Wstrzyknięcie doudowe ludzkich hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych myszom z obniżoną odpornością
8 grudnia 2023
Zastrzyki doudowe pozwalają na wszczepienie niewielkiej liczby hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych (HSPC), poprzez umieszczenie komórek bezpośrednio w jamie szpiku kostnego. Tutaj opisujemy eksperymentalny protokół wstrzykiwania do kości udowej ludzkich HSPC myszom z niedoborem odporności.
Naszym zainteresowaniem jest badanie zdrowej hematopoezy u ludzi przez całe życie, od płodu do osoby starszej. Na przykład badamy wątrobę u płodu oraz szpik kostny i krew obwodową u osoby dorosłej. Uważamy, że ważne jest, aby badać zdrowy kontekst, który pomoże nam zrozumieć, co idzie nie tak w chorobie.
Istnieje wiele podejść omicznych opartych na pojedynczych komórkach, które w ostatnich latach przyczyniły się do postępu w tej dziedzinie, ale działają one raczej równolegle z eksperymentami transplantacyjnymi, które testują funkcję komórek macierzystych, niż je zastępują. Wstrzykując komórki macierzyste i progenitorowe krwi bezpośrednio do kości udowej, omijamy fazę naprowadzania zastrzyków dożylnych. Komórki znajdują się już w swoim naturalnym środowisku, dlatego często mamy do czynienia ze znacznie wyższym wszczepieniem.
Chcemy przedstawić ilościowe spojrzenie na to, jak komórki macierzyste krwi ewoluują w ciągu życia człowieka, jak wpływają na nie zdarzenia takie jak stan zapalny lub infekcje, i wreszcie, jak mutacje kumulują się wraz z wiekiem, jak kształtują funkcję komórek macierzystych krwi i jak to predysponuje nas do chorób związanych z wiekiem. Aby rozpocząć, wyjmij kriowialny kriowial zawierający komórki CD34 + krwi pępowinowej z zamrażarki. Rozmrozić komórki w łaźni wodnej przed przeniesieniem ich do 50-mililitrowej probówki.
Potrząsając probówką, kroplami dodaj do probówki 10-krotność objętości wstępnie podgrzanego IMDM zawierającego 50% FBS i 0,1 miligrama na mililitr DNAse. Odwirować zawiesinę komórkową o masie 500 g przez pięć minut. Ponownie zawiesić osad w 20 do 40 mikrolitrach PBS zawierającego penicylinę i streptomycynę.
Przechowuj komórki na lodzie do czasu użycia. Przygotuj strzykawkę o pojemności 3 mililitrów z igłą o rozmiarze 27 i pół cala. Przygotuj strzykawkę insulinową o pojemności 0,5 mililitra z igłą o rozmiarze 29 i średnicy 12,7 milimetra, zawierającą zawiesinę komórek CD 34 + krew pępowinowa.
Następnie przygotuj strzykawkę insulinową o pojemności 1 mililitra z igłą o rozmiarze 29 i rozmiarze 0,5 cala ze 100 mikrolitrami buprenorfiny. Przenieś znieczuloną mysz do stożka nosowego i wykonaj uszczypnięcie palca u nogi, aby potwierdzić jej gotowość do wstrzyknięcia. Połóż mysz na grzbiecie i zegnij tylne nogi.
Aby zabezpieczyć tylne nogi, połóż kciuk ręki niedominującej na stopie, palec środkowy na biodrze, a palec wskazujący na zewnątrz kości udowej. Delikatnie wyrwij włosy z okolic rzepki i przetrzyj obszar wacikiem nasączonym alkoholem. Teraz, za pomocą 3-mililitrowej strzykawki z półcalową igłą o rozmiarze 27, delikatnie wywierć otwór w skórze w kierunku kości udowej.
Gdy igła znajdzie się w kości, obracaj ją zgodnie z ruchem wskazówek zegara, aż cała igła znajdzie się w kości. Wyjąć igłę, obracając ją w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara do połowy. Przetrzyj igłę wacikiem nasączonym alkoholem i kontynuuj obracanie igły w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara, aby całkowicie ją usunąć.
Następnie włóż 0,5 mililitrową strzykawkę insulinową zawierającą zawiesinę komórek do trzonu kości udowej. Gdy igła znajdzie się w kości, zwolnij uchwyt na nodze i delikatnie wstrzyknij 25 mikrolitrów zawiesiny do kości udowej. Na koniec wstrzyknij buprenorfinę podskórnie i umieść mysz z powrotem w jej domowej klatce, pozwalając jej dojść do siebie po znieczuleniu.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie analizuje dynamikę hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych (HSPCs) na różnych etapach rozwoju człowieka, wykorzystując wstrzykiwanie wewnątrzudowe u myszy z niedoborem odporności w celu zwiększenia efektywności engraftingu komórek. Poprzez umieszczenie HSPCs bezpośrednio w szpiku kostnym, badanie ma na celu pogłębienie wiedzy na temat prawidłowego rozwoju komórek krwi oraz wpływu wieku i chorób na ten proces.
Kluczowe elementy badania
Obszar badawczy
- Biologia komórek macierzystych
- Hematopoeza człowieka
- Modelowanie chorób
Wprowadzenie
- Zdrową hematopoezę u ludzi bada się od etapów płodowych aż po wiek podeszły.
- Zrozumienie kontekstu zdrowego organizmu pomaga w rozszyfrowywaniu mechanizmów chorobowych.
- Eksperymenty z transplantacją dostarczają funkcjonalnych informacji na temat zachowania komórek macierzystych.
Zastosowane metody
- Wewnątrzudowa iniekcja ludzkich HSPC
- Model myszy z niedoborem odporności
- Techniki hodowli i przygotowania komórek
Główne wyniki
- Bezpośrednie wstrzyknięcie prowadzi do wyższego stopnia wszczepienia komórek macierzystych.
- Zapewnia ilościową perspektywę na proces starzenia i funkcje komórek macierzystych.
- Podkreśla wpływ czynników zewnętrznych, takich jak stan zapalny, na komórki macierzyste.
Wnioski
- Badanie demonstruje skuteczne metody zaprawiania HSPC.
- Zapewnia wgląd w ewolucję komórek macierzystych krwi oraz predyspozycje do chorób.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Bezpośrednie wstrzykiwanie ludzkich hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych (HSPCs) do jam ciała kości udowych myszy z niedoborem odporności umożliwia precyzyjną walidację funkcjonalną populacji komórek macierzystych w odpowiednim dla danej choroby kontekście in vivo. Podejście to zwiększa wydajność engraftmentu, wspierając rzetelną ilościową ocenę ludzkiej hematopoezy na różnych etapach rozwoju i starzenia się. Metoda ta zwiększa pewność prognostyczną w procesach wczesnego odkrywania i badaniach translacyjnych poprzez redukcję zmienności biologicznej oraz zwiększenie mocy statystycznej.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia rygorystyczną analizę funkcjonalną populacji ludzkich HSPC in vivo.
- Wspiera mechanistyczne ograniczanie ryzyka poprzez eliminację zmienności procesu homingu obserwowanej w modelach dożylnych.
- Ułatwia ilościową ocenę ewolucji komórek macierzystych oraz ich odpowiedzi na stresory biologiczne.
- Zwiększa pewność prognostyczną w procesie walidacji celów w badaniach nad hematopoezą.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Zapewnia zwalidowany system in vivo do oceny przyjmowania się komórek macierzystych oraz ich różnicowania w poszczególne linie komórkowe.
- Zwiększa powtarzalność testu poprzez standaryzację dostarczania komórek bezpośrednio do niszy szpiku kostnego.
- Umożliwia ilościowe pomiary składu wieloliniowego przeszczepu z wykorzystaniem cytometrii przepływowej.
- Wspiera skalowalne procedury ksenotransplantacji w badaniach przesiewowych związków chemicznych lub genetycznych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodne z modelowaniem hematopoezy ludzkiej i dysfunkcji związanych z wiekiem w kontekście chorobowym.
- Umożliwia przejście od wyników na etapie odkryć do przedklinicznej walidacji hipotez terapeutycznych.
- Wspiera decyzje o dalszym rozwoju projektu w oparciu o analizę ryzyka, dostarczając rzetelnych funkcjonalnych danych in vivo.
- Ułatwia opracowywanie biomarkerów translacyjnych dzięki ilościowym wskaźnikom engraftmentu.
Integracja potoku i przepływu pracy
Niniejszy protokół wstrzykiwania wewnątrzudowego znajduje się na styku wczesnych etapów odkrywania, walidacji celów oraz modelowania przedklinicznego w ramach kontinuum badań nad hematopoezą.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących funkcji komórek macierzystych, starzenia się i predyspozycji do chorób w kontrolowanym środowisku in vivo.
- Przesiewanie: Dostarcza powtarzalnych, ilościowych danych dotyczących engraftmentu, odpowiednich do dalszych przesiewów związków chemicznych lub genetycznych.
- Analityka: Umożliwia pomiar wieloliniowej rekonstytucji oraz wielkości przeszczepu z wykorzystaniem cytometrii przepływowej w celu przeprowadzenia analizy porównawczej.
- Badania translacyjne: Stanowi platformę do modelowania ludzkiej hematopoezy oraz oceny translacyjnych biomarkerów stanu komórek macierzystych.
- Zastosowania w przedsiębiorstwach: Oferuje ustandaryzowany, skalowalny protokół, który można dostosować do różnych projektów doświadczalnych i źródeł komórek od dawców.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad komórkami macierzystymi.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację, powtarzalność i skalowalność testów wszczepienia in vivo.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie bardziej świadomych decyzji typu go/no-go i zwiększa efektywność kapitałową poprzez ograniczenie liczby wykorzystywanych zwierząt.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój celów hematopoetycznych i strategii terapeutycznych.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w chirurgii małych zwierząt oraz technikach transplantacji in vivo.
- Wymaga dostępu do immunokompromitowanych modeli mysich oraz infrastruktury do cytometrii przepływowej.
- Konieczna jest standaryzacja protokołów przygotowania komórek i iniekcji pomiędzy zespołami.
- Metoda jest dostosowana zarówno do komórek dawcy ludzkiego, jak i mysiego, w zależności od potrzeb eksperymentalnych.
- Potencjalne ograniczenia obejmują zmienność techniczną oraz konieczność posiadania precyzyjnych umiejętności chirurgicznych.
