Bezproblemowe podejście do klonowania konstrukcji wektora ekspresji wirusa zespołu rozrodczo-oddechowego świń
17 maja 2024
Tutaj prezentujemy protokół do uzyskania wektora wyrażenia pVAX1-PRRSV poprzez wprowadzenie odpowiednich miejsc restrykcyjnych na końcu 3' wstawek. Możemy linearyzować wektor i łączyć fragmenty DNA z wektorem jeden po drugim za pomocą technologii rekombinacji homologicznej.
Protokół ten demonstruje budowę długiego i skomplikowanego wektora ekspresji genów. W przypadku gdy pełnowymiarowego fragmentu nie można uzyskać metodą pojedynczego PCR z cDNA lub nie można uzyskać pełnowymiarowego wektora ekspresji genu w drodze wielokrotnej rekombinacji homologicznej in vitro, stosuje się tę metodę. Obecnie klonowanie z wieloma wstawkami stosuje się w celu uzyskania pełnowymiarowego fragmentu DNA do sklonowania do odpowiedniego wektora.
Metoda ta może osiągnąć delecję lub mutację docelowych genów i skutecznie połączyć dużą liczbę fragmentów DNA z wektorem ekspresyjnym. Aby rozpocząć, otwórz oprogramowanie i wybierz opcję utworzenia nowego pliku DNA. Przygotuj sekwencję genu PRRSV z NCBI i kliknij przycisk OK, aby wygenerować pliki sekwencji.
Przeanalizuj sekwencję i zaznacz połączenia fragmentów. Zidentyfikuj wszystkie skrzyżowania przed zaprojektowaniem konkretnych starterów sekwencji dla fragmentów. Następnie kliknij Podkłady i wybierz Dodaj podkład.
Wklej określoną sekwencję i dodaj nakładające się sekwencje wektora do pierwszych pięciu pierwszych nukleotydów startera. Nazwij podkład do przodu i kliknij Dodaj podkład do szablonu, aby włączyć zaprojektowany podkład do szablonu. Następnie zaznacz połączenia fragmentów i zaprojektuj starter fragmentów o odwrotnej sekwencji specyficznej.
Ponownie przejdź do Podkłady i wybierz Dodaj podkład. Wprowadź określoną sekwencję. Dodaj miejsce restrykcyjne do pierwszych pięciu pierwszych nukleotydów.
Uwzględnij również od 20 do 40 par zasad sekwencji zwisu wektora do pierwszych pięciu głównych nukleotydów miejsca restrykcji. Nazwij odwrotny podkład i wybierz pozycję Dodaj podkład do szablonu. Następnie ustaw sześć indywidualnych reakcji PCR przy użyciu sześciu fragmentów i zaprojektowanych par starterów.
Uruchom PCR zgodnie z trzyetapowym protokołem, jak pokazano tutaj. Po zakończeniu PCR odpipetować 1 mikrolitr 6x buforu ładującego DNA z 5 mikrolitrami produktu PCR. Wymieszaj i krótko odwiruj.
Analizować próbki za pomocą elektroforezy w 1% żelu agarozowym. Aby skonstruować gen o pełnej długości, fragmenty insercji PRRSV amplifikowano za pomocą sześciu reakcji PCR. Rozmiary fragmentów potwierdzono za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym.
Zacznij od linearyzacji wektora. Przygotować mieszaninę reakcyjną zawierającą specyficzne enzymy restrykcyjne w temperaturze pokojowej. Użyj zestawu do ekstrakcji żelu, aby oczyścić zlinearyzowane wektory, a następnie inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 60 minut.
Następnie złóż reakcję bezszwowego klonowania i składania ExonArt w celu subklonowania genu PRRSV. Dostosuj całkowitą objętość reakcji do 10 mikrolitrów za pomocą wysterylizowanej wody dejonizowanej. Następnie dokładnie wymieszaj.
Inkubować mieszaninę w termocyklerze przez 15 do 60 minut w temperaturze 50 stopni Celsjusza. Następnie należy przechowywać próbki na lodzie. Po przekształceniu wektora w kompetentne komórki, wybierz 8 kolonii do 20 mikrolitrów pożywki LB zawierającej kanamycynę.
Skonfiguruj reakcję PCR kolonii, aby przeanalizować transformanty. Pełnowymiarowy PRRSV nad wektorem ekspresji uzyskano poprzez wprowadzenie fragmentu PRRSV 1 do wektora pVAX1, tworząc pVAX1-F1. Kolejne rundy rekombinacji z użyciem specyficznych enzymów restrykcyjnych skutkowały włączeniem fragmentów od 2 do 5, co uwidoczniło się wzrostem rozmiaru plazmidu.
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje konstrukcję złożonego wektora ekspresyjnego dla genu PRRSV. Ma on zastosowanie w sytuacjach, gdy pełnowymiarowe fragmenty genów nie mogą zostać pozyskane za pomocą pojedynczej reakcji PCR lub homologicznej rekombinacji in vitro, co umożliwia efektywne wbudowanie wielu fragmentów DNA do odpowiedniego wektora.
Kluczowe elementy badania
Obszar badań
- Biologia molekularna
- Inżynieria genetyczna
- Techniki klonowania
Wstęp
- Trudności w uzyskiwaniu pełnowymiarowych wektorów ekspresyjnych genów z cDNA
- Znaczenie rekombinacji homologicznej w przypadku złożonych konstruktów
- Potencjalne zastosowania w walidacji funkcji genów oraz opracowywaniu terapii
Zastosowane metody
- Technologia rekombinacji homologicznej
- System wektorowy pVAX1
- Amplifikacja PCR i elektroforeza w żelu agarozowym
Główne wyniki
- Pomyślna konstrukcja wektora ekspresyjnego pVAX1-PRRSV
- Efektywne włączenie wielu fragmentów DNA
- Weryfikacja wielkości fragmentów za pomocą elektroforezy żelowej
Wnioski
- Badanie dostarcza wiarygodnej metody klonowania dużych i złożonych wektorów ekspresyjnych genów.
- Podejście to może usprawnić badania w dziedzinie biologii molekularnej, szczególnie w kontekście badań nad genetyką wirusów.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Efektywne konstruowanie dużych wektorów ekspresyjnych genów wirusowych jest kluczowym elementem umożliwiającym wczesną walidację celów oraz badania mechanistyczne w badaniach i rozwoju szczepionek oraz leków przeciwwirusowych. To podejście do bezszwowej klonowania pozwala pokonać bariery techniczne w składaniu pełnowymiarowych genomów PRRSV, wspierając solidną weryfikację hipotez oraz funkcjonalną analizę genów wirusowych. Metoda ta zwiększa pewność prognostyczną w kluczowych punktach procesu odkrywania leków, umożliwiając precyzyjną manipulację genetyczną i skalowalny montaż wektorów.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Ułatwia systematyczne usuwanie lub mutowanie genów wirusowych w celu walidacji funkcjonalnej.
- Umożliwia etapowe składanie złożonych genomów wirusowych, wspierając mechanistyczną redukcję ryzyka.
- Zwiększa pewność predykcyjną w wyborze celu poprzez umożliwienie modularnej konstrukcji wektorów.
Przesiew i opracowywanie testu
- Przygotowuje zwalidowane konstrukty ekspresyjne do późniejszych analiz fenotypowych lub funkcjonalnych.
- Umożliwia powtarzalny montaż wektorów wielofragmentowych, co zwiększa standaryzację analiz.
- Umożliwia skalowalną produkcję wektorów ekspresyjnych dla platform przesiewowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia generowanie istotnych dla danej choroby konstruktów wirusowych do opracowywania modeli przedklinicznych.
- Zapewnia ciągłość procesu od klonowania molekularnego po walidację funkcji genów wirusowych in vivo.
- Zmniejsza ryzyko w badaniach translacyjnych dzięki umożliwieniu precyzyjnej manipulacji genetycznej.
Integracja rurociągów i przepływów pracy
Ten przepływ pracy bezszwowego klonowania integruje się z wczesnymi etapami odkrywania i identyfikacji związków wiodących, łącząc klonowanie molekularne z przesiewaniem funkcjonalnym i walidacją przedkliniczną.
- Biologia odkrywcza: Wspiera manipulacje genomami wirusowymi w oparciu o postawione hipotezy w celu wyjaśnienia szlaków sygnałowych.
- Przesiewanie: Umożliwia otrzymywanie powtarzalnych konstruktów wielofragmentowych do stabilnego opracowywania testów.
- Analityka: Zapewnia ilościową weryfikację składania fragmentów za pomocą elektroforezy żelowej i PCR kolonii.
- Badania translacyjne: Umożliwia konstrukcję pełnowymiarowych wektorów wirusowych do dopasowania do modeli chorób.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje modularną, adaptacyjną strategię klonowania dla różnorodnych celów wirusowych i niewirusowych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną i redukuje niejednoznaczność w badaniach nad funkcją genów wirusowych.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje klonowanie wielofragmentowe, poprawiając powtarzalność i skalowalność.
- Wartość strategiczna: Przyspiesza decyzje o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez umożliwienie szybkiego składania i walidacji wektorów.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację celów wirusowych i konstruktów do dalszego rozwoju w oparciu o analizę ryzyka.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna w zakresie projektowania starterów, optymalizacji PCR oraz technik rekombinacji homologicznej.
- Niezbędny jest dostęp do termocyklerów, elektroforezy żelowej oraz infrastruktury do transformacji komórek kompetentnych.
- Wymagana jest standaryzacja protokołów klonowania i weryfikacji pomiędzy zespołami.
- Metoda jest dostosowalna do różnych systemów wirusowych i niewirusowych przy odpowiednim doborze starterów i wektorów.
- Rozmiar fragmentu i złożoność sekwencji mogą ograniczać wydajność i wymagać rozwiązywania problemów.
