych wykresach słupkowych, wskazujących procent odczytów należących do unikalnych OTU z każdego punktu czasowego badania w bioreaktorze. Unikalne OTU przypisano do odpowiadającej im taksonomii na poziomie rodzaju. Rodzaj „Other” definiuje wszystkie rodzaje stanowiące mniej niż 10% odczytów w każdym punkcie czasowym. Całkowita liczba przedstawionych odczytów DNA wynosi 506 358. Liczba odczytów dla każdego punktu czasowego jest podana na górze wykresu. Inokulum dodano na początku 23. dnia. Skrót: OTU = Operational Taxonomic Unit (operacyjna jednostka taksonomiczna). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66228/66228fig04large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Związek</td>
			<td>Ilość dla mieszanej kultury glebowej</td>
			<td>Ilość dla mieszanej kultury z otworu wiertniczego</td>
			<td>Ilość dla metanogenów wyizolowanych z otworu wiertniczego</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Woda destylowana</td>
			<td>1000,0 mL</td>
			<td>1000,0 ml</td>
			<td>1000,0 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>3,600 g</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>2,000 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl22 ∙6 h2O</td>
			<td>0,400 g</td>
			<td>0,400 g</td>
			<td>0,400 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>0,500 g</td>
			<td>0,250 g</td>
			<td>0,500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4Cl</td>
			<td>0,268 g</td>
			<td>0,268 g</td>
			<td>0,268 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2SO4</td>
			<td>-</td>
			<td>0,284 g</td>
			<td>1,500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO (histochemia i patomorfologia)4 ∙2 H2O</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>0,356 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M KH2PO42PO4 przy pH 6</td>
			<td>1,0 mL</td>
			<td>1,0 ml</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M HCl3BO3 przy pH 9,4</td>
			<td>1,0 mL</td>
			<td>1,0 ml</td>
			<td>1,0 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pierwiastki śladowe</td>
			<td>1,0 ml</td>
			<td>-</td>
			<td>1,0 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Witaminy</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>1,0 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mg/mL rezazureny sodowej</td>
			<td>0,4 mL</td>
			<td>0,3 ml</td>
			<td>0,4 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>regulacja pH do</td>
			<td>-</td>
			<td>7.0</td>
			<td>7.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>regulacja pH za pomocą</td>
			<td>-</td>
			<td>NaOH</td>
			<td>KOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperatura inkubacji</td>
			<td>25 °C</td>
			<td>60 °C</td>
			<td>47 °C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Skład pożywek. Lista związków i parametrów fizycznych dla każdej pożywki. Przedstawione pożywki są podstawowe; nie zawierają one źródeł węgla i energii, ponieważ mogą one być specyficzne dla mikroorganizmów i środowiska badawczego użytkownika. Proponowane dodatki źródeł węgla i energii znajdują się w sekcji dyskusji.
Plik uzupełniający 1: Konfiguracja kolektora gazowego. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66228/66228_Supplemental%20File%201.zip" target="_blank">Aby pobrać ten plik, kliknij tutaj.</a>

Tematem tego artykułu jest szczegółowe opisanie najlepszych praktyk tworzenia pożywek dla wymagających mikroorganizmów beztlenowych pozyskanych ze środowiska. Metody te pomagają w zarządzaniu kulturami beztlenowymi i mogą być stosowane do wspomagania wzrostu nieuchwytnych mikroorganizmów niehodowlanych, "mikrobiologicznej ciemnej materii".

Zestaw symulowanych formatów pożywek opartych na informacjach in situ do hodowli mikroorganizmów beztlenowych nabytych w środowisku

Culture-dependent research of anaerobic microorganisms rests upon methodological competence. These methods must create and maintain suitable growth ...

Nasze badania koncentrują się na mikroorganizmach lądowych na powierzchni i pod powierzchnią, hodowli ich oraz badaniu ich genomów i fenotypów. Szczególny nacisk kładziony jest na mikroorganizmy i środowiska, które nie są dobrze poznane, takie jak te znajdujące się głęboko pod powierzchnią i na niektórych terenach podmokłych. Większość hodowanych przez nas mikroorganizmów jest beztlenowa, co oznacza, że proces hodowli na ogół wymaga więcej czasu i uwagi niż procesy w przypadku częściej stosowanych mikroorganizmów tlenowych.Mamy nadzieję, że audiowizualna prezentacja preparatyki beztlenowej pomoże naukowcom dopiero zaczynającym przygodę z tą techniką opanować ją stosunkowo szybko i łatwo. Ten preparat pożywki oparty jest na zmodyfikowanej węgierskiej technice Millera i Rolanda Hodowla wybrednych drobnoustrojów jest żmudna i problematyczna. Posiadanie większej liczby narzędzi do ich uprawy jest bardzo mile widziane w społeczności naukowej.Ogólnie rzecz biorąc, przyszłe badania będą podobne do naszych obecnych badań nad niedostatecznie zbadanymi mikroorganizmami lądowymi. Wciąż jest wiele nowych mikroorganizmów do odkrycia i zbadania. Aby rozpocząć, odmierz i dodaj wymagane składniki pożywki do litrowej butelki.Dostosuj pH do interesującej nas kultury mikrobiologicznej i wymieszaj składniki do jednorodności, obracając butelkę. Podgrzej płyn do wrzenia w kuchence mikrofalowej przez pięć do sześciu minut, często otwierając kuchenkę mikrofalową i delikatnie obracając butelką za pomocą żaroodpornej rękawicy. Następnie podłącz sterylną szklaną pipetę o pojemności 10 mililitrów do zestawu kolektora azotu gazowego.Otwórz kolektor, aby odprowadzić tlen i pozwól na wypłynięcie azotu. Umieść końcówkę pipety w cieczy i wyreguluj przepływ gazu tak, aby pęcherzyki były umiarkowanie energiczne. Przepłucz płyn azotem, aż butelka przestanie być zbyt gorąca, aby ją dotknąć.Czekając, aż butelka ostygnie, ustaw 10 sterylnych 100-mililitrowych butelek do hodowli. Gdy butelka z pożywką osiągnie znośne ciepło, pociągnij końcówkę pipety do góry w przestrzeń nad butelką. Dodaj 0,125 grama wodorowęglanu sodu i 0,3 grama bezwodnego siarczku sodu i poczekaj, aż rezazuryna stanie się bezbarwna.Czekając, aż resazurin zmieni kolor, przymocuj metalowe kaniule do zestawu kolektora gazowego. Dostosuj przepływ azotu do umiarkowanej szybkości i umieść końcówki kaniuli w butelkach hodowlanych. Gdy rezazuryna stanie się bezbarwna, wlej 50 mililitrów płynu do każdej butelki hodowlanej.Zakręć każdą butelkę gumowym korkiem o podobnym rozmiarze natychmiast po wyjęciu kaniuli. Następnie zabezpiecz korek aluminiową uszczelką. Umieść butelki w pojemniku na autoklawo i napełnij pojemnik wodą z kranu, aż poziom wody będzie odpowiadał poziomowi w butelkach.Autoklaw butelek w temperaturze 121 stopni Celsjusza przez 30 minut. Aby przygotować zestaw gąsiora, otwórz zawór 6.4-centymetrowej kuli węża. Przymocuj dwucentymetrowe odcinki silikonowej rurki na obu końcach zaworu kulowego pręta węża.Przymocuj złączkę adaptera pręta węża o średnicy od 7.9 do 6.4 milimetra do jednego końca zespołu. Przymocuj drugi koniec zespołu do króćca węża ośmiolitrowego balonu. Użyj opaski zaciskowej, aby zabezpieczyć połączenie między króćcem węża gąża gąsiora a rurką oraz połączenie między złączką adaptera węża a rurką.Odmierz i dodaj wymagane składniki pożywki do ośmiolitrowego balonu. Po dostosowaniu wymaganego pH wymieszaj składniki do jednorodności, mieszając na gorącej płycie i pozwól płynowi wrzeć przez 30 minut. Następnie podłącz sterylną szklaną pipetę o pojemności 10 mililitrów do kolektora azotu gazowego.Otwórz kolektor, aby odprowadzić tlen i pozwól na wypłynięcie azotu. Po wyłączeniu ognia umieść końcówkę pipety w płynie i płucz ją azotem gazowym przez 30 minut, umiarkowanie energicznie, ale nie przelewając. Następnie pociągnij końcówkę pipety do góry w przestrzeń nad gąsiorem.Dodaj dwa gramy wodorowęglanu sodu i 4,8 grama bezwodnego siarczku sodu i poczekaj, aż rezazuryna stanie się bezbarwna. Gdy rezazuryna stanie się bezbarwna, wyjmij szklaną pipetę i natychmiast zakryj gąsień korkiem o rozmiarze 10. Owinąć drut nad korkiem i wokół krawędzi gąsiora, aby zabezpieczyć korek.Aby uzyskać mieszaną kulturę gleby beztlenowej, należy wsunąć narzędzie do rdzeniowania w osad polowy, aż górna część cylindra do pobierania próbek zostanie zrównana z powierzchnią osadu. Przekręć rdzeń pod kątem 90 stopni, aby uwolnić rdzeń i pociągnij w górę, aż próbka zostanie pobrana z otoczenia. W przypadku luźnych osadów przykryj podstawę rdzenia nową ręką w rękawicy nitro, aby zapobiec wypadnięciu próbki lub rozprzestrzenieniu się do wody podczas ekstrakcji.Szybko przybliż na oko, sześć do siedmiu centymetrów w górę od podstawy rdzenia i pokrój go, aby oddzielić spód. Natychmiast przenieś dno rdzenia do butelki hodowlanej, minimalizując w jak największym stopniu narażenie na atmosferę tlenową. Po przeniesieniu natychmiast zmień położenie korka i przytrzymaj go na miejscu za pomocą nakrętki.Utrzymuj próbkę w chłodnym miejscu i wstaw butelkę do lodówki w temperaturze 4 stopni Celsjusza po powrocie do laboratorium. Na początek należy przygotować korek i sterylną butelkę z azotem oraz butelki z kulturami i butelkę do pobierania próbek. Wlej 100% etanol na korki i podpal je za pomocą zapalniczki.Gdy korki przestaną się palić, włóż jednomililitrową strzykawkę wyposażoną w igłę o rozmiarze 23 do butelki z azotem i pobierz około jednego mililitra azotu. Wyciągnąć igłę i powoli nacisnąć tłok, aby uwolnić azot. Natychmiast włóż igłę do butelki do pobierania próbki i pobierz 0,5 mililitra próbki środowiskowej.Pobrać próbkę do butelki hodowlanej zawierającej pożywkę. Delikatnie zakręć butelką i umieść ją w inkubatorze o żądanej temperaturze. Bezpośrednia liczba komórek przed inokulacją była często poniżej granicy wykrywalności.Po inokulacji liczba komórek wzrosła o ponad 10 milionów komórek na mililitr w dniach 30, 37 i 44. Chociaż liczba komórek była poniżej granicy wykrywalności przed dodaniem inokulum, NGS wskazał na podstawową obecność mikroorganizmów preinokulum w osadzie, a główny rodzaj geobacillus był stabilny w dniach 8, 15 i 22. Po inokulacji inokulum BLM-1 w 23 dniu, geobacillus przestał dominować i powstały nowe główne rodzaje wraz z wieloma mniej obecnymi rodzajami.

a-set-situ-informed-simulated-medium-formats-for-culturing

Research

JoVE Journal

Environment

Środowisko

Clostridium difficile to bakteria chorobologiczna, która jest ściśle beztlenowca i powoduje biegunkę związaną z antybiotykami (AAD). Opisano tu metody izolacji, hodowli i utrzymania komórek wegetatywnych i zarodników C. difficile. Techniki te wymagają komory beztlenowej, która wymaga regularnej konserwacji w celu zapewnienia odpowiednich warunków do optymalnej uprawy C. difficile.

Hodowla i utrzymanie Clostridium difficile w środowisku beztlenowym

Techniki wzbogacania mikroorganizmów na miejscu lub hodowli in situ mogą ułatwić izolację trudnych do hodowli taksonów mikroorganizmów, zwłaszcza z ekstremalnych środowisk o niskiej biomasie lub geochemicznie. W tym miejscu opisujemy układ elektrochemiczny bez użycia zewnętrznego źródła zasilania w celu wzbogacenia szczepów drobnoustrojów, które są zdolne do zewnątrzkomórkowego transportu elektronów (EET).

Wolnostojący zestaw elektrochemiczny do wzbogacania bakterii oddychających anodą na miejscu

Ponieważ organizmy beztlenowe nie są w stanie rosnąć po ekspozycji na tlen, niezbędne jest stosowanie technik hodowli beztlenowej. W tym miejscu demonstrujemy prostą i skuteczną metodę uprawy mieszanej kultury pochodzącej z biogazowni, od przygotowania pożywki do ilościowego oznaczania gazu i lotnych kwasów tłuszczowych.

Pożywka Preparat do hodowli mikroorganizmów w warunkach ściśle beztlenowych/beztlenowych

Protokół podsumowuje najlepsze praktyki mające na celu zminimalizowanie obciążenia biologicznego mikroorganizmów w środowisku pomieszczeń czystych i zawiera strategie, takie jak monitorowanie środowiska, monitorowanie procesów i testowanie sterylności produktu. Jest to istotne dla zakładów produkcyjnych i badawczych, które są zobowiązane do spełniania aktualnych standardów dobrej praktyki tkankowej i aktualnych standardów dobrej praktyki wytwarzania.

Strategie kontroli i monitorowania mikrobiologicznego w pomieszczeniach czystych i terapiach komórkowych

Protokół przedstawia dwie metodologie poprawy izolacji beztlenowych bakterii jelitowych. Pierwszy z nich koncentruje się na izolacji różnych bakterii przy użyciu różnych pożywek hodowlanych. Drugi koncentruje się na etapach uprawy określonej grupy drobnoustrojów, ewentualnie asymilując mio-inozytol, aby w pełni zrozumieć jego znaczenie ekologiczne.

Strategie mające na celu poprawę hodowli bakterii beztlenowych z przewodu pokarmowego kurczaka

Ten protokół opisuje projekt i użycie chipa izolacyjnego (iChip) do hodowli in situ opornych mikrobów glebowych w ich naturalnym środowisku. Opisano w nim również hodowlę in situ bakterii glebowych wytwarzających środki przeciwdrobnoustrojowe. Protokół można dostosować do odzyskiwania bakterii z różnych nisz o innych pożądanych właściwościach.

In Situ Izolacja i hodowla opornych bakterii glebowych za pomocą chipa izolacyjnego (iChip)

Ten protokół szczegółowo opisuje montaż układów mini-bioreaktorów, które mają być wykorzystane do hodowli złożonego przepływu złożonych zbiorowisk kałowych w warunkach beztlenowych. Omówiono również metody montażu, inokulacji i pobierania próbek z reaktorów do dalszej analizy.

Montaż bioreaktora do ciągłej hodowli złożonych zbiorowisk kałowych

Wywołane przez rybołówstwo zmiany w eksploatowanych połowach skorupiaków, takie jak amerykańskie połowy homarów, mogą potencjalnie wpłynąć na ich dynamikę reprodukcyjną, prowadząc do zmniejszenia sukcesu godowego. Celem tego badania było opracowanie nieinwazyjnej metody ustalania sukcesu godowego samic homarów, które mogą być fizjologicznie lub funkcjonalnie dojrzałe.

Nieinwazyjna metoda określania in situ udanego krycia u samic homarów amerykańskich (Homarus americanus)

Nowatorski reaktor beztlenowy z przepływem stałym (UASS) został wykorzystany do produkcji biogazu z włóknistego surowca. Poferment z reaktora UASS został hydrotermalnie zwęglony do biowęgla HTC w ciśnieniowym reaktorze wsadowym. W tym badaniu zastosowano integrację dwóch koncepcji bioenergii w celu zwiększenia ogólnej produkcji bioenergii.

Ocena zintegrowanej fermentacji beztlenowej i karbonizacji hydrotermalnej w produkcji bioenergii

Mikrobiologiczna redukcja siarczanów jest procesem o wielkim znaczeniu w biotechnologii środowiskowej. Powodzenie reaktorów sulfidogennych zależy m.in. od składu mikrobiologicznego osadu. W tym miejscu przedstawiamy protokół zagospodarowania osadu sulfidogennego z osadów kominów hydrotermalnych w reaktorze UASB do celów odchlorowania redukcyjnego.

Opracowanie osadu sulfidogennego z osadów morskich i redukcja trichloroetylenu w reaktorze z przepływem atmosferycznym z przepływem atmosferycznym

Poznaj metodę przygotowania pożywek dla wymagających mikroorganizmów beztlenowych z wykorzystaniem zmodyfikowanej techniki Hungary. Protokół ułatwia hodowlę trudnych szczepów z mikrobiologicznej ciemnej materii.

Zestaw symulowanych formatów pożywek opartych na informacjach in situ do hodowli mikroorganizmów beztlenowych nabytych w środowisku (Wideo) | JoVE Journal

Zestaw symulowanych formatów pożywek opartych na informacjach in situ do hodowli mikroorganizmów beztlenowych nabytych w środowisku

Przeglądaj więcej filmów