Name: Dwufotonowa mikroskopia przyżyteczna glejaka w modelu mysim (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-01T14:15:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: Poznaj dwufotonową mikroskopię przyżyciową w badaniu glejaka w modelu mysim. Ta technika umożliwia obserwację dystrybucji nanocząstek tlenku żelaza w czasie rzeczywistym, wspierając rozwój strategii dostarczania leków przez barierę krew-mózg.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Stanford Wu Tsai Neuroscience Microscopy Service, Stanford Center for Innovations in In Vivo Imaging (SCi3) - centrum obrazowania małych zwierząt, NIH S10 Shared Instrumentation Grant (S10RR026917-01, kierownik Michael Moseley, Ph.D.) oraz Stanford Preclinical Imaging Facility w Porter Drive za dostarczenie sprzętu i infrastruktury dla tego projektu. Praca ta została wsparta grantem z National Institute for Child Health and Human Development, grant numer R01HD103638. Serdecznie dziękujemy Grupie Schnitzer, Uniwersytetowi Stanforda; laboratorium Zuo, Uniwersytet Santa Cruz; oraz Laboratorium Obrazowania Nerwowo-Naczyniowego, Boston Photonic Center, University of Boston, w celu prowadzenia dyskusji edukacyjnych na temat obrazowania dwufotonowego i modeli okien czaszkowych.

Real-Time Tracking of Nanoparticles in Brain Tumors Using 2P-IVM in Mice

<ol><li>Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248 (4951), 73-76 (1990).</li>
<li>Wang, Z., McCracken, S., Williams, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transpupillary+two-photon+in+vivo+imaging+of+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Transpupillary two-photon in vivo imaging of the mouse retina.</a> J Vis Exp. 168, 61970(2021).</li>
<li>Zhang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+two-photon+microscopy+reveals+the+contribution+of+Sox9%2B+to+kidney+regeneration+in+a+mouse+model+with+extracellular+vesicle+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">In vivo two-photon microscopy reveals the contribution of Sox9+ to kidney regeneration in a mouse model with extracellular vesicle treatment.</a> J Biol Chem. 295 (34), 12203(2020).</li>
<li>Jang, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+microscopy+of+Paneth+cells+in+the+small+intestine+of+live+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Two-photon microscopy of Paneth cells in the small intestine of live mice.</a> Sci Rep. 8 (1), 14174(2018).</li>
<li>Ihler, F., Bertlich, M., Weiss, B., Dietzel, S., Canis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+microscopy+allows+imaging+and+characterization+of+cochlear+microvasculature+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Two-photon microscopy allows imaging and characterization of cochlear microvasculature in vivo.</a> Biomed Res Int. 2015, 154272(2015).</li>
<li>Matsuura, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+with+two-photon+microscopy+reveals+cellular+dynamics+in+the+ischeamia-reperfused+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging with two-photon microscopy reveals cellular dynamics in the ischeamia-reperfused rat heart.</a> Sci Rep. 8 (1), 15991(2018).</li>
<li>Veres, T. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intubation-free+in+vivo+imaging+of+the+tracheal+mucosa+using+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Intubation-free in vivo imaging of the tracheal mucosa using two-photon microscopy.</a> Sci Rep. 7 (1), 694(2017).</li>
<li>Zong, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+two-photon+calcium+imaging+in+freely+moving+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Large-scale two-photon calcium imaging in freely moving mice.</a> Cell. 185 (7), 1240-1256.e30 (2022).</li>
<li>Takasaki, K., Abbasi-Asl, R., Waters, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superficial+bound+of+the+depth+limit+of+two-photon+imaging+in+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">Superficial bound of the depth limit of two-photon imaging in mouse brain.</a> eNeuro. 17 (1), (2019).</li>
<li>Birkner, A., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+two-photon+imaging+in+vivo+with+a+red-shifted+calcium+indicator%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Deep two-photon imaging in vivo with a red-shifted calcium indicator.</a> Methods Mol Biol. 1929, 15-26 (1929).</li>
<li>Busche, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+two-photon+calcium+imaging+of+hippocampal+neurons+in+Alzheimer+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">In vivo two-photon calcium imaging of hippocampal neurons in Alzheimer mouse models.</a> Methods Mol Biol. 1750, 341-351 (2018).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+two-photon+probe+to+selectively+detect+monoamine+oxidase+B+activity+in+Parkinson%27s+disease+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">A sensitive two-photon probe to selectively detect monoamine oxidase B activity in Parkinson's disease models.</a> Nat Commun. 5, 3276(2014).</li>
<li>Madden, K. S., Zettel, M. L., Majewska, A. K., Brown, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+tumor+imaging%3A+live+imaging+of+glioma+by+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Brain tumor imaging: live imaging of glioma by two-photon microscopy.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2013 (3), (2013).</li>
<li>Ricard, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+dynamics+of+microglial+and+monocyte-derived+cells+in+glioblastoma-bearing+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Phenotypic dynamics of microglial and monocyte-derived cells in glioblastoma-bearing mice.</a> Sci Rep. 6, 26381(2016).</li>
<li>Soubéran, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+VEGF+blockade+on+the+dynamics+of+the+inflammatory+landscape+in+glioblastoma-bearing+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Effects of VEGF blockade on the dynamics of the inflammatory landscape in glioblastoma-bearing mice.</a> J Neuroinflammation. 16 (1), 191(2019).</li>
<li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+vivo+reveals+specific+nanoparticle+target+binding+in+a+syngeneic+glioma+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Real-time vivo reveals specific nanoparticle target binding in a syngeneic glioma mouse model.</a> Nanoscale. 14 (15), 5678-5688 (2022).</li>
<li>Wartchow, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+with+cyclic+AMP+activators+reduces+glioblastoma+growth+and+invasion+as+assessed+by+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Treatment with cyclic AMP activators reduces glioblastoma growth and invasion as assessed by two-photon microscopy.</a> Cells. 10 (3), 556(2021).</li>
<li>Jiang, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+detection+of+fibrillar+collagen+deposition+associated+with+vascular+elements+in+glioblastoma+multiforme+by+using+multiphoton+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Label-free detection of fibrillar collagen deposition associated with vascular elements in glioblastoma multiforme by using multiphoton microscopy.</a> J Microsc. 265 (2), 207-213 (2017).</li>
<li>Chen, Z., Ross, J. L., Hambardzumyan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+2-photon+imaging+reveals+distinct+morphology+and+infiltrative+properties+of+glioblastoma-associated+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Intravital 2-photon imaging reveals distinct morphology and infiltrative properties of glioblastoma-associated macrophages.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (28), 14254-14259 (2019).</li>
<li>Zhang, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labeling+human+mesenchymal+stem+cells+with+gold+nanocages+for+in+vitro+and+in+vivo+tracking+by+two-photon+microscopy+and+photoacoustic+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Labeling human mesenchymal stem cells with gold nanocages for in vitro and in vivo tracking by two-photon microscopy and photoacoustic microscopy.</a> Theranostics. 3 (8), 532-543 (2013).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Hoeferlin, G. F., Menendez, D. M., Krebs, O. K., Capadona, J. R., Shoffstall, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+thermal+damage+from+robot-drilled+craniotomy+for+cranial+window+surgery+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Assessment of thermal damage from robot-drilled craniotomy for cranial window surgery in mice.</a> J Vis Exp. 189, 64188(2022).</li>
<li>Holtmaat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nat Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).</li>
<li>Heo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+soft%2C+transparent%2C+freely+accessible+cranial+window+for+chronic+imaging+and+electrophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">A soft, transparent, freely accessible cranial window for chronic imaging and electrophysiology.</a> Sci Rep. 6, 27818(2016).</li>
<li>Kim, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+optical+access+to+an+estimated+one+million+neurons+in+the+live+mouse+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Long-term optical access to an estimated one million neurons in the live mouse cortex.</a> Cell Rep. 17 (12), 3385-3394 (2016).</li>
<li>Kılıç, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+cranial+windows+for+long+term+multimodal+neurovascular+imaging+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Physiol%22%5BJournal%5D)">Chronic cranial windows for long term multimodal neurovascular imaging in mice.</a> Front Physiol. 11, 612678(2021).</li>
<li>Helm, P. J., Ottersen, O. P., Nase, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+optical+properties+of+the+mouse+cranium-implications+for+in+vivo+multi+photon+laser+scanning+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of optical properties of the mouse cranium-implications for in vivo multi photon laser scanning microscopy.</a> J Neurosci Methods. 178 (2), 316-322 (2009).</li>
<li>Lu, W., Sun, Q., Wan, J., She, Z., Jiang, X. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cationic+albumin-conjugated+pegylated+nanoparticles+allow+gene+delivery+into+brain+tumors+via+intravenous+administration%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Cationic albumin-conjugated pegylated nanoparticles allow gene delivery into brain tumors via intravenous administration.</a> Cancer Res. 66 (24), 11878-11887 (2006).</li>
<li>Zhang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LDLR-mediated+peptide-22-conjugated+nanoparticles+for+dual-targeting+therapy+of+brain+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">LDLR-mediated peptide-22-conjugated nanoparticles for dual-targeting therapy of brain glioma.</a> Biomaterials. 34 (36), 9171-9182 (2013).</li>
<li>Xin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+anti-glioblastoma+efficacy+by+PTX-loaded+PEGylated+poly%28%C9%9B-caprolactone%29+nanoparticles%3A+In+vitro+and+in+vivo+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Pharm%22%5BJournal%5D)">Enhanced anti-glioblastoma efficacy by PTX-loaded PEGylated poly(ɛ-caprolactone) nanoparticles: In vitro and in vivo evaluation.</a> Int J Pharm. 402 (1-2), 238-247 (2010).</li>
<li>Valable, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+MRI+tracking+of+exogenous+monocytes%2Fmacrophages+targeting+brain+tumors+in+a+rat+model+of+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroimage%22%5BJournal%5D)">In vivo MRI tracking of exogenous monocytes/macrophages targeting brain tumors in a rat model of glioma.</a> Neuroimage. 40 (2), 972(2008).</li>
<li>Jia, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phototheranostics%3A+Active+targeting+of+orthotopic+glioma+using+biomimetic+proteolipid+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Phototheranostics: Active targeting of orthotopic glioma using biomimetic proteolipid nanoparticles.</a> ACS Nano. 13 (1), 386-398 (2021).</li>
<li>Asan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+correlates+of+gray+matter+volume+changes+in+magnetic+resonance+morphometry+identified+by+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Cellular correlates of gray matter volume changes in magnetic resonance morphometry identified by two-photon microscopy.</a> Sci Rep. 11, 4234(2021).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie ma dla nich konfliktu interesów.

Przedstawiamy metodę śledzenia NP in vivo w czasie rzeczywistym za pomocą 2P-IVM przez okno czaszkowe w celu oceny dostarczania do guza znakowanych fluorescencyjnie NP tlenku żelaza. Technika chirurgiczna tego zabiegu wymaga pewnej ręki i zaawansowanych eksperymentalnych umiejętności chirurgicznych. Wskazane jest, aby przećwiczyć używanie tusz lub fantomów przed przejściem do doświadczenia z żywymi zwierzętami. Jako alternatywę, Hoeferlin i in. wdrożyli wiertarkę robotyczną w celu zmniejszenia uszkodzeń termicznych, zminimalizowania zmienności techniki chirurgicznej i standaryzacji chirurgii22.
Rozmiar okna reprezentuje inny parametr krytyczny. Większe okno umożliwiłoby obrazowanie większej części guza za pomocą 2P-IVM. W piśmiennictwie opisano rozmiary w przedziale 3-7 mm23. Jednak większe okna nie są w stanie dostosować się do krzywizny mózgu, co może prowadzić do zwiększonego ciśnienia regionalnego24. Aby przezwyciężyć to ograniczenie, zamiast tego można użyć tak zwanej "szklanej czaszki"25. W porównaniu z tradycyjnymi szklanymi oknami, ta metoda wykorzystuje zakrzywione szkło, dostosowując się do krzywizny mózgu, a tym samym umożliwiając tworzenie większych okien przy jednoczesnym zmniejszeniu nacisku ogniskowego na korę mózgową. Ten rodzaj zakrzywionego szkła nie jest dostępny na rynku i ma ograniczone zastosowania w 2P-IVM, ponieważ zakrzywiona powierzchnia powoduje artefakty odbicia, ograniczając obszar okna, który można obrazować. Inną alternatywą jest okno24 na bazie krzemu. Z jednej strony metoda ta daje większą elastyczność w zakresie wielkości i formy tworzonego okna. Ponadto odnotowano porównywalne wyniki pod względem awaryjności okien i wskaźników zapalności do klasycznych okien szklanych. Z drugiej strony, wykazano, że jakość obrazowania 2-fotonowego w oknach na bazie polimerów spada szybciej niż w oknach szklanych, co sprawia, że nie jest ona możliwa do zastosowania w dłuższej perspektywie26. Inną alternatywą jest przerzedzone okno czaszki czaszki. Chociaż jest mniej inwazyjny niż klasyczne szklane okno, nie pozwala na implantację komórek GBM przy użyciu tej samej techniki, która została opisana tutaj. Dodatkowo trudno jest osiągnąć stałą grubość czaszki, w wyniku czego może to powodować znaczne artefakty w 2P-IVM27.
Linia komórkowa i ilość wszczepianych komórek GBM to inne ważne czynniki przy planowaniu harmonogramu badania. Linia komórkowa glejaka szczura C6 jest jedną z najczęściej stosowanych linii komórkowych w badaniach GBM. U szczurów i myszy liczba komórek między 5 x 104 a 5 x 106 została zgłoszona dla implantacji wewnątrzczaszkowych 27,28,29,30,31. Z reguły przy wszczepianiu większej liczby komórek należy spodziewać się szybszego wzrostu guza. W tym protokole wszczepiono 1 x 105 komórek, a obrazowanie wykonano w 11 i 12 dniu po implantacji. Xin i wsp. wszczepili 1 x 105 komórek C6 nagim myszom BALB/c i zgłosili wykrycie zaawansowanego GBM w MRI w 7 dniu po implantacji i zwiększoną śmiertelność po 15 dniach30. Dla porównania, Jia i in. użyli większej liczby komórek (1 x 106) i tego samego szczepu myszy i wykryli małą masę guza w 7 dniu w MRI z lekko zakłóconą barierą krew-mózg (BBB), o czym świadczy blady niebieski barwnik Evansa w tkanceGBM 32. W dniu 14 niebieskie zabarwienie Evansa było silniejsze niż w dniu 7, co wskazuje, że BBB był silnie zakłócony. Z kolei wzrost guza wpływa również na to, jak długo zwierzęta mogą być trzymane w eksperymencie. Jest to ważny czynnik wpływający na dobrostan zwierząt w badaniach obrazowania podłużnego. Doniesiono, że przewlekłe okna czaszkowe nadają się do obrazowania przez okres do 6 miesięcy po implantacji26.
Nanocząstki użyte w tym protokole składają się ze składników tlenku żelaza i fluoroforu. Możliwe zastosowania obejmują badanie dostarczania nowych leków terapeutycznych do guza, terapii komórkowych oraz interwencji w zakresie unaczynienia guza i mikrośrodowiska guza. Różni kandydaci na leki i terapie skojarzone mogą być oceniani na poziomie komórkowym i molekularnym. Składnik tlenku żelaza w nanocząsteczkach pozwala na obrazowanie multimodalne za pomocą rezonansu magnetycznego lub obrazowania cząstek magnetycznych jako dodatek do 2P-IVM. Chociaż MRI stanowi klinicznie istotną metodę obrazowania, jego rozdzielczość anatomiczna jest gorsza niż w mikroskopii przyżyciowej33.
Ta metoda ma również pewne ograniczenia. Współrzędne mózgu zgodnie z atlasem mózgu myszy są znormalizowane dla myszy C57BL/6J i muszą być dostosowane w zależności od szczepu myszy, płci i wieku. Co więcej, w przypadku obrazowania dwufotonowego można uzyskać dostęp tylko do ograniczonej głębokości około 450 μm9. W związku z tym możliwa jest tylko częściowa charakterystyka guza za pomocą 2P-IVM, a regionalne różnice w charakterystyce guza mogą zostać pominięte. Ponadto uwzględniono tylko dwa punkty czasowe po podaniu NP. Przyszłe badania, obejmujące więcej punktów czasowych po podaniu dożylnym, pozwolą na bardziej szczegółową analizę czasoprzestrzennego zachowania nanocząsteczek w mikrośrodowisku guza.
Podsumowując, oceniliśmy dostarczanie do guza znakowanych fluorescencyjnie nanocząstek tlenku żelaza za pomocą 2P-IVM w mysim modelu GBM. Metoda ta może być łatwo modyfikowana w celu dopasowania do różnych obszarów badań i stanowi ważne narzędzie do obrazowania mózgu in vivo w dziedzinie neuronauki.

Mikroskopia dwufotonowa (2P-IVM) to technika obrazowania fluorescencyjnego, która pozwala na wizualizację żywej tkanki1.
Po raz pierwszy opracowany w latach 90., 2P-IVM został użyty do analizy in vivo siatkówki2, nerka3, jelito cienkie4, cochlea5, heart6, trachea7, oraz mózg w różnych modelach przedklinicznych8,9. W dziedzinie neuronauki 2P-IVM zyskał na znaczeniu jako technika obrazowania w czasie rzeczywistym zdrowego mózgu u przebudzonych zwierząt10, a także do badania chorób układu nerwowego, takich jak choroba Alzheimera11, Parkinson's12 i glejak (GBM)13,14,15,16.
2P-IVM oferuje eleganckie rozwiązanie do badania mikrośrodowiska guza podczas rozwoju GBM. Podczas gdy niektóre wcześniejsze badania koncentrowały się na in vitro17 i ex vivo models18, inne implementowały modele in vivo orthotopic19 i xenotropic20 do badania GBM. Madden i wsp. przeprowadzili natywne obrazowanie linii komórkowej glejaka szczurzego OUN-1 w modelu mysim13. Korzystając z ortotopowego mysiego modelu GL261-DsRed, Ricard i wsp. przeprowadzili dożylne podanie fluoroforu w celu wzmocnienia naczyń krwionośnych w regionie guza w 2P-IVM14.
Tutaj stosujemy 2P-IVM do śledzenia dostarczania do guza znakowanych fluorescencyjnie nanocząstek tlenku żelaza (NP) w ortotopowym mysim modelu GBM. Wykorzystując okno czaszkowe, metoda ta pozwala nam szczegółowo badać czasoprzestrzenny rozkład nanocząsteczek w mózgu w czasie rzeczywistym.

<table><tbody><tr><td>0,9% roztwór infuzyjny chlorku sodu</td><td>Baxter Corp</td><td>533-JB1301P</td><td></td></tr><tr><td> Dulbecco's Modified Eagle Medium</td><td>Invitrogen</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawki 1 ml</td><td>Strzykawka BD Luer-Lok, REF309628</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10%&nbsp; FBS</td><td>Thermo fisher</td><td>Cytiva SH30910.03HI</td><td></td></tr><tr><td>10% DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop 2-fotonowy</td><td>Prairie Technologies, Bruker</td><td>Prairie Ultima IV</td><td></td></tr><tr><td>Aplikatory alkoholowe, 70%</td><td>Medline Industries, LP</td><td>MDS093810</td><td></td></tr><tr><td>Alkohol, butelka z rozpylaczem</td><td>Decon Labs Inc</td><td>Decon SaniHol, 04-355-122</td><td></td></tr><tr><td>Folia aluminiowa</td><td>Reynold Brands</td><td>Reynold Wrap nieprzywierająca folia</td><td></td>aluminiowa</tr><tr><td>Maszyna do znieczulenia</td><td>Patterson Scientific</td><td>SAS3</td><td></td></tr><tr><td>Monitorowanie anestezjologii&nbsp;</td><td>Kent Naukowy&nbsp;</td><td>MouseSTAT Jr. Pulsoksymetr</td><td></td>gryzoni</tr><tr><td>Antybiotyk-Antybiotyk (100x), płyn</td><td>Invitrogen</td><td>15240-096</td><td></td></tr><tr><td>Aplikatory Betadine</td><td>Professional Disposables International, Inc</td><td>S41125</td><td></td></tr><tr><td>Dziurkacz do biopsji, 5 mm&nbsp;</td><td>Miltex</td><td>Size 5</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfina o przedłużonym uwalnianiu</td><td>Zoo Pharm</td><td>Bup SR Lab, 1,0 mg/ml</td><td>Zamiast tego można zastosować lek generyczny.&nbsp;</td></tr><tr><td>Linia komórkowa glejaka szczura C6</td><td>ATCC (American Tissue Culture Collection)</td><td>CCL-107</td><td></td></tr><tr><td>Kaniule</td><td>BD</td><td>16 G, 1.1/2", 30 G, 1"</td><td></td></tr><tr><td>Karprofen</td><td>Pfizer&nbsp;</td><td>Rimadyl, 50 mg/ml</td><td>Zamiast tego można zastosować lek generyczny.&nbsp;</td></tr><tr><td>Cefazoline</td><td>Sagent Pharmaceuticals</td><td>25021-101-10, 1 g / fiolkę</td><td>Zamiast tego można zastosować lek generyczny.&nbsp;</td></tr><tr><td>Sitko do komórek, 40 i mikro; m</td><td>Fisher Scientific</td><td>87711</td><td></td></tr><tr><td>Aplikatory z końcówką bawełnianą, 6" &nbsp;</td><td>Dyad Medical Sourcing, LLC</td><td>HCS1005</td><td></td></tr><tr><td>Cement dentystyczny</td><td>Stoelting Co</td><td>51459</td><td>Zestaw cementu dentystycznego, przezroczysty, 2-składnikowy</td></tr><tr><td>Deksametazon</td><td>Bimeda</td><td>138RX, 2 mg / ml</td><td>Zamiast tego można zastosować lek generyczny.&nbsp;</td></tr><tr><td>DietGel</td><td>ClearH2O</td><td>Recovery, 72-06-502</td><td></td></tr><tr><td>Serwe&nbsp;</td><td>Wiertarka Cardinal Health</td><td>Bio Shield Saeyang</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Microtech</td><td>Escort Pro, B08350</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki wiertarskie&nbsp;</td><td>Hager & Meissinger GmbH</td><td>REF310104001001005</td><td>Rozmiar 005, US 1/4</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do analizy obrazowania FIDŻI</td><td>Narodowy Instytut Zdrowia</td><td>https://imagej.net/software/fiji/</td><td></td></tr> <tr><td>Kleszcze</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-812-41</td><td></td></tr><tr><td>Gauze</td><td>Fisher HealthCare</td><td>Sterylna bawełniana gaza, 4 x 4", 22-415-469</td><td></td></tr><tr><td>Gelfoam&nbsp;</td><td>Ethicon Inc.&nbsp;</td><td>Wchłanialna gąbka żelatynowa Surgifoam, Ref. 1972</td><td></td></tr><tr><td>Germinator&nbsp;</td><td>Cellpoint Naukowy&nbsp;</td><td>Germinator 500, nr 11688</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe szklane, średnica 5 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>Menzel Szkło nakrywkowe&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Rękawiczki niesterylne</td><td>Bezpudrowe rękawice</td><td></td>do badań lekarskich <td>Fisher Scientific</td> Nitrylowe</tr><tr><td>Rękawiczki sterylne</td><td>Medline Industries, LP</td><td>MDS104070</td><td></td></tr><tr><td>Krem do depilacji</td><td>Kościół & Dwight</td><td>Nair Emulsja do depilacji&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka Hamilton</td><td>Company Inc</td><td>Gazoszczelna #1701, 10 i mikro; L</td><td></td></tr><tr><td>HBSS bez Ca, Mg</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI88284</td><td></td></tr><tr><td>Belka czołowa</td><td>Hongway</td><td>5 mm średnica wewnętrzna O-ringi Poduszka</td><td></td></tr><tr><td>grzewcza</td><td>Stoelting Co.&nbsp;</td><td>Podgrzewacz do gryzoni X2</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawki insulinowe</td><td>Exel International Medical Products&nbsp;</td><td>29G x 1/2&Prime;</td><td></td></tr><tr><td>Nanocząstki tlenku żelaza</td><td>Covis Pharma GmbH</td><td>Feraheme ferumoxytol do wstrzykiwań, 510 mg/17 mL, 59338077501</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Dechra</td><td>26675-46-7</td><td></td></tr><tr><td>Myszy</td><td>Jackson Laboratories</td><td>NSG, Mikroskop szczepu 005557</td><td></td></tr><tr><td>(chirurgia)</td><td>Seiler Medical</td><td>Seiler IQ Q-100-220</td><td></td></tr><tr><td>Nanocząstki</td><td>Niestandardowe</td><td></td><td>Nanocząstki tlenku żelaza (ferumoksytol) znakowane izotiocyjanianem fluoresceiny</td></tr><tr><td>Maść oftalmiczna</td><td>Główne farmaceutyki</td><td>Maść na noc Lubrifresh P.M., 203964</td><td></td></tr><tr><td>Tlen</td><td>Linde Gas & Sprzęt Inc.&nbsp;</td><td>Butla ze stali wysokociśnieniowej typu K, 249CF, 2000PSIG, CGA 540</td><td></td></tr><tr><td>Kubki plastikowe</td><td>Georgia-Pacirif Consumer Products</td><td>Dixie Porcje, 2 uncje, plastikowe, przezroczyste, PK2400</td><td></td></tr><tr><td>Rurki polietylenowe</td><td>Braintree Scientific</td><td>50-195-5494</td><td></td></tr><tr><td>Skala</td><td>Ohaus Corp</td><td>CR2200</td><td></td></tr><tr><td>Skalpel</td><td>Integra Life Sciences Production Corp</td><td>Integra Miltex Nożyczki do skalpela jednorazowego ze stali nierdzewnej</td> Fisher Scientific 13-804-18 Uszczelniacz Henkel Corp Loctite 4014 Jednorazowy fartuch laboratoryjny High Tech Conversions 17-444-081 Rama stereotaktyczna Stoelting Co.&nbsp;<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>Stoelting New Standard TM</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne systemy filtracji butelki próżniowej</td><td>Fisher Scientific</td><td>S2GPU05RE, MilliporeSigma NR:S2GPU05RE</td><td></td></tr><tr><td>Pudełko styropianowe</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Rękawice chirurgiczne</td><td>Cardinal Health</td><td>19-163-108</td><td></td></tr><tr><td>Klej chirurgiczny, klej do tkanek 3M Vetbond</td><td>3M Animal Care Prodcuts</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>Ogon Cewnik żyłowy</td><td>Niestandardowy</td><td></td><td>Składa się z dwóch kaniul 30 G połączonych rurką silikonową&nbsp;</td></tr><tr><td>TrypLE Express (1x), bez czerwieni fenolowej</td><td>Invitrogen</td><td>12604-039</td><td></td></tr><tr><td>Latarka ultrafioletowa</td><td>Technologia wiosennego słońca</td><td>Consciot</td><td></td></tr></tbody></table>

dwufotonowa mikroskopia przyżyteczna glejaka w modelu mysim

Two-Photon Intravital Microscopy of Glioblastoma in a Murine Model

Dostarczanie dożylnie leków przeciwnowotworowych do guzów mózgu jest ograniczone przez barierę krew-mózg. Metoda bezpośredniego obrazowania akumulacji i dystrybucji makrocząsteczek w guzach mózgu in vivo znacznie zwiększyłaby naszą zdolność do zrozumienia i optymalizacji dostarczania leków w modelach przedklinicznych. Protokół ten opisuje metodę śledzenia in vivo w czasie rzeczywistym dożylnie podawanych nanocząstek znakowanych fluorescencyjnie za pomocą dwufotonowej mikroskopii przyżyciowej (2P-IVM) w mysim modelu glejaka (GBM).
Protokół zawiera wieloetapowy opis procedury, w tym znieczulenie i analgezję zwierząt doświadczalnych, tworzenie okna czaszkowego, implantację komórek GBM, umieszczenie pręta na głowę, prowadzenie badań 2P-IVM i opiekę pooperacyjną dla długoterminowych badań kontrolnych. Pokazujemy reprezentatywne sesje obrazowania 2P-IVM i analizę obrazu, badamy zalety i wady tej technologii oraz omawiamy potencjalne zastosowania.
Ta metoda może być łatwo modyfikowana i dostosowywana do różnych pytań badawczych w dziedzinie przedklinicznego obrazowania mózgu in vivo.

W niniejszej procedurze przeprowadzono operację wszczepienia okna czaszkowego oraz przeszczepiono komórki C6 w modelu GBM u myszy NSG (n = 5). Odpowiednie uszczelnienie między wszystkimi elementami wykorzystanymi do stworzenia okna (Rysunek 1A) zapewni trwałość okien podczas długotrwałego obrazowania i dodatkowo zmniejszy śmiertelność. Wykorzystując stoły przystosowane do in vivo 2P-IVM (Rysunek 2), możliwe było obrazowanie zwierząt pod narkozą przez maksymalnie 2 h bez istotnych artefaktów ruchowych. Około 10 min po dożylnym podaniu nanocząsteczek u myszy z GBM, badanie 2P-IVM wykazuje zielony sygnał fluorescencyjny naczyń w obrębie guza, co jest zgodne z wewnątrznaczyniową lokalizacją nanocząsteczek znakowanych FITC. Poza naczyniami krwionośnymi odnotowano jedynie niewielką ilość zielonego sygnału fluorescencyjnego, co wskazuje na początek ekstrawasacji NP (Rysunek 3A). Widoczny jest wzrost sygnału FITC pochodzącego z przestrzeni pozanaczyniowej, co odpowiada zaawansowanej ekstrawasacji (Rysunek 3B).
<img alt="Schemat przygotowania do kraniotomii; obrazowanie dwufotonowe w badaniach mózgu z przedstawionym procesem implantacji komórek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66304/66304fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Umieszczenie okna czaszkowego, kraniotomia, implantacja i obrazowanie. (A) Przekrój poprzeczny anatomicznego rozmieszczenia okna czaszkowego. Ponieważ uchwyt głowy jest wolny od metalu, możliwe jest przeprowadzenie obrazowania rezonansem magnetycznym lub obrazowania cząsteczek magnetycznych oprócz dwufotonowej mikroskopii intravitalnej. (B) Przegląd (górny rząd) i szczegółowy widok (dolny rząd) kraniotomii (lewo), implantacji komórek (środek) oraz dwufotonowej mikroskopii intravitalnej (prawo). Po otwarciu czaszki występuje powierzchowne krwawienie (lewo), które jest szybko wchłaniane (środek). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66304/66304fig01large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Równowaga statyczna ramienia mechanicznego; schemat CAD; analiza naprężenia śrub; studium inżynieryjne." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66304/66304fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Projekt wspomagany komputerowo (CAD) platformy. Projekt CAD platformy wykorzystywanej do dwufotonowej mikroskopii intravitalnej in vivo, obejmujący listwę do gryzienia, stabilizację listwą głowową oraz śruby do regulacji wysokości i kąta. Plik CAD 3D znajduje się w Pliku uzupełniającym z kodem 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66304/66304fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Dwufotonowa mikroskopia intravitalna nanocząsteczek FITC po 10 i 24 godzinach, obrazowanie guza mózgu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66304/66304fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Obrazy z dwufotonowej mikroskopii intravitalnej in vivo. Obrazy pozyskane (A) 10 min i (B) 24 h po dożylnym podaniu nanocząsteczek. Podczas gdy komórki GBM emitują sygnały fluorescencyjne w spektrum czerwonym (lewo), nanocząsteczki w tkance mózgowej są widoczne w kolorze zielonym (prawo). # oznacza nanocząsteczki, które przeniknęły poza naczynia (ekstrawasacja), * oznacza naczynie krwionośne. Tylko ograniczona liczba cząsteczek uległa ekstrawasacji i jest widoczna w sąsiedztwie komórek nowotworowych 10 min po podaniu nanocząsteczek. Liczne cząsteczki są widoczne w obszarze komórek GBM, co sugeruje ekstrawasację 24 h po podaniu nanocząsteczek. Nanocząsteczki składają się z izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC) i nanocząsteczek tlenku żelaza (Ferumoxytol). Paski skali reprezentują 100 µm. Skróty: 2P-IVM: dwufotonowa mikroskopia intravitalna, RFP: czerwone białko fluorescencyjne, GBM: glejak wielopostaciowy, FITC: izotiocyjanian fluoresceiny, NP: nanocząsteczki. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66304/66304fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Plik uzupełniający z kodem 1: plik 3D CAD stolika. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66304/custom%20stage%203D%20CAD.zip" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Prezentujemy nowatorskie podejście do dwufotonowej mikroskopii dostarczania przez nowotwór znakowanych fluorescencyjnie nanocząstek tlenku żelaza do glejaka w modelu mysim.

Dwufotonowa mikroskopia przyżyteczna glejaka w modelu mysim

The delivery of intravenously administered cancer therapeutics to brain tumors is limited by the blood-brain barrier. A method to directly image the ...

Glejak wielopostaciowy jest jednym z najczęstszych pierwotnych nowotworów mózgu i wiąże się z szybkim wzrostem i niską oczekiwaną długością życia. Opracowanie skutecznych terapii glejaka pozostaje poważnym wyzwaniem, ponieważ dostarczanie leków jest ograniczone przez barierę krew-mózg. Metoda bezpośredniego obrazowania akumulacji i dystrybucji makrocząsteczek w mózgu znacznie zwiększyłaby naszą zdolność do zrozumienia i optymalizacji dostarczania leków.Mikroskopia dwufotonowa stanowi eleganckie rozwiązanie do badania rozkładu nanocząstek w czasie rzeczywistym w przedklinicznym modelu glejaka. Modyfikując nanocząstki użyte w tym badaniu, możliwe jest zbadanie dostarczania różnych kandydatów na leki i terapii skojarzonych na poziomie komórkowym i molekularnym. Oprócz dwufotonowej mikroskopii trivital, składnik tlenku żelaza w tych nanocząstkach pozwala na multimodalne obrazowanie za pomocą MRI lub MPI.W przyszłości urządzenia do obrazowania mogą służyć w realizacji wczesnego wykrywania raka, prowadząc w ten sposób do skuteczniejszych terapii przeciwko nowotworom złośliwym. Jedną ze ścieżek do osiągnięcia tego celu jest połączenie dwufotonowej mikroskopii przyżyciowej z innymi metodami obrazowania, takimi jak pozytonowa tomografia emisyjna i ultradźwięki fotoakustyczne. Aby rozpocząć, przygotuj mysz do zabiegu i umieść ją na ramie stereotaktycznej.Następnie podnieś skórę na czaszce i przytrzymaj nożyczki między prawym okiem a uchem, aby utworzyć nacięcie. Przeciąć w kierunku lewej strony czaszki zgodnie ze śladami nacięć i usunąć powstały okrągły płat skóry. Za pomocą ostrza skalpela lub mikrokiretki delikatnie podrap powierzchnię czaszki, aby usunąć okostną.Użyj soli fizjologicznej i odkurzacza, aby utrzymać obszar operacyjny w czystości z zanieczyszczeń. Zdrap okostną, aby zapewnić lepsze przyleganie kleju cyjanoakrylowego i cementu dentystycznego. Następnie za pomocą ołówka do autoklawu zaznacz położenie okienka czaszki.Trzymaj wiertło w ręce dominującej, a strzykawkę lub kleszcze w ręce niedominującej. Nałóż zimną sól fizjologiczną na kalwarię, aby zapobiec przegrzaniu i utrzymać widok chirurgiczny w czystości. Podczas wiercenia umieść szkiełko nakrywające na czaszce, aby upewnić się, że dokładnie pasuje do okna czaszki.Gdy możliwe jest wciśnięcie płata czaszki, za pomocą kleszczy ostrożnie usuń fragment z pola operacyjnego. Jeśli wystąpi niewielkie krwawienie, użyj gąbki hemostatycznej do miejscowego nakładania lodowatej soli fizjologicznej pod lekkim ciśnieniem, aby zmniejszyć utratę krwi. Weź hodowane komórki glejaka C6 do implantacji.Odessać jeden mikrolitr zawiesiny komórkowej w gazoszczelnej strzykawce mikrolitrowej. Następnie umieścić strzykawkę w ramce stereotaktycznej. Aby wszczepić komórki do obrazowania dwufotonowego, wstrzyknij 0,5 mikrolitra zawiesiny komórkowej na głębokość 0,8 milimetra w powierzchowny obszar mózgu.Po wstrzyknięciu należy wycofać igłę i opuścić tkankę mózgową. Teraz przenieś pałąk na głowę i szkiełko z alkoholu do roztworu soli fizjologicznej i użyj końcówki próżniowej lub kleszczy, aby nawigować tymi elementami do miejsca operacji. Umieść szkiełko pokrywy szklanej w oknie czaszki i nałóż niewielką ilość kleju cyjanoakrylowego.Usuń rozlany klej na szkiełku nakrywkowym za pomocą aplikatora z bawełnianą końcówką lub delikatnie zdrapując go skalpelem. Zabezpiecz szklane szkiełko nakrywkowe w oknie czaszki i przyłóż zagłówek. Wymieszaj cement dentystyczny, ustaw pręt pod głowę i nałóż cement na otoczenie.Oczyść zbędny cement za pomocą końcówki strzykawki, skalpela lub końcówki wiertła. Po uszczelnieniu okna czaszki sprawdź, czy nie ma odsłoniętych obszarów czaszki. Zacznij od wstrzyknięcia komórek glejaka C6 do powierzchownych obszarów mózgu myszy, aby stworzyć mysi model glejaka.Następnie zamocuj pręt na głowę w oknie czaszki i pozwól myszom dojść do siebie. Następnie wstrzyknij dożylnie znakowane fluorescencyjnie nanocząstki myszy, aby wykonać obrazowanie dwufotonowe w mózgu. Natychmiast włącz laser Ti:sapphire i główny wyłącznik systemu.Następnie uruchom oprogramowanie do widoku prerii. Teraz unieruchom mysz pod mikroskopem dwufotonowym na niestandardowym stoliku. Ułóż zwierzę w pozycji leżącej na podgrzewanej podkładce i zabezpiecz je taśmą, nie uciskając klatki piersiowej.Dodaj kroplę wody do okienka czaszki i dostosuj ostrość. Aby monitorować tętno zwierzęcia i natlenienie krwi, umieść czujnik na tylnej łapie. Dostosuj pozycję głowy.Korzystając z filtru RFP, zlokalizuj żądane pole obrazowania. Po określeniu orientacji próbki i pola do wyświetlenia przełącz mikroskop z trybu szerokiego pola na tryb lekkiej mikroskopii skaningowej. Upewnij się, że laser Ti:sapphire jest zablokowany w trybie 920 nanometrów i otwórz wszystkie żaluzje.Dostosuj napięcie GaASP PMT do 500 do 600 woltów. Naciśnij Live Image w oprogramowaniu, aby rozpocząć obrazowanie. Po uzyskaniu wyraźnego obrazu użyj oprogramowania i zmotoryzowanego stolika, aby ustawić górną i dolną część stosu obrazów w oprogramowaniu.Powoli zwiększaj pocles lub wzmocnienie PMT, aby skompensować ciemność na coraz większych głębokościach. Ustaw ścieżkę zapisu i rozpocznij serię Z. Po zakończeniu układania stosu użyj odtwarzania, aby przejrzeć stos pod kątem jakości.Po zakończeniu obrazowania przenieś zwierzę do klatki rekonwalescencji. Wyjdź z widoku prerii, upewnij się, że wszystkie dane zostały zapisane i przesłane, a następnie wyłącz komputer i cały sprzęt. Ograniczona liczba cząstek uległa wynaczynieniu i jest widoczna w pobliżu komórek nowotworowych 10 minut po podaniu nanocząstek.Jednak 24 godziny po podaniu nanocząstek w glejaku widoczna jest obfitość cząstek, co sugeruje wynaczynienie.

two-photon-intravital-microscopy-of-glioblastoma-in-a-murine-model

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Dośródczaszkowa implantacja komórek GL261 u myszy C57BL/6 powoduje powstanie złośliwych glejaków, które odzwierciedlają wiele cech charakterystycznych dla ludzkiego wielopostaciowego glejakaa. Wykorzystaliśmy komórki GL261 stabilnie wykazujące ekspresję lucyferazy, co pozwoliło nam zastosować obrazowanie in vivo do śledzenia progresji guza. Przedstawiono procedurę chirurgiczną oraz trójwymiarowe obrazowanie in vivo.

Implantacja wewnątrzczaszkowa z następującym obrazowaniem bioluminescencyjnym 3D in vivo glejaków mysich

Opisujemy zintegrowaną metodę precyzyjnej implantacji stereotaktycznej ludzkich komórek wielopostaciowego glejaka do mózgów myszy nago oraz następującego po niej seryjnego obrazowania in vivo w celu monitorowania wzrostu i odpowiedzi na leczenie powstałych ksenograftów.

Stereotaktyczna implantacja wewnątrzczaszkowa i obrazowanie bioluminescencyjne in vivo ksenoprzeszczepów guzów w mysim modelu glioblastoma multiforme

W tym filmie wykonujemy obrazowanie dożylne wstępnie wstrzykniętych komórek rakowych w modelu mysim przez wszczepione okienko czaszkowe. Ta technika obrazowania poklatkowego o wysokiej rozdzielczości umożliwia badanie dynamicznego zachowania komórek nowotworowych u żywej myszy.

Obrazowanie przyżyciowe oparte na oknie czaszkowym w modelu mysim: technika obrazowania służąca do badania zachowania wstępnie wstrzykniętych komórek rakowych w mózgu modelu mysiego

W tym filmie opisujemy fluorescencyjną tomografię molekularną lub FMT do obrazowania in vivo fluorescencyjnych ksenoprzeszczepów glejaka znakowanego białkiem w modelach mysich. Technika ta jest przydatna do wyjaśnienia efektów terapii przeciwnowotworowych na poziomie molekularnym.

Fluorescencyjna tomografia molekularna: technika obrazowania in vivo ksenoprzeszczepów glejaka znakowanego białkiem fluorescencyjnym w modelu mysim

Źródło: Clark, A.J., et al. Obrazowanie bioluminescencyjne immunokompetentnego modelu zwierzęcego glejaka. J. Vis. Exp. (2016)Ten film przedstawia obrazowanie bioluminescencyjne w celu śledzenia progresji glejaka w immunokompetentnym modelu myszy, przy użyciu komórek nowotworowych eksprymujących lucyferazy i lucyferyny do nieinwazyjnego ilościowego określenia wzrostu guza.

Obrazowanie bioluminescencyjne immunokompetentnego mysiego modelu glejaka

Ustaliliśmy korowy model glejaka ortotopowego u myszy do przyżyciowej mikroskopii dwufotonowej, który podsumowuje ograniczenia biofizyczne, które normalnie występują podczas wzrostu guza. Przewlekłe szklane okienko zastępujące czaszkę nad guzem umożliwia śledzenie postępu guza w czasie za pomocą mikroskopii dwufotonowej.

Ortotopowy mysi model glejaka wielopostaciowego utrzymujący fizyczne ograniczenia miąższu mózgu i nadający się do przyżyciowej mikroskopii dwufotonowej

Komórki glejaka GL261 dostarczają użytecznego immunokompetentnego modelu zwierzęcego glejaka. Celem tego protokołu jest zademonstrowanie właściwych technik monitorowania wzrostu guza wewnątrzczaszkowego za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego in vivo oraz zweryfikowanie użyteczności komórek GL261 zmodyfikowanych lucyferazą do badania immunologii guza i podejść immunoterapeutycznych w leczeniu glejaka.

Obrazowanie bioluminescencyjne immunokompetentnego modelu zwierzęcego glejaka

Fluorescencyjna tomografia molekularna do obrazowania in vivo ksenoprzeszczepów glejaka

Zrozumienie złośliwego zachowania raka wymaga stworzenia dokładnych modeli interakcji komórek nowotworowych z elementami mikrośrodowiska guza, takimi jak makrofagi. W tym miejscu opisujemy dwie metody badania interakcji komórek glejaka z makrofagami związanymi z nowotworem i mikroglejem, w których oceniany jest wpływ na inwazję glejaka.

Testy kokulturowe w celu zbadania stymulacji makrofagów i mikrogleju inwazji glejaka

Ten protokół opisuje użycie mikroskopii wielofotonowej do wykonywania długoterminowego, wysokorozdzielczego, jednokomórkowego obrazowania nienaruszonego płuca w czasie rzeczywistym przy użyciu stabilizowanego próżniowo okna obrazowania.

Długotrwała mikroskopia przyżyciowa o wysokiej rozdzielczości w płucach z okienkiem obrazowania stabilizowanym podciśnieniowo

Poznaj dwufotonową mikroskopię przyżyciową w badaniu glejaka w modelu mysim. Ta technika umożliwia obserwację dystrybucji nanocząstek tlenku żelaza w czasie rzeczywistym, wspierając rozwój strategii dostarczania leków przez barierę krew-mózg.

Dwufotonowa mikroskopia przyżyteczna glejaka w modelu mysim

Przeglądaj więcej filmów