Pomiar dynamicznych zmian pH glikosomalnego u żywego Trypanosoma brucei

Metabolizm glukozy ma kluczowe znaczenie dla Trypanosoma brucei, ale niewiele wiadomo o tym, jak komórki wyczuwają i reagują na zmieniający się poziom glukozy w środowisku. Opracowaliśmy bioczujnik pH wykazujący ekspresję pasożytów, który pozwala nam monitorować pH glikosomalne u żywych pasożytów, co pomoże w zrozumieniu dynamicznych reakcji pasożytów na wahania składników odżywczych. Wyzwaniem dla tego eksperymentu byłaby dostępność cytometru przepływowego wyposażonego w czytnik płytek mikromiareczkowych, a także odpowiednich zestawów filtrów do pomiaru fluorescencji biosensora.

Ponadto T.brucei jest organizmem grupy ryzyka, więc cytometr musi być przechowywany w obiekcie o drugim poziomie bezpieczeństwa biologicznego. Odkryto, że poziom pH glikosomów może wpływać na glikolizę, ponieważ heksokinaza i fosfofruktokinaza są wrażliwe na pH. Jednak sondy pH, które były wcześniej używane, nie były dokładnie ukierunkowane na glikosom w postaci krwi.

Potrzebne było lepsze narzędzie do zbadania związku między pH glikosomalnym a glikolizą na tym etapie życia pasożyta. Czujnik pHluorin2-PTS1 jest narzędziem, które lepiej lokalizuje glikosom niż chemiczne sondy pH na tym etapie życia. Jest przyjazny dla użytkownika, ponieważ wystarczy wywołać ekspresję czujnika pH w ciągu nocy, a komórki wytworzą i zlokalizują pHluorin2 w glikosomie.

Zastosowanie cytometrii przepływowej do pomiaru pHluorin2 zwiększa przepustowość i poprawia pomiary statystyczne w porównaniu z mikroskopią. Na początek weź komórki Trypanosoma brucei z ekspresją pHluoryny, dodaj tetracyklinę lub doksycyklinę i inkubuj przez noc, aby wywołać ekspresję pHluorin. Następnie przenieś trzy mililitry każdej kultury do oddzielnych 15-mililitrowych probówek.

Następnie odwirować komórki w temperaturze pokojowej przez 10 minut w temperaturze 1000 razy G. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w jednym mililitrze PBS. Po odwirowaniu komórek po raz czwarty usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w PBS o różnych stężeniach glukozy. Dodaj jodek propidyny lub czerwień tiazolową, aby odróżnić komórki martwe od żywych.

Następnie przenieś każdą próbkę do 5-mililitrowych probówek kompatybilnych z cytometrem przepływowym. Aby rozpocząć, uruchom oprogramowanie cytometru przepływowego. Otwórz nowy eksperyment.

Dodaj żądaną liczbę próbek i nazwij je. Następnie skonfiguruj histogram kanału YL2-H lub RL1-H, wykres punktowy obszaru rozproszenia do przodu w stosunku do obszaru rozproszenia bocznego, wykres obszaru rozproszenia do przodu w stosunku do wysokości rozproszenia do przodu oraz wykres kanału BL1-H w porównaniu z VL2-H. Umieść niebarwione komórki kontrolne Trypanosoma brucei typu dzikiego na porcie iniekcji próbki i dostosuj położenie stolika.

Aby zmniejszyć rozmiar pliku, odznacz kanały, które nie są przeznaczone do nagrywania. Zacznij od niskiego natężenia przepływu, aby umożliwić regulacje, a następnie kliknij przycisk Uruchom, aby rozpocząć pobieranie danych. Dostosuj napięcie YL2 lub RL1, aby wyrównać główny pik w zakresie od 10 do trzeciej do 10 do czwartej względnej intensywności fluorescencji.

Dostosuj napięcia rozproszenia do przodu i rozproszenia bocznego, aby upewnić się, że ponad 90% zdarzeń mieści się w zakresie wykresu punktowego. Ustaw próg rozproszenia do przodu, aby wykluczyć zanieczyszczenia bez pomijania żywych komórek. Zmodyfikuj ustawienia kanałów VL2 i BL1, aby ustawić główny pik niebarwionej kontroli typu dzikiego w zakresie od 10 do dwóch do 10 do czwartej względnej jednostki intensywności fluorescencji.

Kliknij opcję Nagraj i zmierz co najmniej 10 000 zdarzeń. Następnie umieścić pierwszą indukowaną próbkę trypanosoma z ekspresją pHluoryny, barwioną jodkiem propidyny lub czerwienią tiazolową, w porcie wstrzyknięcia próbki. Ponownie rozpocznij zbieranie danych przy niskim natężeniu przepływu po wykonaniu płukania.

Monitoruj każdy wykres, aby upewnić się, że ponad 90% zdarzeń jest poprawnie przechwytywanych i że kanały VL2-H i BL1-H nie są nasycone. Zapisz dane z każdej próbki w formacie pliku FCS i przygotuj się do analizy. Na początek wykonaj cytometrię przepływową na komórkach Trypanosoma brucei wykazujących ekspresję pHluoryny.

Otwórz nowy układ, a następnie przeciągnij i upuść pobrane pliki fcs do okna układu. W przypadku bramkowania dynamicznych komórek wybierz formant niezabarwionego typu dzikiego, aby otworzyć okno. Analizuj dane za pomocą histogramów na kanale YL2-H lub RL2-H.

W takim przypadku należy użyć histogramu YL2-H, ponieważ próbki były barwione jodkiem propydyny. Następnie ustaw dwusieczną bramę, aby oddzielić żywe i martwe komórki, oznaczając lewą bramę jako żywą, a prawą bramę jako martwą. Zastosuj i dostosuj tę bramkę we wszystkich próbkach.

Upewnij się, że bramka jest prawidłowo narysowana, wyświetlając bramkę na wielu próbkach w zestawie danych. Na kontrolce nieskalanego typu wild kliknij dwukrotnie na bramę na żywo. Ustaw oś X wykresu punktowego na obszar punktowy do przodu, a oś Y na boczny obszar punktowy.

Następnie użyj narzędzia Bramka wielokątna, aby obrysować populację komórek, oznaczając ją etykietami komórek. Wyklucz szczątki lub umierające komórki i agregaty, zachowując ostrożność co do ich typowych pozycji na wykresie kropkowym. Zastosuj bramkę komórek pod bramką pod napięciem dla wszystkich próbek, upewniając się, że obejmuje prawdopodobną populację komórek dla wszystkich próbek.

Kliknij dwukrotnie bramkę komórek na kontrolce nieskalanego typu wild, aby wyświetlić zdarzenia w tej bramie. Aby dostosować wykres punktowy, ustaw oś X na obszar rozproszenia do przodu, a oś Y na wysokość rozproszenia do przodu. Zidentyfikuj przekątną rozkład pojedynczych komórek na tym wykresie kropkowym, odróżniając je od dubletów.

Użyj narzędzia Bramka wielokątna, aby otoczyć zdarzenia podświetlenia, nazywając te singlety bramki. Zastosuj bramkę podwójną pod bramką komórek dla wszystkich próbek, upewniając się, że wyklucza dublety, a jednocześnie singlety. I dostosuj bramkę w razie potrzeby dla różnych próbek.

Na niebarwionej próbce kontrolnej typu dzikiego kliknij dwukrotnie bramkę podkoszulków. Zmień oś X wykresu punktowego na BL1-H, a oś Y na VL2-H. Za pomocą narzędzia Bramka wielokątna narysuj bramkę ukośną, aby przechwycić komórki fluorescencyjne pHluorin2 w VL2 i BL1.

Oznacz tę bramkę jako pHL+Zastosuj bramkę pHL+ pod bramką singlelets dla wszystkich próbek. Dostosuj bramkę pHL, aby pokryć komórki o wyższej intensywności fluorescencji niż komórki autofluorescencyjne w kontroli typu dzikiego. Aby wyeksportować statystyki, kliknij w edytor tabel, następnie Edytuj pasek, a na końcu wybierz Dodaj kolumnę.

Uwzględnij kolumny dla całkowitej liczby niezaliczonej, pHL+liczby, częstotliwości na żywo całkowitej, pHL+częstości rodzica, pHL+mediany VL2-H i pHL+mediany BL1-H. Aby dostosować ustawienia eksportu w edytorze tabel, ustaw opcję wyświetlania na Do pliku, a tekst na CSV. Wybierz miejsce docelowe i nazwę pliku, a następnie kliknij przycisk Utwórz tabelę.

Z czasem zaobserwowano stopniowe, łagodne zakwaszenie w odpowiedzi na głód, które utrzymywało się przez 90 minut. Po ponownym wprowadzeniu glukozy, jak wskazuje zielona linia, pH glikozomalnego powróciło do poziomu sprzed głodu w ciągu 30 minut, co sugeruje, że pH glikosomalne jest dynamiczne i regulowane w odpowiedzi na glukozę.