1 marca 2024
Prezentujemy nowatorskie podejście do dwufotonowej mikroskopii dostarczania przez nowotwór znakowanych fluorescencyjnie nanocząstek tlenku żelaza do glejaka w modelu mysim.
Glejak wielopostaciowy jest jednym z najczęstszych pierwotnych nowotworów mózgu i wiąże się z szybkim wzrostem i niską oczekiwaną długością życia. Opracowanie skutecznych terapii glejaka pozostaje poważnym wyzwaniem, ponieważ dostarczanie leków jest ograniczone przez barierę krew-mózg. Metoda bezpośredniego obrazowania akumulacji i dystrybucji makrocząsteczek w mózgu znacznie zwiększyłaby naszą zdolność do zrozumienia i optymalizacji dostarczania leków.
Mikroskopia dwufotonowa stanowi eleganckie rozwiązanie do badania rozkładu nanocząstek w czasie rzeczywistym w przedklinicznym modelu glejaka. Modyfikując nanocząstki użyte w tym badaniu, możliwe jest zbadanie dostarczania różnych kandydatów na leki i terapii skojarzonych na poziomie komórkowym i molekularnym. Oprócz dwufotonowej mikroskopii trivital, składnik tlenku żelaza w tych nanocząstkach pozwala na multimodalne obrazowanie za pomocą MRI lub MPI.
W przyszłości urządzenia do obrazowania mogą służyć w realizacji wczesnego wykrywania raka, prowadząc w ten sposób do skuteczniejszych terapii przeciwko nowotworom złośliwym. Jedną ze ścieżek do osiągnięcia tego celu jest połączenie dwufotonowej mikroskopii przyżyciowej z innymi metodami obrazowania, takimi jak pozytonowa tomografia emisyjna i ultradźwięki fotoakustyczne. Aby rozpocząć, przygotuj mysz do zabiegu i umieść ją na ramie stereotaktycznej.
Następnie podnieś skórę na czaszce i przytrzymaj nożyczki między prawym okiem a uchem, aby utworzyć nacięcie. Przeciąć w kierunku lewej strony czaszki zgodnie ze śladami nacięć i usunąć powstały okrągły płat skóry. Za pomocą ostrza skalpela lub mikrokiretki delikatnie podrap powierzchnię czaszki, aby usunąć okostną.
Użyj soli fizjologicznej i odkurzacza, aby utrzymać obszar operacyjny w czystości z zanieczyszczeń. Zdrap okostną, aby zapewnić lepsze przyleganie kleju cyjanoakrylowego i cementu dentystycznego. Następnie za pomocą ołówka do autoklawu zaznacz położenie okienka czaszki.
Trzymaj wiertło w ręce dominującej, a strzykawkę lub kleszcze w ręce niedominującej. Nałóż zimną sól fizjologiczną na kalwarię, aby zapobiec przegrzaniu i utrzymać widok chirurgiczny w czystości. Podczas wiercenia umieść szkiełko nakrywające na czaszce, aby upewnić się, że dokładnie pasuje do okna czaszki.
Gdy możliwe jest wciśnięcie płata czaszki, za pomocą kleszczy ostrożnie usuń fragment z pola operacyjnego. Jeśli wystąpi niewielkie krwawienie, użyj gąbki hemostatycznej do miejscowego nakładania lodowatej soli fizjologicznej pod lekkim ciśnieniem, aby zmniejszyć utratę krwi. Weź hodowane komórki glejaka C6 do implantacji.
Odessać jeden mikrolitr zawiesiny komórkowej w gazoszczelnej strzykawce mikrolitrowej. Następnie umieścić strzykawkę w ramce stereotaktycznej. Aby wszczepić komórki do obrazowania dwufotonowego, wstrzyknij 0,5 mikrolitra zawiesiny komórkowej na głębokość 0,8 milimetra w powierzchowny obszar mózgu.
Po wstrzyknięciu należy wycofać igłę i opuścić tkankę mózgową. Teraz przenieś pałąk na głowę i szkiełko z alkoholu do roztworu soli fizjologicznej i użyj końcówki próżniowej lub kleszczy, aby nawigować tymi elementami do miejsca operacji. Umieść szkiełko pokrywy szklanej w oknie czaszki i nałóż niewielką ilość kleju cyjanoakrylowego.
Usuń rozlany klej na szkiełku nakrywkowym za pomocą aplikatora z bawełnianą końcówką lub delikatnie zdrapując go skalpelem. Zabezpiecz szklane szkiełko nakrywkowe w oknie czaszki i przyłóż zagłówek. Wymieszaj cement dentystyczny, ustaw pręt pod głowę i nałóż cement na otoczenie.
Oczyść zbędny cement za pomocą końcówki strzykawki, skalpela lub końcówki wiertła. Po uszczelnieniu okna czaszki sprawdź, czy nie ma odsłoniętych obszarów czaszki. Zacznij od wstrzyknięcia komórek glejaka C6 do powierzchownych obszarów mózgu myszy, aby stworzyć mysi model glejaka.
Następnie zamocuj pręt na głowę w oknie czaszki i pozwól myszom dojść do siebie. Następnie wstrzyknij dożylnie znakowane fluorescencyjnie nanocząstki myszy, aby wykonać obrazowanie dwufotonowe w mózgu. Natychmiast włącz laser Ti:sapphire i główny wyłącznik systemu.
Następnie uruchom oprogramowanie do widoku prerii. Teraz unieruchom mysz pod mikroskopem dwufotonowym na niestandardowym stoliku. Ułóż zwierzę w pozycji leżącej na podgrzewanej podkładce i zabezpiecz je taśmą, nie uciskając klatki piersiowej.
Dodaj kroplę wody do okienka czaszki i dostosuj ostrość. Aby monitorować tętno zwierzęcia i natlenienie krwi, umieść czujnik na tylnej łapie. Dostosuj pozycję głowy.
Korzystając z filtru RFP, zlokalizuj żądane pole obrazowania. Po określeniu orientacji próbki i pola do wyświetlenia przełącz mikroskop z trybu szerokiego pola na tryb lekkiej mikroskopii skaningowej. Upewnij się, że laser Ti:sapphire jest zablokowany w trybie 920 nanometrów i otwórz wszystkie żaluzje.
Dostosuj napięcie GaASP PMT do 500 do 600 woltów. Naciśnij Live Image w oprogramowaniu, aby rozpocząć obrazowanie. Po uzyskaniu wyraźnego obrazu użyj oprogramowania i zmotoryzowanego stolika, aby ustawić górną i dolną część stosu obrazów w oprogramowaniu.
Powoli zwiększaj pocles lub wzmocnienie PMT, aby skompensować ciemność na coraz większych głębokościach. Ustaw ścieżkę zapisu i rozpocznij serię Z. Po zakończeniu układania stosu użyj odtwarzania, aby przejrzeć stos pod kątem jakości.
Po zakończeniu obrazowania przenieś zwierzę do klatki rekonwalescencji. Wyjdź z widoku prerii, upewnij się, że wszystkie dane zostały zapisane i przesłane, a następnie wyłącz komputer i cały sprzęt. Ograniczona liczba cząstek uległa wynaczynieniu i jest widoczna w pobliżu komórek nowotworowych 10 minut po podaniu nanocząstek.
Jednak 24 godziny po podaniu nanocząstek w glejaku widoczna jest obfitość cząstek, co sugeruje wynaczynienie.
Niniejsze badanie przedstawia nowatorskie podejście wykorzystujące mikroskopię dwufotonową do badania dostarczania znakowanych fluorescencyjnie nanocząsteczek tlenku żelaza do glejaka w modelu mysim. Technika ta pozwala na lepsze zrozumienie mechanizmów dostarczania leków przez barierę krew-mózg.
Pokonanie bariery krew-mózg pozostaje krytycznym wyzwaniem w opracowywaniu skutecznych terapii glejaka wielopostaciowego oraz innych nowotworów OUN. Dwufotonowa mikroskopia intravitalna (2P-IVM) umożliwia bezpośrednią wizualizację rozkładu nanocząsteczek i makrocząsteczek w czasie rzeczywistym w przedklinicznych modelach guzów mózgu, dostarczając cennych informacji niezbędnych do optymalizacji strategii dostarczania leków. Możliwość ta zwiększa pewność prognostyczną na styku biologii odkrywczej i badań translacyjnych, wspierając decyzje dotyczące portfela aktywów ukierunkowanych na OUN.
Metoda 2P-IVM integruje się z kontinuum od etapu odkrywania leku do badań przedklinicznych, zapewniając wysokorozdzielcze, ilościowe obrazowanie dystrybucji terapeutyków w żywych modelach zwierzęcych glejaka.