Chirurgiczna perfuzja i izolacja trzustki świni w celu izolacji wysp trzustkowych
7 czerwca 2024
Ten protokół zawiera przewodnik krok po kroku dotyczący pobierania trzustki świni do izolacji i oczyszczania wysp trzustkowych.
Nasze laboratorium koncentruje się na mikrokapsułkowaniu do ksenotransplantacji wysp trzustkowych. Wymaga to niezawodnej izolacji i oczyszczania wysp trzustkowych. Radzimy sobie z tym wyzwaniem, izolując trzustkę bez uszkodzenia jej w wyniku niedokrwienia ciepłem lub urazu mechanicznego.
A to zapewnia strategie skutecznego trawienia i wysoką wydajność wysepek. Izolowanie wysp trzustkowych jest bardzo trudne. Zarówno wydajność, jak i czystość zależą od tego, czy każda faza procesu jest wykonywana skutecznie i wydajnie, od pobrania narządów i trawienia po oczyszczanie wysp trzustkowych.
Ponadto względy etyczne i humanitarne są ważne przy planowaniu procedur na zwierzętach, które ułatwią uzyskanie optymalnych wyników przy jednoczesnym zmniejszeniu cierpienia zwierząt. Więc tutaj pokazujemy, że możemy przezskórnie kanniulować aortę, aby selektywnie perfundować trzustkę. Ta technika pozwala nam skutecznie zachować trzustkę, a następnie wyizolować wyspy trzustkowe.
Tak więc główną zaletą naszego protokołu jest zastosowanie techniki Seldingera do kaniulacji aorty. Pomaga to utrzymać bezkrwawe pole operacyjne i zachowuje płaszczyzny rozwarstwienia. Technikę tę można również łatwo dostosować do mniejszych świń, po prostu używając mniejszej osłony.
Nasze laboratorium bada obecnie metody tworzenia podaży wysp trzustkowych na żądanie. W szczególności jesteśmy zainteresowani sprawdzeniem, czy zamknięcie wysp trzustkowych w hydrożelu może przedłużyć ich żywotność i poprawić ich funkcję w in vitro i w hodowli. Ostatecznym celem jest niezawodna izolacja wysp trzodowych świń w celu wykorzystania ich w badaniach transplantacyjnych, a nawet do ksenotransplantacji.
Zacznij od przygotowania się do zabiegu. Aby wykonać rozwarstwienie zaotrzewnowe, należy naciąć otrzewną po prawej stronie linii środkowej od poziomu prawej nerki do rozwidlenia aorty za pomocą elektrokoagulacji. Ostro odsłonić prawą nerkę, prawą żyłę nerkową, prawą tętnicę nerkową i żyłę główną dolną, a także aortę.
Korzystając z dużej pętli naczynia, uzyskaj obwodową kontrolę dystalnej aorty podnerkowej. Następnie uzyskaj kontrolę obwodową IVC w środkowej części podnerki i podwiąż IVC za pomocą jedwabnej opaski 2-0. Następnie uzyskaj kontrolę obwodową prawej i lewej tętnicy nerkowej i żył.
Zwiąż te struktury za pomocą jedwabnych krawatów 2-0. Kontynuuj rozwarstwienie wewnątrz klatki piersiowej, cofając wątrobę niżej, aby odsłonić prawą półprzeponę. Przyłóż dwa zaciski Allis do błoniastej części prawej półmembrany i naciąć membranę między dwoma zaciskami za pomocą elektrokoagulacji.
Przedłuż miotomię przepony w poziomie do około siedmiu centymetrów. Następnie należy uzyskać kontrolę obwodową IVC w obrębie klatki piersiowej. Umieść jedwabny krawat 2-0 wokół IVC wewnątrz klatki piersiowej i zatrzaśnij końce szwu małym hemostatem bez zasłaniania IVC.
Następnie użyj dwóch zacisków Allis, aby cofnąć krawędź przepony dolnie i przedłużyć ją do lewej półmembrany. Podaj świni heparynę ogólnoustrojową w celu leczenia przeciwzakrzepowego przez obwodowy dostęp żylny i odczekaj co najmniej trzy minuty przed kontynuowaniem. Za pomocą igły do mikronakłuwania o rozmiarze 18 uzyskaj dostęp do aorty podnerkowej.
Następnie przełóż drut j przez igłę do aorty i wyjmij igłę z drutu. Umieść 10 francuskiej osłony na drucie w aorcie i usuń drut. Następnie podłącz rurkę dożylną do 10 francuskich osłonek i wlej sterylny roztwór UW przez osłonkę w sterylny sposób z szybkością od 40 do 60 kropli na minutę.
Następnie za pomocą zacisku aortalnego zaciśnij aortę podnerkową i zstępującą aortę piersiową. Związać IVC wewnątrz klatki piersiowej z wcześniej umieszczonym krawatem 2-0 i podać chlorek potasu przez obwodowy dostęp żylny w celu eutanazji. Następnie odizoluj przewód trzustkowy, lokalizując go przy wejściu do dwunastnicy.
Podkleić kanał za pomocą dwóch jedwabnych opasek 3-0 i przeciąć kanał między opaskami. Ukończ pankreatektomię. Aby wstrzyknąć trzustkę roztworem enzymu, przepuść 60 mililitrowych bolusów do przewodu trzustkowego, aż cały roztwór enzymu zostanie wstrzyknięty.
Umieść trzustkę w komorze Ricordi wraz z filtrem siatkowym i gumową uszczelką, a następnie przymocuj pokrywę do komory Ricordi, aby ją uszczelnić. Następnie umieść wężownicę grzewczą w gorącej łaźni wodnej ustawionej na 47 stopni Celsjusza. Włóż kaniule doprowadzające i odpływowe do zbiornika obwodu trawienia zawierającego 500 mililitrów 1X HBSS.
Uruchomić pompę z natężeniem przepływu 450 mililitrów na minutę, aż cała komora zostanie wypełniona roztworem wytrawiającym. Następnie zmniejsz natężenie przepływu do 100 mililitrów na minutę, gdy płyn krąży w obwodzie. Aby rozpocząć, ustaw pompę na natężenie przepływu 200 mililitrów na minutę i załaduj 125 mililitrów roztworu gradientu o dużej gęstości do ciągłego kształtowania gradientu, a następnie do procesora komórkowego.
Uruchom funkcję wirówki procesora komórkowego przy 1000 obr./min. Uwolnij powietrze z systemu i zalej go ponownie roztworem gradientowym o dużej gęstości. Następnie dodaj 125 mililitrów roztworu gradientowego o dużej gęstości i 130 mililitrów roztworu o niskiej gęstości do formy gradientu.
Załaduj 100 mililitrów strawionej zawiesiny tkankowej. Zwiększ prędkość procesora komórkowego do 2000 obr./min na trzy minuty. Aby przygotować 16 50-mililitrowych stożkowych probówek do zbierania oczyszczonej frakcji wysp trzustkowych, dodaj 25 mililitrów pożywki RPMI do każdej probówki i ułóż je w kolejności rosnącej.
Zbierz oczyszczone frakcje wysp trzustkowych w przygotowanych stożkowych probówkach. Aby poplamić wysepki. Zebrać od 100 do 200 mikrolitrów podwielokrotności z każdej oczyszczonej frakcji wysp trzustkowych i ocenić zawartość wysp trzustkowych za pomocą barwienia DTZ na 24-dołkowej płytce do hodowli tkankowej.
Sprawdź każdą frakcję za pomocą mikroskopii świetlnej przy 4X, gdzie wysepki będą ciemnoczerwone lub czarne. Korzystając z tego protokołu, izolację wysp trzustkowych przeprowadzono u trzech świń. Obrazy w jasnym polu pokazały oczyszczone wyspy trzustkowe, które scharakteryzowano pod kątem żywotności przy użyciu barwienia żywego/martwego.
Reprezentatywny rozkład wielkości wysepek po izolacji wysepek wykazał rozkład wielkości około 50 do 100 mikronów. Ponadto wydajność i czystość oceniano za pomocą licznika komórek wysp trzustkowych, co wskazuje na skuteczną izolację trzustki świni.
Przegląd
Ten protokół zapewnia krok po kroku przewodnik po pozyskiwaniu trzustki wieprzowej w celu izolacji i oczyszczenia wysp trzustkowych. Nasze laboratorium koncentruje się na mikroenkapsulacji w celu przeszczepu allogenicznego wysp trzustkowych, podkreślając znaczenie niezawodnej izolacji i oczyszczenia wysp.
Kluczowe komponenty badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Biologia przeszczepów
- Techniki izolacji wysp
Tło
- Izolowanie wysp trzustkowych jest wyzwaniem z powodu ryzyka uszkodzenia związanego z ciepłowo-niedokrwieniem lub urazem mechanicznym.
- Wydajność i czystość wysp zależy od efektywności każdej fazy procesu izolacji.
- Strategie skutecznej trawienia są kluczowe dla osiągnięcia wysokiego wydajności wysp.
- Zrozumienie procesu pozyskiwania jest niezbędne dla udanej transplantacji wysp.
Cel badania
- Aby zapewnić niezawodną metodę pozyskiwania trzustki wieprzowej w celu izolacji wysp.
- Aby poprawić wydajność i czystość izolowanych wysp.
- Aby opracować strategie minimalizujące uszkodzenia podczas procesu izolacji.
Stosowane metody
- Krok po kroku protokół pozyskiwania trzustki wieprzowej.
- Techniki, aby uniknąć ciepłowo-niedokrwienia i urazu mechanicznego.
- Skuteczne metody trawienia do izolacji wysp.
- Procesy oczyszczania, aby poprawić jakość wysp.
Główne wyniki
- Skuteczna izolacja wysp trzustkowych z minimalnymi uszkodzeniami.
- Wysoka wydajność i czystość wysp osiągnięte dzięki zoptymalizowanym metodom.
- Demonstrowane strategie skutecznego trawienia i oczyszczania.
Wnioski
- Protokół zapewnia niezawodne podejście do pozyskiwania wysp.
- Minimalizowanie uszkodzeń podczas izolacji jest kluczowe dla żywotności wysp.
- Skuteczne metody mogą znacznie poprawić wydajność i jakość wysp.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Reliable procurement and preservation of porcine pancreata are critical for generating high-quality islets to support xenotransplantation research and scalable islet supply. Minimizing warm-ischemia and mechanical injury during organ isolation directly impacts islet viability, yield, and downstream translational potential. This protocol addresses a key bottleneck in the preclinical pipeline for diabetes cell therapy innovation and portfolio expansion.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables robust interrogation of islet biology in a controlled, reproducible system.
- Supports functional validation of porcine islets for xenotransplantation feasibility studies.
- Facilitates mechanistic de-risking by preserving islet integrity for downstream assays.
Screening & Assay Development
- Provides standardized, high-viability islets for assay development and compound screening.
- Improves reproducibility and quantitative assessment of islet function and viability.
- Enables scalable preparation of biological material for repeated experimental workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models for diabetes and cell therapy research.
- Ensures continuity from islet procurement through preclinical transplantation studies.
- Reduces biological variability, supporting risk-adjusted advancement decisions.
Pipeline & Workflow Integration
This surgical perfusion and isolation protocol positions porcine islet procurement at the interface of early discovery and preclinical model development for diabetes research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on islet viability and function under controlled procurement conditions.
- Screening: Delivers reproducible, high-quality islets for functional assays and compound evaluation.
- Analytics: Enables quantitative measurement of islet yield, purity, and viability for cross-condition comparison.
- Translational Research: Provides a foundation for preclinical xenotransplantation and encapsulation studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized protocol adaptable across research teams and model systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in islet-based translational models and target validation.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of islet procurement workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and reduces late-stage biological risk in cell therapy pipelines.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of diabetes and xenotransplantation programs.
Implementation Considerations
- Requires surgical expertise in vascular cannulation and organ dissection.
- Demands access to perfusion equipment, Ricordi chamber, and cell processing infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization for reproducible islet isolation outcomes.
- Adaptable to different pig sizes with sheath selection and procedural adjustments.
- Warm-ischemia minimization is critical for optimal islet yield and viability.
