Name: Hodowla Axenic Delia antiqua z częściowo fermentowaną, sterylną dietą (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-22T14:55:00.000+00:00
Duration: 5 min 58 s
Description: Poznaj metodę hodowli aksenicznej Delia antiqua z częściowo fermentowaną sterylną dietą. Protokół eliminuje bakterie jelitowe bez skutków ubocznych i wykrywa szczep Wolbachia metodą PCR, oferując skuteczniejszą alternatywę dla antybiotyków.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (32272530), Projekt New Twenty Policies for University in Jinan (2021GXRC040), Główne Projekty Innowacji Naukowych i Technologicznych w prowincji Shandong (2021TZXD002) oraz Projekt Integracji Nauki i Edukacji Uniwersytetu Technologicznego Qilu (2022PYI009, 2022PY016, 2022PT105).

D. antiqua są pozyskiwane z pola Fanzhen, Taian.
1. Przygotowanie bezpłodnych diet
<ol>
	<li>Oderwij zewnętrzne warstwy szalotki i wyrzuć zielone liście. Zachowaj białą część szalotki (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A) i umyj ją sterylną wodą, powtarzając proces płukania trzy razy. Pokrój białą część szalotki na 1-2 cm pokrojone w kostkę kawałki za pomocą nożyczek (patrz Tabela materiałów) wysterylizowanych 75 % roztworem EtOH (wspomnianym w kroku 2.5) do późniejszego wykorzystania.</li>
	<li>Zważ 50 g pokrojonej w kostkę szalotki i umieść ją w robocie kuchennym (patrz tabela materiałów). Dodaj 50 ml wysterylizowanej wody i zmiel je pięć razy po 2 minuty. Wszystkie pokrojone w kostkę szalotki powinny być zmielone na konsystencję pasty (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A).</li>
	<li>Za pomocą pęsety przenieś 10 sztuk larw D. antiqua w trzecim stadium rozwojowym do probówki wirówkowej o pojemności 10 ml zawierającej 10 ml 1x PBS i zmiel je jednorazowym tłuczkiem do mielenia (patrz Tabela materiałów) przez około 5 minut, aby uzyskać płyn do mielenia larw.</li>
	<li>Wlać pastowatą ciecz z szalotki i płyn do mielenia larw do czystej kolby stożkowej o pojemności 500 ml (patrz tabela materiałów). Owinąć stożkowe ujście kolby dwiema warstwami przezroczystej folii uszczelniającej, a następnie umieścić kolbę w inkubatorze do wytrząsania (patrz Tabela Materiałów) do fermentacji w temperaturze 25 °C i 180 obr./min przez 12 godzin (<klasa silna = "xfig">Rysunek 2B).</li>
	<li>Wytnij nożyczkami siedem warstw kwadratowej gazy o bokach 10 cm (nie ma potrzeby sterylności) i ułóż je razem, aby utworzyć proste urządzenie filtrujące. Powoli wlej sfermentowany płyn z szalotki na gazę i wyciśnij przefiltrowany płyn do nowej stożkowej kolby o pojemności 500 ml. Pozostałe resztki szalotki zawiń na gazie w folię aluminiową do późniejszego wykorzystania.</li>
	<li>Przefiltrować filtrat otrzymany w poprzednim kroku za pomocą pompy próżniowej (patrz tabela materiałów) i lejka Buchnera. Umieść bibułę filtracyjną zwilżoną wodą dejonizowaną na lejku Buchnera, a następnie wlej filtrat i trzykrotnie wykonaj filtrację ssącą za pomocą innej bibuły filtracyjnej. Zebrać końcowy filtrat do kolby stożkowej o pojemności 500 ml.</li>
	<li>Wykonaj kolejną filtrację za pomocą butelki filtrującej 0,22 μM i pompy próżniowej. Przykręć pokrywę kolby z filtrem ssącym w ultra czystej ławce (patrz Tabela materiałów) w celu dalszego użycia. W tym momencie otrzymuje się sfermentowaną pozostałość szalotki i filtrat (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 2C). 
	UWAGA: Przefiltrowana ciecz uzyskana na tym etapie będzie sterylna. (Butelka filtrująca 0,22 μM to sterylny system filtracji próżniowej do sterylizacji filtratu).</li>
	<li>Powtórz poprzednie kroki, aby uzyskać niesfermentowaną pozostałość szalotki i przesączenie. Tutaj różnica polega na tym, że fermentacja nie jest potrzebna.</li>
	<li>Odważyć 0,24 g chlorku choliny i 0,56 g kwasu L-askorbinowego (patrz tabela materiałów) w probówce wirówkowej o pojemności 10 ml. Dodaj 3 ml wody dejonizowanej i energicznie wstrząsaj, aż całkowicie się rozpuszczą. Na ultra czystej ławce użyj nowej strzykawki o pojemności 5 ml i podłącz trzy filtry strzykawkowe 0,22 μM (patrz tabela materiałów), aby wysterylizować roztwór i umieść go w sterylnej probówce wirówkowej o pojemności 10 ml do późniejszego użycia. 
	UWAGA: Chlorek choliny jest niezbędnym neuroprzekaźnikiem do wzrostu owadów, podczas gdy kwas L-askorbinowy działa jako środek konserwujący.</li>
	<li>Odważyć 2 g agaru w proszku i 6 g TSB (patrz Tabela Materiałów) i wlać je do kolby stożkowej o pojemności 500 ml. Następnie dodaj 100 ml wody dejonizowanej, aby przygotować pożywkę hodowlaną. Po spłukaniu szklanego pręta wodą dejonizowaną użyj go do mieszania mieszaniny, aż dobrze się wymiesza. Następnie uszczelnić kolbę stożkową za pomocą dwóch warstw przezroczystej folii uszczelniającej.</li>
	<li>Zawiń sfermentowane szalotki i niesfermentowane szalotki (wymienione w kroku 1.5 i kroku 1.8) w folię aluminiową i sterylizuj je, wraz z pożywką, w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 20 minut.</li>
	<li>Na ultra czystej ławce wlej wysterylizowany chlorek choliny, kwas L-askorbinowy i sterylny filtrat do pożywki hodowlanej, delikatnie obracając, aby dokładnie je wymieszać. Na koniec dodaj sfermentowaną i niesfermentowaną szalotkę i energicznie wstrząśnij ręcznie, aby uzyskać sterylną dietę. Wlej diety do probówek wirówkowych o pojemności 50 ml (sterylne; nasadka odpowietrzająca z hydrofobową membraną PVDF 0,22 μM) (patrz tabela materiałów) pod kątem (<silna klasa="xfig">Rysunek 2D). 
	UWAGA: Po sterylizacji temperatura pożywki hodowlanej powinna być utrzymywana w zakresie 65-80 °C, aby zapobiec szybkiemu schłodzeniu i zestaleniu podczas dodawania szalotki lub innych składników. Poza tym do każdej probówki wlej około 10-15 ml diety. Po zestaleniu się pokarmu należy przechowywać probówki w lodówce w temperaturze 4 °C, jeśli nie zostaną natychmiast zużyte.</li>
</ol>
2. Pozyskiwanie jaj aksenicznych
<ol>
	<li>Laboratoryjny system chowu D. antiqua
	<ol>
		<li>Umieścić klatkę hodowlaną w inkubatorze o temperaturze 25 °C z wewnętrznym oświetleniem LED (24 godziny w cyklu, stosunek światła do ciemności wynosi 16:8), aby wychować dorosłe samce i samice, umożliwiając im łączenie się w pary i składanie jaj. Napełnij dystrybutor wody (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B) wodą i uszczelnij go zwilżoną watą, aby zapewnić wodę dorosłym.</li>
		<li>Umieść cztery dna szalek Petriego o wymiarach 35 mm x 12 mm w pokrywie szalki Petriego o wymiarach 94 mm x 16 mm. Zwilż watę zjonizowaną wodą, a następnie umieść wilgotną watę na dwóch dnie szalki Petriego, a na wierzch waty dodaj jedną łyżkę sacharozy.</li>
		<li>Wypełnij pozostałe dwie płytki Petriego dwiema łyżkami sacharozy i ekstraktu drożdżowego (patrz Tabela Materiałów), które służą jako pokarm dla dorosłych owadów (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C). 
		UWAGA: Sacharoza i ekstrakt drożdżowy wymienione w krokach 2.1.2 i 2.1.3 nie muszą być sterylizowane.</li>
		<li>Umieść dno szalki Petriego o wymiarach 94 mm x 16 mm zawierające zwilżony piasek i kawałek nieukorzenionego, obranego ząbka czosnku (<silna klasa="xfig">Rysunek 1D) do klatki na muchy, aby zebrać jaja. Samica zostanie zwabiona zapachem czosnku i złoży wokół niego jaja.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zbieranie jaj
	<ol>
		<li>Wyjąć z klatki przyrząd do składania jaj, który jest szalką Petriego o wymiarach 94 mm x 16 mm zawierającą piasek i czosnek wymienione powyżej (krok 2.14). Wlej piasek razem z czosnkiem do zlewki o pojemności 500 ml i użyj wody z kranu, aby wypłukać pozostałe jajka z czosnku do zlewki. W tym momencie jaja unoszą się w wodzie.</li>
		<li>Weź sito o oczkach 100 (patrz Tabela materiałów) i zwilż je wodą z kranu. Następnie wlej wodę zawierającą pływające jajka ze zlewki na sito. Jajka pozostaną na sicie.</li>
		<li>Po naturalnym wyschnięciu jajek na sicie, za pomocą szczotki delikatnie przemieść jajka na szalkę Petriego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pierwszego dnia przepłucz urządzenie do składania jaj, aby zebrać jaja bez dezynfekcji lub sterylizacji. Drugiego dnia o godzinie czwartej po południu ponownie spłucz jajka i zbierz je, przesiewając je czystą wodą. 
	UWAGA: Zebranie jaj w drugim dniu ma zapewnić stałe tempo wzrostu w kolejnych etapach. Godzina czwarta po południu to szczyt składania jaj przez D. antiqua. Dlatego idealnie jest zbierać jaja w tym czasie.</li>
	<li>Umieść zebrane jaja na sterylnym sicie komórkowym (patrz Tabela Materiałów) na ultra czystej ławce (<silna klasa="xfig">Rysunek 3A).</li>
	<li>Przygotuj roztwór do sterylizacji jaj
	<ol>
		<li>Pobrać 5 ml 5,2% NaClO (patrz tabela materiałów) i przenieść do wysterylizowanej kolby stożkowej o pojemności 250 ml. Dodać 95 ml wysterylizowanej wody, aby uzyskać całkowitą objętość 100 ml, co daje 0,26% roztwór NaClO.</li>
		<li>Aby przygotować 75% roztwór EtOH, należy pobrać 75 ml 99,7% EtOH i przenieść go do wysterylizowanej kolby stożkowej o pojemności 250 ml. Dodaj 25 ml wysterylizowanej wody, aby uzyskać całkowitą objętość 100 ml, co daje 75% roztwór EtOH.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wlać 30 ml NaClO do szalki Petriego i wlać 30 ml EtOH do innej szalki Petriego. Umieścić sito komórkowe zawierające jaja, o których mowa w kroku 2.4, w naczyniu zawierającym NaClO. Namocz go w 0,26% roztworze NaClO na 0,5 minuty. Następnie przenieś sito do naczynia zawierającego EtOH, pozwalając mu zanurzyć się w 75% roztworze EtOH przez kolejne 0,5 minuty.</li>
	<li>Powtórz ten proces trzy razy, naprzemiennie 0,26% NaClO i 75% EtOH co 0,5 minuty. Następnie zostaną uzyskane jaja akseniczne. W tym momencie sito zawierające jaja należy zanurzyć w EtOH. 
	UWAGA: Aby zapewnić dokładną sterylizację, użyj pipety o pojemności 1 ml do odessania NaClO i EtOH i rozproszenia jaj. Powtórz proces płukania wiele razy. Ten krok dodatkowo oczyści powierzchnię jaj z resztek bakterii i zanieczyszczeń, zapewniając czystą i sterylną powierzchnię.</li>
</ol>
3. Hodowla larw aksenicznych
<ol>
	<li>Aby przenieść wysterylizowane jaja, użyj nożyczek, które zostały wysterylizowane lampą alkoholową, aby przeciąć końcową końcówkę pipety o pojemności 1 ml (<silna klasa = "xfig">Rysunek 3B). Upewnij się, że otwór końcowy pociętej pipety jest większy niż średnica jaj (około 2 mm). Następnie za pomocą pipety przenieś jaja z roztworu EtOH (jaja razem z roztworem) (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3C) do probówki wirówkowej zawierającej sterylne diety, a każda probówka powinna zawierać około 20-50 jaj (<silna klasa = "xfig">Rysunek 3D). Powtarzaj ten proces, aż wszystkie jaja zostaną przeniesione. 
	UWAGA: Średnica końcówki pipety powinna być jak największa, aby uniknąć rozbicia jaj podczas przenoszenia, co mogłoby doprowadzić do ich śmierci.</li>
	<li>Użyj pipety, aby usunąć nadmiar etanolu z probówki. Umieść probówkę wirówkową zamkniętą pokrywkami w samozamykającej się torbie i umieść kawałek bawełny w otworze worka, aby umożliwić cyrkulację powietrza. Na koniec umieść worek w inkubatorze o temperaturze 25 °C (wilgotność względna: 50%-70%; fotoperiod: 16 godzin światła: 8 godzin ciemności) w celu obserwacji i uprawy.</li>
	<li>Około trzy dni później zaczynają wykluwać się jaja akseniczne w diecie (<silna klasa="xfig">Ryc. 4A). Wyklute larwy będą aktywne, a powierzchnia sterylnych diet nie będzie już gładka. Larwy zaczną żerować na dietach.</li>
	<li>Kontynuuj obserwację larw, aż osiągną stadium larw 2. stadium. Monitoruj ich wzrost i rozwój w tym okresie.</li>
	Po 9-12 dniach ponad 80% jaj rozwinęło się w larwy w trzecim stadium rozwojowym (<silna klasa="xfig">Ryc. 4B).<li> Wskazuje to na pomyślny wzrost i rozwój larw.</li>
</ol>
4. Walidacja larw aksenu za pomocą testów zależnych od hodowli
<ol>
	<li>Losowo wybierz trzy larwy 3. stadium osiowego z probówki wirówkowej.</li>
	<li>Umieścić larwy na szalce Petriego o wymiarach 94 mm x 16 mm zawierającej 75% alkoholu w celu oczyszczenia. Następnie przenieś je do pojemnika ze sterylną wodą w celu dalszego płukania.</li>
	<li>Użyj zdezynfekowanych kleszczy preparacyjnych, które zostały wysterylizowane 75% roztworem EtOH, aby chwycić larwy (głowa i ogon są pokazane na <silna klasa = "xfig" >Rysunek 5A). Użyj nożyczek preparacyjnych, aby usunąć końce głowy i ogona (<silna klasa="xfig">Rysunek 5B). Przytrzymaj ogon larw kleszczami i użyj innych kleszczy, aby delikatnie ścisnąć od ogona do głowy i wydobyć narządy wewnętrzne (wynik pokazany w <silna klasa="xfig">Rysunek 5C). Umieść narządy wewnętrzne w wodzie dejonizowanej i delikatnie oderwij jelito, naciskając kleszczami na tkankę tłuszczową, a następnie umieść wyekstrahowaną wewnętrzną (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 5D) w sterylnej wodzie do dalszego użytku.</li>
	<li>Umieść jelito w sterylnej probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml, dodaj 500 μl wysterylizowanego buforu 1x PBS i użyj jednorazowego tłuczka do zmielenia tkanki jelitowej na homogenat.</li>
	<li>Weź 100 μl homogenatu i dodaj go do pożywki agarowej. Użyj rozsiewacza w kształcie litery L (patrz Tabela materiałów) do smugowania płytki agarowej.</li>
	<li>Umieścić szalkę Petriego w inkubatorze biochemicznym w temperaturze 28 °C i inkubować przez 72 godziny, aby obserwować wzrost kolonii.</li>
</ol>
5. Walidacja larw aksenu za pomocą testów niezależnych od hodowli
<ol>
	<li>Ekstrahować całkowite DNA z tkanki jelitowej larw aksenicznych za pomocą zestawu do ekstrakcji DNA (patrz tabela materiałów) zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Zmierz stężenie DNA za pomocą spektrofotometru UV.</li>
	<li>Przeprowadzić reakcję PCR przy użyciu uniwersalnych bakteryjnych starterów 16S rRNA (1492R: 5'- GGTTACCTTGTTACGACTT -3', 27F: 5'- AGAGTTTGATCATGGCTCAG -3'). Całkowita objętość reakcyjna wynosi 25 μl i składa się z 1 μl matrycy DNA, 0,5 μl startera do przodu, 0,5 μl startera wstecznego, 10,5 μl ddH2O i 12,5 μl 2x Taq PCR Master Mix (patrz tabela materiałów). Ustawić warunki reakcji PCR w następujący sposób: początkowa denaturacja w temperaturze 94 °C przez 3 min; 35 cykli denaturacji w temperaturze 94 °C przez 30 s, wyżarzania w temperaturze 55 °C przez 30 s i przedłużania w temperaturze 72 °C przez 90 s; końcowe przedłużenie w temperaturze 72 °C przez 10 min. Produkty PCR należy przechowywać w temperaturze 4 °C do dalszej analizy.</li>
	<li>Przeprowadzić reakcję PCR przy użyciu uniwersalnych starterów ITS grzybów (ITS1: 5'- TCCGTAGGTGAACCTGCGG -3', ITS4: 5'- TCCTCCGCTTATTGATATGC -3'). Całkowita objętość reakcyjna wynosi 25 μl i składa się z 1 μl matrycy DNA, 0,5 μl startera do przodu, 0,5 μl startera odwrotnego, 10,5 μl ddH2O i 12,5 μl 2x Taq PCR Master Mix. Ustawić warunki PCR w temperaturze 95 °C na 5 minut; 35 cykli w temperaturze 95 °C przez 30 s, 55 °C przez 1 min i 72 °C przez 90 s; następnie w temperaturze 72 °C przez 10 min. Produkty PCR należy przechowywać w temperaturze 4 °C do dalszej analizy.</li>
	<li>Użyj barwnika kwasu nukleinowego Super Green (patrz Tabela materiałów), aby równomiernie wymieszać z każdym z dwóch rodzajów produktów PCR i przeanalizować je za pomocą elektroforezy na 1% żelu agarozowym w 1x buforze TAE (rozcieńczonym z 50x TAE, patrz Tabela Materiałów). Jako odniesienie należy użyć 3 μl markera DNA (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Użyj transiluminatora UV, aby obserwować żel i zlokalizować docelowy fragment.</li>
</ol>

Studying Development of Axenic Delia antiqua and Ensuring Bacteria-Free Growth

<ol><li>Al-Asmakh, M., Zadjali, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+germ-free+animal+models+in+microbiota-related+research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Use of germ-free animal models in microbiota-related research.</a> Journal of Microbiology and Biotechnology. 25 (10), 1583-1588 (2015).</li>
<li>Bhattarai, Y., Kashyap, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germ-free+mice+model+for+studying+host-microbial+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Germ-free mice model for studying host-microbial interactions.</a> Methods in Molecular Biology. 1438, 123-135 (2016).</li>
<li>Douglas, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiorganismal+insects%3A+diversity+and+function+of+resident+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Entomology%22%5BJournal%5D)">Multiorganismal insects: diversity and function of resident microorganisms.</a> Annual Review of Entomology. 60 (1), 17-34 (2015).</li>
<li>Wang, G. -H., Brucker, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+method+for+Nasonia+germ-free+rearing%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">An optimized method for Nasonia germ-free rearing.</a> Scientific Reports. 12 (1), 219(2022).</li>
<li>Nishide, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aseptic+rearing+procedure+for+the+stinkbug+Plautia+stali+%28Hemiptera%3A+Pentatomidae%29+by+sterilizing+food-derived+bacterial+contaminants%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Entomology+and+Zoology%22%5BJournal%5D)">Aseptic rearing procedure for the stinkbug Plautia stali (Hemiptera: Pentatomidae) by sterilizing food-derived bacterial contaminants.</a> Applied Entomology and Zoology. 52 (3), 407-415 (2017).</li>
<li>Ma, M., Liu, P., Yu, J., Han, R., Xu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparing+and+rearing+axenic+insects+with+tissue+cultured+seedlings+for+host-gut+microbiota+interaction+studies+of+the+leaf+beetle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Preparing and rearing axenic insects with tissue cultured seedlings for host-gut microbiota interaction studies of the leaf beetle.</a> Journal of Visualized Experiments. 176, e63195(2021).</li>
<li>Zhu, Z., Wang, D., Liu, Y., Tang, T., Wang, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+the+rearing+procedure+of+germ-free+wasps%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Optimizing the rearing procedure of germ-free wasps.</a> Journal of Visualized Experiments. 197, e65292(2023).</li>
<li>Somerville, J., Zhou, L. Q., Raymond, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aseptic+rearing+and+infection+with+gut+bacteria+improve+the+fitness+of+transgenic+diamondback+moth%2C+Plutella+xylostella%5BTitle%5D)+AND+%22Insects%22%5BJournal%5D)">Aseptic rearing and infection with gut bacteria improve the fitness of transgenic diamondback moth, Plutella xylostella.</a> Insects. 10 (4), 89(2019).</li>
<li>Shuoying, N., Jiufeng, W., Jinian, F., Hugo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicting+the+current+potential+and+future+world+wide+distribution+of+the+onion+maggot%2C+Delia+antiqua+using+maximum+entropy+ecological+niche+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Predicting the current potential and future world wide distribution of the onion maggot, Delia antiqua using maximum entropy ecological niche modeling.</a> PLoS ONE. 12 (2), e0171190(2017).</li>
<li>Ellis, P. R., Eckenrode, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+influencing+resistance+in+Allium+sp.+to+onion+maggot%5BTitle%5D)+AND+%22Bulletin+of+the+Entomological+Society+of+America%22%5BJournal%5D)">Factors influencing resistance in Allium sp. to onion maggot.</a> Bulletin of the Entomological Society of America. 25 (2), 151-154 (1979).</li>
<li>Nault, B. A., Straub, R. W., Taylor, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+of+novel+insecticide+seed+treatments+for+managing+onion+maggot+%28Diptera+%3A+Anthomyiidae%29+in+onion+fields%5BTitle%5D)+AND+%22Crop+Protection%22%5BJournal%5D)">Performance of novel insecticide seed treatments for managing onion maggot (Diptera : Anthomyiidae) in onion fields.</a> Crop Protection. 25 (1), 58-65 (2006).</li>
<li>Leach, A., Reiners, S., Fuchs, M., Nault, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+integrated+pest+management+tactics+for+onion+thrips+and+pathogens+they+transmit+to+onion%5BTitle%5D)+AND+%22Agriculture+Ecosystems+%26+Environment%22%5BJournal%5D)">Evaluating integrated pest management tactics for onion thrips and pathogens they transmit to onion.</a> Agriculture Ecosystems & Environment. 250, 89-101 (2017).</li>
<li>Zhou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+Inhibition+on+Beauveria+bassiana+Contributes+to+Microbiota+Stability+in+Delia+antiqua%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Bacterial Inhibition on Beauveria bassiana Contributes to Microbiota Stability in Delia antiqua.</a> Frontiers in Microbiology. 12, 710800(2021).</li>
<li>Zhou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Symbiotic+bacterium-derived+organic+acids+protect+delia+antiqua+larvae+from+entomopathogenic+fungal+infection%5BTitle%5D)+AND+%22mSystems%22%5BJournal%5D)">Symbiotic bacterium-derived organic acids protect delia antiqua larvae from entomopathogenic fungal infection.</a> mSystems. 5 (6), 00778-00820 (2020).</li>
<li>Jing, T. Z., Qi, F. H., Wang, Z. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Most+dominant+roles+of+insect+gut+bacteria%3A+digestion%2C+detoxification%2C+or+essential+nutrient+provision%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiome%22%5BJournal%5D)">Most dominant roles of insect gut bacteria: digestion, detoxification, or essential nutrient provision.</a> Microbiome. 8 (1), 38(2020).</li>
<li>Kietz, C., Pollari, V., Meinander, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+germ-free+drosophila+to+study+gut-microbe+interactions%3A+protocol+to+rear+Drosophila+under+axenic+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Generating germ-free drosophila to study gut-microbe interactions: protocol to rear Drosophila under axenic conditions.</a> Current Protocols in Toxicology. 77 (1), e52(2018).</li>
<li>Schretter, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gut+microbial+factor+modulates+locomotor+behaviour+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A gut microbial factor modulates locomotor behaviour in Drosophila.</a> Nature. 563 (7731), 402(2018).</li>
<li>Brummel, T., Ching, A., Seroude, L., Simon, A. F., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+lifespan+enhancement+by+exogenous+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Drosophila lifespan enhancement by exogenous bacteria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (35), 12974-12979 (2004).</li>
<li>Romoli, O., Schonbeck, J. C., Hapfelmeier, S., Gendrin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+germ-free+mosquitoes+via+transient+colonisation+allows+stage-specific+investigation+of+host-microbiota+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Production of germ-free mosquitoes via transient colonisation allows stage-specific investigation of host-microbiota interactions.</a> Nature Communications. 12 (1), 942(2021).</li>
<li>Ma, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+and+immunological+effects+of+gut+microbiota+in+leaf+beetles+at+the+local+and+systemic+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Zoology%22%5BJournal%5D)">Metabolic and immunological effects of gut microbiota in leaf beetles at the local and systemic levels.</a> Integrative Zoology. 16 (3), 313-323 (2021).</li>
<li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+between+microbial+communities+of+pinus+species+having+differing+level+of+resistance+to+the+pine+wood+nematode%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Ecology%22%5BJournal%5D)">Differences between microbial communities of pinus species having differing level of resistance to the pine wood nematode.</a> Microbial Ecology. 84 (4), 1245-1255 (2022).</li>
<li>Jung, S., Kim, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+effect+of+Xenorhabdus+nematophila+K1+and+Bacillus+thuringiensis+subsp+aizawai+against+Spodoptera+exigua+%28Lepidoptera+%3A+Noctuidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Control%22%5BJournal%5D)">Synergistic effect of Xenorhabdus nematophila K1 and Bacillus thuringiensis subsp aizawai against Spodoptera exigua (Lepidoptera : Noctuidae).</a> Biological Control. 39 (2), 201-209 (2006).</li>
<li>Raymond, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mid-gut+microbiota+is+not+required+for+the+pathogenicity+of+Bacillus+thuringiensis+to+diamondback+moth+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A mid-gut microbiota is not required for the pathogenicity of Bacillus thuringiensis to diamondback moth larvae.</a> Environmental Microbiology. 11 (10), 2556-2563 (2009).</li>
<li>Weersma, R. K., Zhernakova, A., Fu, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+between+drugs+and+the+gut+microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Interaction between drugs and the gut microbiome.</a> Gut. 69 (8), 1510-1519 (2020).</li>
<li>Llop, P., Latorre, A., Moya, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+epidemiology+of+antibiotic+resistance%3A+looking+for+an+appropriate+animal+model+system%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+Spectrum%22%5BJournal%5D)">Experimental epidemiology of antibiotic resistance: looking for an appropriate animal model system.</a> Microbiology Spectrum. 6 (1), (2018).</li>
<li>Doll, J. P., Trexler, P. C., Reynolds, L. I., Bernard, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+peracetic+acid+to+obtain+germfree+invertebrate+eggs+for+gnotobiotic+studies%5BTitle%5D)+AND+%22American+Midland+Naturalist%22%5BJournal%5D)">The use of peracetic acid to obtain germfree invertebrate eggs for gnotobiotic studies.</a> American Midland Naturalist. 6 (1), 239(1963).</li>
<li>Dillon, R., Charnley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutualism+between+the+desert+locust+Schistocerca+gregaria+and+its+gut+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Research+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Mutualism between the desert locust Schistocerca gregaria and its gut microbiota.</a> Research in Microbiology. 153 (8), 503-509 (2002).</li>
<li>Tegtmeier, D., Thompson, C. L., Schauer, C., Brune, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+affects+gut+bacterial+colonization+and+metabolic+activities+in+a+gnotobiotic+cockroach+model%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Oxygen affects gut bacterial colonization and metabolic activities in a gnotobiotic cockroach model.</a> Applied and Environmental Microbiology. 82 (4), 1080-1089 (2016).</li>
<li>Muhammad, A., Habineza, P., Hou, Y. M., Shi, Z. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+red+palm+weevil+Rhynchophorus+Ferrugineus+%28Olivier%29+%28Coleoptera%3A+Dryophthoridae%29+germ-free+larvae+for+host-gut+microbes+interaction+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-Protocol%22%5BJournal%5D)">Preparation of red palm weevil Rhynchophorus Ferrugineus (Olivier) (Coleoptera: Dryophthoridae) germ-free larvae for host-gut microbes interaction studies.</a> Bio-Protocol. 9 (24), e3456(2019).</li>
<li>Bavani, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sterilization+of+Lucilia+sericata+%28Diptera%3A+Calliphoridae%29+Eggs+for+maggot+debridement+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Entomology%22%5BJournal%5D)">Sterilization of Lucilia sericata (Diptera: Calliphoridae) Eggs for maggot debridement therapy.</a> Journal of Medical Entomology. 59 (3), 1076-1080 (2022).</li>
<li>Han, L. Z., Li, S. B., Liu, P. L., Peng, Y. F., Hou, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+artificial+diet+for+continuous+rearing+of+Chilo+suppressalis+%28Lepidoptera%3A+Crambidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+Entomological+Society+of+America%22%5BJournal%5D)">New artificial diet for continuous rearing of Chilo suppressalis (Lepidoptera: Crambidae).</a> Annals of the Entomological Society of America. 105 (2), 253-258 (2012).</li>
<li>Bezerra, C. E. S., Amaral, B. B., Souza, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rearing+Chrysoperla+externa+larvae+on+artificial+diets%5BTitle%5D)+AND+%22Neotropical+Entomology%22%5BJournal%5D)">Rearing Chrysoperla externa larvae on artificial diets.</a> Neotropical Entomology. 46 (1), 93-99 (2017).</li>
<li>Feng, H. Q., Jin, Y. L., Li, G. P., Feng, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+an+artificial+diet+for+successive+rearing+of+Apolygus+lucorum+%28Hemiptera%3A+Miridae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Economic+Entomology%22%5BJournal%5D)">Establishment of an artificial diet for successive rearing of Apolygus lucorum (Hemiptera: Miridae).</a> Journal of Economic Entomology. 105 (6), 1921-1928 (2012).</li>
<li>Hassan, B., Siddiqui, J. A., Xu, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vertically+transmitted+gut+bacteria+and+nutrition+influence+the+immunity+and+fitness+of+Bactrocera+dorsalis+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Vertically transmitted gut bacteria and nutrition influence the immunity and fitness of Bactrocera dorsalis larvae.</a> Frontiers in Microbiology. 11, 596352(2020).</li>
<li>Li, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+the+intestinal+bacterial+community+in+black+soldier+fly+larval+guts+and+its+influence+on+insect+growth+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Science%22%5BJournal%5D)">Dynamics of the intestinal bacterial community in black soldier fly larval guts and its influence on insect growth and development.</a> Insect Science. 30 (4), 947-963 (2023).</li>
<li>Moran, N. A., McCutcheon, J. P., Nakabachi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomics+and+Evolution+of+heritable+bacterial+symbionts%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Genetics%22%5BJournal%5D)">Genomics and Evolution of heritable bacterial symbionts.</a> Annual Review of Genetics. 42, 165-190 (2008).</li>
<li>Weinert, L. A., Araujo-Jnr, E. V., Ahmed, M. Z., Welch, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+incidence+of+bacterial+endosymbionts+in+terrestrial+arthropods%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Royal+Society+B-Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">The incidence of bacterial endosymbionts in terrestrial arthropods.</a> Proceedings of the Royal Society B-Biological Sciences. 282 (1807), 20150249(2015).</li>
<li>Weeks, A. R., Turelli, M., Harcombe, W. R., Reynolds, K. T., Hoffmann, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+parasite+to+mutualist%3A+Rapid+evolution+of+Wolbachia+in+natural+populations+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Biology%22%5BJournal%5D)">From parasite to mutualist: Rapid evolution of Wolbachia in natural populations of Drosophila.</a> PLOS Biology. 5 (5), 997-1005 (2007).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Owady posiadają wysoce złożoną mikrobiotę jelitową20,21, co wymaga wykorzystania owadów aksenicznych zaszczepionych specyficznymi szczepami drobnoustrojów jelitowych do badania interakcji między owadami a mikroorganizmami. Przygotowanie owadów aksenicznych ma kluczowe znaczenie dla takich przedsięwzięć badawczych. Antybiotykoterapia to metoda stosowana w celu wyeliminowania mikrobioty jelitowej. Na przykład Jung i Kim(22 l.) karmili Sp...

Zwierzęta akseniczne, zdefiniowane jako zwierzęta, u których nie można wykryć żadnych żywotnych mikroorganizmów lub pasożytów, są cennymi modelami eksperymentalnymi do badania interakcji gospodarz-mikroorganizm1,2. Owady, największa grupa bezkręgowców, mogą tworzyć symbiotyczne relacje z mikroorganizmami3. Owady akseniczne mogą być wykorzystywane do badania interakcji gospodarz-symbiont w systemach symbiotycznych4. Na przykład Nishide i wsp.5 opracowali praktyczną procedurę sterylnego chowu robaka o nieprzyjemnym zapachu Plautia stali, umożliwiając wiarygodną i rygorystyczną analizę interakcji gospodarz-symbiont w modelowych systemach symbiotycznych. Owady akseniczne mogą być wytwarzane poprzez sterylizację stadium jajowego i dostarczanie sterylnego pokarmu larwom i dorosłym osobnikom6,7. Owady akseniczne mają ogromne znaczenie i są szeroko stosowane w badaniach biologicznych. Na przykład badanie przeprowadzone przez Somerville et al.8 wykazało, że diamentowe zaszczepione Enterobacter cloacae poprawiły zdolności adaptacyjne transgenicznych samców.
Delia antiqua Meigen jest ważnym ekonomicznie szkodnikiem cebuli i innych upraw Liliaceae na całym świecie, którego larwy uszkadzają cebulki cebul i innych upraw Liliaceae9. D. antiqua występuje głównie w klimacie umiarkowanym i jest szeroko rozpowszechniony na obszarach uprawy cebuli w obu Amerykach, Europie i Azji. Jeśli nie jest odpowiednio kontrolowany, może powodować straty w plonach cebuli (Allium L.), czosnku (Allium sativum L.), szalotki (Allium fistulosum L.) i pora (Alliumchoenoprasum L.) w zakresie od 50% do 100%10,11. Larwy żywią się podziemnymi częściami roślin, a to karmienie powoduje więdnięcie sadzonek i ostatecznie śmierć. Ponadto uszkodzone rośliny mogą przepuszczać patogeny, co prowadzi do gnicia cebul12. Nawet jeśli rośliny nie zostaną całkowicie skonsumowane przez larwy, szkody, które powodują, sprawiają, że rośliny cebuli nie nadają się do sprzedaży i powodują straty ekonomiczne.
Owady są ściśle związane z mikrobiotą jelitową, a większość jelit owadów zawiera różnorodne bakterie symbiotyczne, które rozwijają się dzięki składnikom odżywczym dostarczanym przez gospodarza13,14. Jing et al.15 wykazali, że podstawową funkcją symbiotycznej społeczności jelitowej jest dostarczanie niezbędnych składników odżywczych, a następnie funkcji związanych z trawieniem i detoksykacją. W niektórych przypadkach bakterie jelitowe mogą służyć jako zasób mikrobiologiczny do celów zwalczania szkodników. W związku z tym pożądane jest badanie wydajności poszczególnych bakterii jelitowych i specyficznych funkcji w organizmie D. antiqua. Dlatego przygotowanie larw aksenicznych jest szczególnie ważne dla badania interakcji między określonymi szczepami bakterii a owadami16. Obecnie powszechnie stosowaną metodą eliminacji bakterii jelitowych owadów jest zastosowanie kombinacji antybiotyków w celu wyeliminowania powiązanych drobnoustrojów17,18,19. W przeciwieństwie do stosowania samych antybiotyków, które mogą jedynie zmniejszyć liczbę drobnoustrojów, akseniczny chów owadów pozwala na kontrolę składu i ilości mikroorganizmów, umożliwiając dokładniejszą walidację funkcjonalności mikrobioty jelitowej.
Tak więc, ten artykuł wprowadza protokół przygotowania i hodowli aksonicznego D. antiqua. Pokarm dla larw aksenu uzyskuje się poprzez sterylizację w wysokiej temperaturze naturalnej diety w połączeniu z pokarmami na wpół sfermentowanymi. Jaja są sterylizowane zgodnie z protokołem eksperymentalnym w celu uzyskania jaj aksenowych, a na koniec larwy akseniczne są hodowane z jaj aksenicznych. Na potrzeby eksperymentu przeprowadzono akseniczny system chowu tylko dla jednego pokolenia. Zapewni to wygodę w badaniu interakcji między owadami a mikrobiotą jelitową.

<table><tbody><tr><td>0,22 &m; Butelka filtrująca M</td><td>Thermo Scientific</td><td>450-0045</td><td></td></tr><tr><td>0,22 &mu; M Filtr strzykawkowy</td><td>Biosharp</td><td>BS-QT-011</td><td></td></tr><tr><td>Sito o oczkach 100</td><td>Zhejiang Shangyu Jinding Standardowe sito Fabryka</td><td>Nr Numery</td><td></td>katalogowe</tr><tr><td>1x roztwór PBS</td><td>Solarbio</td><td>P1020</td><td></td></tr><tr><td>2x Taq PCR Master Mix</td><td>GENVIEW</td><td>GR1113-1ML</td><td></td></tr><tr><td>5,2% roztwór NaClO</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.</td><td></td><td></td>80010428</tr><tr><td>500 ml Kolba stożkowa</td><td>Thermo Scientific</td><td>4103-0500</td><td></td></tr><tr><td>50 mL wentylowana probówka wirówkowa</td><td>JET BIOFIL</td><td>BRT-011-050</td><td></td></tr><tr><td>50x bufor TAE</td><td>GENVIEW</td><td>GT1307</td><td></td></tr><tr><td>Proszek agarowy</td><td>Ding Guo</td><td>DH010-1.1</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator biochemiczny</td><td>STIK</td><td>21040121500010</td><td></td></tr><tr><td>Sito komórkowe</td><td>SAINING</td><td>5022200</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek choliny</td><td>Sangon Biotech</td><td>A600299-0100</td><td></td></tr><tr><td>ddH2O</td><td>Ding Guo</td><td>PER018-2</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowy tłuczek do mielenia</td><td>JET BIOFIL</td><td>CSP-003-002</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do ekstrakcji DNA</td><td>Sangon Biotech</td><td>B518221-0050</td><td></td></tr><tr><td>Marker DNA</td><td>Sangon Biotech</td><td>B600335-0250</td><td></td></tr><tr><td>Absolutny etanol</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.</td><td></td><td></td>10009218</tr><tr><td>Bibuła filtracyjna</td><td>NEWSTAR</td><td>1087309025</td><td></td></tr><tr><td>Robot kuchenny</td><td>Guangdong Midea Life Electric Appliance Manufacturing Co., Ltd.</td><td></td><td></td>WBL25B26</tr><tr><td>Oświetlony&nbsp; inkubator</td><td>Shanghai ESTABLISH Instrumentation Co., Ltd.</td><td></td><td></td>A16110768</tr><tr><td>Kwas L-askorbinowy</td><td>Sangon Biotech</td><td>A610021-0100</td><td></td></tr><tr><td>Rozsiewacz w kształcie litery L</td><td>SAINING</td><td>6040000</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka agarowa</td><td>Hope Bio</td><td>HB0109</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki</td><td>Bing Yu</td><td>&nbsp; Zakup BY-103</td> na inkubator <td>wstrząsowy Jingdong</td></tr><tr><td></td><td>Shanghai Zhichu Instrument Co., Ltd.</td><td></td><td></td>2020000014</tr><tr><td>Sacharoza</td><td>GENVIEW</td><td>CS326-500G</td><td></td></tr><tr><td>Super zielony barwnik kwasu nukleinowego</td><td>Biosharp</td><td>BS355A</td><td></td></tr><tr><td>Super czysty stół</td><td>Heal Force</td><td>AC130052</td><td></td></tr><tr><td>TSB</td><td>Hope Bio</td><td>HB4114</td><td></td></tr><tr><td>Pompa próżniowa</td><td>Zhejiang Taizhou Seeking Precision Vacuum Pump Co., Ltd.</td><td></td><td></td>22051031</tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy</td><td>Thermo Scientific</td><td>LP0021B</td><td></td></tr></tbody></table>

hodowla axenic delia antiqua z częściowo fermentowaną, sterylną dietą

Rearing Axenic Delia antiqua with Half-Fermented Sterile Diets

Owady akseniczne są pozyskiwane z sterylnych systemów sztucznej hodowli przy użyciu sterylnych pożywek. Owady te, charakteryzujące się niewielkimi rozmiarami, krótkim cyklem wzrostu i niskim zapotrzebowaniem na paszę, są idealne do badania relacji między mikroorganizmami a gospodarzami. Mikrobiota jelitowa znacząco wpływa na cechy fizjologiczne gospodarzy owadów, a wprowadzenie określonych szczepów do owadów aksenicznych stanowi metodę weryfikacji funkcji mikrobiologicznych jelit. Delia antiqua, groźny szkodnik z rzędu Diptera, rodziny Anthomyiidae i rodzaju Delia, żywi się głównie cebulą, czosnkiem, porem i innymi warzywami z rodziny Liliaceae. Jego larwy żywią się cebulkami, powodując gnicie, więdnięcie, a nawet śmierć całych roślin. Hodując larwy akseniczne, można przeprowadzić badania kontrolne w celu zaobserwowania wpływu mikroflory jelitowej na wzrost i rozwój D. antiqua. W przeciwieństwie do metody polegającej na eliminacji powiązanych drobnoustrojów za pomocą antybiotyków, w niniejszym artykule przedstawiono niskokosztowe i wysoce efektywne podejście do hodowli aksenu D. antiqua. Po sterylizacji powierzchniowej jaj D. antiqua, do hodowli larw zastosowano na wpół sfermentowaną sterylną dietę, a stan aksoniczny D. antiqua zweryfikowano za pomocą testów zależnych od kultury i niezależnych od kultury. Podsumowując, połączenie sterylizacji jaj owadów i przygotowania sterylnych diet do hodowli larw umożliwiło opracowanie wydajnej i prostej metody otrzymywania aksenu D. antiqua. Metoda ta stanowi skuteczne podejście do badania interakcji między owadami a mikroflorą.

Etapy życia D. antiqua przedstawiono na Rysunku 4. Pełny cykl życiowy obejmuje jaja, larwy, poczwarkę (Rysunek 4C) oraz osobniki dorosłe (Rysunek 4D). Są one hodowane w sterylnych probówkach wirówkowych, a ich wygląd i przeżywalność nie różnią się od osobników D. antiqua hodowanych w warunkach nieaksenicznych. Czas wzrostu i rozwoju dla każdego etapu życia D. antiqua znajduje się na Ry...

Opisana jest prosta procedura hodowli aksenicznej Delia antiqua z na wpół fermentowaną, sterylną dietą. Tylko jeden szczep Wolbachia został wykryty w każdym stadium rozwojowym aksenu D. antiqua za pomocą PCR.

Hodowla Axenic Delia antiqua z częściowo fermentowaną, sterylną dietą

Axenic insects are obtained from sterile artificial rearing systems using sterile media. These insects, characterized by their small size, short growth ...

Naszym obszarem badań jest ekologia mikrobiologiczna i chcemy badać wnętrze interakcji mikrobiologicznych poprzez hodowlę aksenu Delia antiqua. Udzielone zostaną odpowiedzi na pytania dotyczące różnorodności grzybów jelitowych Delia antiqua oraz ich wpływu na wzrost i rozwój Delia antiqua. Ustalono prostą metodę hodowli aksenu Delia antiqua z na wpół sfermentowaną, sterylną dietą i tylko jeden zidentyfikowany szczep Wolbachia wykryto w każdym stadium rozwojowym Delia antiqua za pomocą PCR.W przeciwieństwie do leczenia antybiotykami, protokół ten całkowicie eliminuje bakterie jelitowe i nie powoduje wielu skutków ubocznych u owadów gospodarza. Funkcja mikrobioty jelitowej owadów również nie jest zaznaczona. Jest skuteczniejsza i tańsza niż antybiotykoterapia.

rearing-axenic-delia-antiqua-with-half-fermented-sterile-diets

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

W niniejszym opracowaniu przedstawiamy protokół przeprowadzania restrykcji dietetycznej na sztywnym podłożu u C. elegans z wykorzystaniem zabitych bakterii.

Ograniczenie kaloryczne na stałym podłożu u Caenorhabditis elegans

Test EIW (egg-in-worm) jest użyteczną metodą do ilościowego określenia zachowania podczas składania jaj. Zmiany w składaniu jaj mogą być reakcją behawioralną organizmu modelowego Caenorhabditis elegans na potencjalnie szkodliwe substancje środowiskowe, takie jak te wytwarzane przez bakterie chorobotwórcze.

Pomiar wpływu bakterii na zachowanie C. elegans za pomocą testu retencji jaj

C. elegans jest zwykle uprawiany na solidnych płytkach agarowych lub w płynnych kulturach z wysiewem E. coli. Aby zapobiec zakłóceniom w badaniach toksykologicznych i żywieniowych bakteryjnych produktów ubocznych, wykorzystaliśmy płynne podłoże akseniczne, CeHR, do hodowli i synchronizacji dużej liczby robaków do szeregu dalszych zastosowań.

Hodowla Caenorhabditis elegans w płynnych pożywkach aksenicznych i tworzenie transgenicznych robaków przez bombardowanie mikrocząsteczkami

Celem tej prezentacji jest zademonstrowanie in vivo i in vitro technik hodowli nicieni entomopatogenicznych. Metody in vivo uwzględniają hodowlę tych nicieni z owadem żywicielem, podczas gdy metody in vitro wykorzystują bogate podłoża agarowe.

Hodowla in vivo i in vitro nicieni entomopatogenicznych (Steinernematidae i Heterorhabditidae)

Przedstawiono metodę hodowli Drosophila melanogaster w warunkach aksonicznych i gnotobiotycznych. Zarodki much są dechorionowane w podchlorynie sodu, przenoszone aseptycznie do jałowej diety i hodowane w zamkniętych pojemnikach. Zaszczepianie diety i zarodków bakteriami prowadzi do asocjacji gnotobiotycznych, a obecność bakterii potwierdza się poprzez posiew homogenatów Drosophila na całe ciało.

Hodowla muszki owocowej Drosophila melanogaster w warunkach aksenicznych i gnotobiotycznych

Nicień Caenorhabditis elegans jest doskonałym modelem do analizy interakcji gospodarz-patogen. Opisano tutaj protokół zakażenia robaka paciorkowcami z grupy mitis i określenia aktywacji odpowiedzi na stres oksydacyjny przeciwkoH2O2wytwarzanej przez tę grupę organizmów.

Badanie stresu oksydacyjnego wywołanego przez paciorkowce z grupy Mitis w Caenorhabditis elegans

Tutaj opisujemy metodę generowania piskląt wolnych od zarazków z jaj komercyjnej linii brojlerów, Ross PM3. Metoda ta może być dostosowana do hodowli zwierząt wolnych od zarazków z innych gatunków drobiu.

Produkcja szybko rosnących brojlerów wolnych od zarazków z komercyjnej linii do badań mikrobioty

Aby uzyskać aksenicznego owada, jego powierzchnia jaja jest sterylizowana, a wykluta larwa jest następnie hodowana za pomocą aksonicznych liści. Metoda ta zapewnia skuteczny sposób przygotowania owadów aksenowych bez podawania antybiotyków lub opracowywania sztucznej diety, którą można również zastosować do innych owadów żywiących się liśćmi.

Przygotowanie i hodowla owadów aksonowych z siewkami z hodowli tkankowej do badań interakcji mikrobioty gospodarz-jelito chrząszcza liściowego

Prezentowany tutaj jest zoptymalizowany protokół hodowli izolowanych pojedynczych nicieni na stałych podłożach w mikrofabrykowanych urządzeniach wielodołkowych. Takie podejście pozwala na monitorowanie poszczególnych zwierząt przez całe życie pod kątem różnych fenotypów związanych ze starzeniem się i zdrowiem, w tym aktywności, wielkości i kształtu ciała, geometrii ruchu i przeżycia.

Długotrwała hodowla i monitorowanie izolowanych Caenorhabditis elegans na pożywkach stałych w urządzeniach wielodołkowych

W protokole tym opisano test do ilościowego określenia szybkości karmienia Caenorhabditis elegans w oparciu o pomiar klirensu bakterii w płynnej kulturze.

Kwantyfikacja spożycia pokarmu w Caenorhabditis elegans poprzez pomiar klirensu bakteryjnego

Ten artykuł przedstawia laboratoryjne utrzymanie (w tym krycie i karmienie) muchówki niższej Bradysia (Sciara) coprophila.

Utrzymanie laboratoryjne muchówki dolnej Bradysia (Sciara) coprophila: nowy/stary wyłaniający się organizm modelowy

Poznaj metodę hodowli aksenicznej Delia antiqua z częściowo fermentowaną sterylną dietą. Protokół eliminuje bakterie jelitowe bez skutków ubocznych i wykrywa szczep Wolbachia metodą PCR, oferując skuteczniejszą alternatywę dla antybiotyków.

Hodowla Axenic Delia antiqua z częściowo fermentowaną, sterylną dietą

Przeglądaj więcej filmów