Name: Interferencja RNA w parazytoidzie jaja, Trichogramma dendrolimi Matsumura (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-11-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 29 s
Description: Poznaj metodę interferencji RNA w parazytoidzie jaja Trichogramma dendrolimi. Technika mikroiniekcji dsRNA umożliwia badanie regulacji genów i funkcji genetycznych w małych organizmach kluczowych dla biologicznej ochrony roślin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Te badania zostały sfinansowane przez Projekty Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (32172476, 32102275), Program Innowacji Naukowych i Technologicznych w Rolnictwie (CAAS-ZDRW202203, CAAS-ZDRW202108) oraz Centralne Fundusze Kierujące Lokalnym Rozwojem Nauki i Technologii (XZ202301YD0042C).

UWAGA: Zobacz Tabelę Materiałów, aby uzyskać szczegółowe informacje dotyczące wszystkich materiałów, instrumentów, oprogramowania i odczynników używanych w tym protokole.
1. Zbieranie i utrzymywanie hodowli owadów
<ol>
	<li>Przyklej grupę ~ 5 000 jaj Corcyra cephalonica (Stainton) na karcie o wymiarach 9 cm na 16 cm, używając roztworu 1:5 (v/v) gumy arabskiej w proszku i wody25,26. 
	UWAGA: Unikaj dołączania zbyt wielu jaj żywiciela do karty, ponieważ przepełnienie sprawia, że jest to niepraktyczne dla późniejszych procedur przenoszenia i sekcji.</li>
	<li>Aby zapobiec wykluwaniu się jaj gospodarza, poddaj karty jaj gospodarza 30-minutowemu naświetlaniu promieniowaniem ultrafioletowym (UV) (<silna klasa="xfig">Rysunek 1-i). Następnie pokrój papier z inaktywowanymi jajkami na karty jaj o grubości 1 cm i średnicy 8 cm, z których każda zawiera około 300-500 jaj (Rysunek 1-ii)25,26,27.</li>
	<li>Wprowadź kohortę 80-120 os T. denrolimi do szklanej rurki o średnicy 2 cm i długości 8 cm. Uszczelnij tubę bawełną. 
	UWAGA: Utrzymuj osy w temperaturze 25 ± 1 °C, z cyklem światło/ciemność 16 godzin światła i 8 godzin ciemności oraz utrzymuj wilgotność względną około 75%.</li>
	<li>Przedstaw karcie jaja żywiciela osom w celu pasożytowania (<silna klasa="xfig">Rysunek 1-ii). Pozwól osom złożyć jaja w jajach żywiciela na 6 godzin, po czym natychmiast usuń osy. 
	UWAGA: Unikaj nadmiernego przedłużania okresu pasożytowania, ponieważ może to prowadzić do przeludnienia potomstwa T. denrolimi w jaju żywiciela, co skutkuje zwiększoną śmiertelnością potomstwa os28,29.</li>
</ol>
2. Synteza dsRNA
<ol>
	<li>Zaprojektuj zestawy starterów zawierające promotor T7 do syntezy dwuniciowego RNA (dsRNA). Wybierz segment 300-400 pz z docelowego genu (Ferhch) do syntezy dsRNA.</li>
	<li>Pozyskanie komercyjnie zsyntetyzowanych zestawów starterów do produkcji dsRNA dla docelowego genu i dsGFP do wykorzystania jako kontrola ujemna.</li>
	<li>Wyodrębnij zawartość RNA ze 100 os T. denrolimi za pomocą wspomnianego zestawu zgodnie z protokołem producenta9. Sprawdź jakość zawartości RNA; kontynuuj, jeśli wartość OD260/OD280 mieści się w zakresie od 1,8 do 2,09.</li>
	<li>Oczyść zawartość RNA za pomocą 2 μL 5x buforu (1 U/50 μL), 1 μL DNAzy (1 U/50 μL) i 6,5 μL RNA (~100 ng/μL), 0,5 μLH2Ow 42 °C przez 2 min.</li>
	<li>Wykonaj reakcję łańcuchową polimerazy z odwrotną transkryptazą (RT-PCR), aby wygenerować matrycę cDNA z 10 μL oczyszczonego RNA (~100 ng/μL), 4 μL 5x buforu (1 U/50 μL), 1 μL Enzyme Mix I (1 U/50 μL) i 4 μL H2O. Wykonaj RT-PCR przy użyciu następujących ustawień: 37 °C przez 15 min, 85 °C przez 5 s. Przechowywać produkt cDNA w temperaturze -4 °C do czasu użycia.</li>
	<li>Przeprowadzić reakcję łańcuchową polimerazy (PCR) w celu amplifikacji sekwencji dsRNA zgodnie z odniesioną mieszanką główną (10 μL Taq II [1 U/50 μL], 0,8 μL startera przedniego [0,4 μM], 0,8 μL startera odwrotnego [0,4 μM], 0,8 μL matrycy DNA [40 ng/μL], i 7,6 μlH2O). Wykonaj PCR przy użyciu następujących ustawień: 94 °C przez 2 min; 35 cykli w temperaturze 94 °C przez 30 s, 60 °C przez 30 s, 72 °C przez 30 s; 72 °C przez 2 min.</li>
	<li>Oceń jakość produktów PCR za pomocą elektroforezy na 2,0% żelu agarozowym5,9 i potwierdź sekwencję docelową za pomocą sekwencjonowania Sangera.</li>
	<li>Oczyść produkt PCR za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu zgodnie z wytycznymi producenta9,23.</li>
	<li>Wykorzystaj system RNAi do syntezy dsRNA dla docelowego genu z 10 μL 2x buforu (0,02 U/μL), 8 μL matrycy DNA (75 ng / μL) i 2 μL mieszanki enzymów (1 U/50 μL) z następującymi ustawieniami: 37 °C przez 30 min, 70 °C przez 10 min, i 25 °C przez 20 min. Eluować zsyntetyzowane dsRNA za pomocą 30 μl wody wolnej od nukleaz</li>.
	<li>Oceń jakość produktu dsRNA, wizualizując go na 1,0% żelu agarozowym5,9. Rozcieńczyć dsRNA do 7 000 ng/μl. Sprawdź jakość produktu dsRNA; kontynuuj, jeśli wartość OD260/OD280 mieści się w zakresie od 1,8 do 2,09. Produkt dsRNA należy przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu użycia.</li>
</ol>
3. Przeszczepienie poczwarek T. denrolimi
<ol>
	<li>Hoduj jaja pasożytniczego żywiciela przez około 8 dni w temperaturze 25 ± 1°C, utrzymując cykl 16 godzin światła/8 godzin ciemności i wilgotność względną ~75%. Jaja pasożytniczego żywiciela czernieją po 5 dniach30 (Rysunek 1-iv,v).</li>
	<li>Przenieś kartę jaja gospodarza do mikroskopu preparacyjnego. Użyj pary igieł wolframowych (<silna klasa="xfig">Rysunek 1-vi), aby skrupulatnie usunąć kosmówkę z jaj gospodarza (<silna klasa="xfig">Rysunek 1-vii) i odzyskaj poczwarkę od wewnątrz (<silna klasa="xfig">Rysunek 1-viii)5,17,18. 
	UWAGA: Końcówka igły preparacyjnej powinna być mniejsza niż 0,05 mm.</li>
	<li>Przygotuj czystą płytę na podłoże. Wylej 10-15 ml roztworu agaru o stężeniu 15 g/l, pozwalając mu naturalnie ostygnąć (<silna klasa="xfig">Rysunek 2-i). 
	UWAGA: Wymieszaj roztwór agaru z 0,5 g streptomycyny, aby zahamować wzrost zanieczyszczeń in vitro.</li>
	<li>Za pomocą zdezynfekowanego grawera wytraw kilka rowków o głębokości 0,2-0,3 mm i szerokości 0,4-0,8 mm (<silna klasa="xfig">Rysunek 2-ii).</li>
	<li>Użyj małego pędzelka (<silna klasa="xfig">Rysunek 2-iii), aby przesadzić poczwarkę z wypreparowanego jaja gospodarza do jednego z rowków na podłożu agarowym (<silna klasa="xfig">Rysunek 2-iv).</li>
	<li>Powtórz kroki 3.4 i 3.5, przesadzając 100-300 poczwarek pojedynczo do rowków jeden po drugim (<silna klasa="xfig">Rysunek 2-v).</li>
</ol>
4. Mikroiniekcja dsRNA do poczwarki T. denrolimi
<ol>
	<li>Użyj ściągacza do szklanych igieł, aby pociągnąć szklaną kapilę (<silna klasa="xfig">Rysunek 3-i,ii). Ustaw ciepło na 280, prędkość na 170, opóźnienie na 250, a pociągnięcie na 30 na ściągaczu igłowym (<silna klasa = "xfig">Rysunek 3-iii). Przygotuj wiele igieł ze szkła kapilarnego do mikroiniekcji (<silna klasa="xfig">Rysunek 3-iv,v).</li>
	<li>Skosuj końcówkę szklanej igły za pomocą płytki ściernej (<klasa mocna="xfig">Rysunek 3-vi). 
	UWAGA: Upewnij się, że końcówka igły do wstrzykiwań pozostaje ostra; w przeciwnym razie może to spowodować śmiertelność poczwarki lub utrudnić przepływ odczynnika przez igłę (<silna klasa="xfig">Rysunek 3-vii).</li>
	<li>Załadować około 2 μl roztworu do wstrzykiwań dsRNA o stężeniu 7 000 ng/μl do przygotowanej igły iniekcyjnej za pomocą pompy do mikroiniekcji (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3-vii).</li>
	<li>Przenieś substrat agarowy zawierający setki poczwarek na platformę mikroskopu złożonego (<silna klasa = "xfig">Rysunek 3-viii).</li>
	<li>Ostrożnie wprowadzić igłę do wstrzykiwań do brzucha poczwarki T. denrolimi pod kątem ~30° do brzucha pod soczewką (<silna klasa = "xfig">Rysunek 3-ix).</li>
	<li>Stopniowo wstrzykiwać ~5 nL roztworu do wstrzykiwań (krok 4.3) do poczwarki T. denrolimi tak delikatnie, jak to możliwe. 
	UWAGA: Poczwarka T. denrolimi może nieznacznie pęcznieć po wstrzyknięciu roztworu dsRNA. Wstrzyknięcie nadmiernej ilości roztworu do poczwarki lub użycie igieł ze zbyt dużymi otworami może spowodować przedwczesną śmierć poczwarki. Zmień igły, gdy zostaną zatkane po wstrzyknięciu od kilku do kilkudziesięciu poczwarek.</li>
	<li>Powtórz kroki 4.5 i 4.6, wstrzykując dsRNA do 600 poczwarek jeden po drugim. 
	UWAGA: Aby uzyskać wiarygodną analizę RT-qPCR, zawartość RNA należy wyizolować z co najmniej 100 poczwarek. Wstrzyknąć co najmniej 600 poczwarek dla trzech powtórzeń w leczeniu dsRNA i trzech powtórzeń w kontroli negatywnej dsGFP 9.</li>
</ol>
5. Inkubacja poczwarek T. denrolimi
<ol>
	<li>Przenieść substrat zawierający wstrzyknięte poczwarki do inkubatora w temperaturze 25 ± 1 °C w cyklu 16 godzin/8 godzin światło/ciemność i wilgotności względnej ~75%.</li>
	<li>Inkubować około 700 poczwarek T. denrolimi na zabieg przez 24 godziny lub 48 godzin. Wyodrębnij zawartość RNA z grupy 100 poczwarek na replikę9. 
	UWAGA: Usunąć skurczone poczwarki (martwe poczwarki) z próbek; W przeciwnym razie może to spowodować błędy w wykrywaniu ekspresji genów.</li>
	<li>Inkubuj ~ 50 poczwarek T. denrolimi na zabieg, aż pojawią się osy (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3-x). Rejestruj szybkość pojawiania się i szybkość deformacji.</li>
</ol>
6. Wykrywanie docelowej ekspresji genów
<ol>
	<li>Zaprojektuj zestaw starterów dla genu docelowego i genów referencyjnych dla RT-qPCR za pomocą narzędzia do projektowania. 
	UWAGA: Upewnij się, że sekwencje starterów RT-qPCR nie nakładają się na docelowy region dsRNA.</li>
	<li>Zastosuj gen forkhead box O (FoxO) jako gen referencyjny w analizie RT-qPCR; startery FoxO zostały zgłoszone wcześniej9.</li>
	<li>Uzyskaj komercyjnie zsyntetyzowane zestawy starterów. Wykonać RT-qPCR z 10 μL Taq II (1 U/50 μL), 0,8 μL startera doprowadzającego (0,4 μM), 0,8 μL startera odwrotnego (0,4 μM), 0,8 μL matrycy (10 ng/μL) i 7,6 μLH2O. Wykonaj RT-qPCR przy następujących ustawieniach: 95 °C przez 30 s; 35 cykli w temperaturze 95 °C przez 5 s, 57 °C przez 30 s, 72 °C przez 30 sekund; 95 °C przez 10 s; 60 °C przez 5 s i 95 °C przez 5 s.</li>
	<li>Oblicz wartość ekspresji docelowego genu za pomocą metody 2-ΔΔCt9,25.</li>
	<li>Zastosuj test Kruskala-Wallisa do analizy ekspresji docelowego genu pod wpływem różnych metod leczenia (dsFerhch, dsGFP, bez iniekcji). 
	UWAGA: Unikaj używania testów parametrycznych (np. testu t) do porównań post-hoc, ponieważ heteroskedastyczność i nienormalność danych mogą prowadzić do błędnych wniosków25.</li>
</ol>

Advancing RNAi Techniques in Trichogramma dendrolimi for Gene Function Analysis

<ol><li>Zang, L. S., Wang, S., Zhang, F., Desneux, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+control+with+Trichogramma+in+China%3A+History%2C+present+status+and+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Entomol%22%5BJournal%5D)">Biological control with Trichogramma in China: History, present status and perspectives.</a> Annu Rev Entomol. 66, 463-484 (2020).</li>
<li>Zhou, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+clutch+size+for+quality+control+of+bisexual+and+Wolbachia-infected+thelytokous+lines+of+Trichogramma+dendrolimi+Matsumura+%28Hymenoptera%3A+Trichogrammatidae%29+mass+reared+on+eggs+of+a+substitutive+host%2C+Antheraea+pernyi+Gu%C3%A9rin-M%C3%A9neville+%28Lepidoptera%3A+Saturniidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Pest+Manag+Sci%22%5BJournal%5D)">Optimal clutch size for quality control of bisexual and Wolbachia-infected thelytokous lines of Trichogramma dendrolimi Matsumura (Hymenoptera: Trichogrammatidae) mass reared on eggs of a substitutive host, Antheraea pernyi Guérin-Méneville (Lepidoptera: Saturniidae).</a> Pest Manag Sci. 76 (8), 2635-2644 (2020).</li>
<li>Li, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+status+of+the+biological+control+of+the+fall+armyworm+Spodoptera+frugiperda+by+egg+parasitoids%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pest+Sci%22%5BJournal%5D)">Current status of the biological control of the fall armyworm Spodoptera frugiperda by egg parasitoids.</a> J Pest Sci. 96, 1345-1363 (2023).</li>
<li>Zhou, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+temperature+and+superparasitism+on+quality+and+characteristics+of+thelytokous+Wolbachia-infected+Trichogramma+dendrolimi+Matsumura+%28Hymenoptera%3A+Trichogrammatidae%29+during+mass+rearing%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Effects of temperature and superparasitism on quality and characteristics of thelytokous Wolbachia-infected Trichogramma dendrolimi Matsumura (Hymenoptera: Trichogrammatidae) during mass rearing.</a> Sci Rep. 9 (1), 18114(2019).</li>
<li>Zhou, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Penetrance+during+Wolbachia-mediated+parthenogenesis+of+Trichogramma+wasps+is+reduced+by+continuous+oviposition%2C+associated+with+exhaustion+of+Wolbachia+titers+in+ovary+and+offspring+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Pest+Manag+Sci%22%5BJournal%5D)">Penetrance during Wolbachia-mediated parthenogenesis of Trichogramma wasps is reduced by continuous oviposition, associated with exhaustion of Wolbachia titers in ovary and offspring eggs.</a> Pest Manag Sci. 78 (7), 3080-3089 (2022).</li>
<li>Huang, N. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+and+large-scale+releases+of+Trichogramma+promote+pesticide+decrease+in+maize+in+northeastern+China%5BTitle%5D)+AND+%22Entomol+Gen%22%5BJournal%5D)">Long-term and large-scale releases of Trichogramma promote pesticide decrease in maize in northeastern China.</a> Entomol Gen. 40 (4), 331-335 (2020).</li>
<li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+of+Trichogramma+japonicum+as+a+vector+of+Beauveria+bassiana+for+parasitizing+eggs+of+rice+striped+stem+borer%2C+Chilo+suppressalis%5BTitle%5D)+AND+%22Entomol+Gen%22%5BJournal%5D)">Performance of Trichogramma japonicum as a vector of Beauveria bassiana for parasitizing eggs of rice striped stem borer, Chilo suppressalis.</a> Entomol Gen. 41 (2), 147-155 (2021).</li>
<li>Ning, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+identification+and+expression+pattern+of+the+sex+determination+genes+and+their+sex-specific+variants+in+the+egg+parasitoid+Trichogramma+dendrolimi+Matsumura+%28Hymenoptera%3A+Trichogrammatidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Physiol%22%5BJournal%5D)">The identification and expression pattern of the sex determination genes and their sex-specific variants in the egg parasitoid Trichogramma dendrolimi Matsumura (Hymenoptera: Trichogrammatidae).</a> Front Physiol. 14, 1243753(2023).</li>
<li>Huo, L. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+and+evaluation+of+RT-qPCR+reference+genes+for+expression+analysis+in+the+tiny+egg+parasitoid+wasp%2C+Trichogramma+dendrolimi+Matsumura+%28Hymenoptera%3A+Trichogrammatidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Asia+Pac+Entomol%22%5BJournal%5D)">Selection and evaluation of RT-qPCR reference genes for expression analysis in the tiny egg parasitoid wasp, Trichogramma dendrolimi Matsumura (Hymenoptera: Trichogrammatidae).</a> J Asia Pac Entomol. 25 (2), 101883(2022).</li>
<li>Leung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+biological+control%3A+the+need+for+integrating+genetics+and+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Rev+Camb+Philos+Soc%22%5BJournal%5D)">Next-generation biological control: the need for integrating genetics and genomics.</a> Biol Rev Camb Philos Soc. 95 (6), 1838-1854 (2020).</li>
<li>Fire, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).</li>
<li>Leonard, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+symbionts+activate+honey+bee+immunity+and+limit+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Engineered symbionts activate honey bee immunity and limit pathogens.</a> Science. 367 (6477), 573-576 (2020).</li>
<li>Sun, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silencing+an+essential+gene+involved+in+infestation+and+digestion+in+grain+aphid+through+plant-mediated+RNA+interference+generates+aphid-resistant+wheat+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotechnol+J%22%5BJournal%5D)">Silencing an essential gene involved in infestation and digestion in grain aphid through plant-mediated RNA interference generates aphid-resistant wheat plants.</a> Plant Biotechnol J. 17 (5), 852-854 (2019).</li>
<li>Li, M., Bui, M., Akbari, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryo+Microinjection+and+Transplantation+Technique+for+Nasonia+vitripennis+Genome+Manipulation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation.</a> J Vis Exp. 130, e56990(2017).</li>
<li>Dalla Benetta, E., Chaverra-Rodriguez, D., Rasgon, J. L., Akbari, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pupal+and+Adult+Injections+for+RNAi+and+CRISPR+Gene+Editing+in+Nasonia+vitripennis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis.</a> J Vis Exp. 166, e61892(2020).</li>
<li>Lynch, J. A., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+parental+RNA+interference+in+the+wasp+Nasonia+vitripennis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">A method for parental RNA interference in the wasp Nasonia vitripennis.</a> Nat Protoc. 1 (1), 486-494 (2006).</li>
<li>Zhu, K. Y., Palli, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms%2C+Applications%2C+and+Challenges+of+Insect+RNA+Interference%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Entomol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms, Applications, and Challenges of Insect RNA Interference.</a> Annu Rev Entomol. 65, 293-311 (2020).</li>
<li>Colinet, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+RNAi+in+a+Drosophila+endoparasitoid+wasp+and+demonstration+of+its+efficiency+in+impairing+venom+protein+production%5BTitle%5D)+AND+%22J+Insect+Physiol%22%5BJournal%5D)">Development of RNAi in a Drosophila endoparasitoid wasp and demonstration of its efficiency in impairing venom protein production.</a> J Insect Physiol. 63, 56-61 (2014).</li>
<li>Wang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+digestive+tract+expressing+%CE%B1-amylase+influences+the+adult+lifespan+of+Pteromalus+puparum+revealed+through+RNAi+and+rescue+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Pest+Manag+Sci%22%5BJournal%5D)">A digestive tract expressing α-amylase influences the adult lifespan of Pteromalus puparum revealed through RNAi and rescue analyses.</a> Pest Manag Sci. 75 (12), 3346-3355 (2019).</li>
<li>Zhou, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wolbachia-infected+Trichogramma+dendrolimi+is+outcompeted+by+its+uninfected+counterpart+in+superparasitism+but+does+not+have+developmental+delay%5BTitle%5D)+AND+%22Pest+Manag+Sci%22%5BJournal%5D)">Wolbachia-infected Trichogramma dendrolimi is outcompeted by its uninfected counterpart in superparasitism but does not have developmental delay.</a> Pest Manag Sci. 79 (3), 1005-1017 (2023).</li>
<li>Zhou, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Posterior+concentration+of+Wolbachia+during+the+early+embryogenesis+of+the+host+dynamically+shapes+the+tissue+tropism+of+Wolbachia+in+host+Trichogramma+wasps%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Infect+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Posterior concentration of Wolbachia during the early embryogenesis of the host dynamically shapes the tissue tropism of Wolbachia in host Trichogramma wasps.</a> Front Cell Infect Microbiol. 13, 1198428(2023).</li>
<li>Lee, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+Trichogramma+evanescens+Westw.+and+its+influence+on+the+embryonic+development+of+its+host%2C+Attacus+cynthia+ricini+Boisd%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Entomol+Sin+Z%22%5BJournal%5D)">The development of Trichogramma evanescens Westw. and its influence on the embryonic development of its host, Attacus cynthia ricini Boisd.</a> Acta Entomol Sin Z. 11 (1), 89-119 (1961).</li>
<li>Shen, Y., Chen, Y. Z., Zhang, C. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi-mediated+silencing+of+genes+in+the+brown+planthopper+Nilaparvata+lugens+affects+survival%2C+growth+and+female+fecundity%5BTitle%5D)+AND+%22Pest+Manag+Sci%22%5BJournal%5D)">RNAi-mediated silencing of genes in the brown planthopper Nilaparvata lugens affects survival, growth and female fecundity.</a> Pest Manag Sci. 77 (1), 365-377 (2021).</li>
<li>Wu, S., Yin, S., Zhou, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+physiology+of+iron+trafficking+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Res+Insect+Sci%22%5BJournal%5D)">Molecular physiology of iron trafficking in Drosophila melanogaster.</a> Curr Res Insect Sci. 50, 100888(2022).</li>
<li>Zhou, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wolbachia-Driven+Memory+Loss+in+a+Parasitic+Wasp+Increases+Superparasitism+to+Enhance+Horizontal+Transmission%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Wolbachia-Driven Memory Loss in a Parasitic Wasp Increases Superparasitism to Enhance Horizontal Transmission.</a> mBio. 13 (6), e0236222(2022).</li>
<li>Ning, S. F., Zhou, J. C., Liu, Q. Q., Zhao, Q., Dong, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gradual%2C+temperature-induced+change+of+secondary+sexual+characteristics+in+Trichogramma+pretiosum+infected+with+parthenogenesis-inducing+Wolbachia%5BTitle%5D)+AND+%22PeerJ%22%5BJournal%5D)">Gradual, temperature-induced change of secondary sexual characteristics in Trichogramma pretiosum infected with parthenogenesis-inducing Wolbachia.</a> PeerJ. 7, e7567(2019).</li>
<li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreased+Wolbachia+titers+cause+gradual+change+in+masculinization+of+intersex+individuals+of+thelytokous+Trichogramma+dendrolimi%5BTitle%5D)+AND+%22Entomol+Gen%22%5BJournal%5D)">Decreased Wolbachia titers cause gradual change in masculinization of intersex individuals of thelytokous Trichogramma dendrolimi.</a> Entomol Gen. 42 (5), 751-759 (2022).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-parasitism%3A+A+promising+approach+to+simultaneously+produce+Trichogramma+chilonis+and+T.+dendrolimi+on+eggs+of+Antheraea+pernyi%5BTitle%5D)+AND+%22Entomol+Gen%22%5BJournal%5D)">Multi-parasitism: A promising approach to simultaneously produce Trichogramma chilonis and T. dendrolimi on eggs of Antheraea pernyi.</a> Entomol Gen. 41 (6), 627-636 (2021).</li>
<li>Zhou, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Thelytokous+parthenogenesis-inducing+Wolbachia+on+the+fitness+of+Trichogramma+dendrolimi+Matsumura+%28Hymenoptera%3A+Trichogrammatidae%29+in+superparasitised+and+single-parasitised+hosts%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Ecol+Evol%22%5BJournal%5D)">Effects of Thelytokous parthenogenesis-inducing Wolbachia on the fitness of Trichogramma dendrolimi Matsumura (Hymenoptera: Trichogrammatidae) in superparasitised and single-parasitised hosts.</a> Front Ecol Evol. 9, 730664(2021).</li>
<li>Flanders, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notes+on+the+life+history+and+anatomy+of+Trichogramma%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Entomol+Soc+Am%22%5BJournal%5D)">Notes on the life history and anatomy of Trichogramma.</a> Ann Entomol Soc Am. 30 (2), 304-308 (1937).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie pozostają w konflikcie interesów.

Osy Trichogramma są uznawane za skuteczne środki kontroli biologicznej, w szczególności zwalczające szereg szkodników z rzędu Lepidoptera w rolnictwie i leśnictwie1. Te maleńkie osy przechodzą swoje niedojrzałe stadia w jaju gospodarza, co stanowi wyzwanie w przeprowadzaniu eksperymentów RNAi 5,18. Badanie to stanowi kompleksowy przewodnik wizualny do przeprowadzania eksperymentów RNAi na T. denrolimi. Biorąc pod uwagę ws...

Trichogramma spp. to grupa parazytoidów jaj, które są szeroko wykorzystywane jako wysoce skuteczne środki kontroli biologicznej przeciwko szerokiemu spektrum szkodników Lepidopteran w ekosystemach rolniczych i leśnych na całym świecie1,2,3,4. Zastosowanie masowo hodowanego Trichogramma zapewnia przyjazne dla środowiska podejście do zrównoważonego zarządzania szkodnikami5,6,7. Zrozumienie biologii molekularnej os Trichogramma dostarcza cennych informacji na temat zwiększania wydajności masowej hodowli i wydajności polowej tych środków kontroli biologicznej8,9poprzez badanie metodologii regulacji genów i edycji genomu10.
Od czasu odkrycia w 1998 roku specyficznej interferencji genetycznej za pośrednictwem dwuniciowego RNA (dsRNA) u Caenorhabditis elegans, metoda interferencji RNA (RNAi) przekształciła się w niezbędny zestaw narzędzi genetycznych do badania mechanizmów regulacyjnych organizmów poprzez tłumienie ekspresji docelowych genów11. Eksperymenty RNAi stały się standardową metodologią szeroko stosowaną do badania funkcji genów u wielu gatunków owadów12,13. Niemniej jednak manipulacja RNAi stanowi ogromne wyzwanie u wielu gatunków parazytoidów, szczególnie wśród tych należących do endopasożytniczej rodziny Chalcidoidea14,15,16. Metoda RNAi została udokumentowana na co najmniej 13 gatunkach parazytoidów14,15,16,17,18,19. Wśród nich podejście RNAi zostało kompleksowo przeprowadzone na osach Nasonia i ma zastosowanie na wszystkich etapach rozwoju, w tym na zarodkach, larwach, poczwarkach i osobnikach dorosłych14,15,16. Warto zauważyć, że osy Nasonia są ektoparazytoidami, a ich potomstwo rozwija się w przestrzeni śródmiąższowej między poczwarką gospodarza a poczwarką, co umożliwia ich hodowlę in vitro i sprawia, że tolerują niektóre zabiegi, takie jak mikroiniekcja. W przeciwieństwie do os Nasonia, osobniki Trichogramma przechodzą cały swój rozwój embrionalny, larwalny i poczwarkowy wewnątrz jaja gospodarza. Warstwa w stadiach zarodka i larwy (która może utrudniać przepuszczalność dsRNA), podatność na uszkodzenia i trudności w przetrwaniu in vitro stanowią poważne przeszkody20,21,22. Dodatkowo, niewielki rozmiar osobników Trichogramma, około ~0,5 mm długości dorosłego osobnika lub poczwarki, sprawia, że manipulacja nimi jest niezwykle skomplikowana20,21,22.
W niniejszym badaniu przedstawiamy kompleksową procedurę przeprowadzania eksperymentów z interferencją RNA (RNAi) u Trichogramma denrolimi Matsumura. Procedura ta obejmuje następujące procedury: (1) projektowanie i syntezę dwuniciowego RNA (dsRNA), (2) mikroiniekcję poczwarek T. denrolimi, (3) przeszczepienie i inkubację in vitro tych poczwarek oraz (4) wykrywanie knockdownu genu docelowego za pomocą analizy RT-qPCR. Docelowym genem wybranym do eksperymentu RNAi jest homologia łańcucha ciężkiego ferrytyny (Ferhch). FerHCH, białko wiążące żelazo, zawiera centrum ferroksydazy obdarzone zdolnościami przeciwutleniającymi, ułatwiającymi utlenianie Fe2+ do Fe3+. Odgrywa niezastąpioną rolę we wzroście i rozwoju różnych organizmów poprzez utrzymanie równowagi redoks i homeostazy żelaza. Wyczerpanie FerHCH może powodować nadmierną akumulację żelaza, co prowadzi do nieodwracalnego uszkodzenia tkanek i często prowadzi do znaczących zmian fenotypowych, w tym wad wzrostu, deformacji i śmiertelności23,24. Badanie to oferuje przewodnik krok po kroku dotyczący przeprowadzania RNAi u T. denrolimi, który będzie nieoceniony w badaniu funkcji genów w szerszym kontekście os Trichogramma.

<table><tbody><tr><td>2x ES Taq MasterMix (Dye)</td><td>Cowin Biotech, Chiny</td><td>CW0690H</td><td>Do amplifikacji sekwencji dsRNA</td></tr><tr><td>20x bufor PBS, traktowany DEPC (7.2-7.6)</td><td>Sangon Biotech, Chiny</td><td>B540627-0500</td><td>Do rozcieńczania paska</td></tr><tr><td>agarowego</td> dsRNA <td>Shishi Globe Agar Industries Co., Ltd, Chiny</td><td>nie dotyczy</td><td>Do produkcji pożywki hodowlanej</td></tr><tr><td>Ampicylina sodowa</td><td>Sangon Biotech, Chiny</td><td>A610028</td><td>Do zrobienia </td></tr><tr><td>pożywka hodowlana Bioer Kąpiel metalowa o stałej temperaturze </td><td>BIOER, Chiny</td><td>MB-102</td><td>Do syntezy kapilary ze</td></tr><tr><td>szkła borokrzemianowego dsRNA </td><td>WPI, USA</td><td>1B100-4</td><td>Do wyciągania szklanej igły kapilarnej</td></tr><tr><td>Czysta ławka </td><td>Airtech, Chiny</td><td>SW-CJ-1FD</td><td>Do ekstrakcji RNA</td></tr><tr><td>Podwójnie destylowana woda</td><td>Sangon Biotech, Chiny</td><td>A500197-0500</td><td>Do rozcieńczania</td></tr><tr><td>cDNA Komora do badań środowiskowych </td><td>Panasonic, Japonia</td><td>MLR-352H-PC</td><td>Do hodowli T. denrolimi</td></tr><tr><td>Eppendorf Wirówka </td><td>Eppendrof, Niemcy</td><td>5418R</td><td>Do przechowywania zawartości RNA</td></tr><tr><td>Eppendorf FemtoJet 4i</td><td>Eppendrof, Niemcy</td><td>FemtoJet 4i</td><td>Do wstrzykiwania T. denrolimi</td></tr><tr><td>Eppendorf Wirówka z chłodzeniem </td><td>Eppendrof, Niemcy</td><td>5810R</td><td>Wirówka</td></tr><tr><td>Roztwór etanolu (75%, bez RNaz)</td><td>Aladdin, Chiny</td><td>M052131-500ml</td><td>Do ekstrakcji żelu RNA</td></tr><tr>Zestaw do<td>ekstrakcji</td><td>Omega, USA</td><td>D25000-02</td><td>Do ekstrakcji cDNA</td></tr><tr><td>GUM Arabic</td><td>Solarbio, Chiny</td><td>CG5991-500g</td><td>Aby zrobić kartę jajeczną</td></tr><tr><td>Izopropyl alchohol</td><td>Aladdin, Chiny</td><td>80109218</td><td>Aby wyekstrahować RNA</td></tr><tr><td>Laserowy ściągacz do mikropipet </td><td>SUTTER, USA</td><td>P-2000</td><td>Do ciągnięcia szklanej igły kapilarnej</td></tr><tr><td>Mikroładowarka </td><td>Eppendrof, Niemcy</td><td>20 &amp; mikro; L</td><td>Aby załadować młynek do tkanek wielopróbkowych dsRNA</td></tr><tr><td> </td><td>POROSTY, Chiny</td><td>LC-TG-24</td><td>Do mielenia T. denrolimi</td></tr><tr><td>Szlifierka igłowa </td><td>SUTTER, USA</td><td>BV-10-E</td><td>Do mielenia szklanej igły kapilarnej</td></tr><tr><td>Woda wolna od nukleaz</td><td>Sangon Biotech, Chiny</td><td></td><td>Do rozcieńczania RNA</td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>OLYMPUS OLYMPUS, Japonia</td><td>XZX16</td><td>Aby obserwować</td></tr><tr><td>maszynę do PCR</td> T. denrolimi <td>Bio-rad, USA</td><td>S-1000</td><td>Do amplifikacji DNA</td></tr><tr><td>PowerPac Basic</td><td>Bio-rad, USA</td><td>PowerPacTM Basic Do</td><td>wykrywania jakości dsRNA </td></tr><tr><td>Podkład dsGFP (Naprzód)</td><td></td><td></td><td>[TAATACGACTCACTATAGGG] ACAAACCAAGGCAAGTAATA</td></tr><tr><td>Starter dsGFP (Reverse)</td><td></td><td></td><td>[TAATACGACTCACTATAGGG] CAGAGGCATCTTCAACG</td></tr><tr><td>Starter Ferhch dla qPCR (Naprzód)</td><td></td><td></td><td>TGAAGAGATTCTGCGTTCTGCTGCT</td></tr><tr><td>Starter Ferhch dla qPCR ( Odwrócony)</td><td></td><td></td><td>CTGTAGGAACATCAGCAGGCTT</td></tr><tr><td>Starter Ferhch dla RNAi (Reverse)</td><td></td><td></td><td>[TAATACGACTCACTATAGGG]AG TAGCCATCATCTTTCC</td></tr><tr><td>Starter Ferhch dla RNAi(Forward)</td><td></td><td></td><td>[TAATACGACTCACTATAGGG] ACACTGTCAATCGTCCTG</td></tr><tr><td>Starter of FoxO dla qPCR (do przodu)</td><td></td><td></td><td>CTACGCCGATCTCATAACGC</td></tr><tr><td>Starter FoxO do qPCR (odwrócony)</td><td></td><td></td><td>TGCTGTCCCCTTGTCCT</td></tr><tr><td>Zestaw odczynników PrimeScript RT z gumką gDNA (idealny czas rzeczywisty)</td><td>TaKaRa, Japonia</td><td>RR047A Ilościowy</td><td></td></tr><tr><td>PCR w czasie rzeczywistym </td><td>Bio-rad, USA</td><td>CFX 96 Touch</td><td>Do przeprowadzania reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkryptazą (RT-PCR) </td></tr><tr>Narzędzie <td></td><td></td><td>do projektowania starterów i sond do PCR w czasie rzeczywistym (TaqMan)</td><td>https://www.genscript.com/tools/real-time-pcr-taqman-primer-design-tool/</td></tr> <tr><td>T7 RiBoMAX Express RNAi System</td><td>Promega, USA</td><td>P1700</td><td>Do syntezy dsRNA   in vitro  </td></tr><tr><td>TB Green Premix Ex TaqTM <img alt="Równanie 1" src="/files/ftp_upload/66250/66250eq01.jpg" style="margines: auto; "> (Til RnaseH Plus)</td><td>TaKaRa, Japonia</td><td>RR820A</td><td>Do wykonywania RT-qPCR</td></tr><tr><td>Trichlorometan</td><td>KESHI, Chiny</td><td>GB / T682-2002</td><td>Do ekstrakcji odczynnika RNA</td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Ambion, USA</td><td>15596018</td><td>Do ekstrakcji całkowitej zawartości RNA z próbek</td></tr><tr><td>Zamrażarka ultraniskotemperaturowa </td><td>Thermo, Stany Zjednoczone</td><td>Forma 911</td><td></td></tr></tbody></table>

interferencja rna w parazytoidzie jaja, trichogramma dendrolimi matsumura

RNA Interference in the Egg Parasitoid, Trichogramma dendrolimi Matsumura

Parazytoidy jaj, Trichogramma spp., są uznawane za skuteczne środki kontroli biologicznej przeciwko różnym szkodnikom Lepidoptera w rolnictwie i lasach. Niedojrzałe stadia potomstwa Trichogramma rozwijają się w jaju żywiciela, wykazując niezwykłą drobnienie (około 0,5 mm długości dorosłego osobnika). Metodologia interferencji RNA (RNAi) stała się kluczowym narzędziem do wyjaśniania funkcji genów w wielu organizmach. Jednak manipulowanie RNAi u niektórych małych gatunków parazytoidów, takich jak Trichogramma, na ogół stanowiło poważne wyzwanie. W niniejszej pracy przedstawiono skuteczną metodę RNAi w Trichogramma denrolimi. Przedstawiona procedura obejmuje pozyskanie i izolację pojedynczych próbek T. dendrolimi z jaj gospodarza, zaprojektowanie i syntezę dwuniciowego RNA (dsRNA), przeszczepienie i hodowlę poczwarek T. dendrolimi in vitro, mikroiniekcję dsRNA, a następnie ocenę knockdownu genu docelowego za pomocą analizy RT-qPCR. Badanie to dostarcza kompleksowej, wizualnie szczegółowej procedury przeprowadzania eksperymentów RNAi u T. dendrolimi, umożliwiając w ten sposób naukowcom zbadanie regulacji genów u tego gatunku. Co więcej, metodologia ta może być dostosowana do badań RNAi lub mikroiniekcji u innych gatunków Trichogramma z niewielkimi korektami, co czyni ją cennym punktem odniesienia do przeprowadzania eksperymentów RNAi u innych gatunków endopasożytniczych.

Wskaźnik wyklucia poczwarek T. denrolimi wstrzykniętych z dsFerhch był znacznie niższy niż w przypadku osobników wstrzykniętych z dsGFP lub tych, którym nie wykonano wstrzyknięcia (Tabela 1). Wśród wyklutych błoniczek, 51,85% osobników T. denrolimi poddanych działaniu dsFerhch rozwinęło zdeformowane, małe skrzydła. Zdeformowane błoniczki nie zostały zaobserwowane u osobników wstrzykniętych z dsGFP ani u tych bez wstrzyknięcia (Tabela 1</strong...

Manipulacja interferencją RNA (RNAi) stanowi ogromne wyzwanie dla wielu gatunków parazytoidów o niewielkich rozmiarach, takich jak osy Trichogramma. W badaniu tym opracowano skuteczną metodę RNAi u Trichogramma denrolimi. Obecna metodologia zapewnia solidny model do badania regulacji genów u os Trichogramma.

Interferencja RNA w parazytoidzie jaja, Trichogramma dendrolimi Matsumura

The egg parasitoids, Trichogramma spp, are recognized as efficient biological control agents against various lepidopteran pests in agriculture and ...

Osy Trichogramma to grupa parazytoidów jaj stosowanych do zwalczania szkodników laboratoryjnych w rolnictwie. Wewnątrzkomórkowe bakterie Wolbachia wywołują cysty, ale nie genezę u niektórych os Trichogramma. Próbujemy odpowiedzieć na pytanie o metodę metaboliczną Wolbachia i systemy determinacji płci u os Trichogramma.Opracowaliśmy metodę interferencji RNA u os Trichogramma. Metoda ta jest niezbędnym zestawem narzędzi genetycznych do badania funkcji genów Trichogramma. Tak więc w głównych stadiach Trichogramma potomstwo rozwija się w jaju żywiciela.Rozmiar ciała Trichogramma jest bardzo mały i wynosi około 0,5 milimetra w soczewce dla dorosłych. Manipulowanie narzędziami genetycznymi, takimi jak interferencja RNA i edycja genomu, stanowi ogromne wyzwanie dla tych maleńkich parazytoidów. Przez dziesięciolecia funkcja genomu w obrębie całego rodzaju Trichogramma była rzadko badana.Obecna metodologia zapewnia solidny model do badania ogólnych regulacji podczas działań rozwojowych i fizjologicznych u os Trichogramma. Na początek dodaj roztwór gumy arabskiej w proszku i wody do karty o wymiarach 9 centymetrów na 16 centymetrów. Następnie umieść około 5 000 jaj Corycephalotica na karcie.Poddaj karty jaj gospodarza 30-minutowemu naświetlaniu promieniami ultrafioletowymi, aby zapobiec wykluwaniu się jaj. Następnie pokrój papier z inaktywowanymi jajkami na karty jajek, z których każda zawiera około 300 do 500 jaj. Następnie wprowadź kohortę od 80 do 120 os Trichogramma dendrolimi do szklanej probówki.Uszczelnij rurkę bawełną. W celu pasożytowania pozwól osom złożyć jaja w jajach żywiciela na sześć godzin. Następnie natychmiast usuń osy.Hoduj jaja pasożytniczego żywiciela przez około osiem dni w temperaturze 25 stopni Celsjusza. Po pięciu dniach jaja pasożytniczego żywiciela stały się czarne. Przenieś kartę jaja gospodarza do mikroskopu preparacyjnego.Za pomocą pary igieł wolframowych skrupulatnie usuń kosmówkę z jaj gospodarza i odzyskaj poczwarkę od wewnątrz. Następnie przygotuj płytkę z 1,5% agarem jako substratem. Za pomocą zdezynfekowanego grawera wytraw kilka rowków na agarze .Teraz za pomocą małego pędzla przeszczep poczwarkę z wypreparowanego jaja żywiciela do jednego z rowków na podłożu agarowym. Aby rozpocząć, włącz ściągacz do szklanych igieł. Następnie ustaw ciepło na 280, prędkość na 170, opóźnienie na 250, a biegun na 30.Skos końcówkę igły ze szkła kapilarnego. Następnie, za pomocą pompy do mikroiniekcji, załaduj około dwóch mikrolitrów dwuniciowego roztworu RNA o homologii łańcucha ciężkiego ferrytyny do igły iniekcyjnej. Przenieść płytkę agarową zawierającą poczwarki Trichogramma dendrolimi na stolik mikroskopu złożonego.Ostrożnie włóż igłę do wstrzykiwań do brzucha poczwarki pod kątem około 30 stopni i stopniowo wstrzykuj pięć nanolitrów dwuniciowego roztworu RNA o homologii łańcuchów ciężkich ferrytyny. Inkubować około 700 poczwarek na zabieg w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez 24 lub 48 godzin. Ekstrahować zawartość RNA ze 100 poczwarek na replikę.Z około 50 poczwarek na zabieg obserwuj pojawienie się os. Na koniec zapisz szybkość pojawiania się os i wskaźnik deformacji. Poczwarki T. dendrolimi, którym wstrzyknięto dwuniciową homologię łańcucha ciężkiego ferrytyny, wykazywały znacznie niższą szybkość pojawiania się w porównaniu z tymi, którym wstrzyknięto dwuniciowy GFP lub bez wstrzyknięcia.U wynurzonych os 51,85% os T.dendrolimi poddanych dwuniciowej homologii łańcucha ciężkiego ferrytyny rozwinęło zdeformowane małe skrzydła. Deformacja ta nie występowała u os, którym wstrzyknięto dwuniciowy GFP lub u tych, którym nie wstrzyknięto żadnej iniekcji. Dodatkowo, poczwarki T.dendrolimi, którym wstrzyknięto dwuniciową homologię łańcucha ciężkiego ferrytyny, wykazywały melanizm, co wskazuje na nieprawidłowy metabolizm żelaza.Melanizmu nie zaobserwowano u os, którym wstrzyknięto dwuniciową GFP lub bez żadnej iniekcji.

rna-interference-egg-parasitoid-trichogramma-dendrolimi

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

RNA (RNAi) są podstawą badań nad Tribolium. W tym miejscu przedstawiamy przegląd naszej techniki RNAi larwalnych w Tribolium castaneum. Larwalne RNAi to prosta, ale potężna technika, która zapewnia szybki dostęp do fenotypów utraty funkcji, umożliwiając naukowcom badanie funkcji genów w różnych kontekstach.

Interferencja larwalnego RNA u chrząszcza mącznego (Tribolium castaneum)

Ten protokół zawiera wytyczne do przeprowadzania eksperymentów z odrzucaniem jaj: nakreślenie technik malowania eksperymentalnych modeli jaj w celu naśladowania kolorów naturalnych jaj ptaków, prowadzenie badań terenowych i analizowanie zebranych danych. Protokół ten zapewnia jednolitą metodę przeprowadzania porównywalnych eksperymentów z odrzucaniem jaj.

Badanie granic rozpoznawania jaj za pomocą eksperymentów z odrzucaniem jaj wzdłuż gradientów fenotypowych

W tym protokole, metody przeprowadzania krzyżówek wsobnych i oceny sukcesu tych krzyżówek, są opisane dla mrówki Vollenhovia emeryi. Protokoły te są ważne dla eksperymentów mających na celu zrozumienie genetycznych podstaw systemów determinacji płci u błonkoskrzydłych.

Indukcja i ocena krzyżówek wsobnych z wykorzystaniem mrówki, Vollenhovia emeryi

Prezentujemy prostą technikę cytogenetyczną z użyciem 4′,6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI) do określenia wskaźnika zapłodnienia i pierwotnego stosunku płci haplodifidowego szkodnika inwazyjnego Bemisia tabaci.

Określanie szybkości zapłodnienia jaj Bemisia tabaci za pomocą techniki cytogenetycznej

Udostępniamy szczegółowy protokół hodowli, mikroiniekcji jaj i efektywnego krycia ognika Thermobia domestica w celu wytworzenia i utrzymania zmutowanych szczepów po edycji genomu.

Mikroiniekcja jaj i skuteczne krycie w celu edycji genomu u Firebrat Thermobia domestica

Udostępniamy szczegółowy protokół interferencji RNA za pośrednictwem elektroporacji u owadów z rzędu Odonata (ważki i ważki) przy użyciu ważki niebieskoogoniastej (Ischnura senegalensis: Coenagironidae: Zygoptera) i ważki srokatej (Pseudothemis zonata: Libellulidae: Anisoptera).

Metoda interferencji RNA za pośrednictwem elektroporacji w Odonata

Prezentowany tutaj jest protokół mikroiniekcji zarodka Helicoverpa armigera (Hübner) i identyfikacji mutantów nokautujących, stworzony przez edycję genomu CRISPR/Cas9. Zmutowane owady umożliwiają dalsze badania funkcji genów i interakcji między różnymi genami in vivo.

Mikroiniekcja zarodka i identyfikacja mutanta nokautującego Helicoverpa armigera z edytowanym genomem CRISPR/Cas9 (Hübner)

Obecny protokół opisuje metodę hodowli owadów szkodników w laboratoriach. Procedury rozróżniania płci owadów i ekstrakcji kwasów nukleinowych w celu sekwencjonowania o wysokiej przepustowości są ustalane przy użyciu dwóch szkodników tortricid.

Masowy chów i badania molekularne owadów szkodników Tortricidae

Ten protokół opisuje interferencję RNA i test ChIP w celu zbadania epigenetycznego dziedziczenia indukowanego przez RNAi wyciszania i związanych z nim modyfikacji chromatyny u C. elegans.

Analiza międzypokoleniowego dziedziczenia epigenetycznego u C. elegans przy użyciu fluorescencyjnego reportera i immunoprecypitacji chromatyny (ChIP)

Tutaj prezentujemy protokół ekstrakcji jadu z Trichogramma dendrolimi za pomocą sztucznego gospodarza stworzonego z folii polietylenowej i roztworu aminokwasów.

Ekstrakcja jadu z pasożytniczej osy Trichogramma dendrolimi przy użyciu sztucznego żywiciela

Prezentowany tutaj jest protokół dostarczania nanocząsteczek chitozan/dsRNA larwom jedwabników Bombyx mori w celu wywołania wyciszenia genów poprzez spożycie.

Interferencja RNA larw w jedwabniku Bombyx mori poprzez dostarczanie nanocząstek chitozanu/dsRNA

Poznaj metodę interferencji RNA w parazytoidzie jaja Trichogramma dendrolimi. Technika mikroiniekcji dsRNA umożliwia badanie regulacji genów i funkcji genetycznych w małych organizmach kluczowych dla biologicznej ochrony roślin.

Interferencja RNA w parazytoidzie jaja, Trichogramma dendrolimi Matsumura

Przeglądaj więcej filmów