Name: Wysokoprzepustowa ocena przesiewowa wytwarzania reaktywnych form tlenu (ROS) przy użyciu barwnika fluorescencyjnego Dihydroethidium (DHE) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-19T14:20:00.000+00:00
Duration: 5 min 16 s
Description: Poznaj metodę wysokoprzepustowego pomiaru reaktywnych form tlenu w liniach komórkowych raka wątroby przy użyciu fluorescencyjnej sondy DHE. Ta technika umożliwia ilościową analizę superorodników w badaniach toksykologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

RK i RRG były wspierane przez grant z UNM Center for Metals in Biology and Medicine (CMBM) poprzez grant NIH NIGMS P20 GM130422. RRG zostało wsparte przez pilotażową nagrodę z grantu NM-INSPIRES P30 1P30ES032755. Wsparcie rdzenia obrazowania dla instrumentu CX7 Cellomics zostało zapewnione przez rdzenie centrum AIM ufundowane przez grant NIH P20GM121176. Chcielibyśmy podziękować dr Sharinie Desai i dr Li Chen za ich nieocenioną pomoc w kwestiach technicznych związanych z korzystaniem z platformy obrazowania CX7 Cellomics.

1. Hodowla komórkowa
<ol>
	<li>Wysiewaj badane komórki (komórki raka wątrobowokomórkowego HepG2, HUH7 i JHH4) na 96-dołkową płytkę o gęstości wysiewu 10 000 komórek/dołek w końcowej objętości wysiewu 200 μl na dołek.
	<ol>
		<li>Przed hodowlą komórek HepG2 należy pokryć 96 dołków płytkowych kolagenem typu IV (50 μg/ml) przez 2 godziny w temperaturze pokojowej (RT). Aby uniknąć zestalenia kolagenu podstawowego, umieść roztwór podstawowy w lodzie, a następnie rozpocznij proces rozcieńczania do pożądanego stężenia.</li>
		<li>Po 2 godzinnym okresie inkubacji odessać nadmiar kolagenu i trzykrotnie umyć studzienki 1x PBS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Hodować komórki w zmodyfikowanym podłożu Eagle (DMEM) firmy Dulbecco przez noc w temperaturze 37 °C i stężeniu 5% CO2 w wilgotnym inkubatorze.</li>
	<li>Następnego dnia lub po osiągnięciu zbiegu 80%-90%, w zależności od tego, co nastąpi wcześniej, należy potraktować komórki odpowiednioH2O2(nieleczone, 250 μM, 500 μM, 750 μM i 1000 μM) i menadionem (nieleczone, 25 μM, 50 μM, 75 μM, 100 μM) przez 30 minut, aby wywołać reprezentatywny stres oksydacyjny.</li>
	<li>Alternatywnie, można zdecydować się na badanie komórek z użyciem pożądanej substancji badanej z wyboru, zdolnej do wywołania stresu oksydacyjnego w komórkach.</li>
</ol>
2. Przygotowanie roztworu podstawowego i rozcieńczonego do barwienia komórek DHE
<ol>
	<li>Przygotować roztwór podstawowy DHE (5 mg/ml lub 15,9 mM), rozpuszczając 5 mg DHE w 1 ml DMSO.</li>
	<li>Rozcieńczyć roztwór podstawowy DHE podwójnie destylowaną wodą w autoklawie do końcowego stężenia 100 μM.</li>
	<li>Aby uniknąć procesu zamrażania i rozmrażania barwnika (który z czasem może uszkodzić właściwości fluorescencyjne), należy przygotować kilka porcji w probówkach wirówkowych o pojemności 1,5 ml o stężeniu 100 μM i przechowywać je w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Aby osiągnąć końcowe stężenie robocze 10 μM, należy użyć podwielokrotności stężenia 100 μM DHE i rozcieńczyć ją wstępnie podgrzaną pożywką DMEM. 
	UWAGA: Roztwór roboczy musi być przygotowany świeży w dniu eksperymentu.</li>
	<li>Wirować roboczy roztwór barwnika fluorescencyjnego przez 5-10 sekund, aby zapewnić prawidłowe wymieszanie barwnika.</li>
</ol>
3. Proces barwienia DHE
<ol>
	<li>Usunąć pożywkę zawierającą lek lub substancję badaną z każdej studzienki i przemyć ją delikatnie raz za pomocą 1x PBS lub DMEM. 
	UWAGA: Podczas wykonywania etapów dodawania lub przemywania w eksperymencie ważne jest, aby unikać bezpośredniego kontaktu między komórkami a pipetorem. Można to osiągnąć poprzez delikatne pipetowanie PBS wzdłuż boków studzienek, aby zminimalizować potencjalne uszkodzenia mechaniczne komórek. Upewnienie się, że pipetor nie styka się bezpośrednio z komórkami, pomoże utrzymać integralność i żywotność komórek przez cały czas trwania eksperymentu.</li>
	<li>Dodać 100 μl pożywki DMEM zawierającej 10 μM DHE (roztwór roboczy) do każdej studzienki i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut.</li>
	<li>Po 30 minutowym okresie inkubacji usunąć pożywkę zawierającą DHE i delikatnie umyć każdą studzienkę trzy razy solą fizjologiczną buforowaną 1x fosforanem (PBS). Można to zrobić za pomocą pipety wielokanałowej, aby zapewnić szybką realizację.</li>
	<li>Dodaj 200 μl 1x PBS do każdej studzienki z barwnikiem barwiącym jądrowym Hoechst 33342 przez 10 minut w temperaturze stężonej temperatury.</li>
	<li>Usunąć roztwór do barwienia jądrowego Hoechst 33342 ze studzienki i dodać 200 μl 1x PBS do każdej studzienki. 
	UWAGA: Aby uzyskać stałe komórki, postępuj zgodnie z tym samym protokołem, co w przypadku żywych komórek, z jednym dodatkowym krokiem polegającym na dodaniu 4% PFA przez 5 minut po leczeniu i barwieniu DHE. Usuń roztwór PFA i umyj komórki 1x PBS. Następnie inkubuj komórki z barwnikiem barwiącym jądro przez 10 minut.</li>
	<li>Przenieś płytkę na platformę przesiewową o wysokiej zawartości, mikroskopię fluorescencyjną lub czytnik płytek w celu jak najszybszego uzyskania obrazu.</li>
</ol>
4. Akwizycja obrazu i pomiar intensywności
<ol>
	<li>Załadunek płyt
	<ol>
		<li>Otwórz oprogramowanie Cellomics CX7 do przesiewania o wysokiej zawartości (HCS) w celu uzyskania danych.</li>
		<li>Ostrożnie skalibruj platformę obrazowania zgodnie ze specyfikacjami producenta z wyprzedzeniem za pomocą specjalnej płytki 96-dołkowej do użytku, aby uniknąć zamglonych lub rozmytych obrazów w danych. 
		UWAGA: Płytki wielodołkowe od różnych dostawców mogą mieć różne właściwości materiałowe i mogą wpływać na jakość uzyskiwanych ostatecznych obrazów.</li>
		<li>Po kalibracji należy zapisać parametry systemu specyficzne dla marki płyty w bazie danych przyrządu i ponownie wykorzystać je do przyszłego pozyskiwania danych.</li>
		<li>Ostrożnie umieścić płytkę z przygotowanymi próbkami na podgrzewanym stoliku systemu obrazowania HCS. Upewnij się, że płytka jest bezpiecznie umieszczona i we właściwej orientacji do obrazowania na uchwycie mikropłytki (tj. zlokalizuj etykietę oznaczoną A1 na stoliku czytnika, a następnie obróć mikropłytkę tak, aby położenie studzienki A1 pasowało do rogu z naklejką).</li>
		<li>Delikatnie dociśnij mikropłytkę, aby upewnić się, że opiera się płasko o stolik. Nierównomierne wypoziomowanie płytki w systemie HCS może prowadzić do błędów w pozyskiwaniu obrazu.</li>
		<li>Po umieszczeniu blachy na miejscu naciśnij i przytrzymaj Ctrl, a następnie kliknij Ctrl-OK w oknie dialogowym Załaduj/Rozładuj blachę w oprogramowaniu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dobór parametrów obrazowania
	<ol>
		<li>W systemie obrazowania HCS otwórz tryb Target Activation w interfejsie bioaplikacji Cellomics i utwórz nowy protokół przy użyciu dwukanałowego protokołu konfiguracji zgodnego z (a) barwieniem jądrowym i (b) akwizycją danych sondy fluorescencyjnej DHE. W obecnym protokole filtry 386_BGSRS_BGSRS, 480_BGS_RS i 386_BGS_RS były używane odpowiednio do (a) barwienia jądrowego Hoechst 33342, (b) całkowitej produkcji ROS i (c) wykrywania rodników ponadtlenkowych. Wybór tych filtrów był podyktowany specyficznym nakładaniem się właściwości emisyjnych każdego barwnika (DAPI i DHE) użytego w ramach tego protokołu. 
		UWAGA: Konwencja nazewnictwa filtrów, np. 386-23_BGRFRN_BGRFRN, odnosi się do wzbudzenia próbki światłem 386 nm o szerokości pasma 23 nm, po którym następuje filtr dichroiczny, który przepuszcza światło niebieskie (B), zielone (G), czerwone (R), dalekie czerwone (FR) i bliską podczerwień (N) w określonych zakresach długości fal, a 386_BGS_RS odnosi się do filtra emisyjnego, który przepuszcza światło o długości fali emisji BGS i RS po dichroiku.</li>
		<li>W razie potrzeby określ cele procesu akwizycji obrazu w interfejsie protokołu oprogramowania, takie jak powiększenie 10x lub 20x.</li>
		<li>Wybierz odpowiednie powiększenie obiektywu w zależności od pożądanego poziomu szczegółowości obrazowania i rozdzielczości niezbędnych do eksperymentu. Jednak rozdzielczość każdego celu jest stała. Szczegółowość w wyższej rozdzielczości będzie wymagała zmiany celu na platformie. W obecnym protokole używany jest obiektyw 20x, 0,45 NA, który jest częścią platformy przesiewowej o wysokiej zawartości używanej w tym protokole. 
		UWAGA: Obiektyw 20x stanowi dobry kompromis między szczegółowością rozdzielczości obrazowania a szybkością akwizycji niezbędną do uchwycenia zmian ROS w czasie. Można wybrać obiektywy o większym powiększeniu (np. 40X), jednak doprowadzi to do wydłużenia czasu akwizycji.</li>
		<li>Określ ustawienia ekspozycji kamery do akwizycji obrazu, takie jak czas ekspozycji, łączenie kamery w kategoryzację i interwał stosu z, zgodnie z określonymi wymaganiami protokołu. 
		UWAGA: Czas ekspozycji (często w milisekundach) różni się w zależności od siły sygnału i czułości określonych użytych fluoroforów. Może się to również nieznacznie różnić w zależności od eksperymentu w zależności od stężenia barwnika i jakości barwienia. W obecnym protokole parametry akwizycji są ustalone w następujący sposób - Target % - 35%, tryb akwizycji obrazu - 1104 x 1104 (z binningiem 2x2), a obiektyw 20x, 0,45 NA. Parametry te mogą być ustalane zgodnie ze szczególnymi warunkami doświadczalnymi.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Parametry konfiguracji obrazowania 
	UWAGA: Po ustawieniu parametrów obrazowania proces zbierania obrazu może zostać zainicjowany za pomocą interfejsu oprogramowania.
	<ol>
		<li>Parametry kolekcji obrazów
		<ol>
			<li>Zidentyfikuj główny obiekt śledzący będący przedmiotem zainteresowania (jądro komórek) za pomocą różnych algorytmów dostępnych w instrumencie (optyka - izodane, stała i trójkąt). 
			UWAGA: W niniejszym protokole stosowana jest metoda isodanych do identyfikacji i oznaczania obiektu podstawowego.</li>
			<li>Podziel obiekt na segmenty (jeśli istnieje) według kształtu lub parametru intensywności.</li>
			<li>Zweryfikuj obiekt podstawowy na podstawie żądanych parametrów rozmiaru, kształtu i intensywności unikalnych dla każdego typu komórki.</li>
			<li>Następnie zdefiniuj "obszar zainteresowania" (ROI) wokół tego obiektu podstawowego. 
			UWAGA: ROI jest kluczowym parametrem pozyskiwania danych, który określa miejsce, w którym intensywność barwnika fluorescencyjnego jest identyfikowana jako spójna i powtarzalna we wszystkich typach komórek. ROI określa kluczowe parametry (takie jak intensywność barwnika), które są mierzone dla każdego głównego obiektu śledzącego (tj. komórki) w różnych kanałach instrumentu. ROI można zdefiniować w postaci koła lub pierścienia wokół jądra każdej komórki. Oprogramowanie HCS automatycznie uzyskuje intensywność markera barwnika fluorescencyjnego DHE w kanale 2 w granicach zwrotu z inwestycji dla każdej komórki, która jest segmentowana i analizowana w sposób zautomatyzowany.</li>
			<li>Ustaw okrąg o średnicy 20 μm wokół głównego obiektu (jądra). Odległość 20 μm została wybrana w tym badaniu na podstawie przybliżonych rozmiarów różnych linii komórkowych użytych w tym protokole (HepG2, JHH-4 i HUH-7). Pierścień ROI o średnicy 20 μm wokół komórek uzyskał intensywność fluorescencji w sposób spójny i powtarzalny. 
			UWAGA: Kluczowym parametrem przy wyborze ROI jest zdolność do odpowiedniego pokrycia obszaru komórki; rozmiar okrągłego zwrotu z inwestycji zależy od rozmiaru komórki. Większe ogniwa mogą wymagać większego zwrotu z inwestycji i odwrotnie, aby uzyskać mniejszy zwrot z inwestycji. Parametry te należy określić z wyprzedzeniem dla każdego typu ogniwa i barwnika fluorescencyjnego, który jest przedmiotem zainteresowania.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Charakterystyka populacji i wybór cech do przechowywania
	<ol>
		<li>Po zdefiniowaniu różnych parametrów akwizycji w protokole obrazowania HCS należy przełączyć system HCS w tryb akwizycji danych.</li>
		<li>Parametry akwizycji obrazu dla tego protokołu zostały ustawione w następujący sposób: limit skanowania wynoszący 1000 komórek/studzienkę, z minimalnym wymaganiem 10 obiektów (komórek) na pole. 
		UWAGA: Liczba pól ocenianych dla każdej studni została określona na podstawie końcowej liczby komórek, która osiągnęła liczbę 1000. System HCS kontynuuje przeszukiwanie różnych miejsc w studni, aż uzyska docelową populację 1000 komórek/studzienkę. Szybkość akwizycji zależy zatem od konfluencji i całkowitej liczby komórek obecnych w każdym dołku 96-dołkowej płytki. W obecnym protokole całkowita i średnia intensywność kanału 2 (reprezentująca rodniki ponadtlenkowe i całkowitą produkcję ROS) została pobrana z każdego odwiertu w celu dalszych analiz.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przechwytywanie, przetwarzanie i analiza obrazu
	<ol>
		<li>Po dostosowaniu i sfinalizowaniu parametrów akwizycji obrazu rozpocznij proces skanowania dla każdej płytki 96-dołkowej. 
		UWAGA: System obrazowania Cellomics CX7 umożliwia badania przesiewowe o wysokiej zawartości i zautomatyzowaną analizę próbek o różnych parametrach, w tym produkcję ROS w komórkach w sposób wysokoprzepustowy. Oprócz produkcji ROS, system HCS jest w stanie dostarczyć dodatkowych cennych informacji o różnych parametrach, takich jak morfologia komórki, lokalizacja subkomórkowa i wiele innych interesujących cech komórkowych. Po zoptymalizowaniu pod kątem akwizycji platforma obrazowania HCS pozwala na kompleksową, jakościową i ilościową charakterystykę parametrów komórek w solidny sposób.</li>
		<li>Po zakończeniu procesu skanowania uruchom oprogramowanie View Analysis i wyeksportuj różne parametry danych ilościowych w formacie .csv w celu przeprowadzenia dodatkowej analizy.</li>
		<li>Korzystając z oprogramowania innych firm, skopiuj i wklej różne interesujące Cię wartości ilościowe w celu przeprowadzenia dodatkowych analiz. 
		UWAGA: W obecnym protokole oprogramowanie GraphPad Prism zostało użyte do analizy wartości intensywności DHE w odpowiedzi na indukowany stres oksydacyjny spowodowany ekspozycją naH2O2i menadion.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dane i analiza statystyczna
	<ol>
		<li>Obliczyć średnią średnią intensywność kanału 2 (reprezentującą całkowite wartości ROS i rodniki ponadtlenkowe). 
		UWAGA: Wszystkie eksperymenty mające na celu obliczenie wartości intensywności powtórzono trzykrotnie z 6 powtórzeniami na warunek na każdym poziomie dawkowania.</li>
		<li>Wykonaj jednoczynnikowy test ANOVA lub test t, aby zmierzyć różnice w wartościach intensywności między różnymi warunkami testowymi.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Novel ROS Quantification Using Dihydroethidium in Liver Cancer Cells

<ol><li>Juan, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemistry+of+reactive+oxygen+species+%28ros%29+revisited%3A+Outlining+their+role+in+biological+macromolecules+%28DNA%2C+Lipids+and+Proteins%29+and+induced+pathologies%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">The chemistry of reactive oxygen species (ros) revisited: Outlining their role in biological macromolecules (DNA, Lipids and Proteins) and induced pathologies.</a> Int J Mol Sci. 22 (9), 4642(2021).</li>
<li>Magnani, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+mechanisms+of+ROS+generation+by+NADPH+oxidases%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Structure and mechanisms of ROS generation by NADPH oxidases.</a> Curr Opin Struct Biol. 59, 91-97 (2019).</li>
<li>Collin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+basis+of+reactive+oxygen+species+reactivity+and+involvement+in+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Chemical basis of reactive oxygen species reactivity and involvement in neurodegenerative diseases.</a> Int J Mol Sci. 20 (10), 2407(2019).</li>
<li>Uttara, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+and+neurodegenerative+diseases%3A+a+review+of+upstream+and+downstream+antioxidant+therapeutic+options%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Neuropharmacol%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress and neurodegenerative diseases: a review of upstream and downstream antioxidant therapeutic options.</a> Curr Neuropharmacol. 7 (1), 65-74 (2009).</li>
<li>Dikalov, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+paramagnetic+resonance+measurements+of+reactive+oxygen+species+by+cyclic+hydroxylamine+spin+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxid+Redox+Signal%22%5BJournal%5D)">Electron paramagnetic resonance measurements of reactive oxygen species by cyclic hydroxylamine spin probes.</a> Antioxid Redox Signal. 28 (15), 1433-1443 (2018).</li>
<li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+reactive+oxygen+species+%28ROS%29+and+mitochondrial+ROS+in+AMPK+knockout+mice+blood+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Measurement of reactive oxygen species (ROS) and mitochondrial ROS in AMPK knockout mice blood vessels.</a> Methods Mol Biol. 1732, 507-517 (2018).</li>
<li>Griendling, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+reactive+oxygen+species%2C+reactive+nitrogen+species%2C+and+redox-dependent+signaling+in+the+cardiovascular+system%3A+a+scientific+statement+from+the+American+Heart+Association%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Measurement of reactive oxygen species, reactive nitrogen species, and redox-dependent signaling in the cardiovascular system: a scientific statement from the American Heart Association.</a> Circ Res. 119 (5), e39-e75 (2016).</li>
<li>Kalyanaraman, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+reactive+oxygen+and+nitrogen+species+with+fluorescent+probes%3A+challenges+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Measuring reactive oxygen and nitrogen species with fluorescent probes: challenges and limitations.</a> Free Radic Biol Med. 52 (1), 1-6 (2012).</li>
<li>Gomes, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+probes+used+for+detection+of+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biochem+Biophys+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescence probes used for detection of reactive oxygen species.</a> J Biochem Biophys Methods. 65 (2-3), 45-80 (2005).</li>
<li>Halliwell, B., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHalliwell%2C+B+%22Free+radicals+in+biology+and+medicine%22">Free radicals in biology and medicine</a>. , Oxford University Press, Oxford Academic. USA. (2015).</li>
<li>Cho, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence-based+detection+and+quantification+of+features+of+cellular+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescence-based detection and quantification of features of cellular senescence.</a> Methods Cell Biol. 103, 149-188 (2011).</li>
<li>Dikalov, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+detection+of+mitochondrial+and+cellular+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxid+Redox+Signal%22%5BJournal%5D)">Methods for detection of mitochondrial and cellular reactive oxygen species.</a> Antioxid Redox Signal. 20 (2), 372-382 (2014).</li>
<li>Kalyanaraman, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+developments+in+detection+of+superoxide+radical+anion+and+hydrogen+peroxide%3A+Opportunities%2C+challenges%2C+and+implications+in+redox+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">Recent developments in detection of superoxide radical anion and hydrogen peroxide: Opportunities, challenges, and implications in redox signaling.</a> Arch Biochem Biophys. 617, 38-47 (2017).</li>
<li>Robinson, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+fluorescent+imaging+of+superoxide+in+vivo+using+ethidium-based+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Selective fluorescent imaging of superoxide in vivo using ethidium-based probes.</a> Proc Natl Acad Sci U.S.A. 103 (41), 15038-15043 (2006).</li>
<li>Zielonka, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+2-hydroxyethidium+in+cellular+systems%3A+a+unique+marker+product+of+superoxide+and+hydroethidine%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Detection of 2-hydroxyethidium in cellular systems: a unique marker product of superoxide and hydroethidine.</a> Nat Protoc. 3 (1), 8-21 (2008).</li>
<li>Nazarewicz, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+specific+measurements+of+superoxide+using+fluorescence+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Screen%22%5BJournal%5D)">Rapid and specific measurements of superoxide using fluorescence spectroscopy.</a> J Biomol Screen. 18 (4), 498-503 (2013).</li>
<li>Murphy, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+measuring+reactive+oxygen+species+and+oxidative+damage+in+cells+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Metab%22%5BJournal%5D)">Guidelines for measuring reactive oxygen species and oxidative damage in cells and in vivo.</a> Nat Metab. 4 (6), 651-662 (2022).</li>
<li>Ameziane-El-Hassani, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+reactive+oxygen+species+in+cells+undergoing+oncogene-induced+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene-Induced+Senescence%3A+Methods+Protoc%22%5BJournal%5D)">Detection of reactive oxygen species in cells undergoing oncogene-induced senescence.</a> Oncogene-Induced Senescence: Methods Protoc. 1534, 139-145 (2017).</li>
<li>Abraham,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+content+screening+applied+to+large-scale+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">High content screening applied to large-scale cell biology.</a> Trends Biotechnol. 22 (1), 15-22 (2004).</li>
<li>Criddle, D. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Menadione-induced+reactive+oxygen+species+generation+via+redox+cycling+promotes+apoptosis+of+murine+pancreatic+acinar+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Menadione-induced reactive oxygen species generation via redox cycling promotes apoptosis of murine pancreatic acinar cells.</a> J Biol Chem. 281 (52), 40485-40492 (2006).</li>
<li>Goffart, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+type+and+source+of+reactive+oxygen+species+influences+the+outcome+of+oxidative+stress+in+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">The type and source of reactive oxygen species influences the outcome of oxidative stress in cultured cells.</a> Cells. 10 (5), 1075(2021).</li>
<li>Kurutas, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+antioxidants+which+play+the+role+in+cellular+response+against+oxidative%2Fnitrosative+stress%3A+current+state%5BTitle%5D)+AND+%22Nutr+J%22%5BJournal%5D)">The importance of antioxidants which play the role in cellular response against oxidative/nitrosative stress: current state.</a> Nutr J. 15 (1), 71(2015).</li>
<li>Shad, K. F., Das, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introductory+Chapter%3A+Role+of+Fenton+and+Haber-Weiss+Reaction+in+Epilepsy%5BTitle%5D)+AND+%22Epilepsy-Seizures+without+Triggers.+IntechOpen%22%5BJournal%5D)">Introductory Chapter: Role of Fenton and Haber-Weiss Reaction in Epilepsy.</a> Epilepsy-Seizures without Triggers. IntechOpen. , (2023).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają sprzecznych interesów.

W tym badaniu ustalono protokół oceny wewnątrzkomórkowej reaktywnej produkcji tlenu (ROS) napędzanej ponadtlenkami przy użyciu barwnika fluorescencyjnego dihydroetydyny (DHE) w systemie przesiewowym o wysokiej zawartości. Większość obecnych protokołów dostępnych w literaturze wykorzystuje DCFH-DA jako sondę obrazowania fluorescencyjnego do ilościowego oznaczania gatunków ROS. Jednak wiele badań wykazało, że DCFH-DA nie jest idealną sondą do pomiaru wewnątrzkomórkowego ROS. Różne powody postulowane dla nieprzydatności DCFH-DA jako sondy obejmują - (i) DCFH-DA nie wykazuje bezpośredniej reakcji z H2O2 , co czyni go nieodpowiednim barwnikiem do oceny wewnątrzkomórkowego poziomu H2O2. (ii) Kilka jednoelektronowych form utleniających, takich jak OH, NO2. i ONOO-, utlenia DCFH do DCF. (iii) metale przejściowe, cytochrom c i peroksydaza hemowa mogą sprzyjać utlenianiu DCFH w obecności tlenu iH2O2. (iv) Co najważniejsze, DCFH-DA wytwarza produkt pośredni DCFH.- / DCF., który w obecności tlenu indukuje produkcję dodatkowego ponadtlenku. Dysmutacja z O2.- generuje dodatkoweH2O2, co może skutkować sztucznym wzrostem intensywności fluorescencji i błędnie podwyższonymi poziomami ROS. Wielu autorów uznało zastosowanie DCFH-DA za zawodną sondę fluorescencyjną do wykrywania wewnątrzkomórkowychH2O2i innych gatunków ROS 8,9,10,11,12,13,14.
W przeciwieństwie do DCFH-DA, DHE reaguje specyficznie z rodnikiem ponadtlenkowym, prowadząc do wytworzenia produktu fluorescencyjnego, 2-hydroksyyetidu (2-OH E+). Nieponadtlenkowe formy ROS mogą również reagować z DHE, tworząc drugi produkt fluorescencyjny, etydynę (E+). Podczas gdy widma fluorescencji 2-OH-E+ i E+ są stosunkowo podobne, te dwie cząsteczki reprezentują produkty końcowe specyficznych interakcji między wewnątrzkomórkowymi gatunkami ROS a DHE i są odpowiedzialne za całkowitą intensywność fluorescencji obserwowaną w komórkach z powodu stresu oksydacyjnego. Niektóre badania wykazały, że selektywne wzbudzenie przy krótszych długościach fal UV (<400 nm) może być bardziej specyficzne dla wzbudzenia etydyny 2-OH (w przeciwieństwie do E+), a tym samym produkcji rodników ponadtlenkowych 7,12,14. Oceniono to poprzez wzbudzenie ogniw samym światłem LED o długości fali 386 nm. W stosunku do wzbudzenia o długości fali 480 nm, przy długości fali 560 nm zaobserwowano zmniejszoną intensywność emisji (patrz rysunek uzupełniający 1 i rysunek uzupełniający 2). Nie można jednak być pewnym, że wynika to wyłącznie z samej fluorescencji 2-OH etydyny i stanowi potencjalną wadę obecnego podejścia. Inne badania wykazały, że wzbudzenie promieniowaniem UV (np. 386 nm) może również powodować jednoczesną emisję fluorescencji etydyny, choć na niższych poziomach w porównaniu z 2-OH etydyną 7,15. Niezależnie od tego, nasz protokół ustanawia DHE jako lepszą alternatywę dla barwnika do pomiaru różnic ilościowych większości wewnątrzkomórkowej produkcji ROS przy użyciu systemu obrazowania i badań przesiewowych o wysokiej zawartości. 
Postuluje się, że brak pośrednich czynników generujących ROS (takich jak te obserwowane w DCFH-DA) jest główną zaletą w stosowaniu DHE do oceny wewnątrzkomórkowej produkcji ROS. Jednak ten mechanizm fluorescencji DHE nie jest jeszcze mocno ustalony. W przypadkach, w których konieczne jest dokładne określenie ilościowe poziomów ROS, zaleca się stosowanie dodatkowych ortogonalnych metod walidacji ilościowej, takich jak metody HPLC i/lub chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas (LC-MS) w celu dokładnego oszacowania poziomów 2-OH-E+ w komórkach 8,9,13. Należy jednak mieć świadomość, że metody HPLC i LC-MS koniecznie obejmują agregację i solubilizację komórek w celu oceny. W związku z tym informacja czasoprzestrzenna zakodowana w metodzie obrazowania opartej na fluorescencji, tak jak w obecnym protokole, zostałaby utracona w HPLC i LC-MS i stanowi główną zaletę metod oceny ROS opartych na obrazowaniu. Dodatkową zaletą fluorescencji DHE z przesunięciem ku czerwieni jest to, że światło o dłuższej długości fali (w kolorze czerwonym) jest mniej toksyczne dla komórek ze względu na mniejszą energię przenoszoną przez światło czerwone.
Zależny od dawki charakter fluorescencji DHE w celu pomiaru względnych wewnątrzkomórkowych zmian ROS przetestowano przy użyciu menadionu i nadtlenku wodoru jako induktorów stresu oksydacyjnego. Menadion i nadtlenek wodoru zostały wybrane jako substancje badane ze względu na zmienne mechanizmy ROS i generowania stresu oksydacyjnego20,21. Podczas gdy produkcja ROS spowodowana ekspozycją na menadion, jest pośrednia (poprzez dysfunkcję mitochondriów), H2O2wytwarza stres oksydacyjny w bardziej bezpośredni sposób. Rosnące stężenia menadionu prowadziły do zwiększonej produkcji fluorescencji DHE w sposób liniowy, powtarzalny i zależny od dawki. Podobnie jak menadion,H2O2jest dobrze znanym induktorem ROS zdolnym do generowania rodników hydroksylowych (OH) poprzez chemię Fentona w bezpośredni sposób22. Liniową i zależną od dawki odpowiedź obserwowano podobnie we fluorescencji DHE z powodu ekspozycji naH2O2. Ze względu na selektywność DHE w stosunku do rodnika ponadtlenkowego, nie reaguje on bezpośrednio zH2O2. Zamiast tego wytworzone wewnątrzkomórkowe rodniki ponadtlenkowe początkowo reagują zH2O2, tworząc wtórne formy ROS, takie jak rodniki hydroksylowe w reakcjach Habera-Weissa i Fentona, które są następnie wykrywane przez fluorescencję DHE 23. Widmo emisji fluorescencji DHE w odpowiedzi na dwie różne substancje utleniające poprzez pomiar większości wewnątrzkomórkowej produkcji ROS ustalono w obecnym protokole 8,13. Wyniki te wskazują na użyteczność fluorescencyjnego barwnika DHE jako lepszej alternatywy dla wykrywania i kwantyfikacji wewnątrzkomórkowych poziomów ROS przy użyciu wysokoprzepustowych metod badań przesiewowych.
Doskonała selektywność, czułość i właściwości optyczne DHE sprawiają, że jest to cenna alternatywa do badania produkcji ROS i uszkodzeń oksydacyjnych w sposób wysokoprzepustowy, jak ustalono w obecnym protokole. Przyszłe badania w naszym laboratorium będą badać rolę DHE jako markera ROS w reaktywności krzyżowej między ROS a mechanizmami sygnalizacji komórkowej w różnych warunkach fizjologicznych i patologicznych w warunkach wysokiej przepustowości.

Reaktywne formy tlenu (ROS) to grupa naturalnie występujących, wysoce reaktywnych i czasowo niestabilnych rodników chemicznych powstałych jako część normalnego metabolizmu komórkowego w komórkach. ROS odgrywa kluczową i istotną rolę w modulacji prawidłowych procesów fizjologicznych i biochemicznych zachodzących w komórkach1,2. Głównym źródłem produkcji ROS w komórkach jest szlak mitochondrialnego łańcucha transportu elektronów (ETC) w ramach normalnego cyklu bioenergetycznego. Istotnymi dodatkowymi źródłami produkcji ROS są reakcje enzymatyczne, takie jak komórkowe oksydazy NADPH w komórkach. Metabolizm cząsteczek żywności (np. glukozy) zachodzi poprzez szlak fosforylacji oksydacyjnej w macierzy mitochondrialnej. Wyjściowy poziom produkcji ROS jest niezbędny do regulacji normalnych fizjologicznych procesów sygnalizacji komórkowej. Wiadomo, że wiele kluczowych cząsteczek białka, które są częścią metabolicznych szlaków sygnałowych glukozy (np. Akt i PTEN), reaguje na wewnątrzkomórkowe poziomy ROS. Ponadto ROS są wytwarzane przez różne enzymy wewnątrzkomórkowe, takie jak oksydaza ksantynowa, syntaza tlenku azotu i składniki peroksysomalne jako część komórkowych szlaków enzymatycznych1,2. W przeciwieństwie do naturalnych źródeł ROS, niektóre czynniki środowiskowe, takie jak ksenobiotyki, czynniki zakaźne, światło UV, zanieczyszczenia, palenie papierosów i promieniowanie, również prowadzą do nadmiernej produkcji ROS, które są kluczowym czynnikiem napędzającym wewnątrzkomórkowy stres oksydacyjny1,3. Podwyższony komórkowy stres oksydacyjny może powodować uszkodzenia natywnych biomolekuł wewnątrz komórki, takich jak lipidy, białka i DNA, powodując różne choroby, takie jak rak, cukrzyca, choroby układu krążenia, przewlekłe stany zapalne i zaburzenia neurodegeneracyjne1,3,4. Dlatego dokładne pomiary ROS są niezbędne do zrozumienia mechanizmów komórkowych zaangażowanych w patofizjologię chorób wywołanych stresem oksydacyjnym.
Ze względu na krótki czas produkcji i eliminacji ROS wewnątrz komórek, ilościowe pomiary różnych rodników ROS pozostają wyzwaniem. Metody takie jak elektronowy rezonans paramagnetyczny (EPR)5, wysokociśnieniowa chromatografia cieczowa (HPLC) i obrazowanie oparte na sondzie fluorescencyjnym są wykorzystywane do pomiaru różnych komórkowych ROS6. Podczas gdy metody takie jak EPR i HPLC dają ilościowo dokładne oszacowania, metody te wiążą się ze zniszczeniem morfologii przestrzennej komórki i zwykle mają postać globalnych i masowych pomiarów próbki. W przeciwieństwie do tego, metody oparte na obrazowaniu, takie jak metody oparte na sondzie fluorescencji, zachowują morfologię komórkową i kontekst przestrzenny generacji ROS. Jednak specyficzność różnych sond fluorescencyjnych dla różnych typów rodników ROS nie została dobrze ustalona7,8. Kilka sond fluorescencyjnych, takich jak dihydroethidium (DHE), dioctan dichlorodihydrofluoresceiny (DCFH-DA), dihydrorhodamina (DHR), dimetyloantracen (DMA), 2,7-dichlorodihydrofluresceina (DCFH), 1,3-difenylozobenzofuran (DPBF) i MitoSox są dostępne do wykrywania ROS. W ostatnich dziesięcioleciach DHE, MitoSox i DCFH-DA są powszechnie stosowanymi barwnikami fluorescencyjnymi do pomiaru ROS w komórkach i tkankach8,9. DCFH-DA jest szeroko stosowanym barwnikiem do wykrywania wewnątrzkomórkowegoH2O2i stresu oksydacyjnego. Pomimo popularności DCFH-DA, wiele wcześniejszych badań wykazało, że nie można go wiarygodnie wykorzystać do pomiaru wewnątrzkomórkowych poziomówH2O2i innych poziomów ROS8,9,10,11,12,13,14.
Natomiast sonda fluorescencyjna dihydroethidium (DHE) wykazuje specyficzną reakcję na wewnątrzkomórkowy rodnik ponadtlenkowy (O2-). Chociaż rodnik ponadtlenkowy jest jednym z wielu gatunków ROS obserwowanych w komórkach, jest ważnym rodnikiem biorącym udział w redukcji metali przejściowych, konwersji do nadtlenoazotanu i tworzeniu wodoronadtlenków, wśród innych efektów wewnątrzkomórkowych. DHE jest szybko wychwytywany przez komórki i ma emisję fluorescencji w czerwonym zakresie długości fal15. W reakcji z rodnikiem ponadtlenkowym, DHE tworzy czerwony produkt fluorescencyjny, 2-hydroksyetydynę (2-OH-E+). Tak więc, DHE może być uważany za specyficzną sondę do wykrywania ponadtlenkowego. Jednak DHE może również ulegać niespecyficznemu utlenianiu za pomocą ONOO- lub OH., H2O2i cytochromu c, tworząc drugi produkt fluorescencji, etydynę E+, który może zakłócać mierzone poziomy 2-OH-E+. Jednak te produkty 2-OH E+ i E+, w połączeniu, reprezentują główną część wszystkich komórkowych gatunków ROS obserwowanych wewnątrz komórki po zabarwieniu DHE. E+ interkaluje się z DNA, znacznie zwiększając jego fluorescencję8,9,10,11,13,14,15,16. Ponieważ widma fluorescencji etydyny i 2-hydroksyetydy różnią się tylko nieznacznie, większość poziomów ROS obserwowanych w komórce wtórnych do produkcji ponadtlenkowej można wykryć i zmierzyć za pomocą produktów fluorescencyjnych DHE. Te gatunki ROS są identyfikowane za pomocą wzbudzenia o długości fali 480 nm i emisji o długości fali 610 nm15,16,17.
Oprócz wyboru konkretnej sondy detekcyjnej ROS, ważne jest, aby wybrać czułą metodę wykrywania do pomiaru wewnątrzkomórkowego ROS. Dokładna ocena wewnątrzkomórkowych poziomów ROS jest zatem kluczem do identyfikacji zaburzonych stanów równowagi redoks występujących w komórkach chorych lub komórkach, które były narażone na różne stresory środowiskowe, takie jak promieniowanie, związki toksykologiczne i czynniki genotoksyczne18. Ponieważ ROS jest powszechnie występującym zjawiskiem w komórkach, które jest odpowiedzialne za regulację różnych czynności sygnalizacji komórkowej, niezbędne są solidne metody wykrywania ROS. Aby umożliwić tak wysokoprzepustową ocenę produkcji ROS w komórkach, protokół ten wykorzystuje platformę przesiewową o wysokiej zawartości (HCS) do pomiaru gatunków ROS. Obecny protokół pozwala na wysokoprzepustową analizę wewnątrzkomórkowej produkcji ROS, co ma kluczowe znaczenie w wielu badaniach toksykologicznych19. Protokół ten ma na celu zapewnienie łatwego i wszechstronnego rozwiązania do wykrywania i pomiaru wewnątrzkomórkowych ROS w przylegających komórkach raka wątrobowokomórkowego. Odczynniki chemiczneH2O2i menadionu są stosowane jako silne stymulatory ROS do pomiaru względnych poziomów produkcji ROS w kontrolowanych i wysokoprzepustowych warunkach. Protokół ten można dostroić w celu pomiaru produkcji ROS w komórkach przylegających i nieprzylegających w odpowiednich warunkach, w razie potrzeby.

<table><tbody><tr><td>Probówki wirówkowe 1,5 ml&nbsp;</td><td>Firma VWR&nbsp;</td><td>20170-038&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Płytka 96-dołkowa&nbsp;</td><td>Gwiazda Corning&nbsp;</td><td>07-200-90&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Cellomika Cx7</td><td>ThermoFisher&nbsp;</td><td></td><td></td>HCSDCX7LEDPRO</tr><tr><td>Kolagen&nbsp;</td><td>Zaawansowana biomatryca&nbsp; &nbsp;</td><td>5056&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>DHE (Dihydroethidium)&nbsp;</td><td>ThermoFisher&nbsp;</td><td>D1168&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>DMEM&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp; &nbsp;</td><td>6046&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>FBS&nbsp;</td><td>Firma VWR&nbsp;</td><td>97068-085&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism</td><td>GraphPad</td><td>Version 6.0</td><td></td></tr><tr><td>Linia komórkowa HepG2</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hoechst&nbsp;</td><td>ThermoFisher&nbsp;</td><td>33342&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Linia komórkowa HUH7</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nadtlenek wodoru&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>88597&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Linia komórkowa JHH4</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Menadione&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>M5625&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

wysokoprzepustowa ocena przesiewowa wytwarzania reaktywnych form tlenu (ros) przy użyciu barwnika fluorescencyjnego dihydroethidium (dhe)

High Throughput Screening Assessment of Reactive Oxygen Species (ROS) Generation using Dihydroethidium (DHE) Fluorescence Dye

Reaktywne formy tlenu (ROS) odgrywają kluczową rolę w regulacji metabolizmu komórkowego w procesach fizjologicznych i patologicznych. Fizjologiczna produkcja ROS odgrywa kluczową rolę w przestrzennej i czasowej modulacji normalnych funkcji komórkowych, takich jak proliferacja, sygnalizacja, apoptoza i starzenie się. Natomiast przewlekła nadprodukcja ROS jest odpowiedzialna za szerokie spektrum chorób, takich jak między innymi nowotwory, choroby układu krążenia i cukrzyca. Kwantyfikacja poziomów ROS w dokładny i powtarzalny sposób jest zatem niezbędna do zrozumienia normalnej funkcjonalności komórek. Metody obrazowania fluorescencyjnego do charakteryzowania wewnątrzkomórkowych gatunków ROS są powszechnym podejściem. Wiele protokołów obrazowania ROS w literaturze wykorzystuje barwnik dioctanu 2'-7'-dichlorodihydrofluoresceiny (DCFH-DA). Jednak barwnik ten cierpi na znaczne ograniczenia w jego użyciu i interpretowalności. Obecny protokół demonstruje zastosowanie sondy fluorescencyjnej z dihydroetydydą (DHE) jako alternatywnej metody ilościowego określania całkowitej produkcji ROS w warunkach wysokiej przepustowości. Wysokowydajna platforma obrazowania, CX7 Cellomics, została wykorzystana do pomiaru i ilościowego określenia produkcji ROS. Badanie to przeprowadzono w trzech liniach komórkowych raka wątrobowokomórkowego - HepG2, JHH4 i HUH-7. Protokół ten zawiera szczegółowy opis różnych procedur związanych z oceną ROS w komórkach, w tym - przygotowanie roztworu DHE, inkubację komórek z roztworem DHE oraz pomiar intensywności DHE niezbędnej do scharakteryzowania produkcji ROS. Protokół ten pokazuje, że barwnik fluorescencyjny DHE jest solidnym i powtarzalnym wyborem do charakteryzowania wewnątrzkomórkowej produkcji ROS w sposób wysokoprzepustowy. Wysokoprzepustowe podejścia do pomiaru produkcji ROS mogą być pomocne w różnych badaniach, takich jak toksykologia, badania przesiewowe leków i biologia raka.

Dihydroetydium (DHE) jest fluorescencyjnym barwnikiem reagującym na nadtlenek anionorodnikowy, który dostarcza specyficznych informacji na temat wewnątrzkomórkowych stanów ROS. Barwnik DHE emituje naturalnie niebieską fluorescencję w cytoplazmie. Jednakże, w wyniku oddziaływania z rodnikami ponadtlenkowymi, przekształca się on w 2-hydroksyetydium, które emituje fluorescencję w zakresie fal czerwonych (&gt;550 nm) (Rysunek 1). Barwnik DHE jest łatwo transportowany do wnętrza komórek i do jądra. Emitowaną fluorescencję można wizualizować za pomocą zestawu do mikroskopii fluorescencyjnej, powszechnie dostępnego w wielu laboratoriach. W niniejszym badaniu użyteczność barwnika DHE w kilku liniach komórkowych raka wątrobowokomórkowego – komórkach HUH7, JHH4 i HepG2 – jako sondy generowania gatunków ROS została przetestowana na platformie do przesiewania wysokotreściowego (high-content screening). Komórki poddano działaniu dwóch czynników generujących ROS – (a) nadtlenku wodoru i (b) menadionu – przez 30 min w sposób zależny od dawki (szczegóły dawkowania patrz Rysunek 2 i Rysunek 3) w celu wywołania stresu oksydacyjnego w komórkach, a następnie przeprowadzono znakowanie barwnikiem DHE na płytce 96-dołkowej. Zarówno H2O2, jak i menadion gwałtownie zwiększyły intensywność fluorescencji we wszystkich trzech liniach komórkowych w sposób zależny od dawki. Przy użyciu algorytmów segmentacji i kwantyfikacji obrazu w platformie do przesiewania wysokoprzepustowego, intensywność fluorescencji DHE indukowanej przez ROS została zmierzona w 1000 komórkach na dołek w sześciu powtórzeniach. Wykonano trzy niezależne powtórzenia, a wyniki zagregowano i przeanalizowano. Barwnik jądrowy Hoechst 33342 odgrywa ważną rolę w identyfikacji płaszczyzny, w której znajdują się komórki adherentne w każdym dołku. Ponadto, na platformie do przesiewania wysokoprzepustowego można wykryć fluorescencję 2-OH-E+ i E+ odpowiednio w jądrze i cytoplazmie badanych komórek (patrz Rysunek 4).
Ekspozycja na H2O2 spowodowała statystycznie istotny wzrost fluorescencji indukowanej przez ROS we wszystkich analizowanych liniach komórkowych w sposób zależny od dawki (patrz Rycina 2; dolny panel). Jednakże w przypadku ekspozycji na menadion nie zaobserwowano takiej zależności od dawki. W przypadku menadionu linia komórkowa JHH4 wykazała zależny od dawki wzrost intensywności fluorescencji, natomiast w liniach komórkowych HepG2 i HUH7 istotna różnica w intensywności fluorescencji była obserwowana tylko przy wyższych stężeniach menadionu (patrz Rycina 3; dolny panel). Różnice w odpowiedziach generowania ROS mogą wynikać z odmiennych mechanizmów produkcji ROS przez H2O2 i menadion. Podczas gdy H2O2 wywołuje powstawanie ROS w komórkach w sposób bardziej bezpośredni (np. poprzez działanie enzymów przeciwutleniających, takich jak peroksydazy i katalazy), przypuszcza się, że menadion generuje formy ROS w sposób pośredni poprzez indukowaną dysfunkcję mitochondriów. Ze względu na pośredni mechanizm produkcji ROS, fluorescencja DHE w przypadku menadionu może wymagać więcej czasu, aby się ujawnić. Wyniki te wskazują, że zależna od ROS fluorescencja DHE jest wrażliwa na czas trwania ekspozycji na stres oksydacyjny, stężenie oraz typ komórek. Optymalizacja protokołu eksperymentalnego dla każdego unikalnego typu komórek jest zatem niezbędna. Co ważniejsze, protokół ten demonstruje możliwość zastosowania barwnika DHE jako czynnika detekcji ROS w wysokoprzepustowy sposób, co znajduje zastosowanie w takich dziedzinach jak toksykologia, biologia nowotworów i przesiewanie leków.
<img alt="Pomiar wewnątrzkomórkowych ROS; schemat reakcji chemicznej; DHE do 2-hydroksyetydium za pośrednictwem anionu ponadtlenkowego." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66238/66238fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Schemat ilustrujący szlaki konwersji oksydacyjnej fluorescencyjnej cząsteczki DHE odpowiednio do 2-hydroksyetydium (2-OH-E+) i etydium (E+). Widma emisji fluorescencji 2-OH-E+ oraz E+ nakładają się przy pobudzeniu 480 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66238/66238fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Zmiany morfologii komórek pod wpływem nadtlenku wodoru; obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej i wykresy słupkowe dla HUH7, JHH4, HepG2." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66238/66238fig02v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Traktowanie nadtlenkiem wodoru zwiększa wewnątrzkomórkowy poziom ROS w sposób zależny od dawki. Komórki raka wątrobowokomórkowego – (A) HUH7, (B) JHH4 oraz (C) HepG2 traktowano H2O2 w dawkach 250 µM, 500 µM, 750 µM i 1000 µM przez okres 30 min. Komórki barwiono barwnikiem DHE (10 µM) w pożywce hodowlanej przez kolejne 30 min, a następnie przeprowadzono barwienie jąder Hoechst 33342. W każdej studzience przeliczono łącznie 1000 komórek. we wszystkich trzech liniach komórkowych zaobserwowano liniowy, zależny od dawki wzrost fluorescencji DHE (górny panel). Statystycznie istotne wzrosty fluorescencji widoczne są we wszystkich liniach komórkowych dla dawek 500 µM i wyższych (dolny panel). Każdy zestaw danych stanowi średnią z sześciu powtórzeń na płytce 96-dołkowej uzyskanych z trzech niezależnych eksperymentów (n = 3). Warunki traktowania porównano z próbkami nietraktowanymi za pomocą testu jednoczynnikowej analizy wariancji ANOVA (**** - p &lt; 0.0001, *** - p &lt; 0.001; pasek skali obrazu - 50 µm) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66238/66238fig02largev2.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Test apoptozy komórek; mikroskopia fluorescencyjna i wykres słupkowy; wpływ dawki menadion w komórkach HUH7, JHH4, HepG2." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66238/66238fig03v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Leczenie menadionem zwiększa wewnątrzkomórkowe poziomy ROS w sposób zależny od dawki. Komórki raka hepatokomórkowego - (A) HUH7, (B) JHH4 oraz (C) HepG2 poddano działaniu menadionu w dawkach 25 µM, 50 µM, 75 µM i 100 µM przez okres 30 min. Komórki barwiono barwnikiem DHE (10 µM) w pożywce hodowlanej przez kolejne 30 min, a następnie przeprowadzono barwienie jąder barwnikiem Hoechst 33342. W każdej studzience policzono łącznie 1000 komórek. We wszystkich trzech liniach komórkowych zaobserwowano liniowy, zależny od dawki wzrost fluorescencji DHE (górny panel). Statystycznie istotne wzrosty fluorescencji odnotowano konsekwentnie dla dawki maksymalnej (100 µM; dolny panel). Zmienność zaobserwowano dla pozostałych dawek menadionu w różnych liniach komórkowych (JHH4 &gt; HUH7 &gt; HepG2). Każdy zestaw danych stanowi średnią z sześciu powtórzeń na płytce 96-dołkowej uzyskanych z trzech niezależnych eksperymentów (n = 3). Warunki leczenia porównano z próbkami nieleczonymi za pomocą jednoczynnikowego testu ANOVA (**** - p &lt; 0.0001, *** - p &lt; 0.001; pasek skali obrazu - 50 µm) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66238/66238fig03largev2.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Odpowiedź komórek na stres oksydacyjny; mikroskopia fluorescencyjna po traktowaniu H2O2 i menadionem; efekty komórkowe." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66238/66238fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Fluorescencja DHE w pojedynczych komórkach - Powiększony widok zmian fluorescencji DHE zaobserwowanych po traktowaniu (A) nadtlenkiem wodoru i (B) menadionem przez 30 min. W różnych komórkach obserwuje się zmiany fluorescencji DHE w cytoplazmie i jądrze. Widoczna jest również automatyczna maska segmentacyjna wygenerowana przez platformę do wysokoprzepustowych analiz (high-content screening). Pasek skali obrazu - 10 µm. Powiększenie - 20x. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66238/66238fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Rysunek uzupełniający 1: Obrazowanie fluorescencji DHE indukowanej przez anion ponadtlenkowy w odpowiedzi na nadtlenek wodoru.Komórki raka hepatokomórkowego - (A) HUH7, (B) JHH4 oraz (C) HepG2 poddano działaniu H2O2 w dawkach 250 µM, 500 µM, 750 µM i 1000 µM przez 30 min. Następnie komórki barwiono barwnikiem DHE (10 µM) w pożywce hodowlanej przez kolejne 30 min. W dalszej kolejności komórki naświetlano diodą LED o długości fali 386 nm, a obrazowanie fluorescencji zbierano przy &gt;560 nm. Zrezygnowano z przeciwbarwienia jąder, aby uniknąć interferencji widmowej. W dawkach &gt; 500 µM obserwuje się zależny od dawki wzrost fluorescencji DHE. Przewiduje się, że fluorescencja DHE wywołana naświetlaniem UV wynika z produkcji większości rodników ponadtlenkowych. Każdy zestaw danych stanowi średnią z sześciu powtórzeń w płytce 96-dołkowej uzyskanych z dwóch niezależnych eksperymentów (n = 2). Warunki traktowania porównano z próbkami nietraktowanymi przy użyciu jednoczynnikowej analizy wariancji ANOVA (**** - p &lt; 0.0001, *** - p &lt; 0.001; pasek skali obrazu - 50 µm) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66238/Supplementary%20Figure%201.pdf" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Rysunek dodatkowy 2: Obrazowanie fluorescencji DHE indukowanej przez anionorodnik ponadtlenkowy w odpowiedzi na menadion - Komórki raka hepatokomórkowego - (A) HUH7, (B) JHH4 oraz (C) HepG2 traktowano menadionem w dawkach 25 µM, 50 µM, 75 µM i 100 µM przez 30 min. Następnie komórki barwiono barwnikiem DHE (10 µM) w pożywce hodowlanej przez kolejne 30 min. Podobnie jak w przypadku nadtlenku wodoru, zaobserwowano zależny od dawki wzrost fluorescencji DHE. Każdy zestaw danych stanowi średnią z sześciu powtórzeń na płytce 96-dołkowej uzyskanych z dwóch niezależnych eksperymentów (n = 2). Warunki traktowania porównano z próbkami nietraktowanymi za pomocą jednoczynnikowej analizy wariancji ANOVA (**** - p &lt; 0.0001, *** - p &lt; 0.001; pasek skali na obrazie - 50 µm) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66238/Supplementary%20Figure%202.pdf" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Ten protokół opisuje nowatorską metodę ilościowego oznaczania wewnątrzkomórkowych reaktywnych form tlenu (ROS) przy użyciu dihydroetydydy (DHE) jako sondy barwnika fluorescencyjnego przy użyciu wysokoprzepustowego podejścia przesiewowego. W protokole opisano metody oceny ilościowej wewnątrzkomórkowych reaktywnych form tlenu (ROS) w trzech różnych liniach komórkowych raka wątrobowokomórkowego.

Wysokoprzepustowa ocena przesiewowa wytwarzania reaktywnych form tlenu (ROS) przy użyciu barwnika fluorescencyjnego Dihydroethidium (DHE)

Reactive oxygen species (ROS) play a key role in the regulation of cellular metabolism in physiological and pathological processes. Physiological ROS ...

Nasze laboratorium bada wpływ zanieczyszczeń środowiska, takich jak metale ciężkie, na pracę wątroby i choroby związane z produkcją reaktywnych form tlenu. Protokół ten ma na celu ilościowy pomiar poziomów ROS w komórkach za pomocą sondy fluorescencyjnej dihydroethidium. Protokół ten wykorzystuje platformę przesiewową o wysokiej zawartości do ilościowego pomiaru wewnątrzkomórkowych poziomów gatunków ROS w liniach wątrobowokomórkowych.Dokładny pomiar wewnątrzkomórkowego poziomu ROS ma kluczowe znaczenie w wysokoprzepustowych badaniach toksykologicznych, które są kluczowym obszarem zainteresowań w naszym laboratorium. Fluorescencja DHE jest wysoce specyficzną metodą pomiaru całkowitych poziomów ROS, szczególnie ukierunkowaną na rodnik ponadtlenkowy i dającą mu znaczną przewagę nad innymi powszechnie stosowanymi sondami fluorescencyjnymi ROS. Ponadto protokół ten oferuje unikalną możliwość pomiaru całkowitego poziomu ROS w komórkach na platformie o wysokiej przepustowości.Nasz protokół jest solidnym i powtarzalnym wyborem do scharakteryzowania wewnątrzkomórkowej całkowitej produkcji ROS. Wysokoprzepustowe podejścia do pomiaru poziomów ROS są pomocne w różnych badaniach, takich jak toksykologia, badania przesiewowe leków i biologia nowotworów, na których skupimy się w przyszłości. Na początek wysiew 200 mikrolitrów objętości 10 000 komórek raka wątrobowokomórkowego na 96-dołkowej płytce z DMEM i 10% FBS.Inkubuj komórki przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza w wilgotnym inkubatorze w temperaturze poniżej 5% dwutlenku węgla. Następnego dnia zastąp pożywkę hodowlaną i potraktuj komórki nadtlenkiem wodoru i menadionem o różnych stężeniach. Rozpuść pięć miligramów DHE w jednym mililitrze DMSO.Aby uzyskać roztwór roboczy, rozcieńczyć podwielokrotność 100 mikromoli wstępnie podgrzanym podłożem DMEM do stężenia 10 mikroli. Wiruj roztwór barwnika roboczego przez pięć do 10 sekund, aby zapewnić prawidłowe wymieszanie. Teraz usuń pożywkę testową z każdej studzienki przed zabarwieniem komórek raka.Następnie delikatnie umyj każdą studzienkę PBS. Odpipetować 100 mikrolitrów roboczego roztworu barwnika do każdej studzienki. Inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut.Usuń pożywkę zawierającą DHE z każdej studzienki. Użyj pipety wielokanałowej, aby przemyć każdą studzienkę trzy razy PBS. Teraz do każdej studzienki należy odpipetować 200 mikrolitrów PBS zawierającego barwnik do barwienia jądrowego Hoechst 33342.Po inkubacji przenieść płytkę na platformę przesiewową o wysokiej zawartości. Uruchom oprogramowanie do przesiewania o wysokiej zawartości Cellomics CX7. Skalibruj platformę obrazowania zgodnie ze specyfikacją producenta.Otwórz parametry systemu specyficzne dla marki tabliczki w bazie danych instrumentów. Następnie ostrożnie umieść płytkę z próbkami na podgrzewanym stoliku systemu obrazowania. Upewnij się, że płyta jest bezpiecznie ustawiona i we właściwej orientacji.Następnie delikatnie dociśnij mikropłytkę, aby upewnić się, że opiera się płasko o stolik. Po prawidłowym ustawieniu płytki naciśnij i przytrzymaj Control. Następnie kliknij Control i OK, aby otworzyć okno dialogowe ładowania/rozładowywania blachy.Aby wybrać parametry obrazowania, otwórz tryb Target Activation w interfejsie Cellomics BioApplications. Stwórz nowy protokół dwukanałowej akwizycji danych kompatybilny z barwieniem jądrowym i sondą fluorescencyjną DHE. Następnie określ wymagane cele do uzyskania obrazu, a następnie wybierz odpowiednie powiększenie.Teraz określ czas ekspozycji, łączenie aparatu i interwał stosu Z. Po ustawieniu parametrów obrazowania zidentyfikuj główny obiekt śledzenia, który Cię interesuje, korzystając z różnych algorytmów w instrumencie. Po segmentacji zidentyfikowanego obiektu zweryfikuj obiekt podstawowy na podstawie określonych parametrów rozmiaru, kształtu i intensywności unikatowych dla każdego typu komórki.Zdefiniuj obszar zainteresowania wokół obiektu i ustaw wokół niego okrąg o długości 20 mikrometrów. Kliknij kartę Charakterystyka populacji, a następnie ustaw limit skanowania na 1 000 komórek na studzienkę z minimum 10 obiektami na pole. Teraz kliknij Uruchom widok, aby zeskanować każdą płytkę studzienki.Następnie uruchom oprogramowanie do analizy widoku i wyeksportuj parametry danych ilościowych w formacie csv w celu dodatkowej analizy. Ekspozycja na nadtlenek spowodowała statystycznie istotny przyrost fluorescencji indukowanej przez ROS we wszystkich liniach komórkowych w sposób zależny od dawki. W przypadku menadionu komórki JHH-4 wykazywały zależny od dawki wzrost intensywności fluorescencji.Jednak istotną różnicę we fluorescencji zaobserwowano tylko przy wyższych stężeniach w pozostałych dwóch liniach komórkowych.

high-throughput-screening-assessment-reactive-oxygen-species-ros

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Metodą przesiewową służącą do wykrywania utleniającego środowiska wewnątrzkomórkowego jest pomiar utleniania CM-H2DCFDA. Po utlenieniu wewnątrz komórki CM-H2DCFDA zmienia się z związku niewykazującego fluorescencji w związek fluorescencyjny. Zmianę fluorescencji mierzy się za pomocą cytometrii przepływowej, co pozwala określić liczbę komórek znajdujących się w środowisku utleniającym.

Test przesiewowy stresu oksydacyjnego w linii komórkowej astrocytów kotów, G355-5

W niniejszej pracy proponujemy proste metody testowania i oceny obecności reaktywnych form tlenu w komórkach.

Produkcja i detekcja reaktywnych form tlenu (ROS) w nowotworach

Dostosowaliśmy zestaw protokołów do pomiaru reaktywnych form tlenu (ROS), które mogą być stosowane w różnych modelach komórkowych ameb i ssaków do badań jakościowych i ilościowych.

Wykrywanie, wizualizacja i ilościowe określanie wytwarzania reaktywnych form tlenu w systemie modelu Amoeba

Ten artykuł przedstawia proces pracy mikroskopii o wysokiej zawartości do jednoczesnej kwantyfikacji wewnątrzkomórkowych poziomów ROS, jak również potencjału i morfologii błony mitochondrialnej - wspólnie określanych jako morfofunkcja mitochondriów - w żywych komórkach przylegających przy użyciu przenikających komórkę fluorescencyjnych cząsteczek reporterowych 5-(i-6)-chlorometylo-2',7'-dichlorodihydrofluoresceiny dioctanu, ester acetylowy (CM-H2DCFDA) i ester metylowy tetrametylodaminy (TMRM).

Profilowanie redoks komórkowe przy użyciu mikroskopii o wysokiej zawartości

Ten manuskrypt opisuje użycie genetycznie kodowanych reporterów fluorogenicznych w zastosowaniu obrazowania żywych komórek do badania stresu oksydacyjnego wywołanego ksenobiotykami. To eksperymentalne podejście oferuje niezrównaną rozdzielczość czasoprzestrzenną, czułość i swoistość, unikając jednocześnie wielu niedociągnięć konwencjonalnych metod stosowanych do wykrywania toksykologicznego stresu oksydacyjnego.

Obrazowe podejścia do oceny toksykologicznego stresu oksydacyjnego przy użyciu genetycznie kodowanych czujników fluorogennych

Mitochondria zawierają kilka enzymów zależnych od flawin, które mogą wytwarzać reaktywne formy tlenu (ROS). Monitorowanie uwalniania ROS z poszczególnych miejsc w mitochondriach jest trudne ze względu na niepożądane reakcje uboczne. Przedstawiamy łatwą i niedrogą metodę bezpośredniej oceny natywnych wskaźników uwalniania ROS przy użyciu oczyszczonych flawoenzymów i fluorometrii mikropłytek.

Jednoczesny pomiar produkcji nadtlenków/nadtlenku wodoru i NADH przez dehydrogenazy mitochondrialne zawierające flawiny

To badanie demonstruje użycie cytometrii przepływowej do wykrywania produkcji reaktywnych form tlenu (ROS) wynikającej z aktywacji FcγR. Metoda ta może być stosowana do oceny zmian w funkcji sygnalizacji przeciwdrobnoustrojowej i redoks fagocytów w odpowiedzi na kompleksy immunologiczne, opsonizowane mikroorganizmy lub bezpośrednie sieciowanie FcγR.

Pomiar cytometryczny przepływu produkcji ROS w makrofagach w odpowiedzi na sieciowanie FcγR

Tutaj prezentujemy protokół wykrywania całkowitej komórkowej reaktywnej formy tlenu (ROS) za pomocą dioctanu 2',7'-dichlorodihydrofluoresceiny (DCFH-DA). Ta metoda może wizualizować komórkową lokalizację ROS w przylegających komórkach za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego i określać ilościowo intensywność ROS za pomocą czytnika płytek fluorescencyjnych. Ten protokół jest prosty, wydajny i opłacalny.

Wykrywanie całkowitych reaktywnych form tlenu w przylegających komórkach za pomocą barwienia dioctianem 2',7'-dichlorodihydrofluoresceiny

Tutaj proponujemy usystematyzowany, dostępny i powtarzalny protokół do wykrywania komórkowych reaktywnych form tlenu (ROS) za pomocą sondy dioctanu 2′,7′-dichlorofluoresceiny (DCFH-DA) w komórkach glejowych Müllera (MGC). Ta metoda określa ilościowo całkowite komórkowe poziomy ROS za pomocą cytometru przepływowego. Ten protokół jest bardzo łatwy w użyciu, odpowiedni i powtarzalny.

Kwantyfikacja reaktywnych form tlenu za pomocą sondy dioctanu 2′,7′-dichlorofluoresceiny i cytometrii przepływowej w komórkach glejowych Müllera

Niniejszy materiał wideo przedstawia szczegółowy protokół badania profilu farmakologicznego ludzkich kanałów TRPA1 przy użyciu systemu FlexStation 3. Protokół obejmuje szczegóły dotyczące przygotowania komórek, ładowania barwnika oraz obsługi czytnika mikropłytek FlexStation 3.

Komórkowy test wapniowy do przesiewowej analizy funkcji kanałów TRP o średniej i wysokiej przepustowości z wykorzystaniem systemu FlexStation 3

Poznaj metodę wysokoprzepustowego pomiaru reaktywnych form tlenu w liniach komórkowych raka wątroby przy użyciu fluorescencyjnej sondy DHE. Ta technika umożliwia ilościową analizę superorodników w badaniach toksykologicznych.

Wysokoprzepustowa ocena przesiewowa wytwarzania reaktywnych form tlenu (ROS) przy użyciu barwnika fluorescencyjnego Dihydroethidium (DHE) (Wideo) | JoVE Journal

Wysokoprzepustowa ocena przesiewowa wytwarzania reaktywnych form tlenu (ROS) przy użyciu barwnika fluorescencyjnego Dihydroethidium (DHE)

Przeglądaj więcej filmów