Kation Nanoemulsja kapsułkowana kwasem retinowym jako adiuwant w celu promowania specyficznych dla OVA odpowiedzi ogólnoustrojowych i błony śluzowej

Pracujemy nad szczepionką śluzówkową, która wywołuje odpowiedź immunologiczną jako zestaw infekcji, która może zapobiegać infekcji i przerywać transmisję. Opracowaliśmy kationową nanoemulsję kapsułkowaną systemem dostarczania kwasu retinowego. Immunizacja albuminą jaja kurzego przez wstrzyknięcie domięśniowe, które wyzwala zarówno ogólnoustrojową, jak i śluzówkową odpowiedź immunologiczną.

W przyszłych badaniach modele zwierzęce chorób związanych z jelitami mogą być wykorzystane do dalszej oceny wpływu i mechanizmu kationowego kwasu retinowego kapsułkowanego w nanoemulsji w celu poprawy ochrony przed mieszaniem. Przygotowanie fazy wodnej należy rozpocząć od rozpuszczenia 0,15 grama polisorbatu 80 w 28,2 mililitrze PBS, mieszając w temperaturze 40 stopni Celsjusza. Aby przygotować preparat fazy olejowej, rozpuść trioleinian sorbitanu 85, DOTAP i kwas retinowy w skwalenie, mieszając w temperaturze 40 stopni Celsjusza.

Następnie kroplami dodaj fazę wodną w ilości jednego mililitra na minutę do fazy olejowej, mieszając z prędkością 1400 obr./min w celu przygotowania pierwotnej emulsji olejowo-wodnej. Mieszaninę należy wstępnie emulgować za pomocą emulgatora o wysokim ścinaniu przy 30 000 obr./min przez sześć minut. Pierwotną emulsję olejowo-wodną należy traktować homogenizatorem wysokociśnieniowym przez 12 cykli pod ciśnieniem 900 barów, aby uzyskać jednorodną nanoemulsję.

Zebrać emulsję w kolbie o pojemności 50 mililitrów. I przesterylizuj go przez strzykawkę z filtrem PES 0,2 mikrona. Podłączyć kolbę do przewodu Schlenka przez cewnik, obracając trójdrogowy zawór odcinający, aby podłączyć system do rury próżniowej.

Włącz pompę próżniową, aby wytworzyć podciśnienie w kolbie. Następnie obróć trójdrożny kurek, aby podłączyć system do rurki argonowej i napełnij ją argonem. Wymień korek kolb i uszczelnij go folią parafinową.

Zawiń kolbę w folię aluminiową i przechowuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Włącz przyrząd do dynamicznego rozpraszania światła i poczekaj 30 minut, aż laserowe źródło światła ustabilizuje się. Rozcieńczyć nanoemulsję 50-krotnie ultraczystą wodą i dodać jeden mililitr próbki do odpowiedniej celi próbki.

Na instrumencie ustaw temperaturę na 25 stopni Celsjusza. Wybierz wodę jako medium dyspergujące i jednorazowe plastikowe naczynia jako celę pomiarową. Załaduj próbki i zmierz wielkość cząstek.

Jako wynik należy podać średnią wartość z trzech powtórzonych pomiarów dla każdej próbki. Aby rozpocząć powlekanie antygenem, rozcieńczyć albuminę jaja kurzego do pięciu mikrogramów na mililitr za pomocą buforu powlekającego. Pokryj 96-dołkową płytkę ELISA 100 mikrolitrami roztworu albuminy jaja kurzego na studzienkę przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Następnego dnia umyj studzienki pięć razy PBST. Zablokuj studzienki 250 mikrolitrami 1% BSAPBST w temperaturze 37 stopni Celsjusza na dwie godziny. Aby przygotować 1000-krotne rozcieńczenie surowicy, najpierw rozcieńczyć 20 mikrolitrów surowicy do jednego mililitra za pomocą 0,5% BSAPBST.

Następnie usunąć 25 mikrolitrów podwielokrotności surowicy i rozcieńczyć ją do 500 mikrolitrów za pomocą 0,5% BSAPBST. Dodaj 200 mikrolitrów surowicy rozcieńczonej do 1000x do pierwszego rzędu powlekanej płytki. Następnie dodaj 100 mikrolitrów 0,5% BSAPBST do wszystkich studzienek z wyjątkiem studzienek w pierwszym rzędzie.

Przenieś 100 mikrolitrów z pierwszego rzędu do drugiego rzędu i wymieszaj 10 razy. Aby uzyskać różne stężenia surowicy do wykrywania IgG, wyrzuć 100 mikrolitrów płynu z ostatniego rzędu. Następnie rozcieńczyć płukanie pochwy myszy, płukanie oskrzeli i pęcherzyków płucnych, płyny z płukania nosa 0,5% BSAPBST i płyn z płukania jelita cienkiego z 20% płodową surowicą cielęcą PBST.

Inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę. Umyj studzienki pięć razy PBST. Dodaj 100 mikrolitrów sprzężonego z HRP koziego przeciwciała anty-mysiego do odpowiednich studzienek i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 40 minut.

Po pięciokrotnym umyciu studzienek PBST, dodać 100 mikrolitrów substratu TMB Eliza i inkubować w chronionym światłem miejscu przez pięć minut. Dodaj 100 mikrolitrów 450 nanometrowego roztworu zatrzymującego, aby zakończyć reakcję. Zmierz absorbancję przy 450 nanometrach na czytniku mikropłytek.

Obliczyć miano przeciwciał określające wartość odpowiedzi dodatniej jako 2,1-krotność wartości surowicy grupy kontrolnej myszy. Szczepionka z adiuwantem nanoemulsyjnym znacząco zwiększa miano przeciwciał IgG, IgG1 i IgG2a specyficznych dla albuminy jaja kurzego w surowicy. Poziomy swoistej IgA w płynie z płukania pochwy i płynie z płukania jelita cienkiego były znacznie zwiększone, gdy albumina jaja kurzego była adiuwantowana kationowym kwasem retinowym zawierającym nanoemulsję.