Name: Kation Nanoemulsja kapsułkowana kwasem retinowym jako adiuwant w celu promowania specyficznych dla OVA odpowiedzi ogólnoustrojowych i błony śluzowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-23T13:40:00.000+00:00
Duration: 6 min 2 s
Description: Poznaj metodę przygotowania kationowej nanoemulsji z kwasem retinowym jako adiuwantem szczepionkowym. Technika ta wzmacza odpowiedzi immunologiczne specyficzne dla antygenu OVA zarówno ogólnoustrojowe, jak i błony śluzowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie zostało sfinansowane przez Kluczowy Program Fundacji Nauk Przyrodniczych Chongqing (nr cstc2020jcyj-zdxmX0027) oraz Projekt Chińskiej Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych (nr 32270988).

Eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z Przewodnikiem po użytkowaniu i opiece nad zwierzętami laboratoryjnymi oraz zatwierdzone przez Komisję ds. Dobrostanu i Etyki Zwierząt Laboratoryjnych Trzeciego Wojskowego Uniwersytetu Medycznego.
1. Przygotowanie nanoemulsji (NEs)
<ol>
	<li>W celu przygotowania fazy wodnej rozpuścić 0,15 g polisorbatu 80 w 28,2 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), mieszając w temperaturze 40 °C.</li>
	<li>Do przygotowania fazy olejowej należy użyć preparatu nanoemulsji w fazie olejowej przedstawionego w tabeli 1. Rozpuścić trileinian sornitanu 85, DOTAP i RA w skwalenie, mieszając w temperaturze 40 °C.</li>
	<li>W celu przygotowania pierwotnej emulsji O/W, należy mieszać fazę olejową magnetycznie z prędkością 1400 obr./min, dodając roztwór wodny powoli i kroplami z szybkością 1 ml/min. Mieszaninę należy wstępnie zemulgować za pomocą emulgatora o wysokim ścinaniu przy 30 000 obr./min przez 6 min.</li>
	<li>W przypadku homogenizacji wysokociśnieniowej (HPH) przygotowaną powyżej emulsję O/W należy poddać działaniu homogenizatora wysokociśnieniowego przez 12 cykli pod ciśnieniem 900 barów, aby uzyskać jednorodną nanoemulsję w zakresie 160-190 nm.</li>
	<li>Pod koniec procesu zebrać emulsję do kolby o pojemności 50 ml i przefiltrować emulsję przez membranę filtracyjną PES o grubości 0,2 μm.</li>
	<li>Podłączyć kolbę do przewodu Schlenka przez cewnik, obracając trójdrogowy zawór odcinający, aby podłączyć system do rury próżniowej i włączyć pompę próżniową, aby wytworzyć podciśnienie w kolbie. Następnie, obracając trójdrogowy kurek, podłącz system do rurki Argon i napełnij ją Argonem. Powtórz ten krok 3 razy, aby upewnić się, że kolba jest wypełniona argonem.</li>
	<li>Wymienić korek i uszczelnić folią paraffine, owinąć kolbę w folię aluminiową i przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
2. Charakterystyka nanoemulsji
<ol>
	<li>Wykrywanie wielkości cząstek i potencjału zeta
	<ol>
		<li>Włącz przyrząd i odczekaj 30 minut, aż laserowe źródło światła się ustabilizuje.</li>
		<li>Rozcieńczyć NE 50-krotnie ultraczystą wodą i dodać 1 ml próbki do odpowiedniej celi próbki.</li>
		<li>Aby zmierzyć wielkość cząstek, ustaw temperaturę na 25 °C, wybierz wodę jako medium dyspergujące i wybierz jednorazowe plastikowe naczynia jako celę pomiarową. Załaduj próbki i zmierz automatycznie. Jako wynik końcowy należy podać średnią wartość z trzech powtórzonych pomiarów dla każdej próbki.</li>
		<li>Do pomiaru potencjału zeta należy ustawić temperaturę na 25 °C. Ze względu na wybór fazy wodnej jako medium dyspersyjnego, należy wybrać model Smoluchowsiego, a jako celę pomiarową złożoną komórkę kapilarną. Załaduj próbki i zmierz automatycznie. Jako wynik końcowy należy podać średnią z trzech powtórzonych pomiarów dla każdej próbki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oznaczanie szybkości kapsułkowania i szybkości ładowania leku
	<ol>
		<li>Aby określić ilość RA załadowanego w NE, należy użyć absolutnego etanolu do demulgacji i ekstrakcji RA z NE. Do 5 μl próbki dodać 995 μl etanolu i oznaczyć zawartość RA w roztworze za pomocą spektrofotometru przy długości fali 355 nm. Porównaj absorbancję z krzywą wzorcową. Użyj następującego równania: 
		Enkapsulacja = rzeczywiste obciążenie RZS/waga dodanego leku 
		Szybkość ładowania leku = rzeczywiste ładowanie RA / jakość próbki</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Procedury szczepień i pobieranie próbek
<ol>
	<li>Procedura szczepień i grupowanie szczepień
	<ol>
		<li>Grupa samic myszy Balb/C w wieku 6-8 tygodni i o wadze około 18-21 g w zestawach po 5 sztuk do immunizacji w dniu 0, dniu 14, dniu 28 według następujących grup eksperymentalnych: (1) grupa PBS, (2) grupa albuminy jaja kurzego (OVA), (3) grupa OVA+ NE-RA (OVA/ NE-RA), (4) grupa OVA+CNE-RA(OVA/CNE-RA).</li>
		<li>Uodpornić wszystkie myszy przez wstrzyknięcie domięśniowe do górnych mięśni czworogłowych za pomocą 200 μl różnych preparatów szczepionek: 100 μl emulsji i 15 μg OVA wchłoniętych w 100 μl PBS, zmieszanych przed podaniem. Wstrzyknąć 100 μl/tylną nogę. Dla myszy w grupie kontrolnej podawać sam PBS.</li>
		<li>Eutanazja: Poddaj eutanazji wszystkie myszy przez dootrzewnowe wstrzyknięcie 100 mg/kg 1% pentobarbitalu sodu 2 tygodnie po zakończeniu trzech szczepień.</li>
		<li>Pobieranie i przetwarzanie próbek: Po eutanazji użyj nożyczek, aby rozciąć klatkę piersiową myszy i włóż strzykawkę bezpośrednio do serca, aby odessać około 0,5 ml pełnej krwi. Pozostawić krew na 2 godziny w temperaturze pokojowej, a następnie odwirować przy 1800 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Zebrać surowicę, podwielokrotność i przechowywać w temperaturze -80 °C do dalszej analizy.</li>
		<li>Zbierz krew pełną, śledzionę, płyn z płukania pochwy (VLF), płyn z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego (BALF), płyn z płukania nosa (NLF) i płyn z płukania jelita cienkiego (SILF).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Izolacja limfocytów śledziony
	<ol>
		<li>Namocz myszy w etanolu 75% (v/v) w celu krótkiej sterylizacji, przenieś myszy na czystą ławkę. Przetnij skórę na lewym brzuchu nożyczkami, odsłoń i usuń śledzionę.</li>
		<li>Umieścić śledzionę na szalce Petriego zawierającej 3 ml PBS, zmielić i przefiltrować do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml za pomocą sita (200 oczek, 70 μm) i pręta mielącego.</li>
		<li>Odwirować komórki przy 650 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant i zawiesić osad w 3 ml roztworu do lizy czerwonych krwinek, inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.</li>
		<li>Dodać 10 ml PBS do probówki i dobrze wstrząsnąć, aby zakończyć reakcję, a następnie odwirować ją przy 650 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 10 ml PBS, dodać 20 μl rozcieńczenia komórek do automatycznego licznika komórek w celu zliczenia komórek.</li>
		<li>Odwirować komórki przy 650 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant i rozcieńczyć komórki do 1 x 106 komórek/ml za pomocą 1640 kompletnej pożywki (1% penicylina-streptomycyna, 10% płodowa surowica bydlęca).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pobieranie VLF: Przepłukać pochwę 4 razy 75 μl 1%BSA/PBST, połączyć roztwór do płukania i zebrać do probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml, odwirować przy 5000 x g w temperaturze 4 °C przez 20 minut, a następnie zebrać supernatant pipetą i przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Kolekcja BALF i NLF
	<ol>
		<li>Zdezynfekuj myszy po uśmierceniu za pomocą 75% (v/v) etanolu. Trzymaj mysz brzuchem do góry i wyprostuj szyję. Użyj nożyczek, aby wykonać podłużne nacięcie w skórze szyi myszy i użyj kleszczy, aby oddzielić mięśnie i odpowiednio odsłonić tchawicę.</li>
		<li>Przeciąć tchawicę przez mały poprzeczny otwór i wprowadzić wąż w kierunku płuc, podłączyć strzykawkę do węża i wstrzyknąć 0,5 ml PBS do płuc i wycofać, powtórzyć płukanie 3x i odwirować przy 650 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut, przechowywać supernatant (BALF) w temperaturze -80 °C.</li>
		<li>Odwróć wąż do jamy nosowej, podłącz strzykawkę do węża i wstrzyknij 0,5 ml PBS, płyn przepłynie przez jamę nosową do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml. Odessać popłuczynę z probówki wirówkowej i powtórzyć płukanie 2x, następnie odwirować przy 650 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut, przechowywać supernatant (NLF) w temperaturze -80 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kolekcja SILF
	<ol>
		<li>Przygotować roztwór PBS zawierający 0,1 mg/ml inhibitora trypsyny, 50 mM/L EDTA-2Na, 1 mM/l fluorku fenylometylosulfonylu (PMSF) jako roztwór do płukania jelita cienkiego. Mieszać w temperaturze pokojowej do rozpuszczenia i przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Rozciąć jelito cienkie wzdłuż rurki jelitowej i zanurzyć w 3 ml płynu z płukania jelita cienkiego. Mieszać przez pionowe wytrząsanie przy 15 obr./min przez 30 min w temperaturze 4 °C. Wirować przy 1440 x g w temperaturze 4 °C przez 20 min i zebrać supernatant za pomocą pipety, następnie odwirować przy 5000 x g w temperaturze 4 °C przez 20 min. Przechowywać supernatant (SILF) w temperaturze -80 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Ocena odpowiedzi przeciwciał specyficznych dla OVA po podaniu domięśniowym
<ol>
	<li>Określić poziomy IgG w surowicy, podklasy IgG1, IgG2a oraz poziomy swoistego sIgA w VLF, BALF, NLF i SILF za pomocą testu immunoenzymatycznego (ELISA).</li>
	<li>W przypadku powlekania antygenowego rozcieńczyć OVA do 5 μg/ml buforem powlekającym i pokryć 96-dołkowe płytki ELISA przez noc w temperaturze 4 °C 100 μl roztworu OVA na studzienkę.</li>
	<li>Przemyć płytki ELISA 5x PBST i blokować przez inkubację z 250 μl 1%BSA/PBST w temperaturze 37 °C przez 2 godziny.</li>
	<li>Przemyć płytki ELISA 5x PBST, następnie dodać 100 μl próbki rozcieńczonej zgodnie z opisem poniżej do badania i inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę. Rozcieńczyć surowicę, VLF, BALF, NLF 0,5% BSA/PBST, rozcieńczyć SILF 20% płodową surowicą cielęcą (FCS)/PBST.
	<ol>
		<li>Rozpocząć od rozcieńczenia surowicy 1000x, stosując dwuetapową procedurę rozcieńczania: rozcieńczyć 20 μl surowicy do 1 ml, następnie rozcieńczyć 25 μl tej rozcieńczonej surowicy do 500 μl. Użyj tego rozcieńczenia surowicy do wykrycia IgG1, IgG2a.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodać 200 μl surowicy rozcieńczonej 1000x do pierwszego rzędu powlekanej płytki i dodać 100 μl 0,5% BSA/PBST do wszystkich studzienek z wyjątkiem pierwszego rzędu. Przenieść 100 μl z pierwszego rzędu do drugiego rzędu i wymieszać 10x z pipetą. Powtórzyć ten krok do wiersza 8 i wylać 100 μl płynu, uzyskano surowicę o różnych stężeniach w celu wykrycia IgG.</li>
	<li>Wykonaj rozcieńczenie 1:1 BALF, NLF i SILF, aby wykryć IgA. W przypadku VLF należy stosować tę samą procedurę rozcieńczania, co w przypadku surowicy.</li>
	<li>Umyj płytki ELISA 5x za pomocą PBST. Dodać 100 μl sprzężonych z HRP kozich anty-mysich IgG/IgG1/IgG2a/IgA (rozcieńczonych w stosunku 1:10000 PBST) do odpowiednich studzienek i inkubować w temperaturze 37 °C przez 40 minut.</li>
	<li>Płytki ELISA przemyć 5x PBST, dodać 100 μL podłoża TMB ELISA (bardzo wrażliwego) i przenieść płytkę w miejsce chronione przed światłem na 5 min. Natychmiast dodać 100 μL roztworu zatrzymującego o długości 450 nm dla substratu TMB, aby zatrzymać reakcję.</li>
	<li>Zmierzyć absorbancję (OD) przy 450 nm dla każdej studzienki i obliczyć miano przeciwciał, przyjmując 2,1-krotność wartości surowicy myszy z grupy ślepej jako wartość odpowiedzi dodatniej.</li>
</ol>
5. Test ELISpot
<ol>
	<li>Postępuj zgodnie z wytycznymi dotyczącymi ELISpot Plus, użyj myszy IFN-γ (ALP) z zestawu, aby wykonać testy.</li>
	<li>Wyjąć płytkę z szczelnie zamkniętego opakowania i przemyć 4x sterylnym PBS (200 μL/basenik). Kondycjonować płytkę w 1640 kompletnym podłożu (200 μl/basenik) i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Usunąć pożywkę i dodać dostosowane stężenie zawiesiny limfocytów przygotowanej w kroku 3.2.2 (100 μl/dołek) do płytki, a następnie dodać 100 μl bodźca, tj. 1640 kompletnej pożywki zawierającej 20 μg/ml OVA257~264 lub OVA323~339 lub 1640 kompletnej pożywki. Umieścić płytkę w nawilżonym inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 48 godzin. Owiń talerz folią aluminiową, aby uniknąć parowania.</li>
	<li>Wyrzucić zawiesinę komórkową i przemyć płytkę 5x PBS (200 μl/basenik). Rozcieńczyć przeciwciało wykrywające (R4-6A2-biotyna) do 1 μg/ml w PBS zawierającym 0,5% płodowej surowicy cielęcej (PBS-0,5% FCS). Dodać 100 μl/basenik i inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Umyj płytę jak w kroku 5.2. Rozcieńczyć streptawidynę-ALP (1:1000) w PBS-0,5% FCS i dodać 100 μl/basenik, inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Umyj płytę jak w kroku 5.2. Przefiltruj gotowy do użycia roztwór substratu (BCIP/NBT-plus) przez filtr 0,45 μm i dodaj 100 μl/studzienkę. Rozwijaj się, aż pojawią się wyraźne plamy.</li>
	<li>Zatrzymaj rozwój koloru, myjąc go intensywnie w wodzie z kranu, usuń miękki plastik i pozostaw płytkę do wyschnięcia.</li>
	<li>Sprawdź i policz miejsca w czytniku ELISpot.</li>
</ol>
6. Analiza statystyczna
<ol>
	<li>Przeanalizuj różnice między danymi z 4 grup za pomocą jednokierunkowej ANOVA, a następnie wielokrotnego porównania Tukeya po teście. Wyraż wszystkie wyniki jako średnią ± SD. Wartość P mniejsza niż 0,05 została uznana za istotną.</li>
</ol>

Evaluating Immunogenicity of Nanoemulsion&#45;Encapsulated Retinoic Acid in Mice

<ol><li>Pulendran, B., Arunachalam, P. S., O'Hagan, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+concepts+in+the+science+of+vaccine+adjuvants%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Emerging concepts in the science of vaccine adjuvants.</a> Nat Rev Drug Discov. 20 (6), 454-475 (2021).</li>
<li>Pandey, P., Gulati, N., Makhija, M., Purohit, D., Dureja, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoemulsion%3A+A+novel+drug+delivery+approach+for+enhancement+of+bioavailability%5BTitle%5D)+AND+%22Recent+Pat+Nanotech%22%5BJournal%5D)">Nanoemulsion: A novel drug delivery approach for enhancement of bioavailability.</a> Recent Pat Nanotech. 14 (4), 276-293 (2020).</li>
<li>Chen, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disintegration+and+cancer+immunotherapy+efficacy+of+a+squalane-in-water+delivery+system+emulsified+by+bioresorbable+poly%28ethylene+glycol%29-block-polylactide%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Disintegration and cancer immunotherapy efficacy of a squalane-in-water delivery system emulsified by bioresorbable poly(ethylene glycol)-block-polylactide.</a> Biomaterials. 35 (5), 1686-1695 (2014).</li>
<li>Iwasaki, A., Omer, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+and+how+vaccines+work%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Why and how vaccines work.</a> Cell. 183 (2), 290-295 (2020).</li>
<li>Spadoni, I., Fornasa, G., Rescigno, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ-specific+protection+mediated+by+cooperation+between+vascular+and+epithelial+barriers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Organ-specific protection mediated by cooperation between vascular and epithelial barriers.</a> Nat Rev Immunol. 17 (12), 761-773 (2017).</li>
<li>Singh, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoemulsion%3A+Concepts%2C+development+and+applications+in+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cont+Release%22%5BJournal%5D)">Nanoemulsion: Concepts, development and applications in drug delivery.</a> J Cont Release. 252, 28-49 (2017).</li>
<li>Yan, W. L., Chen, W. S., Huang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+adjuvant+activity+of+cationic+liposome%3A+Phosphorylation+of+a+MAP+kinase%2C+ERK+and+induction+of+chemokines%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mechanism of adjuvant activity of cationic liposome: Phosphorylation of a MAP kinase, ERK and induction of chemokines.</a> Mol Immunol. 44 (15), 3672-3681 (2007).</li>
<li>Korsholm, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+adjuvant+mechanism+of+cationic+dimethyldioctadecylammonium+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">The adjuvant mechanism of cationic dimethyldioctadecylammonium liposomes.</a> Immunology. 121 (2), 216-226 (2007).</li>
<li>Agger, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cationic+liposomes+formulated+with+synthetic+mycobacterial+cordfactor+%28CAF01%29%3A+A+versatile+ddjuvant+for+vaccines+with+different+immunological+requirements%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Cationic liposomes formulated with synthetic mycobacterial cordfactor (CAF01): A versatile ddjuvant for vaccines with different immunological requirements.</a> Plos One. 3 (9), e3116(2008).</li>
<li>Slutter, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nasal+vaccination+with+N-trimethyl+chitosan+and+PLGA+based+nanoparticles%3A+Nanoparticle+characteristics+determine+quality+and+strength+of+the+antibody+response+in+mice+against+the+encapsulated+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Nasal vaccination with N-trimethyl chitosan and PLGA based nanoparticles: Nanoparticle characteristics determine quality and strength of the antibody response in mice against the encapsulated antigen.</a> Vaccine. 28 (38), 6282-6291 (2010).</li>
<li>Nochi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanogel+antigenic+protein-delivery+system+for+adjuvant-free+intranasal+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Mater%22%5BJournal%5D)">Nanogel antigenic protein-delivery system for adjuvant-free intranasal vaccines.</a> Nat Mater. 9 (8), 685-685 (2010).</li>
<li>Henriksen-Lacey, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposomal+cationic+charge+and+antigen+adsorption+are+important+properties+for+the+efficient+deposition+of+antigen+at+the+injection+site+and+ability+of+the+vaccine+to+induce+a+CMI+response%5BTitle%5D)+AND+%22J+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Liposomal cationic charge and antigen adsorption are important properties for the efficient deposition of antigen at the injection site and ability of the vaccine to induce a CMI response.</a> J Control Release. 145 (2), 102-108 (2010).</li>
<li>Zhong, X. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanovaccines+mediated+subcutis-to-intestine+cascade+for+improved+protection+against+intestinal+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Nanovaccines mediated subcutis-to-intestine cascade for improved protection against intestinal infections.</a> Small. 18 (1), e2105530(2022).</li>
<li>Mora, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+gut-homing+IgA-secreting+B+cells+by+intestinal+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Generation of gut-homing IgA-secreting B cells by intestinal dendritic cells.</a> Science. 314 (5802), 1157-1160 (2006).</li>
<li>Iwata, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+imprints+gut-homing+specificity+on+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid imprints gut-homing specificity on T cells.</a> Immunity. 21 (4), 527-538 (2004).</li>
<li>Hammerschmidt, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+induces+homing+of+protective+T+and+B+cells+to+the+gut+after+subcutaneous+immunization+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid induces homing of protective T and B cells to the gut after subcutaneous immunization in mice.</a> J Clin Invest. 121 (8), 3051-3061 (2011).</li>
<li>Burger, C., Shahzad, Y., Brümmer, A., Gerber, M., du Plessis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traversing+the+skin+barrier+with+nano-emulsions%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Drug+Deliv%22%5BJournal%5D)">Traversing the skin barrier with nano-emulsions.</a> Curr Drug Deliv. 14 (4), 458-472 (2017).</li>
<li>Lodaya, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formulation+design%2C+optimization+and+evaluations+of+an+%CE%B1-tocopherol-containing+self-emulsified+adjuvant+system+using+inactivated+influenza+vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cont+Release%22%5BJournal%5D)">Formulation design, optimization and evaluations of an α-tocopherol-containing self-emulsified adjuvant system using inactivated influenza vaccine.</a> J Cont Release. 316, 12-21 (2019).</li>
<li>Carmona-Ribeiro, A. M., Pérez-Betancourt, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cationic+nanostructures+for+vaccines+design%5BTitle%5D)+AND+%22Biomimetics%22%5BJournal%5D)">Cationic nanostructures for vaccines design.</a> Biomimetics. 5 (3), 32(2020).</li>
<li>Lam, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((trialkyl+ionizable+lipids+are+versatile+lipid-nanoparticle+components+for+therapeutic+and+vaccine+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Mater%22%5BJournal%5D)">trialkyl ionizable lipids are versatile lipid-nanoparticle components for therapeutic and vaccine applications.</a> Adv Mater. 35 (15), e2209624(2023).</li>
<li>Nie, T. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+coating+approach+to+overcome+mucosal+entrapment+of+DNA+nanoparticles+for+oral+gene+delivery+of+glucagon-like+peptide+1%5BTitle%5D)+AND+%22Acs+Appl+Mater+Inter%22%5BJournal%5D)">Surface coating approach to overcome mucosal entrapment of DNA nanoparticles for oral gene delivery of glucagon-like peptide 1.</a> Acs Appl Mater Inter. 11 (33), 29593-29603 (2019).</li>
<li>Lou, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+self-amplifying+mRNA+vaccines+by+cationic+lipid+nanoparticles%3A+The+impact+of+cationic+lipid+selection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cont+Release%22%5BJournal%5D)">Delivery of self-amplifying mRNA vaccines by cationic lipid nanoparticles: The impact of cationic lipid selection.</a> J Cont Release. 325, 370-379 (2020).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konfliktu interesów w związku z tą pracą.

W tym protokole opracowaliśmy kationowy kwas retinowy w kapsułkach z nanoemulsją, który ma być stosowany jako adiuwant w celu promowania specyficznych dla antygenu odpowiedzi ogólnoustrojowych i śluzówkowych. W porównaniu z tradycyjnymi adiuwantami NE ma następujące dwie zalety. Po pierwsze, ogólnie rzecz biorąc, powierzchnia O/W NE ma wysoki ładunek ujemny, co utrudnia bezpośrednie ładowanie antygenów. Kationowe NE mogą skutecznie adsorpować antygeny peptydowe lub białkowe i wzmacniać swoistą immunogenność. Po drugie, doświadczenie w tradycyjnych badaniach nad szczepionkami wykazało, że trudno jest stymulować odpowiedź błony śluzowej za pomocą wstrzyknięcia podskórnego lub domięśniowego5. Poprzez dodanie zatwierdzonego przez FDA RA do nanoemulsji 14,15,16, sIgA specyficzne dla OVA było promowane w pochwie i jelicie cienkim poprzez wstrzyknięcie domięśniowe. Protokół ten nie został zwalidowany w innych antygenach z wyjątkiem OVA. W przyszłych badaniach modele zwierzęce chorób związanych z jelitami mogą być wykorzystane do dalszej oceny wpływu i mechanizmu CNE-RA w zwiększaniu ochrony poszczepiennej.
Homogenizacja wysokociśnieniowa, mieszanie ścinające i ultradźwięki są najpowszechniejszymi metodami emulgowania wysokoenergetycznego stosowanymi do wytwarzania NE, przy czym homogenizacja wysokociśnieniowa zapewnia najlepszą jednorodność17. Jednak metody homogenizacji wysokociśnieniowej często wymagają drogiego specjalistycznego sprzętu, co wiąże się z wysokimi kosztami przygotowania i istotnymi problemami z chłodzeniem18. W naszych poprzednich doświadczeniach stwierdzono, że ciśnienie homogenizacji i liczba cykli miały wpływ na wielkość cząstek NE, a w pewnym zakresie, im wyższe ciśnienie homogenizacji i im większa liczba cykli, tym mniejszy był rozmiar cząstek. Przygotowanie siary emulsyjnej typu olej w wodzie skutecznie przekształca fazę olejową i wodną w duże kropelki i zmniejsza liczbę cykli homogenizacji. Jeśli ten krok zostanie pominięty, zwiększenie liczby cykli homogenizacji może ostatecznie doprowadzić do powstania nanoemulsji o tej samej wielkości cząstek i dyspersji. Zastąpienie PBS w fazie wodnej 0,9% roztworem soli fizjologicznej lub buforem cytrynianu sodu nie miało wpływu na wielkość cząstek i dyspersję NE.
Wiele lipidów kationowych jest szeroko stosowanych w projektowaniu szczepionek19, DOTAP został wybrany ze względu na to, że został zatwierdzony do użytku klinicznego, wykazuje dobre bezpieczeństwo i jest dobrze tolerowany. Nadmierny ładunek dodatni na powierzchni NE może prowadzić do cytotoksyczności. Ze względów bezpieczeństwa przy sporządzaniu kationowych NE należy wziąć pod uwagę rodzaj i ilość kationowych lipidów. Inne lipidy kationowe powszechnie stosowane w badaniach szczepionek to DLin-MC3-DMA ((6Z,9Z,28Z,31Z)-heptatriacont-6,9,28,31-tetraeno-19-yl4-(dimetyloamino)butanian)20, DMG-PEG2000 (1,2-dimyristoyl-rac-glycero-3-methoxyethyle glycol-2000), DOTMA (N,N,N-trimetylo-2,3-bis(octadec-9-en-1-yloxy)propan-1-aminium chlorek)21, DC-Chol (chlorowodorek cholesterolu 3β-[N-(N′,N′-dimetyloaminoetan)-karbamoilo]cholesterolu)22, a także to, czy można je wykorzystać do przygotowania kationowych NE, wymaga dalszych badań.
W ostatnich latach RZS przyciągnęło uwagę ze względu na jego zdolność do indukowania naprowadzania komórek odpornościowych na błonę śluzową jelit różnymi drogami, jednak RZS jest nie tylko słabo rozpuszczalny w wodzie, ale także niestabilny dla światła i tlenu. Podczas przygotowywania i przechowywania NE należy stale zwracać uwagę na ochronę RZS przed światłem i tlenem. RZS szybko ulega utlenieniu i rozkładowi pod wpływem światła i tlenu, ostatecznie tracąc swoje działanie adiuwantowe.

Adiuwanty są często stosowane w celu zwiększenia skuteczności szczepionki poprzez stymulację układu odpornościowego do silniejszej reakcji na szczepionkę, zwiększając w ten sposób odporność na określony patogen1. Adiuwant nanoemulsyjny (NE) odnosi się do koloidalnego układu dyspersyjnego o stabilności termodynamicznej poprzez emulgowanie pewnej proporcji fazy olejowej i fazy wodnej w celu wytworzenia emulsji w postaci wody w oleju (W/O) lub oleju w wodzie (O/W)2. Adiuwant nanoemulsyjny O/W może wytwarzać cytokiny i chemokiny w miejscu wstrzyknięcia, indukować szybką agregację i proliferację ważnych komórek odpornościowych, takich jak monocyty, neutrofile i eozynofile, oraz wzmacniać odpowiedź immunologiczną i poprawiać immunogenność antygenów3. Obecnie trzy adiuwanty nanoemulsyjne (MF59, AS03 i AF03) zostały dopuszczone do stosowania w szczepionkach i wykazały dobre bezpieczeństwo i skuteczność4.
Jednakże, odporność błony śluzowej została słabo rozwiązana przez obecnie licencjonowane preparaty uzupełniające w konwencjonalnych szczepieniach pozajelitowych5. Doniesiono, że kwas retinowy (RZS) indukuje naprowadzanie komórek odpornościowych w jelitach, ale jego niska polarność, słaba rozpuszczalność w wodzie oraz słaba stabilność świateł i termiczna ograniczają jego zastosowanie w solidnych szczepieniach dojelitowych. Nanoemulsje dają możliwości zwiększenia biodostępności wysoce lipofilnych leków, a rdzeń olejowy adiuwantów emulsyjnych O/W nadaje się do rozpuszczania substancji niepolarnych, takich jak RA6. Dlatego nanoemulsje mogą być stosowane jako nośniki RZS w celu uzyskania efektu podwójnej odpowiedzi odporności ogólnoustrojowej i odporności błony śluzowej.
W porównaniu do neutralnych lub anionowych systemów dostarczania, kationowe systemy dostarczania mają stosunkowo skuteczne możliwości enkapsulacji i dostarczania antygenów, co może zwiększyć immunogenność antygenów7,8,9. Kationowy ładunek powierzchniowy różnych systemów adiuwantowych jest ważny dla ich efektów adiuwantowych10,11,12. Ładunek kationowy jest ważnym czynnikiem przedłużającym retencję szczepionki w miejscu wstrzyknięcia, zwiększającym prezentację antygenu i przedłużającym stymulację odporności komórkowej w organizmie12.
Na podstawie powyższych rozważań, opracowaliśmy kationową nanoemulsję, aby skutecznie dostarczać RA i antygeny. Wielkość cząstek i potencjał zeta nanoemulsji określono za pomocą dynamicznego rozpraszania światła (DLS), a ogólnoustrojowe i śluzówkowe odpowiedzi immunologiczne nanoemulsji w połączeniu z OVA oceniono za pomocą wstrzyknięcia domięśniowego13.

<table><tbody><tr><td>1640 średni</td><td>GIBCO, USA</td><td>C11875500BT</td><td></td></tr><tr><td>450 nm Roztwór zatrzymujący do podłoża TMB</td><td>Abcam</td><td>ab171529-1000 mL</td><td></td></tr><tr><td>Automatyczny licznik komórek</td><td>Countstar, Chiny</td><td>IC1000</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>Wirówka B2064-100G</td><td></td></tr><tr><td>5810 R</td><td>Eppendorf, Niemcy</td><td>5811000398</td><td></td></tr><tr><td>Danamic Rozpraszanie światła</td><td>Malvern</td><td>Zetasizer Nano S90</td><td></td></tr><tr><td>DOTAP</td><td>CordenPharma, Szwajcaria</td><td>O02002</td><td></td></tr><tr><td>ELISpot Plus: Mysz IFN-gamma (ALP)</td><td>mabtech</td><td>ab205719</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu GIBCO, USA</td><td>10099141C</td><td></td></tr><tr><td>W pełni funkcjonalny czytnik mikropłytek</td><td>Thermo Fisher Scientific, USA</td><td>VL0000D2</td><td></td></tr><tr><td>Koza Anty-mysie IgG1 (HRP)</td> <td>Abcam</td><td>ab97240-1mg</td><td></td></tr><tr><td>Koza Anty-mysi łańcuch alfa IgA (HRP)</td> <td>Abcam</td><td>ab97235-1mg</td><td></td></tr><tr><td>Koza Anty-mysia IgG H& L (HRP)</td><td>Abcam</td><td>Ab205720-500ug</td><td></td></tr><tr><td>Koza&nbsp; Przeciw myszom IgG2a łańcuch ciężki (HRP)</td><td>Abcam</td><td>ab97245-1mg</td><td></td></tr><tr><td>Homogenizator wysokociśnieniowy</td><td>ATS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MONTANE 85 PPI</td><td>SEPPIC, Francja</td><td>L12910</td><td></td></tr><tr><td>MONTANOX 80 PPI</td><td>SEPPIC, Francja</td><td>36372K</td><td></td></tr><tr><td>OVA257&ndash; 264</td><td>Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd.</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>OVA323-339</td><td>Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd.</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Bufor fosforanowy sól fizjologiczna</td><td>ZSGB-bio</td><td>ZLI-9061</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do lizy czerwonych krwinek</td><td>Solarbio, Chiny</td><td>R1010</td><td></td></tr><tr><td>kwas retinowy</td><td>TCI, Japonia</td><td>TCI-R0064-5G</td><td></td></tr><tr><td>Skwalen</td><td>Sigma, USA</td><td>S3626</td><td></td></tr><tr><td>T10 basic Ultra-Turrax</td><td>IKA, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Podłoże</td> <td>TMB ELISAAbcam</td><td>ab171523-1000ml</td><td></td></tr><tr><td>inhibitor trypsyny</td><td>Diamond</td><td>A003570-0100</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Macklin, Chiny</td><td>9005-64-5</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr ultrafioletowy</td><td>Hitachi</td><td>U-3900</td><td></td></tr></tbody></table>

kation nanoemulsja kapsułkowana kwasem retinowym jako adiuwant w celu promowania specyficznych dla ova odpowiedzi ogólnoustrojowych i błony śluzowej

Cationic Nanoemulsion-Encapsulated Retinoic Acid as an Adjuvant to Promote OVA&#45;Specific Systemic and Mucosal Responses

Nanostruktury kationowe pojawiły się jako adiuwant i system dostarczania antygenu, który wspomaga dojrzewanie komórek dendrytycznych, wytwarzanie ROS i wychwyt antygenu, a następnie promuje specyficzne dla antygenu odpowiedzi immunologiczne. W ostatnich latach kwas retinowy (RZS) cieszy się coraz większym zainteresowaniem ze względu na jego wpływ na aktywację odpowiedzi immunologicznej błony śluzowej; jednak, aby użyć RZS jako adiuwanta błony śluzowej, konieczne jest rozwiązanie problemu jego rozpuszczania, ładowania i dostarczania. Tutaj opisujemy kationowy system dostarczania kwasu retinowego w kapsułkach nanoemulsyjnych (CNE-RA) składający się z kationowego lipidu 1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfocholiny (DOTAP), kwasu retinowego, skwalenu jako fazy olejowej, polisorbatu 80 jako środka powierzchniowo czynnego i trioleinianu sorbitolu 85 jako kosurfaktantu. Jego właściwości fizyczne i chemiczne scharakteryzowano za pomocą dynamicznego rozpraszania światła i spektrofotometru. Immunizacja myszy mieszaniną antygenu (albuminy jaja kurzego, OVA) i CNE-RA znacznie podniosła poziom immunoglobuliny wydzielniczej anty-OVA A (sIgA) w płynie z płukania pochwy i płynie z płukania jelita cienkiego myszy w porównaniu z samym OVA. Protokół ten opisuje szczegółową metodę przygotowania, charakterystyki i oceny działania adiuwantowego CNE-RA.

W sumie przygotowano cztery formulacje nanoemulsji, które scharakteryzowano pod kątem wielkości cząstek (Rysunek 1), potencjału zeta oraz wydajności enkapsulacji, zgodnie z danymi przedstawionymi w Tabeli 2. Wielkość cząstek koncentrowała się w przedziale 160-190nm, a dodatek DOTAP odwrócił potencjał zeta nanoemulsji. Poziom swoistych dla OVA przeciwciał IgG w surowicy oraz ich podgrup zmierzono 2 tygodnie po trzecim szczepieniu. Szczepionka z adiuwantem w postaci nanoemulsji znacząco zwiększyła miana swoistych przeciwciał IgG, IgG1 i IgG 2a w surowicy (Rysunek 2). Co ważniejsze, poziomy swoistych sIgA w płukankach z pochwy i jelita cienkiego uległy znacznemu wzrostowi w przypadku zastosowania OVA z adiuwantem CNE-RA (Rysunek 3). W analizie ELISpot nie stwierdzono istotnej liczby punktów.
<img alt="Wykres rozkładu wielkości według intensywności; analiza cząstek; dwa piki; porównanie; skala w nanometrach." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66270/66270fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Średnica i rozkład wielkości. (A) Średnica i rozkład wielkości NE-RA. (B) Średnica i rozkład wielkości CNE-RA. d.nm to średnia średnica cząstek w nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66270/66270fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Poziomy swoistych dla OVA przeciwciał IgG w surowicy; wykres słupkowy przedstawiający miana IgG w różnych grupach badawczych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66270/66270fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Poziomy swoistych dla OVA przeciwciał IgG w surowicy oraz ich podgrup. Poziomy swoistych dla OVA przeciwciał IgG w surowicy oraz ich podgrup zmierzone 2 tygodnie po zakończeniu trzech immunizacji. (A) Wartość Log2 mian IgG. (B) Gęstość optyczna IgG1 przy 450 nm. (C) Gęstość optyczna IgG2a przy 450 nm. Dane przedstawiono jako średnia ± SD (n=5), ***: P&lt;0.001. Porównania różnic między grupami a grupą PBS przedstawiono bezpośrednio nad słupkami na rysunku i oznaczono następująco: ns: brak istotności, #p&lt;0.05, ###p&lt;0.001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66270/66270fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Porównanie poziomów sIgA w różnych płynach; wykres dla PBS, OVA, OVARA-NE, OVARA-CNE; dane statystyczne." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66270/66270fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 3"> 
Rysunek 3: sIgA swoiste dla OVA. sIgA swoiste dla OVA w płuczynie pochwowej, płuczynie bronchoalveolarnej, płuczynie nosowej oraz płuczynie jelita cienkiego. (A) Płuczyna pochwowa, (B) płuczyna bronchoalveolarna, (C) płuczyna nosowa i (D) płuczyna jelita cienkiego. Dane przedstawiono jako średnia ± SD (n=5), ns: brak istotności, *p&lt;0.05; ***p&lt;0.001. Porównania różnic między grupami a grupą PBS przedstawiono bezpośrednio nad słupkami na rysunku i oznaczono w następujący sposób: ns: brak istotności, ###p&lt;0.001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66270/66270fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Próbka</td>
			<td>Skwalen</td>
			<td>Trioleinian sorbitanu 85</td>
			<td>DOTAP</td>
			<td>RZS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NE-RA</td>
			<td>1,5 g</td>
			<td>0,15 g</td>
			<td>0</td>
			<td>60 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CNE-RA</td>
			<td>1,5 g</td>
			<td>0,15 g</td>
			<td>45 mg</td>
			<td>60 mg</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Skład fazy olejowej nanoemulsji (NEs).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Próbka</td>
			<td>Średnia wielkość cząstek (nm)</td>
			<td>Wskaźnik polidyspersyjności</td>
			<td>Potencjał zeta (mV)</td>
			<td>Wydajność enkapsulacji (%)</td>
			<td>Stopień załadunku leku (mg/ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NE-RA</td>
			<td>182.9±3.4</td>
			<td>0.18±0.02</td>
			<td>-23.0±0.2</td>
			<td>40</td>
			<td>0.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CNE-RA</td>
			<td>162.7±4.2</td>
			<td>0.16±0.01</td>
			<td>42.2±0.5</td>
			<td>40</td>
			<td>0.8</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Charakterystyka fizykochemiczna NEs.

W tym protokole opracowaliśmy kationowy kwas retinowy (RA) kapsułkowany nanoemulsją, który ma być stosowany jako adiuwant do promowania specyficznych dla antygenu odpowiedzi ogólnoustrojowych i śluzówkowych. Poprzez dodanie zatwierdzonego przez FDA RA do nanoemulsji, sIgA specyficzne dla antygenu było promowane w pochwie i jelicie cienkim po domięśniowym wstrzyknięciu nanoemulsji.

Kation Nanoemulsja kapsułkowana kwasem retinowym jako adiuwant w celu promowania specyficznych dla OVA odpowiedzi ogólnoustrojowych i błony śluzowej

Cationic nanostructures have emerged as an adjuvant and antigen delivery system that enhances dendritic cell maturation, ROS generation, and antigen ...

Pracujemy nad szczepionką śluzówkową, która wywołuje odpowiedź immunologiczną jako zestaw infekcji, która może zapobiegać infekcji i przerywać transmisję. Opracowaliśmy kationową nanoemulsję kapsułkowaną systemem dostarczania kwasu retinowego. Immunizacja albuminą jaja kurzego przez wstrzyknięcie domięśniowe, które wyzwala zarówno ogólnoustrojową, jak i śluzówkową odpowiedź immunologiczną.W przyszłych badaniach modele zwierzęce chorób związanych z jelitami mogą być wykorzystane do dalszej oceny wpływu i mechanizmu kationowego kwasu retinowego kapsułkowanego w nanoemulsji w celu poprawy ochrony przed mieszaniem. Przygotowanie fazy wodnej należy rozpocząć od rozpuszczenia 0,15 grama polisorbatu 80 w 28,2 mililitrze PBS, mieszając w temperaturze 40 stopni Celsjusza. Aby przygotować preparat fazy olejowej, rozpuść trioleinian sorbitanu 85, DOTAP i kwas retinowy w skwalenie, mieszając w temperaturze 40 stopni Celsjusza.Następnie kroplami dodaj fazę wodną w ilości jednego mililitra na minutę do fazy olejowej, mieszając z prędkością 1400 obr./min w celu przygotowania pierwotnej emulsji olejowo-wodnej. Mieszaninę należy wstępnie emulgować za pomocą emulgatora o wysokim ścinaniu przy 30 000 obr./min przez sześć minut. Pierwotną emulsję olejowo-wodną należy traktować homogenizatorem wysokociśnieniowym przez 12 cykli pod ciśnieniem 900 barów, aby uzyskać jednorodną nanoemulsję.Zebrać emulsję w kolbie o pojemności 50 mililitrów. I przesterylizuj go przez strzykawkę z filtrem PES 0,2 mikrona. Podłączyć kolbę do przewodu Schlenka przez cewnik, obracając trójdrogowy zawór odcinający, aby podłączyć system do rury próżniowej.Włącz pompę próżniową, aby wytworzyć podciśnienie w kolbie. Następnie obróć trójdrożny kurek, aby podłączyć system do rurki argonowej i napełnij ją argonem. Wymień korek kolb i uszczelnij go folią parafinową.Zawiń kolbę w folię aluminiową i przechowuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Włącz przyrząd do dynamicznego rozpraszania światła i poczekaj 30 minut, aż laserowe źródło światła ustabilizuje się. Rozcieńczyć nanoemulsję 50-krotnie ultraczystą wodą i dodać jeden mililitr próbki do odpowiedniej celi próbki.Na instrumencie ustaw temperaturę na 25 stopni Celsjusza. Wybierz wodę jako medium dyspergujące i jednorazowe plastikowe naczynia jako celę pomiarową. Załaduj próbki i zmierz wielkość cząstek.Jako wynik należy podać średnią wartość z trzech powtórzonych pomiarów dla każdej próbki. Aby rozpocząć powlekanie antygenem, rozcieńczyć albuminę jaja kurzego do pięciu mikrogramów na mililitr za pomocą buforu powlekającego. Pokryj 96-dołkową płytkę ELISA 100 mikrolitrami roztworu albuminy jaja kurzego na studzienkę przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Następnego dnia umyj studzienki pięć razy PBST. Zablokuj studzienki 250 mikrolitrami 1% BSAPBST w temperaturze 37 stopni Celsjusza na dwie godziny. Aby przygotować 1000-krotne rozcieńczenie surowicy, najpierw rozcieńczyć 20 mikrolitrów surowicy do jednego mililitra za pomocą 0,5% BSAPBST.Następnie usunąć 25 mikrolitrów podwielokrotności surowicy i rozcieńczyć ją do 500 mikrolitrów za pomocą 0,5% BSAPBST. Dodaj 200 mikrolitrów surowicy rozcieńczonej do 1000x do pierwszego rzędu powlekanej płytki. Następnie dodaj 100 mikrolitrów 0,5% BSAPBST do wszystkich studzienek z wyjątkiem studzienek w pierwszym rzędzie.Przenieś 100 mikrolitrów z pierwszego rzędu do drugiego rzędu i wymieszaj 10 razy. Aby uzyskać różne stężenia surowicy do wykrywania IgG, wyrzuć 100 mikrolitrów płynu z ostatniego rzędu. Następnie rozcieńczyć płukanie pochwy myszy, płukanie oskrzeli i pęcherzyków płucnych, płyny z płukania nosa 0,5% BSAPBST i płyn z płukania jelita cienkiego z 20% płodową surowicą cielęcą PBST.Inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę. Umyj studzienki pięć razy PBST. Dodaj 100 mikrolitrów sprzężonego z HRP koziego przeciwciała anty-mysiego do odpowiednich studzienek i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 40 minut.Po pięciokrotnym umyciu studzienek PBST, dodać 100 mikrolitrów substratu TMB Eliza i inkubować w chronionym światłem miejscu przez pięć minut. Dodaj 100 mikrolitrów 450 nanometrowego roztworu zatrzymującego, aby zakończyć reakcję. Zmierz absorbancję przy 450 nanometrach na czytniku mikropłytek.Obliczyć miano przeciwciał określające wartość odpowiedzi dodatniej jako 2,1-krotność wartości surowicy grupy kontrolnej myszy. Szczepionka z adiuwantem nanoemulsyjnym znacząco zwiększa miano przeciwciał IgG, IgG1 i IgG2a specyficznych dla albuminy jaja kurzego w surowicy. Poziomy swoistej IgA w płynie z płukania pochwy i płynie z płukania jelita cienkiego były znacznie zwiększone, gdy albumina jaja kurzego była adiuwantowana kationowym kwasem retinowym zawierającym nanoemulsję.

cationic-nanoemulsion-encapsulated-retinoic-acid-as-an-adjuvant-to

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

W tym filmie demonstrujemy technikę ułatwiającą internalizację nanocząstek siarczku miedzi z kwasem foliowym (CuS NPs). Funkcjonalizowane kwasem foliowym nanocząsteczki CuS mają zdolność celowania w receptory kwasu foliowego, które ulegają nadekspresji w wielu komórkach raka jajnika.

Funkcjonalizowane celowanie w nanocząstki raka jajnika: technika ułatwiająca wychwyt nanocząsteczkowego środka kontrastowego sprzężonego z kwasem foliowym przez komórki raka jajnika

Ten film pokazuje produkcję szczepionek przeciwnowotworowych z nanoemulsją. Stabilne zbiorniki ropy naftowej przenoszące syntetyczne peptydy i adiuwanty są wytwarzane z niskoenergetycznej nanoemulsji, co stanowi znaczącą nadzieję w immunoterapii nowotworów.

Przygotowanie szczepionki z adiuwantem w postaci nanoemulsji

Prezentujemy tutaj aplikację do standardowej techniki immunologicznej (proliferacja OT-I barwiona CFSE) przeznaczonej do szybkiego monitorowania wytwarzania cytotoksycznych limfocytów T (CTL) za pośrednictwem adiuwantów in vivo. To szybkie oszacowanie zdolności CTL jest przydatne do opracowywania szczepionek profilaktycznych przeciwko patogenom wewnątrzkomórkowym, a także terapeutycznych szczepionek przeciwnowotworowych.

Szybka ocena in vivo zdolności wytwarzania cytotoksycznych limfocytów T adiuwantu w celu opracowania szczepionki

Opisujemy protokół chemicznej koniugacji modelowego antygenu albuminy jaja kurzego z przeciwciałem specyficznym dla receptora endocytozy do celowania in vivo w komórki dendrytyczne. Protokół obejmuje oczyszczenie przeciwciała, chemiczne sprzęgnięcie antygenu, a także oczyszczenie koniugatu i weryfikację sprawnej koniugacji.

Chemiczna koniugacja oczyszczonego przeciwciała skierowanego przeciwko DEC-205 z białkiem o pełnej długości do celowania w mysie komórki dendrytyczne in vitro i in vivo

Protokół przedstawia szczegółowe metody oceny, czy adiuwant nanoemulsji ofiopogoniny D wspomaga skuteczne komórkowe odpowiedzi immunologiczne.

In vitro Ocena aktywności komórkowej adiuwantu szczepionki nanoemulsyjnej ofiopogoniny D

Tutaj prezentujemy szczegółowe metody przygotowania i oceny nosowej samoorganizującej się szczepionki przeciwnowotworowej z nanoemulsji in vitro i in vivo.

Przygotowanie, charakterystyka, toksyczność i skuteczność oceny samoorganizującej się szczepionki przeciwnowotworowej z nanoemulsją do nosa in vitro i in vivo

Aby racjonalnie zaprojektować skuteczne adiuwanty, opracowaliśmy emulsję Pickeringa stabilizowaną nanocząstkami kwasu poli-mlekowo-glikolowego (PNPE). PNPE posiadał wyjątkową miękkość i hydrofobowy interfejs zapewniający silny kontakt komórkowy i oferował ładowanie antygenem o wysokiej zawartości, poprawiając powinowactwo komórkowe systemu dostarczania do komórek prezentujących antygen i indukując wydajną internalizację antygenów.

Powinowactwo komórkowe emulsji stabilizowanej cząstkami w celu zwiększenia internalizacji antygenu

Obecny protokół przygotowuje i ocenia właściwości fizyczne, odpowiedź immunologiczną i efekt ochronny in vivo nowej szczepionki z adiuwantem nanoemulsyjnym.

Ocena odpowiedzi immunologicznej szczepionki z adiuwantem nanoemulsyjnym przeciwko zakażeniu gronkowcem złocistym opornym na metycylinę (MRSA)

To badanie przedstawia metodologię dostarczania leków do siatkówki i nerwów wzrokowych dorosłego szczura. Dodatkowo wprowadzono unikalną metodę pobierania tkanek w celu odgórnego pobrania en bloc nerwu wzrokowego i siatkówki u dorosłego szczura.

Terapeutyczne dostarczanie do oczu i zaawansowane pobieranie tkanek u dorosłych szczurów

Podczas procesu infekcji kluczowym etapem jest adhezja patogenów do komórek gospodarza. W większości przypadków etap adhezji ten zachodzi w obecności stresu mechanicznego generowanego przez przepływającą ciecz. Opisujemy technikę, która wprowadza naprężenie ścinające jako istotny parametr w badaniu adhezji bakteryjnej.

Wprowadzenie naprężenia ścinającego w badaniach nad adhezją bakteryjną

Poznaj metodę przygotowania kationowej nanoemulsji z kwasem retinowym jako adiuwantem szczepionkowym. Technika ta wzmacza odpowiedzi immunologiczne specyficzne dla antygenu OVA zarówno ogólnoustrojowe, jak i błony śluzowej.

Kation Nanoemulsja kapsułkowana kwasem retinowym jako adiuwant w celu promowania specyficznych dla OVA odpowiedzi ogólnoustrojowych i błony śluzowej (Wideo) | JoVE Journal

Kation Nanoemulsja kapsułkowana kwasem retinowym jako adiuwant w celu promowania specyficznych dla OVA odpowiedzi ogólnoustrojowych i błony śluzowej

Przeglądaj więcej filmów