Name: Bezproblemowe podejście do klonowania konstrukcji wektora ekspresji wirusa zespołu rozrodczo-oddechowego świń (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-17T14:15:00.000+00:00
Duration: 4 min 18 s
Description: Naucz się klonowania wektorów ekspresji genu PRRSV metodą homologicznej rekombinacji z wieloma fragmentami DNA. Ta technika umożliwia budowę złożonych konstrukcji wektorowych pVAX1 do badań nad wirusem.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez wsparcie finansowe funduszy na inicjację badań doktoranckich dostarczonych przez China West Normal University (nr 20E059).

1. Przygotowanie matrycy genu PRRSV
<ol>
	<li>Rozmrozić zapas wirusa w 1 ml odczynnika do ekstrakcji RNA (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Dodaj 0,2 ml chloroformu i dokładnie wymieszaj. Inkubować przez 3 minuty.</li>
	<li>Odwirowywać mieszaninę przez 15 minut w temperaturze 12 000 × g w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: Mieszaninę dzieli się na trzy fazy, a mianowicie bezbarwną fazę wodną, fazę interfazową i czerwoną fazę fenolowo-chloroformową.</li>
	<li>Odpipetować bezbarwną wodną fazę i przenieść ją do nowej probówki.</li>
	<li>Dokładnie wymieszać fazę wodną z 0,5 ml izopropanolu i inkubować przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Wirować przez 10 minut w temperaturze 12 000 × g w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: Na dnie probówki znajduje się biały osad RNA.</li>
	<li>Za pomocą mikropipety usunąć supernatant z probówki.</li>
	<li>Dodaj 1 ml 75% etanolu, aby ponownie zawiesić osad i krótko zwirować.</li>
	<li>Wirować przez 5 minut w temperaturze 7 500 × g w temperaturze 4 °C. Za pomocą mikropipety usunąć supernatant z probówki.</li>
	<li>Suszyć RNA przez 5 minut, dodać 20-50 μl wody wolnej od RNaz w celu ponownego zawieszenia RNA i dokładnie wymieszać.</li>
	<li>Przejdź do wykonywania odwrotnej transkrypcji; ustaw reakcje tak, aby przeprowadzić odwrotną transkrypcję, jak pokazano w Tabeli 1. 
	UWAGA: Aby zapewnić pomyślną odwrotną transkrypcję, należy używać wysokiej jakości matryc RNA.</li>
	<li>Otrzymany cDNA należy wykorzystać do PCR lub przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
</ol>
2. Projekt startera PCR
<ol>
	<li>Projektowanie podkładu do przodu
	<ol>
		<li>Otwórz oprogramowanie i wybierz Nowy plik DNA.</li>
		<li>Wklej sekwencję genu PRRSV (GenBank: FJ548852.1) z NCBI do oprogramowania. Kliknij przycisk OK, aby wygenerować pliki sekwencji.</li>
		<li>Przeanalizuj sekwencję i zaznacz połączenia fragmentów. Zaprojektuj starter fragmentów do sekwencji specyficznej dla przodu. W większości przypadków preferowana temperatura topnienia (Tm) wynosi od 55 °C do 62 °C, a zawartość GC wynosi 40-60%.</li>
		<li>Kliknij Podkłady i wybierz Dodaj podkład.</li>
		<li>Wklej określoną sekwencję i dodaj nakładające się sekwencje wektora do pierwszego nukleotydu 5' startera określonej sekwencji. W pobliżu każdego skrzyżowania wybierz 20–40 pz, które mają służyć jako obszar nakładania się między dwoma sąsiednimi fragmentami.</li>
		<li>Nazwij przednią zasuwę zawierającą zwisy i określoną sekwencję (patrz rysunek uzupełniający S1).</li>
		<li>Kliknij Dodaj podkład do szablonu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Projektowanie podkładu odwrotnego
	<ol>
		<li>Przeanalizuj sekwencję i zaznacz skrzyżowania fragmentów w oprogramowaniu. Zaprojektuj starter fragmentów o odwrotnej sekwencji specyficznej.</li>
		<li>Kliknij Podkłady i wybierz Dodaj podkład.</li>
		<li>Wklej określoną sekwencję i dodaj miejsce restrykcji do pierwszego nukleotydu 5' startera określonej sekwencji. 
		UWAGA: Dodane miejsca ograniczeń muszą być nieobecne we fragmencie wstawiania i wektorze, z wyjątkiem wielu miejsc klonowania.</li>
		<li>Dodaj sekwencje zwisów wektorów o długości 20-40 pz do pierwszego nukleotydu 5' miejsca restrykcyjnego.</li>
		<li>Nazwij odwrócony podkład zawierający zwisy i określoną sekwencję (patrz rysunek uzupełniający S1).</li>
		<li>Kliknij Dodaj podkład do szablonu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. PCR do amplifikacji fragmentów
<ol>
	<li>Przygotuj sześć indywidualnych reakcji PCR (Tabela 2): dla fragmentu 1 użyj starterów P1 i P2 (patrz rysunek uzupełniający S2); dla fragmentu 2 użyj starterów P3 i P4 (patrz rysunek uzupełniający S2); dla fragmentu 3 użyj starterów P5 i P6 (patrz rysunek uzupełniający S2); dla fragmentu 4 użyj starterów P7 i P8 (patrz rysunek uzupełniający S2); dla fragmentu 5 użyj starterów P9 i P10; i użyć starterów P11 i P12 do amplifikacji fragmentu 6 (patrz rysunek uzupełniający S2). 
	UWAGA: Rozmrozić, wymieszać i krótko odwirować każdy składnik przed użyciem.</li>
	<li>Uruchom PCR, korzystając z trzyetapowego protokołu przedstawionego w Tabeli 2.</li>
	<li>Dodać 1 μl 6x buforu ładującego DNA do 5 μl produktu PCR, wymieszać i krótko odwirować zawartość.</li>
	<li>Analizować próbki za pomocą elektroforezy w 1% żelu agarozowym.</li>
</ol>
4. Oczyszczanie fragmentów PCR
UWAGA: Oczyszczanie produktów PCR z żelu za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu (patrz Tabela Materiałów) jest ważne dla budowy wektorów.
<ol>
	<li>Dodać 9 μl 6x buforu ładującego DNA do 45 μl produktów PCR, wymieszać i krótko odwirować zawartość.</li>
	<li>Wykonaj 1% elektroforezę w żelu agarozowym/goldview, aby oddzielić fragmenty DNA. 
	UWAGA: Nie używaj ponownie buforu TAE, ponieważ jego wartość pH wpłynie na odzyskiwanie fragmentów DNA.</li>
	<li>Po odpowiednim oddzieleniu prążków użyj ostrego skalpela, aby ostrożnie wyciąć prążki DNA. 
	UWAGA: Zminimalizuj rozmiar plastra żelu, odcinając nadmiar agarozy.</li>
	<li>Zważyć plasterek żelu w czystej probówce do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml, dodać równą objętość buforu wiążącego do wycinka żelu (np. 0,3 ml na plasterek 0,3 g) i inkubować w temperaturze 60 °C przez 7 minut.</li>
	<li>Włożyć mini kolumnę do probówki zbiorczej o pojemności 2 ml. Dodać 700 μl roztworu DNA/agarozy z kroku 4.4 do mini kolumny.</li>
	<li>Wirować przy 10 000 × g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej. Wyrzucić filtrat i ponownie użyć probówki zbiorczej.</li>
	<li>Dodać 300 μl buforu wiążącego i odwirować w stężeniu 13 000 × g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej. Wyrzucić filtrat i ponownie użyć probówki zbiorczej.</li>
	<li>Dodać 700 μl buforu do płukania i odwirować w stężeniu 13 000 × g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej. Wyrzucić filtrat i ponownie użyć probówki zbiorczej.</li>
	<li>Wiruj pustą mini kolumnę przez 2 minuty z maksymalną prędkością, aby wysuszyć matrycę kolumny. Umieść mini kolumnę w czystej probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Dodać 20 μl wody dejonizowanej bezpośrednio do środka membrany kolumny i pozostawić w temperaturze pokojowej na 2 minuty. Wirować z prędkością 13 000 × g przez 1 min.</li>
	<li>Przechowywać DNA w temperaturze -20 °C.</li>
</ol>
5. Przygotowanie wektora zlinearyzowanego
UWAGA: Po przygotowaniu plazmidu, wybrane enzymy mogą być użyte do jego cięcia. Długie trawienie lub trawienie podwójne enzymatyczne ma kluczowe znaczenie dla zapewnienia trawienia całego DNA. Zmniejszy to liczbę fałszywie dodatnich klonów w kolejnych eksperymentach.
<ol>
	<li>Linearyzacja pVAX1
	<ol>
		<li>Przygotować mieszaninę reakcyjną w temperaturze pokojowej we wskazanej kolejności (tabela 3). 
		UWAGA: Należy dodać objętość wody, aby zachować wskazaną całkowitą objętość reakcji. Tutaj 1 μg plazmidu trawiono enzymami w mieszaninie reakcyjnej. W zależności od stężenia plazmidu, objętość plazmidu można regulować w mieszaninie reakcyjnej.</li>
		<li>Delikatnie wymieszaj, a następnie odwiruj. Inkubować w temperaturze 37 °C w bloku grzewczym lub termostacie wodnym przez 60 minut.</li>
		<li>Przeprowadzić oczyszczanie żelu podobne do oczyszczania fragmentów PCR w sekcji 4 za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu (patrz Tabela materiałów).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>pVAX1-F1 linearyzacja 
	UWAGA: pVAX1-F1 jest wektorem otrzymanym z pierwszej rundy rekombinacji pVAX1 (NdeI i HindIII) i fragmentu 1. pVAX1-F2 jest wektorem otrzymanym z rundy rekombinacji pVAX1-F1 (NdeI) i fragmentu 2. pVAX1-F3 jest wektorem otrzymanym z rundy rekombinacji pVAX1-F2 (NdeI) i fragmentu 3. pVAX1-F4 jest wektorem otrzymanym z rundy rekombinacji pVAX1-F3 (NdeI) i fragmentu 4. pVAX1-F5 jest wektorem otrzymanym z rundy rekombinacji pVAX1-F4 (EcoRV i NtoI) i fragmentu 5.
	<ol>
		<li>Dla każdego wektora mieszaninę reakcyjną należy przygotować oddzielnie w temperaturze pokojowej we wskazanej kolejności (tabela 3).</li>
		<li>Delikatnie wymieszaj, a następnie odwiruj. Inkubować w temperaturze 37 °C w bloku grzewczym lub termostacie wodnym przez 60 minut.</li>
		<li>Przeprowadzić oczyszczanie żelu podobne do oczyszczania fragmentów PCR w sekcji 4 za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu (patrz Tabela materiałów).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Subklonowanie do nowego wektora
UWAGA: Dobrą efektywność klonowania można osiągnąć przy użyciu 50-200 ng wektora i wstawień.
<ol>
	<li>Skonfiguruj płynną reakcję klonowania i montażu ExonArt (Tabela 4). Dostosować całkowitą objętość reakcji do 10 μl za pomocą wysterylizowanego dejonizowanegoH2Oi wymieszać.</li>
	<li>Inkubować reakcję w termocyklerze przez 15-60 minut w temperaturze 50 °C. Próbki przechowywać na lodzie. 
	UWAGA: Wydłużenie inkubacji do 60 minut może zwiększyć wydajność montażu.</li>
	<li>Rozmrozić chemicznie kompetentne komórki DH5α na lodzie.</li>
	<li>Dodać 10 μl produktu do montażu do odpowiednich komórek, a następnie delikatnie wymieszać, pipetując w górę i w dół.</li>
	<li>Umieść mieszaninę na lodzie na 30 minut.</li>
	<li>Szok termiczny w temperaturze 45 °C przez 45 s i przenieść probówki na lód na 3 minuty.</li>
	<li>Dodać 900 μl pożywki SOC do probówki.</li>
	<li>Wytrząsać probówkę z prędkością 225 obr./min przez 1 godzinę w inkubatorze z wytrząsaniem o temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Odwirować reakcję przemiany przy 6 000 × g przez 2 minuty. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 100 μl świeżej pożywki SOC.</li>
	<li>Rozprowadzić zawiesinę przekształconych komórek na osobnej płytce LB z 50 μg/ml kanamycyny.</li>
	<li>Inkubować wszystkie płytki przez noc w temperaturze 37 °C. Wybrać pojedyncze izolowane kolonie z każdej płytki doświadczalnej.</li>
</ol>
7. Analiza transformantów
<ol>
	<li>Wybierz osiem kolonii do 20 μl pożywki LB zawierającej 50 μg/ml kanamycyny.</li>
	<li>Skonfiguruj reakcję PCR kolonii i uruchom PCR (Tabela 5). 
	UWAGA: W reakcji PCR kolonii dla fragmentu 1 należy użyć starterów P1 i P2 (patrz plik uzupełniający 1); dla fragmentu 2 należy użyć starterów P3 i P4 (patrz plik uzupełniający 1); dla fragmentu 3 należy użyć starterów P5 i P6 (patrz plik uzupełniający 1); dla fragmentu 4 należy użyć starterów P7 i P8 (patrz rysunek uzupełniający S2); dla fragmentu 5 użyj starterów P9 i P10; i użyć starterów P11 i P12 do wykrycia fragmentu 6 (patrz rysunek uzupełniający S2).</li>
	<li>Dodać 1 μl 6x buforu ładującego DNA do 5 μl produktu PCR, wymieszać i krótko odwirować zawartość.</li>
	<li>Przeanalizuj wyniki za pomocą 1% elektroforezy w żelu agarozowym.</li>
	<li>Wybrać jedną dodatnią kolonię do 5 ml pożywki LB zawierającej 50 μg/ml kanamycyny i hodować przez noc w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Uzyskaj plazmid za pomocą mini zestawu plazmidowego DNA (patrz tabela materiałów) zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Wizualizacja wyników za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym 1%.</li>
</ol>

Cloning the Full-Length PRRSV Gene in the pVAX1 Expression Vector

<ol><li>Lessard, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning.</a> Methods Enzymol. 529, 85-98 (2013).</li>
<li>Shetty, R. P., Endy, D., Knight, T. F. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+BioBrick+vectors+from+BioBrick+parts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Eng%22%5BJournal%5D)">Engineering BioBrick vectors from BioBrick parts.</a> J. Biol. Eng. 2, 5(2008).</li>
<li>Horton, R. M., Cai, Z. L., Ho, S. N., Pease, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+splicing+by+overlap+extension%3A+tailor-made+genes+using+the+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Gene splicing by overlap extension: tailor-made genes using the polymerase chain reaction.</a> Biotechniques. 54 (3), 129-133 (2013).</li>
<li>Horton, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCR-mediated+recombination+and+mutagenesis.+SOEing+together+tailor-made+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">PCR-mediated recombination and mutagenesis. SOEing together tailor-made genes.</a> Mol Biotechnol. 3 (2), 93-99 (1995).</li>
<li>Bang, D., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+synthesis+by+circular+assembly+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Gene synthesis by circular assembly amplification.</a> Nat. Methods. 5 (1), 37-39 (2008).</li>
<li>Geu-Flores, F., Nour-Eldin, H. H., Nielsen, M. T., Halkier, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((USER+fusion%3A+a+rapid+and+efficient+method+for+simultaneous+fusion+and+cloning+of+multiple+PCR+products%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">USER fusion: a rapid and efficient method for simultaneous fusion and cloning of multiple PCR products.</a> Nucleic Acids Res. 35 (7), e55(2007).</li>
<li>Gibson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+assembly+of+overlapping+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments.</a> Methods Enzymol. 498, 349-361 (2011).</li>
<li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li>
<li>Cho, J. G., Dee, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porcine+reproductive+and+respiratory+syndrome+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Porcine reproductive and respiratory syndrome virus.</a> Theriogenology. 66 (3), 655-662 (2006).</li>
<li>Holtkamp, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+the+economic+impact+of+porcine+reproductive+and+respiratory+syndrome+virus+on+United+States+pork+producers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Swine+Health+Prod%22%5BJournal%5D)">Assessment of the economic impact of porcine reproductive and respiratory syndrome virus on United States pork producers.</a> J. Swine Health Prod. 21, 72-84 (2013).</li>
<li>Thomann, B., Rushton, J., Schuepbach-Regula, G., Nathues, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+economic+effects+of+vaccination+against+porcine+reproductive+and+respiratory+syndrome%3A+Impact+of+vaccination+effectiveness%2C+vaccine+price%2C+and+vaccination+coverage%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Vet+Sci%22%5BJournal%5D)">Modeling economic effects of vaccination against porcine reproductive and respiratory syndrome: Impact of vaccination effectiveness, vaccine price, and vaccination coverage.</a> Front Vet Sci. 7, 500(2020).</li>
<li>Dwivedi, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+immune+responses+to+porcine+reproductive+and+respiratory+syndrome+virus+in+pigs+during+early+stage+of+infection+under+farm+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Virol+J%22%5BJournal%5D)">Evaluation of immune responses to porcine reproductive and respiratory syndrome virus in pigs during early stage of infection under farm conditions.</a> Virol J. 9, 45(2012).</li>
<li>Mengeling, W. L., Lager, K. M., Vorwald, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+consequences+of+exposing+pregnant+gilts+to+strains+of+porcine+reproductive+and+respiratory+syndrome+%28PRRS%29+virus+isolated+from+field+cases+of+%26%2334%3Batypical%26%2334+PRRS%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Vet.+Res%22%5BJournal%5D)">Clinical consequences of exposing pregnant gilts to strains of porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus isolated from field cases of &#34;atypical&#34 PRRS.</a> Am. J. Vet. Res. 59 (12), 1540-1544 (1998).</li>
<li>Dee, S. A., Joo, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevention+of+the+spread+of+porcine+reproductive+and+respiratory+syndrome+virus+in+endemically+infected+pig+herds+by+nursery+depopulation%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Rec%22%5BJournal%5D)">Prevention of the spread of porcine reproductive and respiratory syndrome virus in endemically infected pig herds by nursery depopulation.</a> Vet Rec. 135 (1), 6-9 (1994).</li>
<li>Dee, S. A., Joo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+to+control+PRRS%3A+a+summary+of+field+and+research+experiences%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Strategies to control PRRS: a summary of field and research experiences.</a> Vet Microbiol. 55 (1-4), 347-343 (1997).</li>
<li>Renukaradhya, G. J., Meng, X. J., Calvert, J. G., Roof, M., Lager, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+porcine+reproductive+and+respiratory+syndrome+virus+vaccines%3A+Current+status+and+future+direction%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Live porcine reproductive and respiratory syndrome virus vaccines: Current status and future direction.</a> Vaccine. 33 (33), 4069-4080 (2015).</li>
<li>Conzelmann, K. K., Visser, N., Woensel, P. V., Thiel, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+porcine+reproductive+and+respiratory+syndrome+virus%2C+a+member+of+the+arterivirus+group%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of porcine reproductive and respiratory syndrome virus, a member of the arterivirus group.</a> Virology. 193 (1), 329-339 (1993).</li>
<li>Han, M. Y., Yoo, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+the+PRRS+virus+genome%3A+Updates+and+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Engineering the PRRS virus genome: Updates and perspectives.</a> Vet Microbiol. 174 (3), 279-295 (2014).</li>
<li>Bryksin, A. V., Matsumura, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overlap+extension+PCR+cloning%3A+a+simple+and+reliable+way+to+create+recombinant+plasmids%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Overlap extension PCR cloning: a simple and reliable way to create recombinant plasmids.</a> Biotechniques. 48 (6), 463-465 (2010).</li>
<li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restriction-based+multiple-fragment+assembly+strategy+to+avoid+random+mutation+during+long+cDNA+cloning%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Restriction-based multiple-fragment assembly strategy to avoid random mutation during long cDNA cloning.</a> J Cancer. 6 (7), 632-635 (2015).</li>
<li>Zhang, Z. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+economic+impact+of+porcine+reproductive+and+respiratory+syndrome+outbreak+in+four+Chinese+farms%3A+Based+on+cost+and+revenue+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Vet+Sci%22%5BJournal%5D)">The economic impact of porcine reproductive and respiratory syndrome outbreak in four Chinese farms: Based on cost and revenue analysis.</a> Front Vet Sci. 9, 1024720(2022).</li>
<li>Chen, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+genetic+diversity+of+Chinese+porcine+reproductive+and+respiratory+syndrome+viruses+from+2016+to+2019%5BTitle%5D)+AND+%22Res+Vet+Sci%22%5BJournal%5D)">High genetic diversity of Chinese porcine reproductive and respiratory syndrome viruses from 2016 to 2019.</a> Res Vet Sci. 131, 38-42 (2020).</li>
<li>Wang, X. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salidroside%2C+a+phenyl+ethanol+glycoside+from+Rhodiola+crenulata%2C+orchestrates+hypoxic+mitochondrial+dynamics+homeostasis+by+stimulating+Sirt1%2Fp53%2FDrp1+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Ethnopharmacol%22%5BJournal%5D)">Salidroside, a phenyl ethanol glycoside from Rhodiola crenulata, orchestrates hypoxic mitochondrial dynamics homeostasis by stimulating Sirt1/p53/Drp1 signaling.</a> J Ethnopharmacol. 293, 115278(2022).</li>
<li>Hou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salidroside+intensifies+mitochondrial+function+of+CoCl2-damaged+HT22+cells+by+stimulating+PI3K-AKT-MAPK+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Phytomedicine%22%5BJournal%5D)">Salidroside intensifies mitochondrial function of CoCl2-damaged HT22 cells by stimulating PI3K-AKT-MAPK signaling pathway.</a> Phytomedicine. 109, 154568(2023).</li>
<li>Zhang, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+an+infectious+clone+of+HuN4-F112%2C+an+attenuated+live+vaccine+strain+of+porcine+reproductive+and+respiratory+syndrome+virus+high+copy+plasmid%5BTitle%5D)+AND+%22Virol+J%22%5BJournal%5D)">Generation of an infectious clone of HuN4-F112, an attenuated live vaccine strain of porcine reproductive and respiratory syndrome virus high copy plasmid.</a> Virol J. 8, 410(2011).</li>
<li>Ni, Y. Y., Huang, Y. W., Cao, D. J., Opriessnig, T., Meng, X. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+a+DNA-launched+infectious+clone+for+a+highly+pneumovirulent+strain+of+type+2+porcine+reproductive+and+respiratory+syndrome+virus%3A+identification+and+in+vitro+and+in+vivo+characterization+of+a+large+spontaneous+deletion+in+the+nsp2+region%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Res%22%5BJournal%5D)">Establishment of a DNA-launched infectious clone for a highly pneumovirulent strain of type 2 porcine reproductive and respiratory syndrome virus: identification and in vitro and in vivo characterization of a large spontaneous deletion in the nsp2 region.</a> Virus Res. 160 (1-2), 264-273 (2011).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Technika składania Gibsona to metoda klonowania molekularnego oparta na rekombinacji in vitro w celu złożenia fragmentów DNA8. Metoda ta umożliwia składanie wielu fragmentów DNA w kolisty plazmid w reakcji izotermicznej z jedną rurką. Jednak jedną z przeszkód w technice montażu Gibsona jest pozyskiwanie długich fragmentów z cDNA. Długie fragmenty są trudne do dokładnego amplifikacji z wielu powodów. Na przykład startery są łatwiejsze do niedopasowania podczas długiego wydłużania się, cDNA może nie być dobrej jakości lub regiony bogate w GC przestaną polimeryzować DNA. Gdy fragmentu o pełnej długości nie można łatwo uzyskać z cDNA za pomocą PCR, fragment o pełnej długości należy podzielić na wiele fragmentów w celu amplifikacji. Jednak wraz ze wzrostem liczby i długości wstawionych fragmentów DNA, wydajność i dodatnie klony z testu rekombinacji homologicznej również znacznie się zmniejszą. W związku z tym spróbowaliśmy alternatywnego rozwiązania, wprowadzając odpowiednie miejsca ograniczeń na końcu wkładek 3'. Następnie możemy zlinearyzować wektor i łączyć fragmenty DNA z wektorem jeden po drugim za pomocą technologii rekombinacji homologicznej i eliminować niepożądane miejsca restrykcyjne poprzez reakcję rekombinacji homologicznej.
Jako jeden z najbardziej znaczących ekonomicznie patogenów na rynkach światowych, PRRSV zawsze przyciągał uwagę naukowców w ciągu ostatnich 30 lat 10,21,22. Jest to wirus o dodatniej nici RNA, o długości około 15 kb, a długiego fragmentu DNA nie można łatwo amplifikować z cDNA. W związku z tym, aby zbadać, czy ta metoda może być stosowana do klonowania długich fragmentów, zastosowaliśmy PRRSV jako szablon do klonowania genomu o pełnej długości. W tym badaniu podzieliliśmy sekwencję o pełnej długości na sześć fragmentów i dodaliśmy odpowiednie miejsca restrykcyjne do startera odwrotnego, uzyskując sześć fragmentów metodą PCR. Następnie udało nam się uzyskać pełnowymiarowy wektor ekspresyjny pVAX1-PRRSV za pomocą kilku rund reakcji rekombinacji. Ponadto skonstruowany wektor ekspresyjny PRRSV może służyć jako matryca do transkrypcji in vitro w celu uzyskania ograniczonych RNA do badań nad transfekcją lub szczepionką mRNA. Tymczasem skonstruowany plazmid wirusa mRNA może być wykorzystany do okresowych badań przesiewowych naturalnych związków przeciwwirusowych in vitro za pomocą technik interakcji molekularnych, takich jak powierzchniowy rezonans plazmonowy23,24. Plazmid pVAX1 spełnia wymagania, ponieważ test transkrypcji in vitro wymaga plazmidu o wysokiej kopii z promotorem T7. Poza tym plazmid pVAX1-PRRSV zawierający promotor CMV może być transfekowany do komórek BHK-21 w celu ekspresji genomu wirusa25,26.
Podsumowując, za pomocą tego protokołu pokazujemy, że długie geny o pełnej długości można podzielić na kilka fragmentów uzyskanych przez amplifikację PCR. Ważne jest, aby odwrotne startery zostały wprowadzone do odpowiednich miejsc restrykcyjnych, tak aby wektor ekspresji genów o pełnej długości można było uzyskać w kilku rundach reakcji rekombinacji. Metoda ta może być stosowana w przypadku genów o pełnej długości, których nie można uzyskać bezpośrednio za pomocą pojedynczego PCR, lub w przypadku genów o pełnej długości, których nie można uzyskać w drodze rekombinacji homologicznej wielu insercji. W związku z tym podejście to jest ważnym uzupełnieniem techniki montażu Gibsona, przewidujemy, że może być szeroko stosowana do klonowania długich fragmentów DNA i budowy genów fuzyjnych.

Jako podstawowa technika do konstruowania eksperymentalnych narzędzi do ekspresji w komórkach prokariotycznych i eukariotycznych, klonowanie molekularne jest bardzo ważnym składnikiem biologii eksperymentalnej. Klonowanie molekularne obejmuje cztery procesy: nabycie DNA insercji, ligację insercji do odpowiedniego wektora, transformację wektora rekombinowanego w Escherichia coli (E. coli) oraz identyfikację pozytywnych klonów1. Do tej pory przyjęto wiele metod łączenia cząsteczek DNA za pomocą enzymów restrykcyjnych2,3 i rekombinacji za pośrednictwem PCR4,5,6. Rekombinacja homologiczna, znana jako technologia klonowania bezszwowego, to grupa metod klonowania, która umożliwia niezależne od sekwencji i bezbliznowe wprowadzenie jednego lub więcej fragmentów DNA do wektora. Technologia ta obejmuje klonowanie niezależne od sekwencji i ligacji (SLIC), bezszwowy ekstrakt klonujący ligację (SLiCE), fuzję i montaż Gibsona. Wykorzystuje egzonukleazę do degradacji jednej nici insertu i wektora do generowania spójnych końców, a także naprawę in vivo lub rekombinację in vitro, aby kowalencyjnie połączyć insert z wektorem poprzez tworzenie wiązań fosfodiestrowych. Możliwość łączenia pojedynczej wstawki z wektorem w dowolnej sekwencji bez żadnych blizn jest bardzo atrakcyjna. Co więcej, technologia ma możliwość łączenia 5-10 fragmentów w ustalonej kolejności bez ograniczeń sekwencji.
Jako jedna z wielu technik rekombinacji DNA, technika montażu Gibsona, obecnie najskuteczniejsza metoda klonowania7,8, jest solidną i elegancką metodą opartą na egzonukleazie, która umożliwia bezproblemowe składanie jednego lub wielu zlinearyzowanych fragmentów DNA. Reakcja montażu Gibsona odbywa się w warunkach izotermicznych przy użyciu mieszaniny trzech enzymów, a mianowicie egzonukleazy 5', polimerazy o wysokiej wierności i termostabilnej ligazy DNA. Jednoniciowe zwisy 3' utworzone przez egzonukleazę 5'-3' przyczyniają się do wyżarzania fragmentów, które mają komplementarność na jednym końcu. Polimeraza o wysokiej wierności skutecznie wypełnia luki w wyżarzonych obszarach jednoniciowych poprzez dodanie dNTP, a termostabilna ligaza DNA uszczelnia nacięcia, tworząc wspólne cząsteczki DNA8. W związku z tym ta metoda techniczna jest szeroko stosowana do budowy wektorów ekspresji genów.
Zespół rozrodczo-oddechowy świń (PRRS) jest chorobą wirusową, która prowadzi do upośledzenia rozrodczego i niewydolności oddechowej u świń spowodowanych PRRSV w każdym wieku9. Zespół objawia się gorączką, jadłowstrętem, zapaleniem płuc, letargiem, depresją i niewydolnością oddechową. Ponadto w niektórych epidemiach obserwowano objawy kliniczne, w tym czerwono-niebieskie przebarwienia uszu. Jako członek rodziny arteriwirusów, PRRSV jest szeroko przenoszony do krajów produkujących wieprzowinę poprzez bezpośredni kontakt i wymianę płynów, w tym moczu, siary i śliny. Ze względu na rozprzestrzenianie się PRRSV w Stanach Zjednoczonych, całkowite straty ekonomiczne przemysłu wieprzowego oszacowano na około 664 miliony dolarów rocznie, w oparciu o skalę hodowli 5,8 miliona loch i 110 milionów świń10,11. Raport Inspekcji Zdrowia Zwierząt i Roślin pokazuje, że 49,8% nieszczepionych świń wykazuje obecność PRRSV w surowicy12, a niskie poziomy PRRSV u zakażonych świń są wydalane przez ślinę, wydzielinę z nosa, mocz i kał13. Zaimplementowano wiele strategii kontroli propagacji PRRSV14,15,16. Oprócz procedur eliminacyjnych mających na celu stworzenie populacji całkowicie ujemnych pod względem wirusa lub poprawy bezpieczeństwa biologicznego i zarządzania, podawanie szczepionek jest skutecznym sposobem kontrolowania PRRS.
PRRSV to otoczkowy, jednoniciowy wirus RNA o dodatnim znaczeniu o długości około 15 kilozasad (kb). Genom PRRSV składa się z co najmniej 10 otwartych ramek odczytu (ORF), krótkiego 5' nieulegającego translacji regionu (5' UTR) i ogona poli(A) na końcu 3' (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A)17. Genom wirusa RNA o ujemnej nici jest niezakaźny, podczas gdy genom wirusów RNA o dodatniej nicii jest zakaźny. Istnieją dwie główne strategie transfekcji RNA i DNA w celu generowania potomstwa wirusa18. Jednak klonowanie pełnowymiarowego fragmentu odpowiadającego genomowi RNA ma kluczowe znaczenie dla budowy zakaźnych klonów. Ze względu na długi i złożony charakter genomu PRRSV, pełnego genomu nie można łatwo uzyskać za pomocą PCR za jednym razem. Dodatkowo, chociaż sztuczna synteza genów PRRSV jest skutecznym rozwiązaniem, synteza długich fragmentów jest często kosztowna. Stąd, aby uzyskać wektor ekspresji o pełnej długości PRRSV, próbowaliśmy go utworzyć metodą wielokrotnej rekombinacji homologicznej z wieloma wstawianiami19,20. Niestety, nie udało nam się uzyskać pełnowymiarowego wektora ekspresji genów. Dlatego w tym badaniu dodaliśmy odpowiednie miejsca restrykcyjne do startera odwrotnego i z powodzeniem uzyskaliśmy wektor ekspresji pVAX1-PRRSV za pomocą kilku rund homologicznych reakcji rekombinacji. Co więcej, metoda ta może również osiągnąć delecję lub mutację genów docelowych i skutecznie połączyć dużą liczbę fragmentów DNA z wektorem ekspresyjnym.

<table><tbody><tr><td>1 kb plus drabinka DNA</td><td>Tiangen Biochemical Technology (Beijing) Co., Ltd</td><td>MD113-02</td><td></td></tr><tr><td>2x Uniwersalna zielona mieszanka mistrzowska PCR Rong</td><td>Wei Gene Biotechnology Co., Ltd</td><td>A303-1</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td><td>9012-36-6</td><td></td></tr><tr><td>Mikrowirówka stołowa</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp; Co., Ltd</td><td>FRESCO17</td><td></td></tr><tr><td>Clean Bench</td><td>Sujing Antai Air Technology&nbsp; Co., Ltd</td><td>VD-650-U</td><td></td></tr><tr><td>Sprzęt do elektroforezy DNA</td><td>Cleaver Scientific&nbsp; Co., Ltd</td><td>170905117</td><td></td></tr><tr><td>Bufor ładujący DNA (6x)</td><td>Biosharp Biotechnology Co., Ltd</td><td>BL532A</td><td></td></tr><tr><td>E. Z. N. A. Zestaw do ekstrakcji żelu</td><td>Omega Bio-Tek Co., Ltd</td><td>D2500-01</td><td></td></tr><tr><td>E.Z.N.A. Plasmid DNA Mini Kit I</td><td>Omega Bio-Tek Co., Ltd</td><td>D6943-01</td><td></td></tr><tr><td>Kultywator do elektroogrzewania stojącego</td><td>Shanghai Hengyi Scientific Instrument Co., Ltd</td><td>DHP-9082</td><td></td></tr><tr><td>ExonArt Zestaw do bezszwowego klonowania i montażu</td><td>Rong Wei Gene Biotechnology Co., Ltd</td><td>A101-02</td><td></td></tr><tr><td>ExonScript RT SuperMix z dsDNase</td><td>Rong Wei Gene Biotechnology Co., Ltd</td><td>A502-1</td><td></td></tr><tr><td>FastDigest Eco321 (EcoRV)</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp; Co., Ltd</td><td>FD0303</td><td></td></tr><tr><td>FastDigest HindIII</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp; Co., Ltd</td><td>FD0504</td><td></td></tr><tr><td>FastDigest NheI</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp; Co., Ltd</td><td>FD0974</td><td></td></tr><tr><td>FastDigest NotI</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp; Co., Ltd</td><td>FD0596</td><td></td></tr><tr><td>Gel Doc XR</td><td>Bio-Rad Laboratories Co., Ltd</td><td>721BR07925</td><td></td></tr><tr><td>Goldview Barwnik żelowy z kwasem nukleinowym</td><td>Shanghai Yubo Biotechnology Co., Ltd</td><td>YB10201ES03</td><td></td></tr><tr><td>Kostkarka do lodu</td><td>Shanghai Bilang Instrument Manufacturing Co., Ltd</td><td>FMB100</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen Platinum SuperFi II Polimeraza DNA</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp; Co., Ltd</td><td>12361010</td><td></td></tr><tr><td>LB Płytka agarowa (Kanamycyna)</td><td>Sangon Biotech (Szanghaj) Co., Ltd.</td><td>B530113-0010</td><td></td></tr><tr><td>LB sterylne płynne podłoże (Kanamycyna)</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td><td>B540113-0001</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipety</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp; Co., Ltd</td><td>&mdash;</td><td></td></tr><tr><td>Kuchenka mikrofalowa</td><td>Panasonic Electric (China) Co., Ltd</td><td>NN-GM333W</td><td></td></tr><tr><td>Wytrząsarki orbitalne</td><td>Shanghai Zhicheng Analytical Instrument Manufacturing Co., Ltd</td><td>ZHWY-2102C</td><td></td></tr><tr><td>Wirus PRRSV</td><td>Uniwersytet Rolniczy w Syczuanie</td><td>&mdash;</td><td></td></tr><tr><td>SnapGene</td><td>GSL Biotech, LLC</td><td>v5.1</td><td>Do projektowania starterów</td></tr><tr><td>T100 PCR Gradient Thermal Cycler</td><td>Bio-Rad Laboratories&nbsp; Co., Ltd</td><td>T100 Thermal Cycler</td><td></td></tr><tr><td>TAE buffer</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td><td>B040123-0010</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik TRIzol</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp; Co., Ltd</td><td>15596026</td><td>odczynnik do ekstrakcji RNA</td></tr></tbody></table>

bezproblemowe podejście do klonowania konstrukcji wektora ekspresji wirusa zespołu rozrodczo-oddechowego świń

A Seamless Cloning Approach for Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus Expression Vector Construction

Budowa wektorów ekspresji genów jest ważnym elementem pracy laboratoryjnej w biologii eksperymentalnej. Dzięki postępowi technicznemu, takiemu jak Gibson Assembly, konstrukcja wektorowa staje się stosunkowo prosta i wydajna. Jednakże, gdy pełnowymiarowy genom wirusa zespołu rozrodczości i układu oddechowego świń (PRRSV) nie może być łatwo amplifikowany przez pojedynczą reakcję łańcuchową polimerazy (PCR) z cDNA lub trudno jest uzyskać pełnowymiarowy wektor ekspresji genu przez homologiczną rekombinację wielu insercji in vitro, obecna technika montażu Gibsona nie osiąga tego celu.
W związku z tym, naszym celem było podzielenie genomu PRRSV na kilka fragmentów i wprowadzenie odpowiednich miejsc restrykcyjnych do odwrotnego startera w celu uzyskania fragmentów amplifikowanych PCR. Po połączeniu poprzedniego fragmentu DNA z wektorem za pomocą technologii rekombinacji homologicznej, nowy wektor uzyskał miejsce cięcia enzymu restrykcyjnego. W ten sposób możemy linearyzować wektor za pomocą nowo dodanego miejsca cięcia enzymu i wprowadzić następny fragment DNA poniżej poprzedzającego fragmentu DNA.
Wprowadzone miejsce rozszczepienia enzymu restrykcyjnego na końcu 3' fragmentu DNA w górę zostanie wyeliminowane, a nowe miejsce rozszczepienia zostanie wprowadzone na końcu 3' fragmentu DNA w dalszej części DNA. W ten sposób możemy po kolei łączyć fragmenty DNA z wektorem. Ta metoda ma zastosowanie do pomyślnego skonstruowania wektora wyrażenia PRRSV i jest skuteczną metodą łączenia dużej liczby fragmentów w wektor wyrażenia.

W niniejszej pracy przedstawiamy system rekombinacji in vitro służący do składania i naprawy nakładających się cząsteczek DNA z wykorzystaniem primera odwrotnego poprzez stale wprowadzane miejsca restrykcyjne (Rycina 1B). System ten jest prostą i wydajną procedurą obejmującą przygotowanie liniowego wektora oraz fragmentów insertów zawierających nawisy wprowadzone za pomocą PCR z primerami posiadającymi odpowiednie sekwencje wydłużenia 5' oraz miejsca restrykcyjne; jedną izotermiczną reakcję in vitro oraz standardową transformację chemiczną produktów rekombinacji do odpowiednich bakterii gospodarza; a także selekcję pozytywnej kolonii i pozyskanie wektora rekombinowanego do kolejnej rundy klonowania. Aby uzyskać wektor pVAX1-PRRSV krok po kroku, miejsca restrykcyjne nie mogą występować w insertach ani w miejscach wielokrotnego klonowania wektora rekombinowanego.
Ponieważ trudno jest uzyskać pełne i złożone sekwencje genów za pomocą jednej reakcji PCR, fragmenty insertów PRRSV można było namnożyć jedynie w sześciu reakcjach PCR (Rysunek 1C). Podczas pierwszej rundy rekombinacji fragment 1 PRRSV został z sukcesem wstawiony do wektora pVAX1, a nowy plazmid rekombinowany z wprowadzonymi miejscami restrykcyjnymi (NheI, miejsce cięcia pojedynczego enzymu) nazwano pVAX1-F1 (Rysunek 1D). W drugiej rundzie rekombinacji wektor pVAX1-F1 został zlinearyzowany za pomocą enzymu restrykcyjnego NheI. Fragment 2 został pomyślnie wstawiony do wektora pVAX1-F1, co pozwoliło na otrzymanie plazmidu rekombinowanego pVAX1-F2 z miejscami restrykcyjnymi (NheI, miejsce cięcia pojedynczego enzymu) (Rysunek 1D). W trzeciej rundzie rekombinacji, jak pokazano na Rysunku 1D, fragment 3 został pomyślnie wstawiony do wektora pVAX1-F2 w celu otrzymania pVAX1-F3 z miejscami restrykcyjnymi (NheI, miejsce cięcia pojedynczego enzymu). W czwartej rundzie rekombinacji otrzymaliśmy wektor pVAX1-F4 poprzez wprowadzenie fragmentu 4 z miejscami restrykcyjnymi EcoRV (miejsce cięcia pojedynczego enzymu). Następnie wektor pVAX1-F4 został zlinearyzowany enzymami restrykcyjnymi EcoRV i NotI. Fragment 5 został sklonowany do wektora pVAX1-F4, aby uzyskać pVAX1-F5 z miejscami restrykcyjnymi (NotI, miejsce cięcia pojedynczego enzymu). Po ostatniej rundzie rekombinacji pomyślnie otrzymano pełnowymiarowy wektor nadekspresyjny PRRSV (pVAX1-PRRSV) (Plik uzupełniający 1). Jak zilustrowano na Rysunku 1D, nowy plazmid rekombinowany staje się coraz większy wraz z sukcesywnym wprowadzaniem kolejnych fragmentów. Wyniki te wykazały zatem, że połączenie dodawania odpowiednich miejsc restrykcyjnych i wykorzystania techniki Gibson Assembly pozwala na efektywne wprowadzanie fragmentów DNA do wektora.
<img alt="Proces edycji genów metodą PCR; schemat przedstawiający etapy konstrukcji plazmidu, elektroforeza w żelu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66320/66320fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Organizacja i konstrukcja wektorów pVAX1-F6 (pVAX1-PRRSV) poprzez rekombinację homologiczną. (A) Organizacja genomu PRRSV. ORF1b koduje polimerazę RNA zależną od RNA, helikazę RNA oraz wielojądrowe domeny wiążące cynk. Pozostałe ORF kodują glikoproteiny związane z błoną (GP2, GP3, GP4 i GP5), białko E, białko otoczki błonowej oraz białko nukleokapsydu. (B) Schemat procesu generowania wektora pVAX1-PRRSV.(C) Żel agarozowy z DNA przedstawia amplifikację fragmentów docelowych metodą PCR. (D) Wraz z wstawianiem fragmentów rozmiar wektora rekombinowanego stopniowo wzrasta. Skróty: PRRSV = wirus zespołu rozrodczo-oddechowego świń; ORF = otwarta ramka odczytu; GP = glikoproteina; E = białko E; M = białko otoczki błonowej; N = białko nukleokapsydu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66320/66320fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Komponent </td>
			<td>Objętość</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA PRRSV</td>
			<td>2 μL (25 ng)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>woda wolna od RNaz</td>
			<td>11 μL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5x Mieszanina Reakcyjna</td>
			<td>4 μL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supreme Enzyme Mix</td>
			<td>3 μL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperatura</td>
			<td>Czas trwania</td>
			<td>Cykle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 °C</td>
			<td>10 min</td>
			<td>Usuwanie genomowego DNA, parowanie losowych starterów z matrycami RNA </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>55 °C</td>
			<td>15 min</td>
			<td>Szybka inaktywacja dsDNazy i transkrypcja odwrotna</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>85 °C</td>
			<td>5 min</td>
			<td>Inaktywacja odwrotnej transkryptazy</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Przygotowanie i warunki odwrotnej transkrypcji.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Komponent</td>
			<td>Objętość</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bufor 5x SuperFi II</td>
			<td>10 μL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 μM Starter prawy</td>
			<td>2.5 μL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 μM starter rewersyjny</td>
			<td>2.5 μL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mM dNTP</td>
			<td>1 μL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cDNA (PRRSV)</td>
			<td>1 μL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polimeraza DNA Platinum SuperFi II</td>
			<td>1 μL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddH2O2O</td>
			<td>32 μL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Krok cyklu</td>
			<td>Temperatura</td>
			<td>Czas trwania</td>
			<td>Cykle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wstępna denaturacja</td>
			<td>98 °C</td>
			<td>30 s</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Denaturacja</td>
			<td>98 °C</td>
			<td>10 s</td>
			<td>35</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wyżarzanie</td>
			<td>60 °C</td>
			<td>10 s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rozszerzenie</td>
			<td>72 °C</td>
			<td>3 min</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Końcowe przedłużenie</td>
			<td>72 °C</td>
			<td>5 min</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Przytrzymać</td>
			<td>4 °C</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Skład reakcji PCR i warunki przeprowadzania.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Linearyzacja pVAX1</td>
			<td>Linearyzacja pVAX1-F1</td>
			<td>Linearyzacja pVAX1-F2</td>
			<td>Linearyzacja pVAX1-F3</td>
			<td>Linearyzacja pVAX1-F4</td>
			<td>Linearyzacja pVAX1-F5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Składnik</td>
			<td>Objętość</td>
			<td>Objętość</td>
			<td>Objętość</td>
			<td>Objętość</td>
			<td>Objętość</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wektor</td>
			<td>10 μL (1 μg) pVAX1</td>
			<td>6 μL (1 μg) pVAX1-F1</td>
			<td>3,5 μL (1 μg) pVAX1-F2</td>
			<td>7,5 μL (1 μg) pVAX1-F3</td>
			<td>10 μL (1 μg) pVAX1-F4</td>
			<td>15 μL (1 μg) pVAX1-F5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzym restrykcyjny 1</td>
			<td>1 μL NdeI</td>
			<td>1 μL NdeI</td>
			<td>1 μL NdeI</td>
			<td>1 μL NdeI</td>
			<td>1 μL EcoRV</td>
			<td>1 μL NotI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzym restrykcyjny 2</td>
			<td>1 μL HindIII</td>
			<td>1 μL HindIII</td>
			<td>0,5 μL CIAP</td>
			<td>0,5 μL CIAP</td>
			<td>1 μL NotI</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bufor 10x FastDigest</td>
			<td>2 μL</td>
			<td>2 μL</td>
			<td>2 μL</td>
			<td>2 μL</td>
			<td>2 μL</td>
			<td>2 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddH2O</td>
			<td>6 μL</td>
			<td>10 μL</td>
			<td>13 μL</td>
			<td>9 μL</td>
			<td>6 μL</td>
			<td>2 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suma</td>
			<td>20 μL</td>
			<td>20 μL</td>
			<td>20 μL</td>
			<td>20 μL</td>
			<td>20 μL</td>
			<td>20 μL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 3: Mieszanina do linearyzacji pVAX1, pVAX1-F1, pVAX1-F2, pVAX1-F3, pVAX1-F4 oraz pVAX1-F5.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Komponent</td>
			<td>Objętość</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>zestaw do bezszwowego klonowania i składania ExonArt</td>
			<td>5 μL </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zlinearyzowany wektor</td>
			<td>200 ng</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fragment</td>
			<td>200 ng</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddH2O2O</td>
			<td>Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. 10 μL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 4: Konfiguracja reakcji bezszwowego klonowania i składania ExonArt.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody >
		<tr >
			<td >Składnik</td>
			<td >Objętość</td>
			<td ></td>
		</tr >
		<tr >
			<td >2x Universal Green PCR Master Mix</td>
			<td >10 μL</td >
			<td ></td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Starter forward 10 μM</td>
			<td >0.4 μL</td >
			<td ></td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Starter reverse 10 μM</td>
			<td >0.4 μL</td >
			<td ></td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Matryca</td>
			<td >1 μL</td >
			<td ></td>
		</tr >
		<tr >
			<td >ddH2O</td>
			<td >8.2 μL</td >
			<td ></td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Suma</td>
			<td >20 μL</td >
			<td ></td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Temperatura</td>
			<td >Czas trwania</td>
			<td >Cykle</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >95 °C</td >
			<td >30 s</td >
			<td >1</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >98 °C</td >
			<td >10 s</td >
			<td >28</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >56 °C</td >
			<td >10 s</td >
			<td ></td>
		</tr >
		<tr >
			<td >72 °C</td >
			<td >3 min</td >
			<td ></td>
		</tr >
		<tr >
			<td >72 °C</td >
			<td >5 min</td >
			<td >1</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >4 °C</td >
			<td >-</td >
			<td >-</td >
		</tr >
	</tbody >
</table>
Tabela 5: Konfiguracja i warunki colony PCR.
Rysunek dodatkowy S1: Schemat procesu projektowania starterów. Przedstawiono również inne projekty starterów, takie jak P5 i P6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66320/66320_Supplemental_FigS1.zip" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Rycina uzupełniająca S2: Sekwencje starterów. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66320/66320_Supplemental_FigS2.zip" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Plik uzupełniający 1: Dane sekwencjonowania DNA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66320/Supplemental_File_2.rar" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Tutaj prezentujemy protokół do uzyskania wektora wyrażenia pVAX1-PRRSV poprzez wprowadzenie odpowiednich miejsc restrykcyjnych na końcu 3' wstawek. Możemy linearyzować wektor i łączyć fragmenty DNA z wektorem jeden po drugim za pomocą technologii rekombinacji homologicznej.

Bezproblemowe podejście do klonowania konstrukcji wektora ekspresji wirusa zespołu rozrodczo-oddechowego świń

The construction of gene expression vectors is an important component of laboratory work in experimental biology. With technical advancements like Gibson ...

Protokół ten demonstruje budowę długiego i skomplikowanego wektora ekspresji genów. W przypadku gdy pełnowymiarowego fragmentu nie można uzyskać metodą pojedynczego PCR z cDNA lub nie można uzyskać pełnowymiarowego wektora ekspresji genu w drodze wielokrotnej rekombinacji homologicznej in vitro, stosuje się tę metodę. Obecnie klonowanie z wieloma wstawkami stosuje się w celu uzyskania pełnowymiarowego fragmentu DNA do sklonowania do odpowiedniego wektora.Metoda ta może osiągnąć delecję lub mutację docelowych genów i skutecznie połączyć dużą liczbę fragmentów DNA z wektorem ekspresyjnym. Aby rozpocząć, otwórz oprogramowanie i wybierz opcję utworzenia nowego pliku DNA. Przygotuj sekwencję genu PRRSV z NCBI i kliknij przycisk OK, aby wygenerować pliki sekwencji.Przeanalizuj sekwencję i zaznacz połączenia fragmentów. Zidentyfikuj wszystkie skrzyżowania przed zaprojektowaniem konkretnych starterów sekwencji dla fragmentów. Następnie kliknij Podkłady i wybierz Dodaj podkład.Wklej określoną sekwencję i dodaj nakładające się sekwencje wektora do pierwszych pięciu pierwszych nukleotydów startera. Nazwij podkład do przodu i kliknij Dodaj podkład do szablonu, aby włączyć zaprojektowany podkład do szablonu. Następnie zaznacz połączenia fragmentów i zaprojektuj starter fragmentów o odwrotnej sekwencji specyficznej.Ponownie przejdź do Podkłady i wybierz Dodaj podkład. Wprowadź określoną sekwencję. Dodaj miejsce restrykcyjne do pierwszych pięciu pierwszych nukleotydów.Uwzględnij również od 20 do 40 par zasad sekwencji zwisu wektora do pierwszych pięciu głównych nukleotydów miejsca restrykcji. Nazwij odwrotny podkład i wybierz pozycję Dodaj podkład do szablonu. Następnie ustaw sześć indywidualnych reakcji PCR przy użyciu sześciu fragmentów i zaprojektowanych par starterów.Uruchom PCR zgodnie z trzyetapowym protokołem, jak pokazano tutaj. Po zakończeniu PCR odpipetować 1 mikrolitr 6x buforu ładującego DNA z 5 mikrolitrami produktu PCR. Wymieszaj i krótko odwiruj.Analizować próbki za pomocą elektroforezy w 1% żelu agarozowym. Aby skonstruować gen o pełnej długości, fragmenty insercji PRRSV amplifikowano za pomocą sześciu reakcji PCR. Rozmiary fragmentów potwierdzono za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym.Zacznij od linearyzacji wektora. Przygotować mieszaninę reakcyjną zawierającą specyficzne enzymy restrykcyjne w temperaturze pokojowej. Użyj zestawu do ekstrakcji żelu, aby oczyścić zlinearyzowane wektory, a następnie inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 60 minut.Następnie złóż reakcję bezszwowego klonowania i składania ExonArt w celu subklonowania genu PRRSV. Dostosuj całkowitą objętość reakcji do 10 mikrolitrów za pomocą wysterylizowanej wody dejonizowanej. Następnie dokładnie wymieszaj.Inkubować mieszaninę w termocyklerze przez 15 do 60 minut w temperaturze 50 stopni Celsjusza. Następnie należy przechowywać próbki na lodzie. Po przekształceniu wektora w kompetentne komórki, wybierz 8 kolonii do 20 mikrolitrów pożywki LB zawierającej kanamycynę.Skonfiguruj reakcję PCR kolonii, aby przeanalizować transformanty. Pełnowymiarowy PRRSV nad wektorem ekspresji uzyskano poprzez wprowadzenie fragmentu PRRSV 1 do wektora pVAX1, tworząc pVAX1-F1. Kolejne rundy rekombinacji z użyciem specyficznych enzymów restrykcyjnych skutkowały włączeniem fragmentów od 2 do 5, co uwidoczniło się wzrostem rozmiaru plazmidu.

a-seamless-cloning-approach-for-porcine-reproductive-respiratory

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

System genetyki odwrotnej dla szczepionkowego szczepu MP-12 wirusa gorączki Doliny Rift jest użytecznym narzędziem do tworzenia dodatkowych mutantów MP-12 o zwiększonej atenuacji i immunogenności. Opisujemy protokół generowania i charakteryzacji szczepów mutantów NSs.

Wykorzystanie genetyki odwrotnej do manipulacji genem NSs szczepu MP-12 wirusa gorączki doliny Rift w celu poprawy bezpieczeństwa i skuteczności szczepionki

W niniejszym opracowaniu opisujemy protokół oparty wyłącznie na infekcji komórek, który zwiększa wydajność produkcji rekombinowanego parwowirusa ponad 100-krotnie w porównaniu z innymi stosowanymi protokołami. Protokół ten opiera się na wykorzystaniu nowego pomocniczego adenowirusa typu 5 zawierającego jednostkę transkrypcyjną VP parwowirusa (Ad-VP).

Wydajna produkcja rekombinowanego parwowirusa z wykorzystaniem systemów pochodnych adenowirusa

Metodologie celowania w geny mogą być używane do generowania transgenicznych myszy z allelami knockout, knock-in i taged.  W tym miejscu opisujemy ulepszoną metodę rekombinacji u E. coli, którą nazywamy "subklonowaniem plus insercją", która może być wykorzystana do szybkiego generowania niestandardowych wektorów docelowych genów.

Subklonowanie plus insercja (SPI) - nowatorska metoda rekombinacji do szybkiej budowy wektorów celowania w geny

Tutaj przedstawiono protokół tworzenia zakaźnego bakteryjnego sztucznego chromosomu zawierającego pełnowymiarowe cDNA pozytywnej nici genomowego RNA wirusa japońskiego zapalenia mózgu. Protokół ten może być wykorzystany do skonstruowania funkcjonalnego cDNA innych wirusów o dodatniej nici RNA, co czyni go potężnym narzędziem genomicznym do badania biologii wirusów.

Sztuczne chromosomy bakteryjne: funkcjonalne narzędzie genomiczne do badania wirusów o dodatniej nici RNA

Wirus krowianki (VV) jest szeroko stosowany w badaniach biomedycznych i poprawie zdrowia ludzkiego. W tym artykule opisano prostą, bardzo wydajną metodę edycji genomu VV przy użyciu systemu CRISPR-Cas9.

Proste i skuteczne podejście do konstruowania zmutowanych wektorów wirusa krowianki

Herpeswirus indyków (HVT) jest szeroko stosowany jako platforma wektorowa do generowania rekombinowanych szczepionek przeciwko wielu chorobom ptaków. W artykule opisano proste i szybkie podejście do wytwarzania rekombinowanych szczepionek wektorowych HVT przy użyciu zintegrowanego systemu NHEJ-CRISPR/Cas9 i Cre-Lox.

Generowanie rekombinowanych wektorów herpeswirusa ptasiego z edycją genów CRISPR/Cas9

Opisujemy metodę generowania i amplifikacji genetycznie modyfikowanych syncytialnych wirusów oddechowych (RSV) oraz zoptymalizowany test płytki nazębnej dla RSV. Ilustrujemy ten protokół, tworząc dwa rekombinowane wirusy, które odpowiednio umożliwiają ilościowe określenie replikacji RSV i analizę na żywo ciał inkluzyjnych RSV i dynamiki granulek związanych z ciałami inkluzyjnymi.

Wytwarzanie, amplifikacja i miareczkowanie rekombinowanych syncytialnych wirusów oddechowych

Generowanie rekombinowanych rotawirusów z plazmidowego DNA dostarcza niezbędnego narzędzia do badania replikacji i patogenezy rotawirusów oraz rozwoju wektorów ekspresyjnych rotawirusów i szczepionek. W niniejszym artykule opisano uproszczone podejście genetyki odwrotnej do generowania rekombinowanych rotawirusów, w tym szczepów eksprymujących fluorescencyjne białka reporterowe.

Uproszczona metoda genetyki odwrotnej do odzyskiwania rekombinowanych rotawirusów wykazujących ekspresję białek reporterowych

To jest metoda generowania "bezbliznowatych" rekombinowanych wirusów krowianki przy użyciu wyboru zakresu gospodarzy i wizualnej identyfikacji rekombinowanych wirusów.

Szybkie, bezproblemowe generowanie rekombinowanych pokswirusów przy użyciu zakresu gospodarzy i selekcji wizualnej

Dla dogłębnej analizy mechanistycznej syntezy RNA syncytialnego wirusa oddechowego (RSV), przedstawiamy protokół wykorzystania fosfoproteiny opiekuńczej (P) do koekspresji nukleoproteiny wolnej od RNA (N0) do późniejszego składania in vitro specyficznych dla wirusa nukleokapsydów (NC).

Wytwarzanie i składanie specyficznych dla wirusa nukleokapsydów syncytialnego wirusa oddechowego

Naucz się klonowania wektorów ekspresji genu PRRSV metodą homologicznej rekombinacji z wieloma fragmentami DNA. Ta technika umożliwia budowę złożonych konstrukcji wektorowych pVAX1 do badań nad wirusem.

Bezproblemowe podejście do klonowania konstrukcji wektora ekspresji wirusa zespołu rozrodczo-oddechowego świń

Przeglądaj więcej filmów