Name: Mysi lewy klamra płucny Hilar Clamp Urazu Reperfuzyjnego Niedokrwienia Płuc (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-04-12T13:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 45 s
Description: Poznaj metodę zaciskania lewego wnętrza płucnego w myszy do badania uszkodzenia niedokrwiennego niedokrwienia płuc. Protokół ten pozwala izolować rolę neutrofili i komórek B w mechanizmach immunologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca nie otrzymała żadnej konkretnej dotacji od żadnej agencji finansującej w sektorze publicznym, komercyjnym czy non-profit.

Mouse Model for Studying Lung Ischemia-Reperfusion Injury

<ol><li>Bharat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+link+between+primary+graft+dysfunction+and+chronic+lung+allograft+rejection%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Thorac+Surg%22%5BJournal%5D)">Immunological link between primary graft dysfunction and chronic lung allograft rejection.</a> Ann Thorac Surg. 86 (1), 189-195 (2008).</li>
<li>Daud, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+immediate+primary+lung+allograft+dysfunction+on+bronchiolitis+obliterans+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Impact of immediate primary lung allograft dysfunction on bronchiolitis obliterans syndrome.</a> Am J Respir Crit Care Med. 175 (5), 507-513 (2007).</li>
<li>Halazun, K. J., Al-Mukhtar, A., Aldouri, A., Willis, S., Ahmad, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Warm+ischemia+in+transplantation%3A+search+for+a+consensus+definition%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Proc%22%5BJournal%5D)">Warm ischemia in transplantation: search for a consensus definition.</a> Transplant Proc. 39 (5), 1329-1331 (2007).</li>
<li>Warnecke, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Warm+or+cold+ischemia+in+animal+models+of+lung+ischemia-reperfusion+injury%3A+is+there+a+difference+%5BTitle%5D)+AND+%22Thorac+Cardiovasc+Surg%22%5BJournal%5D)">Warm or cold ischemia in animal models of lung ischemia-reperfusion injury: is there a difference .</a> Thorac Cardiovasc Surg. 52 (3), 174-179 (2004).</li>
<li>Hasenauer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+cold+or+warm+ischemia+and+ex-vivo+lung+perfusion+on+the+release+of+damage+associated+molecular+patterns+and+inflammatory+cytokines+in+experimental+lung+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Heart+Lung+Transplant%22%5BJournal%5D)">Effects of cold or warm ischemia and ex-vivo lung perfusion on the release of damage associated molecular patterns and inflammatory cytokines in experimental lung transplantation.</a> J Heart Lung Transplant. 40 (9), 905-916 (2021).</li>
<li>Iskender, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+warm+versus+cold+ischemic+donor+lung+preservation+on+the+underlying+mechanisms+of+injuries+during+ischemia+and+reperfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Effects of warm versus cold ischemic donor lung preservation on the underlying mechanisms of injuries during ischemia and reperfusion.</a> Transplantation. 102 (5), 760-768 (2018).</li>
<li>Santos, P., Teixeira, P. J. Z., Moraes Neto, D. M., Cypel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donation+after+circulatory+death+and+lung+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bras+Pneumol%22%5BJournal%5D)">Donation after circulatory death and lung transplantation.</a> J Bras Pneumol. 48 (2), e20210369(2022).</li>
<li>Moskowitzova, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+transplantation+enhances+murine+lung+viability+and+recovery+after+ischemia-reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial transplantation enhances murine lung viability and recovery after ischemia-reperfusion injury.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 318 (1), L78-L88 (2020).</li>
<li>Nakata, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+blockage+of+S100A8%2FA9+ameliorates+ischemia-reperfusion+injury+in+the+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Bioengineering+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Functional blockage of S100A8/A9 ameliorates ischemia-reperfusion injury in the lung.</a> Bioengineering (Basel). 9 (11), 673(2022).</li>
<li>Nakata, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+effects+of+anti-HMGB1+monoclonal+antibody+on+lung+ischemia+reperfusion+injury+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Protective effects of anti-HMGB1 monoclonal antibody on lung ischemia reperfusion injury in mice.</a> Biochem Biophys Res Commun. 573, 164-170 (2021).</li>
<li>Wang, Q., Li, Y., Wu, C., Wang, T., Wu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aquaporin-1+inhibition+exacerbates+ischemia-reperfusion-induced+lung+injury+in+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">Aquaporin-1 inhibition exacerbates ischemia-reperfusion-induced lung injury in mouse.</a> Am J Med Sci. 365 (1), 84-92 (2023).</li>
<li>Gielis, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+murine+model+of+lung+ischemia+and+reperfusion+injury%3A+tricks+of+the+trade%5BTitle%5D)+AND+%22J+Surg+Res%22%5BJournal%5D)">A murine model of lung ischemia and reperfusion injury: tricks of the trade.</a> J Surg Res. 194 (2), 659-666 (2015).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitogen-activated+protein+kinases+regulate+HO-1+gene+transcription+after+ischemia-reperfusion+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mitogen-activated protein kinases regulate HO-1 gene transcription after ischemia-reperfusion lung injury.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 283 (4), L815-L829 (2002).</li>
<li>Sharma, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenosine+A2A+receptor+activation+on+CD4%2B+T+lymphocytes+and+neutrophils+attenuates+lung+ischemia-reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thorac+Cardiovasc+Surg%22%5BJournal%5D)">Adenosine A2A receptor activation on CD4+ T lymphocytes and neutrophils attenuates lung ischemia-reperfusion injury.</a> J Thorac Cardiovasc Surg. 139 (2), 474-482 (2010).</li>
<li>Yang, Z., Sharma, A. K., Linden, J., Kron, I. L., Laubach, V. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%2B+T+lymphocytes+mediate+acute+pulmonary+ischemia-reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thorac+Cardiovasc+Surg%22%5BJournal%5D)">CD4+ T lymphocytes mediate acute pulmonary ischemia-reperfusion injury.</a> J Thorac Cardiovasc Surg. 137 (3), discussion 702 695-702 (2009).</li>
<li>Sayah, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+are+pathogenic+in+primary+graft+dysfunction+after+lung+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps are pathogenic in primary graft dysfunction after lung transplantation.</a> Am J Respir Crit Care Med. 191 (4), 455-463 (2015).</li>
<li>Okazaki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+model+of+orthotopic+vascularized+aerated+lung+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Transplant%22%5BJournal%5D)">A mouse model of orthotopic vascularized aerated lung transplantation.</a> Am J Transplant. 6 (7), 1672-1679 (2007).</li>
<li>Hsiao, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spleen-derived+classical+monocytes+mediate+lung+ischemia-reperfusion+injury+through+IL-1beta%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Spleen-derived classical monocytes mediate lung ischemia-reperfusion injury through IL-1beta.</a> J Clin Invest. 128 (7), 2833-2847 (2018).</li>
<li>Sharma, A. K., Mulloy, D. P., Le, L. T., Laubach, V. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NADPH+oxidase+mediates+synergistic+effects+of+IL-17+and+TNF-alpha+on+CXCL1+expression+by+epithelial+cells+after+lung+ischemia-reperfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">NADPH oxidase mediates synergistic effects of IL-17 and TNF-alpha on CXCL1 expression by epithelial cells after lung ischemia-reperfusion.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 306 (1), L69-L79 (2014).</li>
<li>Zanotti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+critical+role+of+Toll-like+receptor+4+in+lung+ischemia-reperfusion+injury+and+edema%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Novel critical role of Toll-like receptor 4 in lung ischemia-reperfusion injury and edema.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 297 (297), L52-L63 (2009).</li>
<li>National Research Council. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Guide+for+the+care+and+use+of+laboratory+animals%22">Guide for the care and use of laboratory animals</a>. , The National Academies Press. Washington, DC. (2011).</li>
<li>Saito, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pirfenidone+alleviates+lung+ischemia-reperfusion+injury+in+a+rat+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thorac+Cardiovasc+Surg%22%5BJournal%5D)">Pirfenidone alleviates lung ischemia-reperfusion injury in a rat model.</a> J Thorac Cardiovasc Surg. 158 (1), 289-296 (2019).</li>
<li>Tanaka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+effects+of+Imatinib+on+ischemia%2Freperfusion+injury+in+rat+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Thorac+Surg%22%5BJournal%5D)">Protective effects of Imatinib on ischemia/reperfusion injury in rat lung.</a> Ann Thorac Surg. 102 (5), 1717-1724 (2016).</li>
<li>Kreisel, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+two-photon+imaging+reveals+monocyte-dependent+neutrophil+extravasation+during+pulmonary+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (42), 18073-18078 (2010).</li>
<li>Koletsis, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+cooling+in+a+lung+hilar+clamping+model+of+ischemia-reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Biol+Med+%28Maywood%29%22%5BJournal%5D)">In situ cooling in a lung hilar clamping model of ischemia-reperfusion injury.</a> Exp Biol Med (Maywood). 231 (8), 1410-1420 (2006).</li>
<li>Hermsen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+landscape+of+rat+strain+and+substrain+variation%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Genomic landscape of rat strain and substrain variation.</a> BMC Genomics. 16 (1), 357(2015).</li>
<li>Beck, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genealogies+of+mouse+inbred+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Genealogies of mouse inbred strains.</a> Nat Genet. 24 (1), 23-25 (2000).</li>
<li>Liao, W. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+model+of+orotracheal+intubation+and+ventilated+lung+ischemia+reperfusion+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A mouse model of orotracheal intubation and ventilated lung ischemia reperfusion surgery.</a> J Vis Exp. (187), 64383(2022).</li>
<li>Murata, T., Nakazawa, H., Mori, I., Ohta, Y., Yamabayashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reperfusion+after+a+two-hour+period+of+pulmonary+artery+occlusion+causes+pulmonary+necrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Am+Rev+Respir+Dis%22%5BJournal%5D)">Reperfusion after a two-hour period of pulmonary artery occlusion causes pulmonary necrosis.</a> Am Rev Respir Dis. 146 (4), 1048-1053 (1992).</li>
<li>Ukita, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+large+animal+model+for+pulmonary+hypertension+and+right+ventricular+failure%3A+Left+pulmonary+artery+ligation+and+progressive+main+pulmonary+artery+banding+in+sheep%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A large animal model for pulmonary hypertension and right ventricular failure: Left pulmonary artery ligation and progressive main pulmonary artery banding in sheep.</a> J Vis Exp. (173), 62694(2021).</li>
<li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+right+ventricular+failure+by+pulmonary+artery+constriction+and+evaluation+of+right+ventricular+function+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Induction of right ventricular failure by pulmonary artery constriction and evaluation of right ventricular function in mice.</a> J Vis Exp. (147), 59431(2019).</li>
<li>Welbourn, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiology+of+ischaemia+reperfusion+injury%3A+central+role+of+the+neutrophil%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Surg%22%5BJournal%5D)">Pathophysiology of ischaemia reperfusion injury: central role of the neutrophil.</a> Br J Surg. 78 (6), 651-655 (1991).</li>
</ol>

Autorzy nie informują o żadnych istotnych ujawnieniach.

Opisujemy technikę zaciskania wnęki, która polega na nałożeniu węzła ślizgowego na lewą wnękę, który zamyka tętnicę płucną i żyły oraz oskrzela w celu wywołania ciepłego niedokrwienia, a następnie reperfuzji. Po zaciśnięciu wnęki lewe płuco może zostać pobrane do różnych technik eksperymentalnych, takich jak histologia, cytometria przepływowa, sekwencjonowanie masowe lub pojedyncze komórki oraz ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy. Dodatkowo krew i śledziona mogą być wykorzystywane do badania skutków ogólnoustrojowych, podczas gdy prawe płuco nieniedokrwienne może służyć jako kontrola wewnętrzna. W tym protokole opisujemy również szczegółowe metody uzyskiwania pomiarów ABG i/lub określania wynaczynienia komórek.
Technika zaciskania mysich wnęk ma kluczowe znaczenie dla badań nad IRI płuc i dla szerszej dziedziny transplantacji płuc. Na przykład, korzystając z tego modelu zacisku wnękowego, nasza grupa odkryła, że klasyczne monocyty CCR2 + pochodzące ze śledziony pośredniczą w wynaczynieniu neutrofili do płuc po IRI18. Inna grupa wykazała, że komórki nabłonka pęcherzyków płucnych typu II wytwarzają CXCL1 (chemoatraktant neutrofili) w sposób zależny od oksydazy NADPH-IL-17-TNFα przy użyciu modelu zacisku wnękowego19. Stwierdzono, że TLR4 odgrywa rolę w rozwoju obrzęku w mysim modelu zaciskania wnęki20.
Podczas gdy ortotopowy przeszczep płuc myszy ma większe zastosowanie kliniczne i może symulować zarówno ciepłe, jak i zimne niedokrwienie, wprowadza również uraz chirurgiczny spowodowany zespoleniami naczyniowymi i oskrzelowymi oraz bodźce allogeniczne wynikające z niedopasowania dawcy i biorcy. Tak więc główną zaletą techniki zacisku wnękowego jest jej zdolność do izolowania skutków IRI płuc od tych innych czynników. Dodatkowo, dla niedoświadczonego mikrochirurga myszy, procedura klamry wnękowej jest technicznie mniej wymagająca i może być szybciej opanowana w porównaniu z przeszczepem płuc. Jednym z ograniczeń modelu zacisku wnękowego jest to, że zimne niedokrwienie jest trudne do osiągnięcia. Zimne niedokrwienie in situ przeprowadzono u świń z perfuzją płuc skierowanych do przodu przez lewą tętnicę płucną25, jednak jest to znacznie trudniejsze u myszy ze względu na jej mniejszy rozmiar i konieczność utrzymania normotermii podczas operacji. Niemniej jednak badanie izolowanego ciepłego niedokrwienia jest ważne, ponieważ jest ono na ogół bardziej szkodliwe dla funkcji narządów niż zimne niedokrwienie 4,5,6. Co więcej, ośrodki transplantacyjne coraz częściej stosują przeszczepy płuc z DCD, którym towarzyszą znacznie dłuższe czasy niedokrwienia niż w przypadku tradycyjnych przeszczepów płuc DBD7. Dlatego szczegółowe badanie zdarzeń podczas ciepłego niedokrwienia i następującego po nim okresu reperfuzji ma kluczowe znaczenie i można je przeprowadzić za pomocą tego modelu zacisku wnękowego.
W ciągu ostatnich kilku dekad powstało wiele odmian techniki zacisku wnękowego. Należą do nich użycie atraumatycznego zacisku mikronaczyniowego 8,9,10,11,12,13, opaski uciskowej Rumel14,15 oraz krawata z węzłem wokół wnęki16. Opisujemy naszą adaptację techniki slipknot u myszy. Główną przewagą tej techniki nad innymi technikami zaciskania wnęki jest to, że pozwala na zamknięcie klatki piersiowej w okresie niedokrwienia, co minimalizuje niewyczuwalne straty płynów, szczególnie w protokołach z dłuższymi okresami niedokrwienia. Nie można tego osiągnąć, gdy zacisk lub opaska uciskowa jest umieszczona na wnęce.
Jeśli chodzi o dobór zwierząt, zdecydowaliśmy się opracować ten model na myszach, w przeciwieństwie do modeli szczurów lub dużych zwierząt, takich jak świnie. Uzasadnienie jest dwojakie - nasze laboratorium ma duże doświadczenie w mikrochirurgii myszy z ortotopowym przeszczepem płuc myszy17. Po drugie, podczas gdy myszy są mniejsze i trudniejsze technicznie do operowania niż szczury, obecnie istnieje więcej dostępnych na rynku transgenicznych szczepów myszy niż szczepów szczurzych26,27. Myszy rozmnażają się również szybciej, co pozwala na szybszy rozwój nowych szczepów, co jest szczególnie przydatne podczas badania mechanizmów immunologicznych IRI. Z tych powodów zdecydowaliśmy się opracować tę technikę na myszach.
O ile nam wiadomo, jest to pierwszy artykuł oparty na filmie, w którym zastosowano technikę zacisku wnękowego lewego płuca u myszy z węzłem ślizgowym. Saito i inni opublikowali artykuł oparty na filmie, w którym demonstrują zacisk wnękowy u szczura za pomocą zacisku mikronaczyniowego22. U myszy Liao i wsp. opublikowali model IRI płuc z zaciskiem tętnicy płucnej (PA) za pomocą węzła, jednak płuco pozostaje wentylowane w tym modelu, ponieważ oskrzela są wyłączone z zacisku28. Technika zaciskania PA została wykorzystana jako model do badania zatorowości płucnej29, nadciśnienia płucnego i/lub niewydolności prawej komory 30,31. Ponieważ obszarem badań jest IRI płuc w transplantacji, zdecydowaliśmy się zacisnąć całą wnękę, w tym oskrzela, aby zminimalizować barotraumę na szczycie urazu niedokrwiennego.
Warto zauważyć, że wybrano 30 minut ciepłego niedokrwienia, a następnie 1 godzinę reperfuzji, ponieważ interesuje nas dynamika komórek naciekających płuca w bardzo wczesnym okresie po IRI. Na przykład badania wykazały zwiększenie poziomu genów cytoprotekcyjnych, takich jak oksygenaza hemowa 1, już po 30 minutach niedokrwienia, a następnie po 2 godzinach reperfuzji13. Wcześniej uważano, że neutrofile są centralnym typem komórek naciekających płuca po IRI32, jednak wykazaliśmy, że monocyty poprzedzają neutrofile w ich przybyciu do płuc18,24. Niedawno odkryliśmy, że limfocyty B poprzedzają nawet monocyty i dostają się do płuc w ciągu 1 godziny od reperfuzji (dane niepublikowane). Dostosowując tę technikę, czas trwania ciepłego niedokrwienia i reperfuzji można dostosować zgodnie z pytaniem badawczym i hipotezą. Dłuższe okresy ciepłego niedokrwienia są możliwe bez obawy o nadmierną utratę płynów i ciepła, ponieważ w tym okresie klatka piersiowa może być zamknięta.
W okresie okołooperacyjnym może wystąpić kilka powikłań, a ostatecznym częstym wynikiem jest śmierć okołooperacyjna. Zaobserwowaliśmy, że częstość zgonów zwierząt podczas operacji zmniejsza się wraz z powtórzeniami techniki przez chirurga. Szacujemy, że chirurdzy potrzebują co najmniej 2 miesięcy praktyki i/lub co najmniej 20 przypadków, aby osiągnąć plateau umiejętności. W tym momencie szacujemy, że śmiertelność śródoperacyjna występuje w około 1 na 50 przypadków. Śmierć u znieczulonej myszy jest często zwiastowana przez agonalne oddechy, które obejmują silne skurcze przepony i mięśni ściany klatki piersiowej. Po rozpoczęciu tych agonalnych oddechów śmierć nastąpi w ciągu 3-5 minut, jeśli nie zostanie podjęta żadna interwencja. Istnieje kilka przyczyn, które mogą przyspieszyć śródoperacyjną śmierć, z których wiele można rozpoznać i którym można zapobiec. Poniżej przedstawimy kluczowe etapy tej operacji i techniki rozwiązywania problemów, aby osiągnąć pomyślny wynik.
Intubacja Pierwszym krytycznym krokiem jest staranna intubacja i zabezpieczenie dróg oddechowych, aby zapobiec przypadkowej ekstubacji. W przypadku operacji przetrwania szczególnie ważne jest, aby upewnić się, że struny głosowe nie zostaną uszkodzone podczas początkowej intubacji, ponieważ mysz nie będzie w stanie oddychać po ekstubacji. Przesuwanie ETT poza przewody powinno odbywać się pod bezpośrednią wizualizacją za pomocą mikroskopu. Jeśli podczas intubacji napotkany zostanie opór, ETT nie powinien być wysuwany na ślepo. Trzymając ustno-gardło otwarte za pomocą zacisku na komary, należy uważać, aby nie przebić błony śluzowej jamy ustnej, ponieważ krew zasłania widok dróg oddechowych. Liczba prób intubacji powinna być ograniczona do mniej niż pięciu.
Przypadkowa ekstubacja Jeśli w którymkolwiek momencie zabiegu płuca wydają się nie napełniać prawidłowo, możliwe, że ETT uległ przemieszczeniu. Innym przejawem przypadkowej ekstubacji, który pozostaje niezauważony przez dłuższy czas, jest nagłe rozpoczęcie oddychania agonalnego u myszy. Po wstępnej intubacji należy zadbać o to, aby przymocować ETT do nosa obwodowo za pomocą jedwabnej taśmy, a regulacja szyi i tułowia myszy powinna być ograniczona. Jeśli ani lewy, ani prawy płuco nie są nadmuchiwane, ETT mógł wydostać się z tchawicy. Można podjąć próby wepchnięcia ETT z powrotem, jednak mysz może wymagać szybkiej ponownej intubacji, aby uniknąć przedwczesnej śmierci zwierzęcia. Jeśli tylko jedno płuco napełnia się, gdy oczekuje się, że oba, ETT może być zbyt głęboki i należy go ostrożnie cofnąć i ponownie zabezpieczyć.
Mobilizacja płuc Mobilizację lewego płuca należy wykonać za pomocą aplikatorów z bawełnianą końcówką z delikatnym naciskiem na miąższ płuca, ponieważ uraz uciskowy może uszkodzić pęcherzyki płucne i zmniejszyć podatność płuc. Płuc nie należy chwytać kleszczami ani zaciskami, ponieważ spowoduje to uszkodzenie miąższu płuca.
Zastosowanie zacisku wnękowego Lewy zacisk wnękowy należy umieścić pod bezpośrednią wizualizacją, uważając, aby nie ułożyć węzła zbyt centralnie (aby nie zahaczyć o lewy przedsionek) lub zbyt obwodowo (aby nie zahaczyć o miąższ płuca). Złapanie lewego przedsionka za pomocą zacisku wnękowego prawdopodobnie przyspieszy migotanie przedsionków, a następnie śmierć. Wizualizację wnęki można poprawić, zapewniając odpowiednie cofnięcie żebra w celu poszerzenia pola widzenia. Po zawiązaniu węzła ślizgowego warto upewnić się, że zacisk jest całkowicie okluzyjny, wykonując manewr rekrutacyjny - poprzez ręczne zamknięcie rurki odpływowej łączącej ETT z respiratorem i upewnienie się, że lewe płuco nie rozszerza się pod wpływem nadciśnienia. Zakłada się, że niedrożność naczyń krwionośnych jest potwierdzona niedrożnością oskrzeli, biorąc pod uwagę zwiększoną zapadalność tętnicy płucnej i żył w porównaniu z oskrzelami chrzęstnymi. Dodatkowo zacisk wnękowy nie powinien być wiązany z nadmierną siłą, ponieważ zmiażdży on chrzęstne części lewego oskrzela głównego pnia i zapobiegnie rozszerzaniu się lewego płuca po zwolnieniu zacisku wnękowego. Po zwolnieniu zacisku wnękowego ważne jest, aby sprawdzić, czy płuco nadal może być wentylowane, wykonując kolejny manewr rekrutacyjny.
Zapięcie na klatce piersiowej Zamykając klatkę piersiową, 4. i 5. żebro powinny być złączone, gdy płuco jest w maksymalnym wdechu końcowym. Zminimalizuje to ilość powietrza pozostającego w jamie opłucnej, co spowoduje powstanie odmy opłucnowej po zamknięciu żeber. Warstwy mięśniowe i skóra powinny być zamknięte w sposób szczelny, aby uniknąć rozwoju odmy opłucnowej napięciowej.
Uzyskiwanie ABG Wreszcie, przy uzyskiwaniu ABG, ważne jest, aby najpierw zacisnąć prawą wnękę, tak aby pomiar ABG odzwierciedlał tylko czynność lewego płuca22,23. Bez prawego zacisku wnękowego, normalnie wentylowane prawe płuco z nawiązką zrekompensuje uszkodzone niedokrwienne lewe płuco, a pomiary ABG będą wyglądały normalnie.
Podsumowując, technika zacisku wnękowego, którą opisaliśmy powyżej, jest cennym narzędziem do badania przeszczepu płuc i, co ważne, może wyizolować badanie ciepłego IRI bez wprowadzania allogeniczności, urazu związanego z zespoleniem chirurgicznym lub przechowywania w zimnym niedokrwieniu. Warto zauważyć, że ta opisana technika mocowania wnęki jest łatwa do nauczenia i szeroko stosowana oraz może prowadzić do wiarygodnych i powtarzalnych wyników.

<a href="https://app.jove.com/t/6603">This corrects</a> the article <a href="https://dx.doi.org/10.3791/66232">10.3791/66232</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/66232">Murine Left Pulmonary Hilar Clamp Model of Lung Ischemia Reperfusion Injury</a>. The Protocol and Representative Results&#160;sections were&#160;updated.

Erratum: Murine Left Pulmonary Hilar Clamp Model of Lung Ischemia Reperfusion Injury

IRI podczas przeszczepu narządu jest głównym czynnikiem ryzyka pierwotnej dysfunkcji przeszczepu i późniejszych epizodów odrzucenia przeszczepu1,2. Podczas przeszczepu ciepły czas niedokrwienia definiuje się jako okres od zacisku krzyżowego aorty dawcy do rozpoczęcia zimnej perfuzji i od usunięcia narządu z lodu do implantacji narządu. Czas przechowywania w chłodni jest definiowany jako okres czasu od rozpoczęcia zimnej perfuzji do usunięcia narządu z ice3. Ciepłe niedokrwienie jest bardziej szkodliwe dla późniejszego funkcjonowania narządów niż zimne niedokrwienie4,5,6, a jego mechanizmy uzasadniają dalsze badania w modelach przedklinicznych. Dodatkowo, przeszczepienie narządu od dawcy po śmierci sercowej (DCD) wiąże się z dłuższym ciepłym czasem niedokrwienia niż tradycyjne dawstwo po śmierci mózgu (DBD)7. Chociaż wykorzystanie dawców DCD może rozszerzyć pulę dawców i zwiększyć wykorzystanie płuc, potrzebne są dalsze badania przedkliniczne w celu oceny wpływu ciepłego niedokrwienia na czynność płuc po przeszczepie. Poniżej opisujemy model ciepłego IRI u myszy przez lewy zacisk wnęki płucnej.
W ciągu ostatnich kilku lat opracowano i dostosowano kilka zwierzęcych modeli zaciskania wnęk płuc i które mogą obejmować użycie atraumatycznego zacisku mikronaczyniowego8,9,10,11,12,13, opaska uciskowa Rumel 14,15, lub podwiązanie szwów 16 jako zacisk wnękowy. Istotą zacisku wnękowego jest to, że musi on być odwracalny i powodować minimalne lub żadne uszkodzenie struktur wnęki, aby można było osiągnąć reperfuzję. Tutaj opisujemy naszą technikę zaciskania wnęki u myszy, która polega na odwracalnym podwiązaniu szwem lewej wnęki płucnej za pomocą węzła ślizgowego. Ta metoda zamyka dopływ tętnicy płucnej, odpływ żylny oraz przepływ powietrza do i z oskrzeli głównych. Główną zaletą węzła ślizgającego się na zacisku naczyniowym, klipsie lub opasce uciskowej jest to, że klatkę piersiową można zamknąć podczas długotrwałych okresów niedokrwienia, minimalizując w ten sposób niewyczuwalne straty płynów i ciepła u myszy. Udostępniamy protokół do uzyskania wiarygodnych pomiarów gazometrii krwi tętniczej (ABG) oraz do pomiaru wynaczynienia komórek po zaciśnięciu wnęki.
Ta technika zacisku wnękowego zajmuje ważne miejsce w szerszym badaniu transplantacji płuc. W porównaniu z modelami ortotopowymi płuc na małych zwierzętach, technika klamry wnękowej może izolować efekty IRI bez dodawania chirurgicznego urazu zespolenia lub allogeniczności17. Dodatkowo, technika zacisku wnękowego może być łatwiejsza i szybciej opanowana niż przeszczep płuc myszy. W rzeczywistości, przy użyciu technik zacisku wnękowego, w ciągu ostatniej dekady zidentyfikowano kilka ważnych mechanizmów w patogenezie IRI, takich jak TLR4, oksydaza NADPH i receptor adenozyny A2A14,18,19,20. W poniższym protokole przedstawiamy wiarygodną, możliwą do nauczenia i powtarzalną metodę zaciskania wnęki jako narzędzia do badania IRI płuc.

<table><tbody><tr><td>Leki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10% roztwór jodu powidonu</td><td>Aplicare</td><td>NDC 52380-0126-2</td><td>Do środka dezynfekującego</td></tr><tr><td>Buprenorfina 1,3 mg/ml</td><td>Fidelis Animal Health</td><td>NDC 86084-100-30</td><td>Do kontroli bólu</td></tr><tr><td>Carprofen</td><td>Cronus Pharma</td><td>NDC 69043-027-18</td><td>Do kontroli bólu</td></tr><tr><td>Heparyna 1000 jednostek/ml</td><td>Sagent</td><td>NDC 25021-404-01</td><td>Do pozyskiwania krwi tętniczej</td></tr><tr><td>Izofluran 1%-1,5%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>26675-46-7</td><td>Do znieczulenia</td></tr><tr><td>Chlorowodorek ketaminy 100 mg/ml</td><td>Vedco</td><td>NDC 50989-996-06</td><td>Do znieczulenia</td></tr><tr><td>Puralube Weterynaryjna maść do oczu</td><td>Medi-Vet.com</td><td>11897</td><td>Aby zapobiec wysuszeniu oczu</td></tr><tr><td>Ksylazyna 20 mg / ml</td><td>Akorn</td><td>NDC 59399-110-20</td><td>Do kontroli bólu</td></tr><tr><td>Narzędzia i instrumenty</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Argent High Temp Fine Tip Cautery Pen</td><td>McKesson</td><td>231</td><td>Do koagulacji naczyń krwionośnych</td></tr><tr><td>Zakrzywiony zacisk na komary</td><td>Fine Science Tools</td><td>13009-12</td><td>Do zabiegu chirurgicznego</td></tr><tr><td>Drobne zakrzywione kleszcze</td><td>Fine Science Tools</td><td>11274-20</td><td>Do chirurgii procedura</td></tr><tr><td>Cienkie nożyczki</td><td>Fine Science Tools</td><td>15040-11</td><td>Do zabiegu chirurgicznego</td></tr><tr><td>Konfiguracja zacisku do intubacji</td><td>Fine Science Tools</td><td>18374-44, 18144-30</td><td>Do trzymania myszy pionowo za język podczas intubacji. Patrz rysunek uzupełniający 1A.&nbsp;</td></tr><tr><td>Magnetyczne zwijacze żeber</td><td>Fine Science Tools</td><td>18200-01, 18200-10</td><td>Do retrakcji torakotomii. Stabilizator magnetyczny i zwijacz powinny być połączone rurką z mikrolateksu poniżej.</td></tr><tr><td>Światłowód z tworzywa sztucznego klasy optycznej bez osłony, 500 i mu; m</td><td>Edmund Optics</td><td>02-532</td><td>Aby wykonać wprowadzacz do rurki dotchawiczej. Patrz rysunek uzupełniający 1B. Długość tego światłowodu o długości 1,5 cala powinna mieć kawałek jedwabnej taśmy przymocowany do jednego końca. Następnie może być stosowany jako wprowadzacz do rurki dotchawiczej. Koniec wprowadzacza powinien być lekko zakrzywiony.</td></tr><tr><td>Maszynka do strzyżenia Power Pro Ultra</td><td>Oster</td><td>078400-020-001</td><td>Do strzyżenia włosów</td></tr><tr><td>Nożyczki</td><td>Fine Science Tools</td><td>14370-22</td><td>Do zabiegu chirurgicznego</td></tr><tr><td>Poduszka grzewcza dla małych zwierząt</td><td>K& H Produkty dla zwierząt Podgrzewana</td><td>podkładka Thermo-Peep</td><td>Aby utrzymać normotermię Wentylator</td></tr><tr><td>dla małych zwierząt</td><td>Harvard Apparatus</td><td>55-0000</td><td>Do wentylacji (TV 0,35 cc, PEEP 1 cm H2O, RR 100-105/min, FiO2 100%)</td></tr><tr><td>Rurka z gumy lateksowej Spearit Micro (1/8 średnicy zewnętrznej, 1/16 średnicy wewnętrznej)</td><td>Amazon.com</td><td>https://www.amazon.com/Rubber-Tubing-CONTINUOUS-Select-Length/dp/B00H4MT7V0?th=1</td><td>Do zwijania torakotomia</td></tr><tr><td>Profil statystyczny Analizator parametrów krytycznych krwi Prime Critical Care</td><td>Nova Biomedical</td><td>https://novabiomedical.com/prime-plus-critical-care-blood-gas-analyzer/index.php?=1&gclid=Cj0KCQjwmICoBhDx ARIsABXkXlInZX--R3ezBkc304nS_GVGI9Z2T3Esr33 2aM8WGPiUVhicPQZ Wj2AaAqhDEALw_wcB&nbsp; &nbsp;</td><td>Do cofnięcia torakotomii</td></tr><tr><td>Prosty zacisk</td><td>Fine Science Tools</td><td>13008-12</td><td>Do zabiegu chirurgicznego</td></tr><tr><td>Kleszcze proste</td><td>Fine Science Tools</td><td>91113-10</td><td>Do zabiegu chirurgicznego</td></tr><tr><td>Mikroskop chirurgiczny</td><td>Wild Heerbrugg</td><td>nie jest już produkowany</td><td>Do intubacji i zabiegu chirurgicznego; zaleca się wymianę na mikroskopy chirurgiczne Leica</td></tr><tr><td>Supplies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&frac12; strzykawka cc z igłą &frac12; cal 29G</td><td>McKesson</td><td>942665</td><td>Do wstrzykiwania ketaminy/ksylazyny dootrzewnowo</td></tr> <tr><td>&frac12; calowa igła 31G na strzykawce tuberkulinowej o pojemności 1 cm3</td><td>McKesson</td><td>16-SNT1C2705</td><td>Do aspiracji krwi tętniczej z lewej komory</td></tr><tr><td>1-calowy cewnik dożylny 20G</td><td>Terumo</td><td>SROX2025CA</td><td>Do rurki dotchawiczej (ETT)</td></tr><tr><td>1-calowy jedwab taśma</td><td>Durapore</td><td>3M ID 7100057168</td><td>Do przyklejania ETT do nosa i zabezpieczania kończyn</td></tr><tr><td>Strzykawka 3/10 cc z igłą 5/16 cala 31G</td><td>McKesson</td><td>102-SN310C31516P</td><td>Do wstrzykiwania przeciwciał do żyły głównej dolnej</td></tr> szew <tr><td>monofilamentowy 6-0 na igle P-10</td><td>McKesson</td><td>S697GX</td><td>Do zamykania torakotomii, warstwy mięśniowej i skóry</td></tr><tr><td>6-0 jedwabny krawat</td><td>Specjalizacje chirurgiczne Wygląd</td><td>SP102</td><td>Do wykonania slipknot na zacisk wnękowy</td></tr><tr><td>Spiczaste aplikatory z bawełnianą końcówką</td><td>Solon</td><td>56225</td><td>Do manipulowania płucami i do rozwarstwiania</td></tr></tbody></table>

mysi lewy klamra płucny hilar clamp urazu reperfuzyjnego niedokrwienia płuc

Murine Left Pulmonary Hilar Clamp Model of Lung Ischemia Reperfusion Injury

Niedokrwienne uszkodzenie reperfuzyjne (IRI) podczas przeszczepu płuc jest głównym czynnikiem ryzyka powikłań po przeszczepie, w tym pierwotnej dysfunkcji przeszczepu, ostrego i przewlekłego odrzucenia przeszczepu oraz śmiertelności. Wysiłki mające na celu zbadanie podstaw IRI doprowadziły do opracowania wiarygodnego i powtarzalnego mysiego modelu zaciskania wnęki w lewym płucu. Model ten polega na zabiegu chirurgicznym wykonywanym na znieczulonej i zaintubowanej myszy. Wykonywana jest torakotomia lewa, a następnie ostrożna mobilizacja płuc i wypreparowanie lewej wnęki płucnej. Zacisk wnękowy polega na odwracalnym podwiązaniu szwem wnęki płucnej za pomocą węzła ślizgowego, który zatrzymuje dopływ tętniczy, odpływ żylny i przepływ powietrza przez lewe oskrzela pniowe. Reperfuzja rozpoczyna się od starannego usunięcia szwu. Nasze laboratorium wykorzystuje 30 minut niedokrwienia i 1 godzinę reperfuzji dla modelu eksperymentalnego w obecnych badaniach. Jednak te okresy czasu mogą być modyfikowane w zależności od konkretnego pytania eksperymentalnego. Bezpośrednio przed ofiarą, gazometrię krwi tętniczej można pobrać z lewej komory po 4-minutowym okresie zaciskania prawej wnęki, aby upewnić się, że uzyskane wartości PaO2 są przypisywane wyłącznie uszkodzonemu lewemu płucu. Opisujemy również metodę pomiaru wynaczynienia komórek za pomocą cytometrii przepływowej, która polega na dożylnym wstrzyknięciu przeciwciała znakowanego fluorochromem specyficznego dla badanej komórki (komórek) przed uśmierceniem. Lewe płuco można następnie pobrać do cytometrii przepływowej, zamrożonej lub utrwalonej, immunohistochemii zatopionej w parafinie i ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy. Ta technika zacisku wnękowego pozwala na szczegółowe badanie mechanizmów komórkowych i molekularnych leżących u podstaw IRI. Reprezentatywne wyniki wskazują na zmniejszone natlenienie lewego płuca i histologiczne dowody uszkodzenia płuc po zaciśnięciu wnęki. Technika ta może być łatwo nauczona i odtworzona przez personel z doświadczeniem mikrochirurgicznym i bez niego, co prowadzi do wiarygodnych i spójnych wyników oraz służy jako szeroko stosowany model do badania IRI płuc.

Po zacisnięciu lewego wnęki płuca, ciśnienie parcjalne tlenu w krwi tętniczej (PaO2) przypisane do lewego płuca wynosi ~100 mmHg, co jest wartością znacznie niższą w porównaniu do ~500 mmHg po torakotomii pozorowanej (Rycina 7A, n=6-7). Należy zauważyć, że torakotomie pozorowane przeprowadzono u myszy B6, a pomiar gazometrii krwi tętniczej wykonano po 4 min zacisnięcia prawej wnęki, co reprezentuje wartości przypisane wyłącznie do lewego płuca. Barwienie H&amp;E lewego płuca z zacisniętą wnęką wykazało naciek komórek zapalnych wypełniających drogi oddechowe oraz przekrwienie naczyń krwionośnych erytrocytami, podczas gdy znaleziska te nie występują w naiwnym lewym płucu (Rycina 7B, n=2). Wyniki te demonstrują natychmiastowe uszkodzenie tkanki i infiltrację komórkową po okresie niedokrwienia i reperfuzji.
Zgodnie z opisem w kroku 6, neutrofile wewnątrznaczyniowe i śródmiąższowe można odróżnić poprzez dożylny wtrysk przeciwciał anty-Ly6G znakowanych FITC na 5 min przed uśmierceniem zwierzęcia, a następnie znakowanie wszystkich neutrofili przeciwciałami APC-Ly6G18,24. Reprezentatywne wykresy pokazują, że po zaklemowaniu wnęki lewego płuca około 75% neutrofili znajduje się w naczyniach (APC-Ly6G+FITC-Ly6G+), a około 25% jest rozmieszczonych w śródmiąższu (APC-Ly6G+FITC-Ly6G-) (Rysunek 7C, n=4). Wyniki te stanowią wiarygodną metodę oceny ekstrawazacji neutrofili i mogą być dostosowane do innych typów komórek w zależności od zastosowanych przeciwciał (np. anty-Ly6C dla monocytów, anty-CD19 dla limfocytów B). Technika ta jest przydatna w badaniu dynamiki komórkowej po IRI.
<img alt="Przygotowanie do zabiegu chirurgicznego u gryzonia: etapy znieczulenia myszy; dopływ/odpływ cewnika; schemat procedury weterynaryjnej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66232/66232fig1v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Intubacja myszy. (A) Mysz z ogoloną lewą stroną klatki piersiowej i brzucha. (B) Rurka endotrachealna połączona z przewodami respiratora. (C) Po potwierdzeniu intubacji rurkę należy przymocować taśmą do nosa myszy, owijając ją dookoła. (D) Zaintubowana mysz z przewodami dopływowymi i odpływowymi od i do respiratora dla małych zwierząt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66232/66232fig1v2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Procedura chirurgiczna u gryzonia, dostęp międzyżebrowy, krok po kroku, metodologia badawcza, procedura." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66232/66232fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Lewostronna torakotomia. (A) Nacięcie skóry nad 4tą przestrzenią międzyżebrową (ICS). (B) Rozdzielenie warstw mięśni nad 4tą przestrzenią międzyżebrową. (C) Wykonanie małego nacięcia tuż nad 5tym żebrem. (D) Przedłużenie nacięcia w kierunku przednim i tylnym w 4tej ICS. (E) Wizualizacja płuca w 4tej ICS. (F-G) Umieszczenie rozwieraczy żeber. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66232/66232fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Procedura chirurgiczna demonstrująca odsłonięcie płuca z identyfikacją wnęki w układzie eksperymentalnym." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66232/66232fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Zacisk wnęki lewej. (A) Mobilizacja lewego płuca za pomocą tamponów bawełnianych. (B) Wizualizacja dolnej więzadła płucnego (IPL). (C) Po odsunięciu lewego płuca do przodu, jedwabna nić jest umieszczana za wnęką. (D) Po odsunięciu lewego płuca do tyłu nad jedwabną nicią, widoczna jest przednia część wnęki. (E) Zawiązanie instrumentem węzła poślizgowego na wnęce lewej. (F) Węzeł poślizgowy na wnęce. (G) Przy manualnej okluzji odpływu lewe płuco nie nadmuchuje się, co wskazuje na prawidłowe założenie zacisku wnęki. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66232/66232fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Procedura chirurgiczna na klatce piersiowej szczura; krok po kroku nacinanie i szycie, żebra oznaczone, sześć kadrów." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66232/66232fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Zwolnienie zacisku w obrębie lewego wnęki płucnej i zamknięcie lewej klatki piersiowej. (A) Po zwolnieniu węzła poślizgowego lewe płuco zostaje ponownie napowietrzone. (B) Zamknięcie żeber za pomocą jednego szwu tuż nad 4tym żebrem i (C) jednego szwu tuż nad 6tym żebrem. (D-E) Klatka piersiowa zamknięta jednym szwem zawiązanym w końcowej fazie wdechu. (F) Zamknięcie skóry szwami przerywanymi (po zamknięciu warstwy mięśniowej szwem ciągłym). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66232/66232fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Dostęp chirurgiczny podczas sekcji zwierzęcia; dostęp do organów wewnętrznych, opisane struktury; do celów edukacyjnych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66232/66232fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Laparotomia, obustronna torakotomia typu „clamshell” i pobieranie krwi tętniczej. (A) Mysz ułożona w pozycji grzbietowej. (B) Nacięcie skóry wykonane wzdłuż linii środkowej brzucha. (C) Laparotomia rozciągająca się od wyrostka mieczowatego do spojenia łonowego, z przedłużeniem w lewo i w prawo wzdłuż najniższego żebra. (D-E) Otwarcie przepony w celu wejścia do jamy klatki piersiowej, z przedłużeniem nacięcia przepony w lewo i w prawo wzdłuż najniższego żebra (linia przerywana). (F) Obustronna torakotomia typu „clamshell” z nacięciami w przednich liniach pachowych (linia przerywana) w kierunku szczytu klatki piersiowej. (G) Płat dodatkowy prawego płuca rozciągający się do lewej klatki piersiowej za żyłą główną dolną. (H) Płat dodatkowy zmobilizowany i przeniesiony z powrotem do prawej klatki piersiowej. (I) Aspiracja krwi tętniczej z lewej komory (wstawka: różnica w kolorze między prawą a lewą komorą). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66232/66232fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schematy techniki chirurgicznej przedstawiające odsłonięcie żyły głównej dolnej (IVC) w modelu gryzoni do badań." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66232/66232fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6: Wstrzyknięcie dożylne do żyły głównej dolnej. (A) Prawostronna przyśrodkowa rotacja trzewna w celu odsłonięcia żyły głównej dolnej (IVC). (B) Wstrzykiwanie roztworu do IVC. (C) Wywieranie nacisku na IVC w celu uzyskania hemostazy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66232/66232fig06large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Efekt zacisku wnęki; wykres słupkowy, obrazy histologiczne, wykres rozrzutu; torakotomia; poziom tlenu; cytometria przepływowa." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66232/66232fig07.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 7"> 
Rycina 7Reprezentatywne wyniki utlenowania płuc, badania histologicznego oraz ekstrawazacji neutrofili po zastosowaniu zacisku na lewy korzeń płuca. (A) Ciśnienie parcjalne tlenu we krwi tętniczej myszy C57BL/6 po pozorowanej torakotomii w porównaniu z zaciskiem wnęki płucnej. Wyniki przedstawiono jako średnia ± SEM, n=6-7. p wartości obliczone testem U Manna-Whitneya U test. **p &lt;0.01. (B) H&amp;Barwienie E przekroju płuca myszy C57BL/6 utrwalonego w formalinie i zatopionego w parafinie po przeprowadzeniu pozorowanej torakotomii w porównaniu z zaciskiem wnęki płucnej. Pasek skali oznacza 250 µm. (C) Reprezentatywny rysunek rozkładu wewnątrznaczyniowego (APC-Ly6G+FITC-Ly6G+) vs. pozanaczyniowe (APC-Ly6G+FITC-Ly6G-) Neutrofile Ly6G+ u myszy C57BL/6 po zaciskaniu wnęki płuca. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66232/66232fig07large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Rycina uzupełniająca 1: Wprowadnik do rurki endotrachealnej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66232/Supplemental_Figure_1_updated.pdf" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Protokół przedstawia wykonalną, niezawodną i powtarzalną metodę zaciskania wnęki lewej płucy, która może być wykorzystana do badania uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego płuc w modelach mysich.

Mysi lewy klamra płucny Hilar Clamp Urazu Reperfuzyjnego Niedokrwienia Płuc

Ischemia reperfusion injury (IRI) during lung transplantation is a major risk factor for post-transplant complications, including primary graft ...

Jesteśmy zainteresowani badaniem wpływu uszkodzenia reperfuzyjnego niedokrwiennego na wyniki po przeszczepie płuc w celu zrozumienia podstawowych mechanizmów komórkowych i molekularnych. Neutrofile, które dostają się do płuc, przyczyniają się do uszkodzenia reperfuzyjnego niedokrwiennego lub IRI. Niedawno odkryliśmy, że limfocyty B wprowadzają neutrofile do płuc i odgrywają rolę w rekrutacji neutrofili po IRI.Przeszczep lewego płuca u myszy jest trudny technicznie i wymaga pełnoetatowego szkolenia przez kilka miesięcy, aby osiągnąć spójne wyniki. Dodatkowo wprowadza alergenność i chirurgiczny uraz zespolenia. Dlatego potrzebujemy bardziej dostępnej techniki, która może wyizolować badanie uszkodzenia reperfuzyjnego niedokrwiennego.Korzystając z naszego modelu klamry wnękowej, odkryliśmy, że limfocyty B dostają się do płuc wcześnie po uszkodzeniu reperfuzyjnym niedokrwiennym i rekrutują klasyczne monocyty w receptorze komórek B w sposób zależny od TLR4. To ostatecznie prowadzi do zwiększonego wynaczynienia neutrofili do płuc. Nasz protokół zakłada odwracalne podwiązanie szwem lewej wnęki płucnej za pomocą węzła poślizgowego.Giętki i dyskretny charakter szwu pozwala na zamknięcie klatki piersiowej, co jest przydatne do badania dłuższych okresów ciepłego niedokrwienia, ponieważ zamknięcie klatki piersiowej minimalizuje ciepło i niewyczuwalne straty płynów u myszy. Na początek umieść znieczuloną i zaintubowaną mysz w prawej bocznej pozycji odleżynowa. Weź obie przednie łapy do lewego górnego rogu, a tylną łapę do dolnych rogów.Przed nacięciem zdezynfekuj lewą klatkę piersiową 70% alkoholem. Po nacięciu i otwarciu skóry nad czwartą przestrzenią międzyżebrową, użyj ręcznego pisaka kauterycznego, aby koagulować widoczne naczynia krwionośne w warstwie podskórnej i mięśniowej. Za pomocą nożyczek podziel mięśnie najszersze grzbietu i mięśnie zębate przednie wzdłuż długości nacięcia skóry.Ostrożnie podnieś czwarte żebro za pomocą pary drobno zakrzywionych kleszczy. Wykonaj punktowe cięcie tuż nad piątym żebrem, aby wejść do czwartej przestrzeni międzyżebrowej. Gdy ujemne ciśnienie w jamie opłucnej zostanie utracone, a płuco wycofa się ze ściany klatki piersiowej, należy przedłużyć torakotomię do przodu i do tyłu w czwartej przestrzeni międzyżebrowej.Zastosuj dwa zwijacze żeber, aby rozłożyć przestrzeń żeber, upewniając się, że okno robocze o powierzchni co najmniej jednego centymetra kwadratowego jest dostępne do wizualizacji. Użyj dwóch spiczastych aplikatorów z bawełnianą końcówką, aby podnieść głowę i zmobilizować lewe płuco. Następnie tępo podziel półprzezroczyste dolne więzadło płucne.Odbij płuco do przodu, aby uwidocznić tylną lewą wnękę płucną. Następnie odetnij około 10 centymetrów jedwabnego krawata 6-0 i umieść środek krawata z tyłu od wnęki. Teraz odwróć lewe płuco do tyłu nad krawatem i pociągnij oba końce krawata do przodu.Trzymaj zakrzywiony zacisk na komary w dominującej ręce, a parę kleszczy w drugiej ręce. Przytrzymaj jeden wolny koniec A opaski kleszczami i przeciągnij jego środek na zamknięty zacisk raz. Następnie chwyć zacisk za środek drugiego wolnego końca B i pociągnij obiema rękami, aby zacisnąć węzeł poślizgowy.Po zawiązaniu węzła B powinien mieć pętelkę od węzła, natomiast A powinien być prosty. Aby potwierdzić odpowiednią niedrożność oskrzeli, należy ręcznie zatkać rurkę odpływową z rurki dotchawiczej do respiratora. Nie spowoduje to napompowania lewego płuca.Następnie zamknij nacięcie skóry jednym lub dwoma prostymi przerywanymi szwami wykonanymi za pomocą nylonowego szwu 6-0. Po wymaganym okresie niedokrwienia delikatnie pociągnij za koniec B opaski, aby zwolnić węzeł poślizgowy. Natychmiast rozpocznij reperfuzję i zatkaj rurkę odpływową rurki dotchawiczej do respiratora, aby ponownie napompować płuca.Podczas reperfuzji zamknij czwartą przestrzeń żebrową pojedynczym szwem nylonowym 6-0. Umieść mysz w pozycji leżącej na plecach 15 do 20 minut przed końcem czasu reperfuzji. Zabezpiecz wszystkie cztery kończyny taśmą.Po wykonaniu laparotomii w linii środkowej należy rozszerzyć laparotomię w lewo i w prawo do linii pachowej zgodnie z krzywizną dolnego najbardziej wysuniętego żebra. Z brzucha wykonaj nacięcie na przedniej przeponie, aby wejść do klatki piersiowej. Następnie przedłuż nacięcie po lewej i prawej stronie przedniej linii pachowej wzdłuż dolnego najbardziej żeber.Podziel obustronne żebra wzdłuż przedniej linii pachowej. Rozszerz się w górę, aby utworzyć torakotomię z klapką. Teraz odbij przednią ścianę klatki piersiowej w górę, aby odsłonić serce i obustronne płuca.Następnie przyłóż zacisk do przedniej ściany klatki piersiowej, aby ułatwić wycofanie. Użyj zakrzywionego zacisku na komary w linii środkowej, aby cofnąć membranę w dół, aby uzyskać lepszą wizualizację klatki piersiowej. Następnie zwróć płat akcesoriów, który wystaje poza linię środkową, do lewej klatki piersiowej i z powrotem do prawej klatki piersiowej.Za pomocą aplikatora z bawełnianą końcówką i nożyczek podziel cienkie więzadło łączące płat z lewą klatką piersiową. Odbijaj całe płuco do przodu. Następnie umieść kolejny jedwabny krawat 6-0 z tyłu do prawej wnęki.Zawiąż węzeł poślizgowy wokół prawej wnęki, upewniając się, że wszystkie cztery płaty prawego płuca są otoczone. Następnie zakoduj półcalową igłę o rozmiarze 31 na jednej strzykawce tuberkulinowej CC z 200 mikrolitrami heparyny. Po czterech minutach zaciskania prawej wnęki pobrać krew tętniczą z lewej komory do strzykawki.Skieruj igłę w kierunku lewej szyi. Może być konieczne wielokrotne nakłucie w celu uzyskania wystarczającej ilości krwi do oceny ABG. Zaciśnięcie lewej wnęki skutkowało istotnym obniżeniem ciśnienia parcjalnego tlenu w lewym płucu w stosunku do torakotomii pozorowanej.Ocena ABG wykazała, że większość neutrofili znajdowała się wewnątrznaczyniowo po zaciśnięciu wnęki w lewym płucu.

murine-left-pulmonary-hilar-clamp-model-lung-ischemia-reperfusion

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Uraz chirurgiczny wywołuje odpowiedź zapalną. Wiadomo, że cytokiny i ligandy endogenne modulują wielkość zawału mięśnia sercowego po niedokrwieniu i reperfuzji. Przedstawiamy zmodyfikowany model niedokrwienia i reperfuzji u myszy z zamkniętą klatką piersiową, wykorzystujący obciążniki wiszące w celu zminimalizowania efektów torakotomii.

Mysi model zamkniętoklatkowy niedokrwienia i reperfuzji mięśnia sercowego

Wprowadzamy metodę chirurgiczną do wywoływania eksperymentalnego uszkodzenia niedokrwienia/reperfuzji (I/R) symulującego zawał mięśnia sercowego (MI) w modelach mysich, co pozwala na większą przejrzystość w umiejscowieniu podwiązania na lewej tętnicy zstępującej przedniej (LAD) w celu zwiększenia powtarzalności eksperymentów MI u myszy.

Mysi model uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego mięśnia sercowego poprzez podwiązanie lewej tętnicy zstępującej przedniej

Unikalny model zacisku wnękowego wątroby szczura został opracowany do badania wpływu cząsteczek farmakologicznych na łagodzenie uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego. Model ten obejmuje bezpośrednią kaniulację dopływu wrotnego do niedokrwionego segmentu wątroby przez odgałęzienie żyły wrotnej, co pozwala na bezpośrednie dostarczenie wątrobowe.

Metoda bezpośredniego segmentalnego dostarczania dowątrobowego przy użyciu modelu klamry Hilar wątroby szczura

Tutaj opisujemy zabieg chirurgiczny pokazujący, jak osiągnąć trwałe podwiązanie lewej przedniej zstępującej tętnicy wieńcowej u myszy. Model ten ma duże znaczenie dla badania patofizjologii zawału mięśnia sercowego i towarzyszących mu procesów biologicznych.

Mysi model zawału mięśnia sercowego z wykorzystaniem trwałego podwiązania lewej przedniej zstępującej tętnicy wieńcowej

Szczegółowo opisujemy klinicznie istotny model raka jelita grubego z przerzutami do wątroby (CRLM) oraz wpływ reperfuzji niedokrwienia wątroby (I/R) na wzrost guza i przerzuty. Model ten może pomóc w lepszym zrozumieniu mechanizmów leżących u podstaw indukowanego przez operację wzrostu przerzutów do wątroby.

Mysi model przerzutowych guzów wątroby w warunkach uszkodzenia reperfuzyjnego niedokrwiennego

Model niedokrwienno-reperfuzyjny serca szczura został ulepszony dzięki zastosowaniu samodzielnie wykonanego retraktora, rurki z polichlorku winylu i unikalnej metody wiązania. Wyniki elektrokardiogramu, chlorku trifenylotetrazolu i barwienia histologicznego oraz analizy procentowej przeżycia wykazały, że ulepszona grupa modelowa ma wyższe wskaźniki sukcesu i przeżycia niż już istniejąca grupa modelowa.

Ulepszony model niedokrwienia mięśnia sercowego i uszkodzenia reperfuzyjnego u gryzoni

Mysi model chirurgiczny do tworzenia uszkodzenia reperfuzyjnego niedokrwienia lewego płuca (IR) przy jednoczesnym utrzymaniu wentylacji i unikaniu niedotlenienia.

Mysi model intubacji jamy ustnej i tchawicy i wentylowanej operacji reperfuzji niedokrwienia płuc

Przedstawiono tutaj zabieg chirurgiczny trwałego podwiązania lewej tętnicy wieńcowej u myszy. Model ten można wykorzystać do zbadania patofizjologii i związanej z nią odpowiedzi zapalnej po zawale mięśnia sercowego.

Podwiązanie lewej tętnicy wieńcowej: chirurgiczny mysi model zawału mięśnia sercowego

W badaniu opisano model ostrego uszkodzenia płuc po niedokrwieniu trzewnym-reperfuzji podczas krzyżowego zaciskania aorty przez nadceliakię za pomocą laparotomii u szczurów. Umożliwia badanie zarówno klinicznych, jak i biologicznych skutków zaciskania aorty, a także wpływu niedokrwienno-reperfuzyjnego na leżące poniżej narządy i odległe urazy płuc.

Model ostrego uszkodzenia płuc po reperfuzji niedokrwienia trzewnego za pomocą krzyżowego zaciskania aorty nadceliakialnej u szczurów

Opisujemy modele umiarkowanego i ciężkiego uszkodzenia nerek wywołanego niedokrwieniem i reperfuzją, w których myszy przechodzą jednostronne zaciskanie szypułki nerki, po którym następuje równoczesna lub opóźniona nefrektomia przeciwległa. Modele te konsekwentnie powodują dysfunkcję nerek i zwłóknienie pourazowe, ale ciężkość urazu i przeżycie zależą od pochodzenia myszy, wieku i sprzętu chirurgicznego.

Model niedokrwienno-reperfuzyjny ostrego uszkodzenia nerek i zwłóknienia pourazowego u myszy

Poznaj metodę zaciskania lewego wnętrza płucnego w myszy do badania uszkodzenia niedokrwiennego niedokrwienia płuc. Protokół ten pozwala izolować rolę neutrofili i komórek B w mechanizmach immunologicznych.

Mysi lewy klamra płucny Hilar Clamp Urazu Reperfuzyjnego Niedokrwienia Płuc

Przeglądaj więcej filmów