Szybkie oznaczanie ilościowe utlenionych i zredukowanych form glutationu przy użyciu orto-ftaldehydu w hodowanych komórkach ssaków in vitro
28 czerwca 2024
Kwantyfikacja zarówno utlenionych, jak i zredukowanych form glutationu (odpowiednio GSSG i GSH) została osiągnięta dzięki zastosowaniu aldehydu ortoftaldehydu (OPA). OPA staje się wysoce fluorescencyjny po sprzęgnięciu z GSH, ale nie jest w stanie sprzęgnąć GSSG, dopóki nie zostanie zredukowany. W tym miejscu opisujemy test wieloparametryczny do ilościowego określenia obu przy użyciu kwantyfikacji białka w celu normalizacji.
Naszym celem jest zaoferowanie nowatorskiego sposobu ilościowego określania stężenia tio, ze szczególnym uwzględnieniem stężeń GSH i GSSG w różnych liniach komórkowych, które można przeprowadzić in situ. Uważamy, że jest to użyteczny protokół dla społeczności naukowej. Podjęto liczne wysiłki w celu wykrycia niszowych i specyficznych biomarkerów będących przedmiotem zainteresowania reaktywnych form tlenu.
Kilka z nich wykazało duże zainteresowanie wykrywaniem krótkożyciowych reaktywnych form tlenu, takich jak detekcja rodników i małych cząsteczek, takich jak hydroksyle i tlen singletowy. Jednym z kluczowych wyzwań stojących przed kilkoma instytucjami była możliwość dokładnego i precyzyjnego wykrywania interesujących biomarkerów bez konieczności stosowania drogiego sprzętu lub pracochłonnych procesów. Protokół ten pozwala na analizę wieloparametryczną, pozwalając na normalizację danych bez konieczności stosowania oddzielnych protokołów.
I usuń kilka etapów znalezionych w innych testach, które są bardzo czasochłonne, zawierają niekompatybilne odczynniki lub używają odczynników niebezpiecznych dla zdrowia. Grupa ds. Bezpieczeństwa Nanomateriałów będzie nadal oceniać różne nanomateriały i polimery pod kątem wpływu, jaki mogą mieć na zdrowie ludzi. Uważamy ten protokół za istotną część naszego zestawu narzędzi do osiągnięcia tego celu, ponieważ protokół ten może być potencjalnie multipleksowany w celu wykrycia dodatkowych biomarkerów.
Aby rozpocząć, przygotuj wszystkie wymagane materiały do testu. W przypadku standardów GSH dodaj 40 mikrolitrów całkowitego buforu glutationu do każdej studzienki. Następnie odessać pożywkę z każdej studzienki płytki zawierającej osad komórek i trzykrotnie umyć komórkę lodowatym PBS.
Przygotuj zakres kalibracji z 10 mikrolitrami glutationu i podwójnie destylowaną wodą w postaci ślepej próby w trzech egzemplarzach. W celu uzyskania pożądanej docelowej kwantyfikacji należy inkubować umyte komórki z odpowiednimi mieszaninami w wytrząsarce orbitalnej z prędkością 300 obr./min przez dwie minuty. Następnie dodaj pięć mikrolitrów 0,01-molowego roztworu 2-karboksyetyfosfiny Tris do każdej studzienki i ponownie inkubuj przez 10 minut.
Następnie odwirować płytkę o sile 200 G przez pięć minut. I przenieś 25 mikrolitrów z każdej studzienki na oddzielną, przezroczystą 96-dołkową płytkę w celu ilościowego określenia białka. Następnie dodaj 170 mikrolitrów roboczego roztworu ortoftaldehydu do każdej studzienki zawierającej 30 mikrolitrów próbek.
Aby osłonić płytkę przed światłem, przykryj ją dokładnie folią i inkubuj w wytrząsarce orbitalnej przez 15 minut. Na koniec odczytaj fluorescencję za pomocą czytnika płytek przy wzbudzeniu 340 nanometrów i emisji 450 nanometrów. Komórki A-549 potraktowane różnymi nanomateriałami wykazały różne proporcje dwusiarczku glutationu w tym teście.
Najwyższą wartość zaobserwowano dla komórek, którym podawano 125 mikrogramów na mililitr srebra.
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia nowy protokół ilościowego oznaczania stężeń zredukowanego (GSH) i utlenionego (GSSG) glutationu w różnych liniach komórkowych. Metoda ta wykorzystuje ortoftalaldehyd (OPA) do detekcji fluorescencyjnej, co umożliwia efektywną normalizację danych bez konieczności stosowania rozbudowanych procedur.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biochemia
- Biologia komórki
Wstęp
- Reaktywne formy tlenu są ważnymi biomarkerami w różnych procesach biologicznych.
- Dokładne oznaczanie GSH i GSSG jest kluczowe dla zrozumienia stresu oksydacyjnego.
- Istniejące metody mogą być kosztowne i czasochłonne.
- Celem niniejszego protokołu jest uproszczenie procesu ilościowego oznaczania.
Cel badania
- Zapewnienie niezawodnej metody ilościowego oznaczania stężeń GSH i GSSG.
- Umożliwienie analizy in situ w różnych liniach komórkowych.
- Zredukowanie złożoności i czasu wymaganego dla istniejących testów.
Zastosowane metody
- Przygotowanie standardów GSH i zakresów kalibracyjnych.
- Przemywanie i inkubowanie osadów komórkowych ze specyficznymi odczynnikami.
- Wykorzystanie OPA do detekcji fluorescencyjnej glutationu.
- Pomiar fluorescencji przy określonych długościach fali wzbudzenia i emisji.
Główne wyniki
- Komórki A-549 wykazywały zmienne stosunki GSH/GSSG po zastosowaniu różnych nanomateriałów.
- Najwyższe poziomy GSSG zaobserwowano przy zastosowaniu srebra w stężeniu 125 µg/mL.
- Analiza wykazała skuteczną normalizację ilości białka.
- Wyniki wskazują na potencjał do multipleksowania w celu wykrycia dodatkowych biomarkerów.
Wnioski
- Niniejszy protokół oferuje usprawnione podejście do oznaczania ilości glutationu.
- Może on zostać włączony do szerszych badań nad stresem oksydacyjnym i biomarkerami.
- Metoda ta jest przystępna i nie wymaga kosztownego wyposażenia.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ilościowa ocena zredukowanego i utlenionego glutationu w hodowlach komórek ssaków jest kluczowa dla oceny stanu redoks komórek oraz odpowiedzi na stres oksydacyjny we wczesnych etapach odkrywania leków. Ten test oparty na OPA umożliwia szybką, multipleksową kwantyfikację GSH i GSSG, wspierając rzetelną analizę biomarkerów bez konieczności stosowania specjalistycznej aparatury. Zgodność protokołu z testami normalizacji i cytotoksyczności usprawnia integrację danych w ramach procesów odkrywania leków oraz badań przedklinicznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia bezpośredni pomiar komórkowej zdolności antyoksydacyjnej w celu mechanistycznej redukcji ryzyka.
- Wspiera walidację funkcjonalną szlaków stresu oksydacyjnego w modelach istotnych dla danej choroby.
- Ułatwia szybką weryfikację hipotez dotyczących oddziaływania na cel i modulacji szlaków.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Zapewnia standaryzowany, ilościowy odczyt dla wysokoprzepustowego przesiewu związków.
- Umożliwia powtarzalną ocenę modulacji redoks w różnych liniach komórkowych.
- Integruje normalizację białek i ocenę cytotoksyczności w celu uzyskania wyników multiparametrycznych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia uzgodnienie ilościowego oznaczania biomarkerów stresu oksydacyjnego z punktami końcowymi badań translacyjnych.
- Zapewnia ciągłość przejścia od odkryć in vitro do walidacji w modelach przedklinicznych.
- Wspiera decyzje o dalszym rozwoju projektu, skorygowane o ryzyko w oparciu o stan redoks komórek.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ta metoda ilościowego oznaczania glutationu oparta na OPA wpisuje się w kontinuum od wczesnego etapu odkrywania do badań przedklinicznych, umożliwiając płynną integrację analizy biomarkerów redoks z identyfikacją związków wiodących oraz badaniami mechanistycznymi.
- Biologia odkrywcza: Wspiera badanie szlaków stresu oksydacyjnego w oparciu o hipotezy oraz walidację celów terapeutycznych.
- Przesiewy: Dostarcza ilościowe, powtarzalne wyniki odpowiednie do selekcji związków i standaryzacji testów.
- Analityka: Zapewnia wiarygodne pomiary oparte na fluorescencji do analizy porównawczej stanu redoks komórek.
- Badania translacyjne: Łączy wyniki uzyskane in vitro ze strategiami przedklinicznymi w zakresie biomarkerów, gdy stres oksydacyjny jest istotnym punktem końcowym.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje skalowalną, adaptacyjną platformę do kwantyfikacji biomarkerów redoks w wielu programach badawczych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w zakresie modulacji szlaków stresu oksydacyjnego i walidacji celów terapeutycznych.
- Wartość operacyjna: Zmniejsza złożoność analizy, czas badania oraz zużycie niebezpiecznych odczynników, umożliwiając jednocześnie uzyskanie wyników z wielu parametrów jednocześnie.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji typu go/no-go poprzez integrację biomarkerów redoks z danymi dotyczącymi cytotoksyczności i normalizacji białek.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację aktywów z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o wglądy mechanistyczne i oparte na biomarkerach.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana wiedza w zakresie konfiguracji testów opartych na fluorescencji oraz interpretacji danych.
- Wymagany dostęp do czytnika płytek fluorescencyjnych i standardowej infrastruktury do hodowli komórkowych.
- Wymagana standaryzacja międzyzespołowa w celu normalizacji i integracji oceny cytotoksyczności.
- Metoda może być dostosowana do różnych linii komórek ssaków, z optymalizacją protokołu w razie potrzeby.
- Potencjał do multipleksowania w celu wykrycia dodatkowych biomarkerów zależy od kompatybilności odczynników i walidacji.
