Kation Nanoemulsja kapsułkowana kwasem retinowym jako adiuwant w celu promowania specyficznych dla OVA odpowiedzi ogólnoustrojowych i błony śluzowej
February 23rd, 2024
W tym protokole opracowaliśmy kationowy kwas retinowy (RA) kapsułkowany nanoemulsją, który ma być stosowany jako adiuwant do promowania specyficznych dla antygenu odpowiedzi ogólnoustrojowych i śluzówkowych. Poprzez dodanie zatwierdzonego przez FDA RA do nanoemulsji, sIgA specyficzne dla antygenu było promowane w pochwie i jelicie cienkim po domięśniowym wstrzyknięciu nanoemulsji.
Pracujemy nad szczepionką śluzówkową, która wywołuje odpowiedź immunologiczną jako zestaw infekcji, która może zapobiegać infekcji i przerywać transmisję. Opracowaliśmy kationową nanoemulsję kapsułkowaną systemem dostarczania kwasu retinowego. Immunizacja albuminą jaja kurzego przez wstrzyknięcie domięśniowe, które wyzwala zarówno ogólnoustrojową, jak i śluzówkową odpowiedź immunologiczną.
W przyszłych badaniach modele zwierzęce chorób związanych z jelitami mogą być wykorzystane do dalszej oceny wpływu i mechanizmu kationowego kwasu retinowego kapsułkowanego w nanoemulsji w celu poprawy ochrony przed mieszaniem. Przygotowanie fazy wodnej należy rozpocząć od rozpuszczenia 0,15 grama polisorbatu 80 w 28,2 mililitrze PBS, mieszając w temperaturze 40 stopni Celsjusza. Aby przygotować preparat fazy olejowej, rozpuść trioleinian sorbitanu 85, DOTAP i kwas retinowy w skwalenie, mieszając w temperaturze 40 stopni Celsjusza.
Następnie kroplami dodaj fazę wodną w ilości jednego mililitra na minutę do fazy olejowej, mieszając z prędkością 1400 obr./min w celu przygotowania pierwotnej emulsji olejowo-wodnej. Mieszaninę należy wstępnie emulgować za pomocą emulgatora o wysokim ścinaniu przy 30 000 obr./min przez sześć minut. Pierwotną emulsję olejowo-wodną należy traktować homogenizatorem wysokociśnieniowym przez 12 cykli pod ciśnieniem 900 barów, aby uzyskać jednorodną nanoemulsję.
Zebrać emulsję w kolbie o pojemności 50 mililitrów. I przesterylizuj go przez strzykawkę z filtrem PES 0,2 mikrona. Podłączyć kolbę do przewodu Schlenka przez cewnik, obracając trójdrogowy zawór odcinający, aby podłączyć system do rury próżniowej.
Włącz pompę próżniową, aby wytworzyć podciśnienie w kolbie. Następnie obróć trójdrożny kurek, aby podłączyć system do rurki argonowej i napełnij ją argonem. Wymień korek kolb i uszczelnij go folią parafinową.
Zawiń kolbę w folię aluminiową i przechowuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Włącz przyrząd do dynamicznego rozpraszania światła i poczekaj 30 minut, aż laserowe źródło światła ustabilizuje się. Rozcieńczyć nanoemulsję 50-krotnie ultraczystą wodą i dodać jeden mililitr próbki do odpowiedniej celi próbki.
Na instrumencie ustaw temperaturę na 25 stopni Celsjusza. Wybierz wodę jako medium dyspergujące i jednorazowe plastikowe naczynia jako celę pomiarową. Załaduj próbki i zmierz wielkość cząstek.
Jako wynik należy podać średnią wartość z trzech powtórzonych pomiarów dla każdej próbki. Aby rozpocząć powlekanie antygenem, rozcieńczyć albuminę jaja kurzego do pięciu mikrogramów na mililitr za pomocą buforu powlekającego. Pokryj 96-dołkową płytkę ELISA 100 mikrolitrami roztworu albuminy jaja kurzego na studzienkę przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Następnego dnia umyj studzienki pięć razy PBST. Zablokuj studzienki 250 mikrolitrami 1% BSAPBST w temperaturze 37 stopni Celsjusza na dwie godziny. Aby przygotować 1000-krotne rozcieńczenie surowicy, najpierw rozcieńczyć 20 mikrolitrów surowicy do jednego mililitra za pomocą 0,5% BSAPBST.
Następnie usunąć 25 mikrolitrów podwielokrotności surowicy i rozcieńczyć ją do 500 mikrolitrów za pomocą 0,5% BSAPBST. Dodaj 200 mikrolitrów surowicy rozcieńczonej do 1000x do pierwszego rzędu powlekanej płytki. Następnie dodaj 100 mikrolitrów 0,5% BSAPBST do wszystkich studzienek z wyjątkiem studzienek w pierwszym rzędzie.
Przenieś 100 mikrolitrów z pierwszego rzędu do drugiego rzędu i wymieszaj 10 razy. Aby uzyskać różne stężenia surowicy do wykrywania IgG, wyrzuć 100 mikrolitrów płynu z ostatniego rzędu. Następnie rozcieńczyć płukanie pochwy myszy, płukanie oskrzeli i pęcherzyków płucnych, płyny z płukania nosa 0,5% BSAPBST i płyn z płukania jelita cienkiego z 20% płodową surowicą cielęcą PBST.
Inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę. Umyj studzienki pięć razy PBST. Dodaj 100 mikrolitrów sprzężonego z HRP koziego przeciwciała anty-mysiego do odpowiednich studzienek i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 40 minut.
Po pięciokrotnym umyciu studzienek PBST, dodać 100 mikrolitrów substratu TMB Eliza i inkubować w chronionym światłem miejscu przez pięć minut. Dodaj 100 mikrolitrów 450 nanometrowego roztworu zatrzymującego, aby zakończyć reakcję. Zmierz absorbancję przy 450 nanometrach na czytniku mikropłytek.
Obliczyć miano przeciwciał określające wartość odpowiedzi dodatniej jako 2,1-krotność wartości surowicy grupy kontrolnej myszy. Szczepionka z adiuwantem nanoemulsyjnym znacząco zwiększa miano przeciwciał IgG, IgG1 i IgG2a specyficznych dla albuminy jaja kurzego w surowicy. Poziomy swoistej IgA w płynie z płukania pochwy i płynie z płukania jelita cienkiego były znacznie zwiększone, gdy albumina jaja kurzego była adiuwantowana kationowym kwasem retinowym zawierającym nanoemulsję.
Przegląd
Ta praca prezentuje nowatorską kationową nanoemulsję otoczoną kwasem retinoicznym (RA), zaprojektowaną w celu wzmocnienia odpowiedzi immunologicznych specyficznych dla antygenu. Formuła ma na celu promowanie zarówno odporności systemowej, jak i śluzowej po podaniu domięśniowym.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Immunologia
- Opracowywanie szczepionek
- Odporność śluzowa
Wprowadzenie
- Szczepionki śluzowe mogą potencjalnie zapobiegać infekcjom i przerywać transmisję.
- Kwas retinoicowy jest znany z wpływu na odpowiedzi immunologiczne.
- Kationowe nanoemulsje są skutecznymi systemami dostarczania szczepionek.
- Odpowiedzi immunologiczne systemowe i śluzowe są kluczowe dla skutecznej szczepionki.
Cel badania
- Opracowanie systemu dostarczania, który wzmacnia odpowiedzi immunologiczne.
- Ocena skuteczności RA w promowaniu sIgA specyficznych dla antygenu.
- Zbadanie potencjału tego systemu w zapobieganiu chorobom związanym z jelitami.
Wykorzystane metody
- Przygotowanie faz wodnych i olejowych do nanoemulsji.
- Immunizacja domięśniowa owalbuaminą.
- Ocena odpowiedzi immunologicznych systemowych i śluzowych.
- Planowane przyszłe badania z wykorzystaniem modeli zwierzęcych.
Główne wyniki
- RA zwiększył produkcję sIgA specyficznych dla antygenu w pochwie i jelicie cienkim.
- Nanoemulsja wywołała odpowiedzi immunologiczne systemowe.
- Formuła zapowiada się obiecująco na przyszłość w rozwoju szczepionek.
- Zidentyfikowano potencjalne zastosowania w modelach chorób jelitowych.
Wnioski
- Kationowa nanoemulsja otoczona RA jest obiecującym adiuwantem.
- To podejście może poprawić skuteczność szczepionek śluzowych.
- Konieczne są dalsze badania, aby zbadać jego pełny potencjał.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Cationic nanoemulsion-encapsulated retinoic acid (CNE-RA) offers a platform for enhancing both systemic and mucosal antigen-specific immune responses, addressing a key challenge in vaccine adjuvant development. This approach enables more robust immunogenicity at mucosal surfaces, which is critical for infectious disease prevention and transmission interruption. The method supports translational continuity from early discovery through preclinical evaluation in disease-relevant models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of mucosal immune activation mechanisms using defined antigen-adjuvant combinations.
- Supports functional validation of adjuvant candidates in immunogenicity studies.
- Facilitates predictive confidence in selecting adjuvant systems for further development.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized protocol for preparing and characterizing nanoemulsion-based adjuvants.
- Delivers quantitative readouts of antigen-specific IgG and IgA responses in multiple biological fluids.
- Enables reproducible assessment of adjuvant performance across batches and conditions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant mucosal models for evaluating vaccine efficacy.
- Supports continuity from in vitro characterization to in vivo immunogenicity testing.
- Informs risk-adjusted advancement decisions for adjuvant and vaccine candidates.
Pipeline & Workflow Integration
This CNE-RA platform integrates into the vaccine discovery continuum from early adjuvant screening to preclinical immunogenicity studies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on mucosal immune potentiation and adjuvant mechanism of action.
- Screening: Provides quantitative, reproducible antibody titers for comparative evaluation of adjuvant formulations.
- Analytics: Enables measurement of specific IgG and IgA levels in serum and mucosal fluids for data-driven decision making.
- Translational Research: Bridges in vitro and in vivo studies, supporting preclinical validation in animal models of mucosal disease.
- Enterprise Reuse: Offers a modular, adaptable adjuvant preparation protocol for diverse antigen systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in mucosal vaccine candidate selection and de-risks adjuvant mechanism.
- Operational Value: Standardizes nanoemulsion preparation and immunogenicity assessment for cross-study comparability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality for adjuvant advancement and portfolio prioritization.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted progression of vaccine candidates targeting mucosal immunity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in nanoemulsion formulation and immunological assay execution.
- Needs access to dynamic light scattering, spectrophotometry, and ELISA instrumentation.
- Demands cross-team standardization for reproducible adjuvant and antigen preparation.
- Adaptable to various antigens and animal models with protocol optimization.
- Dependent on validated quantitative thresholds for antibody response interpretation.
