Name: Pomiar dynamicznych zmian pH glikosomalnego u żywego Trypanosoma brucei (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-19T14:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: Poznaj metodę pomiaru dynamicznych zmian pH glikosomalnego u żywego Trypanosoma brucei za pomocą cytometrii przepływowej. Technika ta umożliwia badanie odpowiedzi pasożyta na zmiany poziomu glukozy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

pHluorin2-PTS1 został sklonowany do pLEW100v5 przez Twist Bioscience, który dostarczył konstrukt w wektorze klonowania o wysokiej kopii; pLEW100v5 był prezentem od Dr. George'a Crossa. Surowica odpornościowa przeciwko aldolazie T. brucei jest dostępna na życzenie u dr Meredith T. Morris z Clemson University. Prace laboratoriów JCM i KAC zostały częściowo wsparte nagrodą przyznaną przez National Institutes of Health (R01AI156382). TPK był wspierany przez NIH 3R01AI156382.

Development of pHluorin2-Based Sensor for Glycosomal pH in Trypanosoma brucei

<ol><li>Coley, A. F., Dodson, H. C., Morris, M. T., Morris, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycolysis+in+the+African+trypanosome%3A+Targeting+enzymes+and+their+subcellular+compartments+for+therapeutic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+International%22%5BJournal%5D)">Glycolysis in the African trypanosome: Targeting enzymes and their subcellular compartments for therapeutic development.</a> Molecular Biology International. 2011, 123702(2011).</li>
<li>Mcconville, M. J., Saunders, E. C., Kloehn, J., Dagley, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leishmania+carbon+metabolism+in+the+macrophage+phagolysosome-+feast+or+famine%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Res%22%5BJournal%5D)">Leishmania carbon metabolism in the macrophage phagolysosome- feast or famine.</a> F1000Res. 4, 938(2015).</li>
<li>Parsons, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycosomes%3A+Parasites+and+the+divergence+of+peroxisomal+purpose%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Glycosomes: Parasites and the divergence of peroxisomal purpose.</a> Molecular Microbiology. 53 (3), 717-724 (2004).</li>
<li>Parsons, M., Furuya, T., Pal, S., Kessler, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenesis+and+function+of+peroxisomes+and+glycosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Biochemical+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Biogenesis and function of peroxisomes and glycosomes.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 115 (1), 19-28 (2001).</li>
<li>Haanstra, J. R., Gonzalez-Marcano, E. B., Gualdron-Lopez, M., Michels, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenesis%2C+maintenance+and+dynamics+of+glycosomes+in+trypanosomatid+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Biogenesis, maintenance and dynamics of glycosomes in trypanosomatid parasites.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1863 (5), 1038-1048 (2016).</li>
<li>Allmann, S., Bringaud, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycosomes%3A+A+comprehensive+view+of+their+metabolic+roles+in+t.+Brucei%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Glycosomes: A comprehensive view of their metabolic roles in t. Brucei.</a> International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 85, 85-90 (2017).</li>
<li>Dodson, H. C., Morris, M. T., Morris, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycerol+3-phosphate+alters+Trypanosoma+brucei+hexokinase+activity+in+response+to+environmental+change%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Glycerol 3-phosphate alters Trypanosoma brucei hexokinase activity in response to environmental change.</a> The Journal of Biological Chemistry. 286 (38), 33150-33157 (2011).</li>
<li>Lin, S., Morris, M. T., Ackroyd, P. C., Morris, J. C., Christensen, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+targeted+delivery+of+pH+sensor+for+quantitative+measurements+of+intraglycosomal+pH+in+live+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Peptide targeted delivery of pH sensor for quantitative measurements of intraglycosomal pH in live Trypanosoma brucei.</a> Biochemistry. 52 (21), 3629-3637 (2013).</li>
<li>Mahon, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phluorin2%3A+An+enhanced%2C+ratiometric%2C+pH-sensitive+green+florescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Bioscience+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Phluorin2: An enhanced, ratiometric, pH-sensitive green florescent protein.</a> Advances in Bioscience and Biotechnology. 2 (3), 132-137 (2011).</li>
<li>Wirtz, E., Leal, S., Ochatt, C., Cross, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tightly+regulated+inducible+expression+system+for+conditional+gene+knock-outs+and+dominant-negative+genetics+in+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Biochemical+Parasitology%22%5BJournal%5D)">A tightly regulated inducible expression system for conditional gene knock-outs and dominant-negative genetics in Trypanosoma brucei.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 99 (1), 89-101 (1999).</li>
<li>Restriction digest v.2. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.protocols.io/view/restriction-digest-nkqdg33pg25z/v2">https://www.protocols.io/view/restriction-digest-nkqdg33pg25z/v2</a> (2018).</li>
<li>Ligation protocol with t4 DNA ligaase (m0202) v.3. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.protocols.io/view/ligation-protocol-with-t4-dna-ligase-m0202-95qpvorzv4o1/v3">https://www.protocols.io/view/ligation-protocol-with-t4-dna-ligase-m0202-95qpvorzv4o1/v3</a> (2021).</li>
<li>Burkard, G., Fragoso, C. M., Roditi, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+stable+transformation+of+bloodstream+forms+of+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Biochemical+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Highly efficient stable transformation of bloodstream forms of Trypanosoma brucei.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 153 (2), 220-223 (2007).</li>
<li>Crowe, L. P., Wilkinson, C. L., Nicholson, K. R., Morris, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypanosoma+brucei+pex13.2+is+an+accessory+peroxin+that+functions+in+the+import+of+peroxisome+targeting+sequence+type+2+proteins+and+localizes+to+subdomains+of+the+glycosome%5BTitle%5D)+AND+%22mSphere%22%5BJournal%5D)">Trypanosoma brucei pex13.2 is an accessory peroxin that functions in the import of peroxisome targeting sequence type 2 proteins and localizes to subdomains of the glycosome.</a> mSphere. 5 (1), e00744(2020).</li>
<li>Kucejova, B., Kucej, M., Petrezselyova, S., Abelovska, L., Tomaska, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+screen+for+nigericin-resistant+yeast+mutants+revealed+genes+controlling+mitochondrial+volume+and+mitochondrial+cation+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A screen for nigericin-resistant yeast mutants revealed genes controlling mitochondrial volume and mitochondrial cation homeostasis.</a> Genetics. 171 (2), 517-526 (2005).</li>
<li>Huynh, M. H., Carruthers, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+gondii+excretion+of+glycolytic+products+is+associated+with+acidification+of+the+parasitophorous+vacuole+during+parasite+egress%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma gondii excretion of glycolytic products is associated with acidification of the parasitophorous vacuole during parasite egress.</a> PLoS Pathogens. 18 (5), e1010139(2022).</li>
<li>Lehoux, S., Abe, J., Florian, J. A., Berk, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((14-3-3+binding+to+Na%2B%2FH%2B+exchanger+isoform-1+is+associated+with+serum-dependent+activation+of+Na%2B%2FH%2B+exchange%5BTitle%5D)+AND+%22TheJournal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">14-3-3 binding to Na+/H+ exchanger isoform-1 is associated with serum-dependent activation of Na+/H+ exchange.</a> TheJournal of Biological Chemistry. 276 (19), 15794-15800 (2001).</li>
<li>Jankowski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+measurements+of+the+ph+of+mammalian+peroxisomes+using+the+fluorescent+protein+phluorin%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">In situ measurements of the ph of mammalian peroxisomes using the fluorescent protein phluorin.</a> The Journal of Biological Chemistry. 276 (52), 48748-48753 (2001).</li>
<li>Jankowski, A., Grinstein, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+noninvasive+fluorimetric+procedure+for+measurement+of+membrane+potential.+Quantification+of+the+NADPH+oxidase-induced+depolarization+in+activated+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A noninvasive fluorimetric procedure for measurement of membrane potential. Quantification of the NADPH oxidase-induced depolarization in activated neutrophils.</a> The Journal of Biological Chemistry. 274 (37), 26098-26104 (1999).</li>
<li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+statistical+parameter+for+use+in+evaluation+and+validation+of+high+throughput+screening+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).</li>
<li>Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).</li>
<li>Lin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ph+regulation+in+glycosomes+of+procyclic+form+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Ph regulation in glycosomes of procyclic form Trypanosoma brucei.</a> The Journal of Biological Chemistry. 292 (19), 7795-7805 (2017).</li>
<li>Ha, D. S., Schwarz, J. K., Turco, S. J., Beverley, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+green+fluorescent+protein+as+a+marker+in+transfected+Leishmania%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Biochemical+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Use of the green fluorescent protein as a marker in transfected Leishmania.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 77 (1), 57-64 (1996).</li>
<li>Kelly, J. M., Ward, H. M., Miles, M. A., Kendall, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+shuttle+vector+which+facilitates+the+expression+of+transfected+genes+in+Trypanosoma+cruzi+and+Leishmania%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">A shuttle vector which facilitates the expression of transfected genes in Trypanosoma cruzi and Leishmania.</a> Nucleic Acids Research. 20 (15), 3963-3969 (1992).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Percepcja środowiskowa i mechanizmy odpowiedzi w afrykańskim trypanosomie są słabo poznane. Wiadomo, że zmiany w dostępności składników odżywczych wywołują różne reakcje pasożyta, w tym zakwaszenie glikosomów. Tutaj opisaliśmy metodę badania odpowiedzi pH glikosomalnego na zaburzenia środowiskowe w żywych komórkach za pomocą czujnika dziedzicznego białka, pHluorin2 i cytometrii przepływowej.
Istnieje kilka krytycznych etapów korzystania z czujnika. Po pierwsze, ważna jest charakterystyka trans...

Pasożytnicze kinetoplastydy, podobnie jak większość żywych organizmów, polegają na glukozie jako podstawowym składniku centralnego metabolizmu węgla. Do tej grupy należą organizmy ważne z medycznego punktu widzenia, takie jak trypanosom afrykański, Trypanosoma brucei; amerykański trypanosom T. cruzi; i pasożyty z rodzaju Leishmania. Metabolizm glukozy ma kluczowe znaczenie dla wzrostu pasożytów na etapach cyklu życia patogenu. Na przykład, gdy jest pozbawiony glukozy, forma krwi (BSF) afrykańskiego trypanosomu szybko umiera. Warto zauważyć, że glikoliza służy jako jedyne źródło ATP na tym etapie infekcji1. Pasożyty Leishmania są również zależne od glukozy u ludzkiego gospodarza, przy czym etap cyklu życiowego amastigota, który znajduje się w makrofagach gospodarza, zależy od tego źródła węgla do wzrostu2.
Chociaż te pasożyty prowadzą odrębny tryb życia z udziałem różnych wektorów owadów, mają wiele wspólnych cech w tym, jak reagują na glukozę i ją spożywają. Na przykład pasożyty te lokalizują większość enzymów glikolitycznych w zmodyfikowanych peroksysomach zwanych glikosomami. Ta specyficzna dla kinetoplastydu organella jest powiązana z peroksysomami ssaków w oparciu o konserwatywne mechanizmy biosyntezy i morfologię3,4,5,6.
Podział większości enzymów szlaku glikolitycznego do glikosomu oferuje specyficzne dla pasożytów sposoby regulacji szlaku. Korzystając z chemicznej sondy pH, ustaliliśmy, że niedobór składników odżywczych powoduje szybkie zakwaszenie glikosomów pasożytów w formie procyklicznej (PF), co skutkuje zmienioną aktywnością enzymu glikolitycznego poprzez ekspozycję miejsca wiązania regulatora allosterycznego na kluczowy enzym glikolityczny heksokinazę7,8. W naszej poprzedniej pracy sonda chemiczna wymagała stałego dostarczania do użytku, co ograniczało jej użyteczność w innych zastosowaniach. Ponadto wyzwania związane z utrzymaniem rozkładu sondy w glikosomie w BSF ograniczyły użyteczność tego podejścia do badania pH glikosomalnego na tym etapie życia.
W tym badaniu użyliśmy biosensora białka fluorescencyjnego pHluorin2 do monitorowania zmiany pH glikosomalnego u BSF T. brucei w odpowiedzi na sygnały środowiskowe, w tym głód glukozy9 (Rysunek 1). Wyniki tej pracy sugerują, że BSF T. brucei szybko zakwasza glikosomy w odpowiedzi na głód w sposób odwracalny, podobny do reakcji, które zaobserwowaliśmy u pasożytów PF. Oczekujemy, że ten bioczujnik poprawi naszą wiedzę na temat regulacji glikolitycznej u T. brucei i pokrewnych pasożytów.

<table><tbody><tr><td>Kolby do hodowli tkankowych 50 ml (niepoddane obróbce, sterylne)</td><td>VWR</td><td>10861-572</td><td></td></tr><tr><td>75 cm2 Kolba do hodowli tkankowych (niepoddawana obróbce, sterylna)</td><td>Corning</td><td>431464U</td><td></td></tr><tr><td>80 &micro; L płaskodenna płytka 384-dołkowa</td><td>BrandTech&nbsp;</td><td>781620</td><td></td></tr><tr><td>Amaxa Ludzki nukleofektor z komórek T&nbsp; Zestaw</td><td>Lonza</td><td>VPA-1002</td><td></td></tr><tr><td>Attune NxT Flow Cytometer</td><td>invitrogen firmy Thermo Fisher Scientific</td><td>A24858</td><td>Oprogramowanie FlowJo</td></tr><tr><td>BRANDplates 96-Well, płaska płyta</td><td>dolna Millipore Sigma</td><td>BR781662</td><td></td></tr><tr><td>wtyczka Coloc 2 firmy ImageJ</td><td></td><td></td><td>https://imagej.net/plugins/coloc-2</td></tr><tr><td>CytKick Max Auto Sampler</td><td>firmy Thermo Fisher Scientific</td><td>A42973</td><td></td></tr><tr><td>Cytometr przepływowy CytoFLEX</td> Mikroskopia elektronowa <td>Beckman-Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nauki 16% wodny roztwór paraformaldehydu, klasa EM, 10 ml Ampułka</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-980-487</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie statystyczne</td><td>GraphPad Prism</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nigericin (sól sodowa)</td> <td>Cayman Chemical</td><td>11437</td><td></td></tr><tr><td>Nucleofector 2b</td><td>Lonza</td><td>Produkt wycofany</td><td></td></tr><tr><td>OP2 Liquid Handler</td><td>opentrons</td><td>OP2</td><td></td></tr><tr><td>poli-L-lizyna, 0,1% (w/v) w H2O</td><td>Sigma Life Science</td><td>CAS: 25988-63-0</td><td>Robot pipetujący do testu HTS</td></tr><tr><td>Czerwień tiazolowa (TO-PRO-3)</td><td>biot#</td><td>40087</td><td>Obrabowaliśmy niestandardowy stojak na płyty akrylowe, aby ta marka płyty mogła być wykrywana i używana w naszym CytKick Max Auto Próbnik</td></tr><tr><td>valinomycin</td><td>Cayman Chemical</td><td>10009152</td><td>Robot do pipetowania do testu HTS</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>Do kalibracji pH</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>Do kalibracji pH</td></tr></tbody></table>

pomiar dynamicznych zmian ph glikosomalnego u żywego trypanosoma brucei

Measuring Dynamic Glycosomal pH Changes in Living Trypanosoma brucei

Metabolizm glukozy jest krytyczny dla afrykańskiego trypanosomu, Trypanosoma brucei, jako niezbędny proces metaboliczny i regulator rozwoju pasożyta. Niewiele wiadomo na temat reakcji komórkowych generowanych, gdy zmienia się poziom glukozy w środowisku. Zarówno w krwiobiegu, jak i w postaci procyklicznej (w stadium owada) glikosomy zawierają większość glikolizy. Te organelle są szybko zakwaszane w odpowiedzi na niedobór glukozy, co prawdopodobnie powoduje allosteryczną regulację enzymów glikolitycznych, takich jak heksokinaza. W poprzednich pracach lokalizacja sondy chemicznej używanej do pomiarów pH była wyzwaniem, co ograniczało jej użyteczność w innych zastosowaniach.
Ten artykuł opisuje rozwój i wykorzystanie pasożytów, które wyrażają glikozomalnie zlokalizowany pHluorin2, dziedziczny białkowy bioczujnik pH. pHluorin2 to ratiometryczny wariant pHluorin, który wykazuje zależny od pH (kwasu) spadek wzbudzenia przy 395 nm, jednocześnie powodując wzrost wzbudzenia przy 475 nm. Transgeniczne pasożyty zostały wygenerowane przez sklonowanie otwartej ramki odczytu pHluorin2 do wektora ekspresji trypanosomów pLEW100v5, umożliwiając indukowalną ekspresję białka na dowolnym etapie cyklu życia. Immunofluorescencję zastosowano w celu potwierdzenia lokalizacji glikosomalnej biosensora pHluorin2, porównując lokalizację biosensora z aldolazą białkową rezydującą w glikosomalach. Czułość czujnika została skalibrowana przy różnych poziomach pH poprzez inkubację komórek w serii o pH od 4 do 8, podejście, które wcześniej zastosowaliśmy do kalibracji czujnika pH na bazie fluoresceiny. Następnie zmierzyliśmy fluorescencję pHluorin2 przy 405 nm i 488 nm za pomocą cytometrii przepływowej w celu określenia pH glikozomalnego. Zweryfikowaliśmy działanie żywych transgenicznych pasożytów wykazujących ekspresję pHluoryny2, monitorując pH w czasie w odpowiedzi na deprywację glukozy, znany czynnik wyzwalający zakwaszenie glikosomalne u pasożytów PF. Narzędzie to ma szereg potencjalnych zastosowań, w tym potencjalnie może być wykorzystywane w wysokoprzepustowych badaniach przesiewowych leków. Poza glikozomalnym pH czujnik może być dostosowany do innych organelli lub stosowany w innych trypanosomatydach w celu zrozumienia dynamiki pH w warunkach żywych komórek.

Lokalizacja pHluorin2-PTS1 w glikosomach T. brucei w formie BSF 
Aby ocenić lokalizację subkomórkową pHluorin2-PTS1, pasożyty poddano analizom immunofluorescencyjnym. Sygnał z transgenu kolokalizował z antyserami przeciwko białku glikosomalnemu, aldolazie (TbAldolase) (Rycina 2A). Średni współczynnik korelacji Pearsona dla kolokalizacji przeciwciał anty-TbAldolase i pHluorin2-PTS1 wyniósł 0,895, co wskazuje, że pHluorin2-PTS1 lokalizowało się głównie w glikosomac...

Opisujemy metodę badania, jak pH reaguje na sygnały środowiskowe w glikosomy krwiobiegowej formy afrykańskich trypanosomów. Podejście to obejmuje czujnik białka dziedzicznego wrażliwego na pH w połączeniu z cytometrią przepływową w celu pomiaru dynamiki pH, zarówno jako test przebiegu w czasie, jak i w formacie wysokoprzepustowego badania przesiewowego.

Pomiar dynamicznych zmian pH glikosomalnego u żywego Trypanosoma brucei

Glucose metabolism is critical for the African trypanosome, Trypanosoma brucei, as an essential metabolic process and regulator of parasite development. ...

Metabolizm glukozy ma kluczowe znaczenie dla Trypanosoma brucei, ale niewiele wiadomo o tym, jak komórki wyczuwają i reagują na zmieniający się poziom glukozy w środowisku. Opracowaliśmy bioczujnik pH wykazujący ekspresję pasożytów, który pozwala nam monitorować pH glikosomalne u żywych pasożytów, co pomoże w zrozumieniu dynamicznych reakcji pasożytów na wahania składników odżywczych. Wyzwaniem dla tego eksperymentu byłaby dostępność cytometru przepływowego wyposażonego w czytnik płytek mikromiareczkowych, a także odpowiednich zestawów filtrów do pomiaru fluorescencji biosensora.Ponadto T.brucei jest organizmem grupy ryzyka, więc cytometr musi być przechowywany w obiekcie o drugim poziomie bezpieczeństwa biologicznego. Odkryto, że poziom pH glikosomów może wpływać na glikolizę, ponieważ heksokinaza i fosfofruktokinaza są wrażliwe na pH. Jednak sondy pH, które były wcześniej używane, nie były dokładnie ukierunkowane na glikosom w postaci krwi.Potrzebne było lepsze narzędzie do zbadania związku między pH glikosomalnym a glikolizą na tym etapie życia pasożyta. Czujnik pHluorin2-PTS1 jest narzędziem, które lepiej lokalizuje glikosom niż chemiczne sondy pH na tym etapie życia. Jest przy

measuring-dynamic-glycosomal-ph-changes-in-living-trypanosoma-brucei

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Dynamika glikosomów w afrykańskich trypanosomach jest trudna do zbadania za pomocą tradycyjnych technik biologii komórki, takich jak mikroskopia elektronowa i fluorescencyjna.  Jako sposób obserwacji dynamicznego zachowania organelli, zastosowano system reporterowy fluorescencyjno-organelli w połączeniu z cytometrią przepływową do monitorowania dynamiki glikosomów w czasie rzeczywistym u żywych pasożytów.

Wykorzystanie białek fluorescencyjnych do monitorowania dynamiki glikosomów w afrykańskim trypanosomie

Ten manuskrypt opisuje użycie bioluminescencyjnego szczepu afrykańskich trypanosomów do śledzenia późnych stadiów infekcji i pokazuje, jak obrazowanie na żywo in vivo może być wykorzystane do wizualizacji infekcji w ośrodkowym układzie nerwowym w czasie rzeczywistym.

Obrazowanie bioluminescencyjne w celu wykrycia późnego stadium zakażenia trypanosomatozą afrykańską

Dodanie znacznika do białka to potężny sposób na uzyskanie wglądu w jego funkcję. W tym miejscu opisujemy protokół endogennego znakowania setek białek Trypanosoma brucei równolegle, tak aby możliwe było znakowanie skali genomu.

Wysokoprzepustowe znakowanie genów u Trypanosoma brucei

Afrykańskie trypanosomy hodowane in vitro ulegają zmienności antygenowej w niskim tempie, tak że populacje składają się z pasożytów wyrażających dominujący wariant typu glikoproteiny powierzchniowej (VSG) i małej populacji "przełączonych" wariantów.  Protokół ten opisuje szybką metodę wykrywania i ilościowego określania tych populacji.

Wykrywanie zmiany glikoproteiny powierzchniowej wariantu Trypanosoma brucei za pomocą magnetycznego sortowania komórek i cytometrii przepływowej

Ta metoda oddzielania trypanosomów od krwi zależy od tego, czy ich ładunek powierzchniowy jest mniej ujemny niż u komórek krwi ssaków. Zakażoną krew umieszcza się i poddaje działaniu środka ciężkości na kolumnie wymieniacza anionowego. Ta metoda, najbardziej odpowiednia diagnostyka trypanosomatozy afrykańskiej, dostarcza oczyszczonych pasożytów do badań immunologicznych, biologicznych, biochemicznych, farmaceutycznych i biologii molekularnej.

Oczyszczanie trypanosomów zewnątrzkomórkowych, w tym afrykańskich, z krwi za pomocą wymieniaczy anionowych (kolumny dietyloaminoetylocelulozowe)

Opisujemy wysokoprzepustowy test kolorymetryczny mierzący aktywność β-galaktozydazy w trzech etapach cyklu życia Trypanosoma cruzi, czynnika wywołującego chorobę Chagasa. Ten test może być używany do identyfikacji związków trypanobójczych w łatwy, szybki i powtarzalny sposób.

In vitro Badania przesiewowe leków przeciwko wszystkim etapom cyklu życia Trypanosoma cruzi przy użyciu pasożytów eksprymujących β-galaktozydazę

Telomery są niezbędne dla stabilności chromosomów, a struktura nawisu G telomeru jest kluczowa dla utrzymania telomerów za pośrednictwem telomerazy. Wprowadziliśmy niedawno dwie metody wykrywania struktury nawisu G telomeru w Trypanosoma brucei, którymi są natywna hybrydyzacja w żelu oraz wydłużanie startera za pomocą ligacji, które zostaną w niniejszym opracowaniu opisane.

Badanie struktury G-overhangu telomerów w Trypanosoma brucei

W niniejszym artykule szczegółowo opisano protokół pomiaru aktywności kalpainy w komórkach utrwalonych i żywych z wykorzystaniem cytometrii przepływowej.

Pomiar aktywności kalpain w komórkach utrwalonych i żywych za pomocą cytometrii przepływowej

Współistnienie infekcji wirusem grypy A jest jednym z czynników uwikłanych w indukcję inwazyjnej choroby pneumokokowej podczas bezobjawowego nosicielstwa Streptococcus pneumoniae. W niniejszej pracy opisujemy metodę infekcji mieszanej z wykorzystaniem myszy noworodkowych w celu zbadania synergizmu między tymi dwoma patogenami dróg oddechowych.

Wykorzystanie obrazowania bioluminescencyjnego do badania synergizmu pomiędzy Streptococcus pneumoniae a wirusem grypy typu A u młodych myszy

Niniejszy artykuł opisuje procedurę przygotowania znakowanej fluorescencyjnie wersji bakteriofaga lambda, zakażania bakterii E. coli, obserwowania efektów zakażenia pod mikroskopem oraz analizy wyników infekcji.

Śledzenie losów komórek E. coli po infekcji fagiem lambda

Poznaj metodę pomiaru dynamicznych zmian pH glikosomalnego u żywego Trypanosoma brucei za pomocą cytometrii przepływowej. Technika ta umożliwia badanie odpowiedzi pasożyta na zmiany poziomu glukozy.

Pomiar dynamicznych zmian pH glikosomalnego u żywego Trypanosoma brucei

Przeglądaj więcej filmów