Szybkie oznaczanie ilościowe utlenionych i zredukowanych form glutationu przy użyciu orto-ftaldehydu w hodowanych komórkach ssaków in vitro
28 czerwca 2024
Kwantyfikacja zarówno utlenionych, jak i zredukowanych form glutationu (odpowiednio GSSG i GSH) została osiągnięta dzięki zastosowaniu aldehydu ortoftaldehydu (OPA). OPA staje się wysoce fluorescencyjny po sprzęgnięciu z GSH, ale nie jest w stanie sprzęgnąć GSSG, dopóki nie zostanie zredukowany. W tym miejscu opisujemy test wieloparametryczny do ilościowego określenia obu przy użyciu kwantyfikacji białka w celu normalizacji.
Naszym celem jest zaoferowanie nowatorskiego sposobu ilościowego określania stężenia tio, ze szczególnym uwzględnieniem stężeń GSH i GSSG w różnych liniach komórkowych, które można przeprowadzić in situ. Uważamy, że jest to użyteczny protokół dla społeczności naukowej. Podjęto liczne wysiłki w celu wykrycia niszowych i specyficznych biomarkerów będących przedmiotem zainteresowania reaktywnych form tlenu.
Kilka z nich wykazało duże zainteresowanie wykrywaniem krótkożyciowych reaktywnych form tlenu, takich jak detekcja rodników i małych cząsteczek, takich jak hydroksyle i tlen singletowy. Jednym z kluczowych wyzwań stojących przed kilkoma instytucjami była możliwość dokładnego i precyzyjnego wykrywania interesujących biomarkerów bez konieczności stosowania drogiego sprzętu lub pracochłonnych procesów. Protokół ten pozwala na analizę wieloparametryczną, pozwalając na normalizację danych bez konieczności stosowania oddzielnych protokołów.
I usuń kilka etapów znalezionych w innych testach, które są bardzo czasochłonne, zawierają niekompatybilne odczynniki lub używają odczynników niebezpiecznych dla zdrowia. Grupa ds. Bezpieczeństwa Nanomateriałów będzie nadal oceniać różne nanomateriały i polimery pod kątem wpływu, jaki mogą mieć na zdrowie ludzi. Uważamy ten protokół za istotną część naszego zestawu narzędzi do osiągnięcia tego celu, ponieważ protokół ten może być potencjalnie multipleksowany w celu wykrycia dodatkowych biomarkerów.
Aby rozpocząć, przygotuj wszystkie wymagane materiały do testu. W przypadku standardów GSH dodaj 40 mikrolitrów całkowitego buforu glutationu do każdej studzienki. Następnie odessać pożywkę z każdej studzienki płytki zawierającej osad komórek i trzykrotnie umyć komórkę lodowatym PBS.
Przygotuj zakres kalibracji z 10 mikrolitrami glutationu i podwójnie destylowaną wodą w postaci ślepej próby w trzech egzemplarzach. W celu uzyskania pożądanej docelowej kwantyfikacji należy inkubować umyte komórki z odpowiednimi mieszaninami w wytrząsarce orbitalnej z prędkością 300 obr./min przez dwie minuty. Następnie dodaj pięć mikrolitrów 0,01-molowego roztworu 2-karboksyetyfosfiny Tris do każdej studzienki i ponownie inkubuj przez 10 minut.
Następnie odwirować płytkę o sile 200 G przez pięć minut. I przenieś 25 mikrolitrów z każdej studzienki na oddzielną, przezroczystą 96-dołkową płytkę w celu ilościowego określenia białka. Następnie dodaj 170 mikrolitrów roboczego roztworu ortoftaldehydu do każdej studzienki zawierającej 30 mikrolitrów próbek.
Aby osłonić płytkę przed światłem, przykryj ją dokładnie folią i inkubuj w wytrząsarce orbitalnej przez 15 minut. Na koniec odczytaj fluorescencję za pomocą czytnika płytek przy wzbudzeniu 340 nanometrów i emisji 450 nanometrów. Komórki A-549 potraktowane różnymi nanomateriałami wykazały różne proporcje dwusiarczku glutationu w tym teście.
Najwyższą wartość zaobserwowano dla komórek, którym podawano 125 mikrogramów na mililitr srebra.
Przegląd
To badanie przedstawia nowy protokół do ilościowego określania stężeń zredukowanego (GSH) i utlenionego (GSSG) glutationu w różnych liniach komórkowych. Metoda wykorzystuje Ortoftalaldehyd (OPA) do wykrywania fluorescencji, co pozwala na efektywną normalizację danych bez konieczności przeprowadzania rozbudowanych procedur.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Neuronauki
- Biochemia
- Biologia komórki
Tło
- Reaktywne formy tlenu są ważnymi biomarkerami w różnych procesach biologicznych.
- Dokładne wykrywanie GSH i GSSG jest kluczowe dla zrozumienia stresu oksydacyjnego.
- Istniejące metody mogą być drogie i czasochłonne.
- Ten protokół ma na celu uproszczenie procesu ilościowego określania.
Cel badania
- Dostarczyć niezawodną metodę do ilościowego określania stężeń GSH i GSSG.
- Ułatwić analizę in situ w różnych liniach komórkowych.
- Zmniejszyć złożoność i czas wymaganego do istniejących analiz.
Stosowane metody
- Przygotowanie standardów GSH i zakresów kalibracji.
- Płukanie i inkubacja peletek komórkowych z określonymi reagentami.
- Użycie OPA do wykrywania fluorescencji glutationu.
- Odczytywanie fluorescencji na określonych długościach fal wzbudzenia i emisji.
Główne wyniki
- Komórki A-549 wykazywały różne współczynniki GSH/GSSG po traktowaniu różnymi nanomateriałami.
- Najwyższe poziomy GSSG obserwowano po leczeniu srebrem w stężeniu 125 µg/mL.
- Analiza wykazała skuteczną normalizację ilościowego określania białek.
- Wyniki wskazują na potencjał multiplexingu do wykrywania dodatkowych biomarkerów.
Wnioski
- Ten protokół oferuje uproszczone podejście do ilościowego określania glutationu.
- Może być zintegrowany z szerszymi badaniami nad stresem oksydacyjnym i biomarkerami.
- Metoda jest dostępna i nie wymaga drogiego sprzętu.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Quantitative assessment of reduced and oxidized glutathione in cultured mammalian cells is critical for evaluating cellular redox status and oxidative stress response in early drug discovery. This OPA-based assay enables rapid, multiplexed quantification of GSH and GSSG, supporting robust biomarker analysis without the need for specialized instrumentation. The protocol's compatibility with normalization and cytotoxicity assays streamlines data integration across discovery and preclinical workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct measurement of cellular antioxidant capacity for mechanistic de-risking.
- Supports functional validation of oxidative stress pathways in disease-relevant models.
- Facilitates rapid hypothesis testing for target engagement and pathway modulation.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized, quantitative readout for high-throughput compound screening.
- Allows for reproducible assessment of redox modulation across diverse cell lines.
- Integrates protein normalization and cytotoxicity assessment for multiparametric outputs.
Translational & Preclinical Research
- Aligns oxidative stress biomarker quantification with translational endpoints.
- Enables continuity from in vitro discovery to preclinical model validation.
- Supports risk-adjusted advancement decisions based on cellular redox state.
Pipeline & Workflow Integration
This OPA-based glutathione quantification method fits within the early discovery to preclinical continuum, enabling seamless integration of redox biomarker analysis into lead identification and mechanistic studies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven interrogation of oxidative stress pathways and target validation.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible outputs suitable for compound triage and assay standardization.
- Analytics: Provides robust fluorescence-based measurements for comparative analysis of cellular redox status.
- Translational Research: Bridges in vitro findings with preclinical biomarker strategies when oxidative stress is a relevant endpoint.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, adaptable platform for redox biomarker quantification across multiple programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in oxidative stress pathway modulation and target validation.
- Operational Value: Reduces assay complexity, time, and hazardous reagent use while enabling multiplexed outputs.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by integrating redox biomarkers with cytotoxicity and protein normalization data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of assets based on mechanistic and biomarker-driven insights.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence-based assay setup and data interpretation.
- Needs access to a fluorescence plate reader and standard cell culture infrastructure.
- Demands cross-team standardization for normalization and cytotoxicity assessment integration.
- Adaptable to various mammalian cell lines with protocol optimization as needed.
- Multiplexing potential for additional biomarkers depends on reagent compatibility and validation.
