Name: Chirurgiczna perfuzja i izolacja trzustki świni w celu izolacji wysp trzustkowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-06-07T13:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: Poznaj metodę chirurgicznej perfuzji i izolacji trzustki świni w celu uzyskania wysp trzustkowych o wysokiej czystości. Technika ta minimalizuje uszkodzenia mechaniczne i niedokrwienie, zapewniając optymalną wydajność izolacji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ten manuskrypt został wsparty grantem na innowacje kliniczne od Mid-America Transplant Foundation.

Wszystkie procedury z udziałem zwierząt są zatwierdzane przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) na Wydziale Medycyny Porównawczej Szkoły Medycznej Uniwersytetu Waszyngtońskiego. Dorosłe świnie Yorkshire o wadze od 35 do 35 kg są idealne do tej procedury; Protokół może być jednak dostosowany do świń o różnej wielkości, w zależności od kontekstu doświadczalnego. Cała procedura powinna być wykonana w sposób sterylny w układzie sali operacyjnej.
1. Przygotowanie przedoperacyjne i znieczulenie
<ol>
	<li>Uspokoić świnię koktajlem składającym się z 4 mg/kg tiletaminy i zolazepamu, 20 mg/kg ketaminy i 2 mg/kg ksylazyny wstrzykniętych domięśniowo.</li>
	<li>Ustalić obwodowy dostęp żylny przez żyłę uszną.</li>
	<li>Wywołaj znieczulenie ogólne wziewnym 1%-3% izofluranem w 100% tlenu i zaintubuj intubację dotchawiczą świni. 
	UWAGA: Może być preferowane użycie propofolu lub innego środka do indukcji dożylnej zamiast inhalacji do indukcji w celu płynniejszej procedury indukcji i intubacji. Parametry życiowe, końcowo-oddechowy CO2 , nasycenie tlenem i przebieg fali serca są stale monitorowane w celu oceny i utrzymania głębokości znieczulenia. Płaszczyzna operacyjna jamy brzusznej jest potwierdzana za pomocą przyłóżkowych ultradźwięków.</li>
	<li>Ogolić i przygotować świnię glukonianem chlorheksydyny od wcięcia mostka do obustronnych pachwin.</li>
	<li>Ułóż pole operacyjne tak, aby było dobrze widoczne całe ciało brzucha (<silna klasa="xfig">Ryc. 1A).</li>
</ol>
2. Operacja i odsłonięcie części zaotrzewnowej
<ol>
	<li>Wykonaj nacięcie laparotomii w linii środkowej (<silna klasa="xfig">Ryc. 1B).
	<ol>
		<li>Użyj skalpela z 10 ostrzami i elektrokoagulacji, aby wykonać laparotomię w linii środkowej od wyrostka mieczykowatego do kości łonowej. Uważaj, aby zakrzywić nacięcie wokół dolnego ujścia układu moczowo-płciowego w jamie brzusznej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj rotację trzewną w prawo.
	<ol>
		<li>Uzewnętrznij prawą okrężnicę i jelito cienkie, owijając je sterylnym ręcznikiem.</li>
		<li>Delikatnie cofnij okrężnicę i jelito w lewo, aby odsłonić prawą zaotrzewnową, unikając skrętu jelita lub malrotacji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Opróżnij pęcherz (opcjonalnie).
	<ol>
		<li>Jeśli pęcherz jest pełny i narażony na ekspozycję, chwyć pęcherz między dwoma kleszczami DeBakeya i użyj skalpela z 11 ostrzami, aby naciąć brzuszną ścianę pęcherza.</li>
		<li>Umieść końcówkę ssącą Yankauer w pęcherzu, aby odprowadzić mocz i odbarczyć pęcherz.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ustaw zestaw retraktora brzusznego, aby ułatwić optymalne odsłonięcie prawej części zaotrzewnowej (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C).</li>
</ol>
3. Rozwarstwienie zaotrzewnowe
<ol>
	<li>Rozpocznij rozwarstwienie zaotrzewnowe (<silna klasa="xfig">Ryc. 2A).
	<ol>
		<li>Za pomocą elektrokoagulacji naciąć otrzewną po prawej stronie linii środkowej, od poziomu prawej nerki do rozwidlenia aorty.</li>
		<li>Ostro odsłonić aortę podnerkową, żyłę główną dolną (IVC) oraz prawą tętnicę nerkową i żyłę</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uzyskaj obwodową kontrolę dystalnej aorty podnerkowej z dużą pętlą naczyniową.</li>
	<li>Ligacja IVC (<silna klasa="xfig">Rysunek 2B).
	<ol>
		<li>Uzyskaj kontrolę obwodową IVC śródnerkowego.</li>
		<li>Liguj IVC za pomocą jedwabnego krawata 2-0.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Podwiązywać naczynia nerkowe (<silna klasa="xfig">Rysunek 2C).
	<ol>
		<li>Uzyskaj kontrolę obwodową prawej i lewej tętnicy nerkowej i żył.</li>
		<li>Zwiąż te struktury za pomocą jedwabnych krawatów 2-0.</li>
		<li>Jeśli istnieje wiele tętnic nerkowych, podobnie wyizoluj i podwiąż każde z tych naczyń.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Rozwarstwienie wewnątrzklatki piersiowej
<ol>
	<li>Naciąć prawą półmembranę (<silna klasa="xfig">Rysunek 3A).
	<ol>
		<li>Delikatnie cofnij wątrobę dolnie, aby odsłonić prawą półprzeponę. Przyłóż dwa zaciski Allis do błoniastej części prawej półmembrany i naciąć membranę między dwoma zaciskami za pomocą elektrokoagulacji.</li>
		<li>Przedłuż miotomię przepony do około 7 cm w poziomie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uzyskaj kontrolę obwodową IVC w obrębie klatki piersiowej (<silna klasa="xfig">Rysunek 3B).
	<ol>
		<li>Umieść jedwabny krawat 2-0 wokół IVC wewnątrz klatki piersiowej. Zatrzaśnij końce szwu małym hemostatem bez zamykania IVC.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozszerz przeponę do lewej półmembrany (<silna klasa="xfig">Rysunek 3C).
	<ol>
		<li>Użyj dwóch zacisków Allis, aby cofnąć krawędź przepony dolnie i wysunąć do lewej półprzepony. 
		UWAGA: Unikaj wchodzenia do osierdzia podczas diafragmotomii.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odsłoń zstępującą aortę piersiową w lewej tylno-przyśrodkowej okolicy klatki piersiowej.</li>
</ol>
5. Kanegulacja podnerkowa aorty, izolacja trzewna i perfuzja
<ol>
	<li>Ogólnoustrojowo przeciwzakrzepowe świnia.
	<ol>
		<li>Podawać heparynę ogólnoustrojową (100 j./kg) przez obwodowy dostęp żylny. Odczekaj 3 minuty przed przystąpieniem do kaniulacji aorty.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uzyskaj dostęp do aorty podnerkowej za pomocą igły do mikronakłuwania 18 G (<silna klasa="xfig">Rysunek 4A).</li>
	<li>Przełóż drut j przez igłę do aorty i wyjmij igłę z drutu.</li>
	<li>Umieść osłonę 10Fr na drucie w aorcie i wyjmij drut (<silna klasa="xfig">Rysunek 4B).</li>
	<li>Podłącz rurkę dożylną do osłony 10Fr i w sterylny sposób wlej roztwór UW przez osłonę. Zaparzać roztwór UW w ilości 40-60 kropli/min. 
	UWAGA: Przepływ nie rozpocznie się, dopóki aorta piersiowa nie zostanie zaciśnięta krzyżowo. Upewnij się, że rurka dożylna nie jest napięta, aby uniknąć przemieszczenia osłonki wewnątrzaortalnej.</li>
	<li>Wykonaj izolację trzewną i perfuzję w krótkich odstępach czasu.
	<ol>
		<li>Zacisnąć aortę podnerkową za pomocą zacisku aortalnego.</li>
		<li>Zacisnąć zstępującą aortę piersiową za pomocą zacisku aortalnego.</li>
		<li>Zwiąż IVC w klatce piersiowej z wcześniej umieszczonym krawatem 2-0.</li>
		<li>Podawać 100 mg/kg KCl do eutanazji przez obwodowy dostęp żylny. 
		UWAGA: Śmierć sercowa rozpoczyna się od podania KCl.</li>
		<li>Wykonaj janotomię w podnerkowym IVC, lepszym niż wiązanie 2-0, i wprowadź ssanie z końcówką kałużową przez wenotomię (<silna klasa = "xfig">Ryc. 4C).</li>
		<li>Ukrwić wnętrzności 2-3 litrami zimnego roztworu UW.</li>
		<li>Kontynuuj sekcję w celu całkowitej pankreatektomii podczas perfuzji. 
		UWAGA: Wnętrzności, a w szczególności trzustka, powinny stać się blade, gdy roztwór UW jest przenikany do obszaru narządu stałego (<silna klasa = "xfig">Ryc. 5A).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Całkowita pankreatektomia
<ol>
	<li>Uwolnij jelito cienkie z retrakcji, gdy roztwór UW przenika.</li>
	<li>Rozpocznij preparację płatów dwunastnicy, łączących i śledziony trzustki podczas perfuzji trzewnej. Cofnij żołądek wyżej, aby odsłonić trzustkę. Za pomocą kombinacji rozwarstwienia i elektrokoagulacji należy wypreparować trzustkę z jej przyczepów omentalnych. 
	UWAGA: Trzon trzustki skutecznie owija się wokół żyły wrotnej. Należy uważać, aby żyła wrotna nie biegła do płata dwunastnicy, a następnie do przodu do mostu i płatów łączących.</li>
	<li>Odizoluj przewód trzustkowy (<silna klasa="xfig">Rysunek 5B). Zlokalizuj przewód trzustkowy w miejscu, w którym wchodzi do dwunastnicy. Podkleić kanał za pomocą dwóch jedwabnych opasek 3-0 i przeciąć kanał między opaskami.</li>
	<li>Zakończ pankreatektomię (<silna klasa="xfig">Rysunek 5C).
	<ol>
		<li>Wypreparuj pozostałą część płata dwunastnicy od pętli C dwunastnicy, aż stanie się swobodnie ruchomy.</li>
		<li>Oddziel trzustkę od pozostałych przyczepów. Ostrożnie podwiązaj i podziel małe naczynia od tętnicy krezkowej górnej do trzustki.</li>
		<li>Oddziel trzustkę od żyły wrotnej. Wypreparuj trzon trzustki i płat łączący z żyły wrotnej. Podwiązać wszelkie gałęzie żylne od żyły wrotnej do trzustki, w tym żyłę śledzionową.
		<ol>
			<li>Przeciąć mostek trzustki między płatem łączącym a płatem śledziony, aby umożliwić swobodną mobilizację z żyły wrotnej. 
			UWAGA: Uważaj, aby nie zakłócić płata dwunastnicy trzustki od płata śledziony.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zanurz całą trzustkę w zimnym, sterylnym roztworze UW, natychmiast umieszczając pojemnik na lodzie. Przetransportuj trzustkę do sterylnego kaptura w celu odizolowania wysp trzustkowych. Kontynuuj izolację wysp trzustkowych (<silna klasa="xfig">Ryc. 6).</li>
</ol>
7. Kaniulacja przewodu trzustkowego
<ol>
	<li>Umieść trzustkę na sterylnej tacy na lodzie wewnątrz szafki bezpieczeństwa biologicznego.</li>
	<li>Wypreparuj nadmiar tkanki włóknistej i krwi z dala od trzustki.</li>
	<li>W razie potrzeby przeciąć kanał poprzecznie, aby lepiej uwidocznić światło. Zlokalizuj i wsuń kaniulę do kanału za pomocą cewnika o odpowiednim rozmiarze (16 G).</li>
	<li>Zabezpiecz cewnik na miejscu za pomocą jedwabnej opaski 2.0, ale unikaj zasłaniania światła.</li>
	<li>Przygotuj trzy roztwory odkażające i zanurz kaniulowaną trzustkę w każdym roztworze odkażającym na 60 sekund.</li>
</ol>
8. Perfuzja i rozdęcie trzustki
<ol>
	<li>Przygotuj roztwór do trawienia enzymatycznego (<silna klasa="xfig">Rysunek 6).
	<ol>
		<li>Wymieszaj 100 mg dostępnych w handlu roztworów kolagenazy 1 i 2 (więcej informacji znajduje się w Tabeli materiałów) z pożądaną ilością 1x HBSS i 10 000 U roztworu heparyny. Jeśli wyizolowana tkanka trzustki ma od 100 g do 200 g, wymieszaj enzym z 200 ml łącznie 1x roztwór HBSS i heparyny.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Napełnij trzustkę roztworem enzymu.
	<ol>
		<li>Z kontrolowaną umiarkowaną siłą wlać roztwór enzymu w 60 ml bolusów do przewodu trzustkowego. Kontynuuj ten proces, aż cały roztwór enzymu zostanie wstrzyknięty do trzustki. 
		UWAGA: Skuteczna infuzja powinna spowodować rozciągnięcie tkanki trzustki.</li>
		<li>Jeśli jakiś roztwór enzymu wycieknie z tkanki trzustki do sterylnej tacy, należy ponownie wstrzyknąć pozostały roztwór do trzustki w kroku 8.3 lub umieścić go w komorze Ricordiego w kroku 9.2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pozostały roztwór enzymu należy wstrzyknąć bezpośrednio do słabo rozdętych segmentów miąższu trzustki za pomocą igły 22 G.</li>
</ol>
9. Trawienie trzustki
<ol>
	<li>Umieść zbiornik obwodowy zawierający 500 ml 1x HBSS w łaźni wodnej ustawionej na 47 °C, aby podgrzać roztwór zbiornika. 
	UWAGA: Roztwór enzymu działa optymalnie w temperaturze 36-38 °C i ta temperatura musi zostać osiągnięta w ciągu 5 minut od uruchomienia pompy perystaltycznej. Temperatura zawartości leku Ricordi, w tym trzustki podawanej enzymem, wynosi początkowo 4 °C. Poprzez wstępne podgrzanie zbiornika obiegu do 47 °C, zawartość zbiornika i komory Ricordi wymieszają się, podnosząc temperaturę całego obiegu do 36-38 °C w ciągu 5 minut od uruchomienia pompy perystaltycznej.</li>
	<li>Wyjmij i wyrzuć cewnik z przewodu trzustkowego i pokrój trzustkę na ~1-3 cm kawałki.</li>
	<li>Przygotować obwód trawienia. Pompa perystaltyczna będzie cyrkulować roztwór ze zbiornika obwodu mineralizacji, przez wężownicę grzewczą i do komory Ricordi (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 6).</li>
	<li>Umieść kawałki trzustki z dziewięcioma kulkami z azotku krzemu o średnicy 1,5 cm w komorze Ricordi i napełnij do poziomu filtra pozostałym roztworem enzymu.</li>
	<li>Aby uszczelnić komorę Ricordi, umieść filtr siatkowy i gumową uszczelkę, a następnie pokrywę na komorze Ricordi. Zabezpiecz pokrywę komory Ricordi, dokręcając i upewnij się, że komora jest dobrze uszczelniona przed kontynuowaniem.</li>
	<li>Umieść wężownicę grzewczą w gorącej łaźni wodnej o temperaturze 47 °C.</li>
	<li>Umieść kaniule doprowadzające i odpływowe w zbiorniku obwodu mineralizacyjnego zawierającym 500 ml 1x HBSS.</li>
	<li>Uruchomić pompę z natężeniem przepływu 450 ml/min, aż cała komora zostanie wypełniona roztworem wytrawiającym. Zmniejsz natężenie przepływu do 100 ml/min, gdy płyn krąży w obwodzie.</li>
	<li>Ręcznie potrząśnij komorą wytrawiania, aby poruszyć tkankę kulkami z azotku krzemu.</li>
	<li>Zaczynając od 8 minut trawienia, należy pobrać 1 ml próbki ze zbiornika obwodu do barwienia ditizonem (DTZ) w celu monitorowania postępu trawienia.
	<ol>
		<li>Aby przygotować barwienie DTZ, rozpuścić 10 mg DTZ w 2 ml dimetylosulfotlenku (DMSO).</li>
		<li>Dodać 10 μl przygotowanego barwnika DTZ do 1 ml próbki do wytrawiania. Sprawdź próbkę pod 4-krotnym powiększeniem. Wysepki będą ciemnoczerwone lub czarne z barwieniem DTZ. 
		UWAGA: Trawienie jest zakończone, gdy większość lub wszystkie obserwowane wysepki są "wolne" i nienaruszone, a tkanka groniasta jest rozproszona na mniejsze skupiska.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Gdy trawienie zostanie uznane za zakończone, przenieś cewkę do łaźni lodowej, wyjmij kaniulę dopływową ze zbiornika i zwiększ prędkość pompy do 210-250 ml/min. Pozwól, aby strawiona tkanka spłynęła z komory Ricordiego do zbiornika obwodu. 
	UWAGA: Typowe jest to, że po trawieniu w komorze Ricordi pozostaje bardzo mało tkanki. Zazwyczaj <10% niestrawionej tkanki trzustki pozostaje, chociaż może się to różnić w zależności od czynników specyficznych dla próbki.</li>
	<li>Zważ pozostałą tkankę, aby określić efektywność trawienia. Przenieś strawioną tkankę ze zbiornika obwodu do stożkowych probówek o pojemności 250 ml, które są utrzymywane w chłodzie na lodzie.</li>
</ol>
10. Pobieranie tkanki trzustki
<ol>
	<li>Odwirować strawioną tkankę trzustkową w stożkowych probówkach o pojemności 250 ml przy 250 × g przez 1 minutę w temperaturze 4 °C bez hamowania.</li>
	<li>Ostrożnie wyjąć probówki z wirówki i odessać supernatant za pomocą pipety serologicznej, unikając rozerwania osadu.</li>
	<li>Delikatnie zawiesić granulki w każdej stożkowej probówce i połączyć je w jedną stożkową probówkę o pojemności 250 ml. Jeśli w organizmie znajduje się ≤50 ml tkanki, zawiesić osad do całkowitej objętości 100 ml w roztworze do pobierania wysp trzustkowych. Jeśli w organizmie znajduje się >50 ml tkanki, należy ponownie zawiesić osad do całkowitej objętości 200 ml w roztworze do pobierania wysp trzustkowych. W przypadku, gdy zostanie pobranych ponad 100 ml tkanki, uruchom dwa cykle oczyszczania procesora komórkowego.</li>
	<li>Ponownie zawiesić tkankę w pożywce RPMI, aby uzyskać całkowitą objętość 100 ml (zakładając, że zebrano 50 ml tkanki) i załadować do procesora komórkowego.</li>
</ol>
11. Oczyszczanie wysepek metodą ciągłego gradientu
<ol>
	<li>Zalać procesor komórkowy zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Załaduj 125 ml roztworu gradientu o wysokiej gęstości do ciągłego formownika gradientu, a następnie załaduj roztwór gradientu o wysokiej gęstości do procesora komórkowego za pomocą pompy ustawionej na 200 ml / min.</li>
	<li>Uruchom funkcję wirówki Cell Processor przy 1,000 obr./min.</li>
	<li>Uwolnij powietrze z systemu i ponownie zalej roztworem gradientowym o dużej gęstości.</li>
	<li>Dodać 125 ml roztworu gradientu o dużej gęstości i 130 ml roztworu o niskiej gęstości do roztworu gradientowego.</li>
	<li>Załadować 100 ml strawionej zawiesiny tkankowej.</li>
	<li>Zwiększ prędkość procesora komórkowego do 2,000 obr./min na 3 min.</li>
	<li>Przygotować 16 stożkowych probówek o pojemności 50 ml do zbierania oczyszczonej frakcji wysp trzustkowych. Dodaj 25 ml pożywki RPMI do każdej probówki i ułóż wszystkie probówki w kolejności rosnącej.</li>
	<li>Zebrać oczyszczone frakcje wysp trzustkowych w przygotowanych stożkowych probówkach zbiorczych.</li>
</ol>
12. Ocena i barwienie wysepek
<ol>
	<li>Zebrać 100-200 μl podwielokrotności z każdej z oczyszczonych frakcji wysp trzustkowych i umieścić je na 24-dołkowej płytce do hodowli tkankowej w celu barwienia DTZ w celu oceny zawartości wysp trzustkowych i z każdej frakcji oczyszczającej. Zbadaj każdą frakcję za pomocą mikroskopii świetlnej z 4-krotnym powiększeniem. Wysepki będą ciemnoczerwone do czarnych z zabarwieniem DTZ.</li>
	<li>Po zidentyfikowaniu wysepek wybierz frakcje o największej zawartości wysepek. Odwirować oczyszczoną frakcję w temperaturze 250 × g przez 1 minutę w temperaturze 4 °C bez hamowania.</li>
	<li>Ostrożnie odessać supernatant i ponownie zawiesić osad wysepki w pożywce do wzrostu wysp. Przenieść oczyszczone wysepki do 1-4 kolb hodowlanych T-125.</li>
	<li>Po oczyszczeniu oceń wysepki pod względem ilości, żywotności i funkcji.
	<ol>
		<li>Użyj licznika komórek wysepek, aby ocenić liczbę wysepek i rozkład wielkości (Rysunek 7A). Cała trzustka zazwyczaj daje 1-2 miliony ekwiwalentów wysp trzustkowych.</li>
		<li>W celu barwienia żywotności zmieszaj 2 μl kalceiny AM i 2 μl homodimeru etydyny-1 (CaAM/EthD-1) z 1,000 μl PBS (<silna klasa = "xfig">Figura 7B). Pozwól wysepkom być zabarwionymi przez 30 minut, a następnie oceń je pod 4-krotnym lub 10-krotnym powiększeniem. Żywotne wysepki będą barwione na zielono, podczas gdy nieżywotne wysepki będą barwione na czerwono.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
13. Hodowla komórkowa wysp trzustkowych
<ol>
	<li>W ciągu początkowych 48 godzin hodować wysepki w pożywce regeneracyjnej w temperaturze 37 °C, aby zapewnić wystarczającą ilość składników odżywczych (~1 000 wysepek/ml pożywki regeneracyjnej).</li>
	<li>Od 2 do 21 dni hodować wysepki w standardowym podłożu w temperaturze 37 °C.</li>
</ol>

Purification of Porcine Islets by Surgical Perfusion of Pig Pancreas

<ol><li>Gillespie, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+1+diabetes%3A+pathogenesis+and+prevention%5BTitle%5D)+AND+%22CMAJ%22%5BJournal%5D)">Type 1 diabetes: pathogenesis and prevention.</a> CMAJ. 175 (2), 165-170 (2006).</li>
<li>Shapiro, A. M., Pokrywczynska, M., Ricordi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+pancreatic+islet+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Clinical pancreatic islet transplantation.</a> Nat Rev Endocrinol. 13 (5), 268-277 (2017).</li>
<li>Shapiro, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+transplantation+in+seven+patients+with+type+1+diabetes+mellitus+using+a+glucocorticoid-free+immunosuppressive+regimen%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen.</a> N Engl J Med. 343 (4), 230-238 (2000).</li>
<li>Anazawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+method+of+porcine+pancreas+procurement+with+arterial+flush+and+ductal+injection+enhances+islet+isolation+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Proc%22%5BJournal%5D)">Improved method of porcine pancreas procurement with arterial flush and ductal injection enhances islet isolation outcome.</a> Transplant Proc. 42 (6), 2032-2035 (2010).</li>
<li>Dufrane, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parameters+favouring+successful+adult+pig+islet+isolations+for+xenotransplantation+in+pig-to-primate+models%5BTitle%5D)+AND+%22Xenotransplantation%22%5BJournal%5D)">Parameters favouring successful adult pig islet isolations for xenotransplantation in pig-to-primate models.</a> Xenotransplantation. 13 (3), 204-214 (2006).</li>
<li>Hilling, D. E., Rijkelijkhuizen, J. K., Tons, H. A., Terpstra, O. T., Bouwman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porcine+islet+isolation+outcome+is+not+affected+by+the+amount+and+distribution+of+collagen+in+the+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Xenotransplantation%22%5BJournal%5D)">Porcine islet isolation outcome is not affected by the amount and distribution of collagen in the pancreas.</a> Xenotransplantation. 17 (3), 250-255 (2010).</li>
<li>Lamb, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+maturation+of+viable+islets+from+partially+digested+young+pig+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">In vitro maturation of viable islets from partially digested young pig pancreas.</a> Cell Transplant. 23 (3), 263-272 (2014).</li>
<li>Otsuka, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreas+preservation+with+a+neutrophil+elastase+inhibitor%2C+alvelestat%2C+contributes+to+improvement+of+porcine+islet+isolation+and+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Med%22%5BJournal%5D)">Pancreas preservation with a neutrophil elastase inhibitor, alvelestat, contributes to improvement of porcine islet isolation and transplantation.</a> J Clin Med. 11 (15), 4290(2022).</li>
<li>Vanderschelden, R., Sathialingam, M., Alexander, M., Lakey, J. R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cost+and+scalability+analysis+of+porcine+islet+isolation+for+islet+transplantation%3A+comparison+of+juvenile%2C+neonatal+and+adult+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Cost and scalability analysis of porcine islet isolation for islet transplantation: comparison of juvenile, neonatal and adult pigs.</a> Cell Transplant. 28 (7), 967-972 (2019).</li>
<li>Weegman, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature+profiles+of+different+cooling+methods+in+porcine+pancreas+procurement%5BTitle%5D)+AND+%22Xenotransplantation%22%5BJournal%5D)">Temperature profiles of different cooling methods in porcine pancreas procurement.</a> Xenotransplantation. 21 (6), 574-581 (2014).</li>
<li>Hart, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+an+adequate+perfusion+pressure+for+continuous+dual+vessel+hypothermic+machine+perfusion+of+the+rat+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Transpl+Int%22%5BJournal%5D)">Determination of an adequate perfusion pressure for continuous dual vessel hypothermic machine perfusion of the rat liver.</a> Transpl Int. 20 (4), 343-352 (2007).</li>
<li>Tullius, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accumulation+of+crystal+deposits+in+abdominal+organs+following+perfusion+with+defrosted+University+of+Wisconsin+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Transplant%22%5BJournal%5D)">Accumulation of crystal deposits in abdominal organs following perfusion with defrosted University of Wisconsin solutions.</a> Am J Transplant. 2 (7), 627-630 (2002).</li>
<li>Ching, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reliable+method+for+isolation+of+viable+porcine+islet+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Surg%22%5BJournal%5D)">A reliable method for isolation of viable porcine islet cells.</a> Arch Surg. 136 (3), 276-279 (2001).</li>
<li>Lu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+pig+islet+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Adult pig islet isolation.</a> J Vis Exp. (176), (2021).</li>
<li>Taylor, M. J., Baicu, S., Greene, E., Vazquez, A., Brassil, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+isolation+from+juvenile+porcine+pancreas+after+24-h+hypothermic+machine+perfusion+preservation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Islet isolation from juvenile porcine pancreas after 24-h hypothermic machine perfusion preservation.</a> Cell Transplant. 19 (5), 613-628 (2010).</li>
<li>Iwanaga, Y., Sutherland, D. E., Harmon, J. V., Papas, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreas+preservation+for+pancreas+and+islet+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Organ+Transplant%22%5BJournal%5D)">Pancreas preservation for pancreas and islet transplantation.</a> Curr Opin Organ Transplant. 13 (4), 445-451 (2008).</li>
<li>Pratschke, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+death+and+its+influence+on+donor+organ+quality+and+outcome+after+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Brain death and its influence on donor organ quality and outcome after transplantation.</a> Transplantation. 67 (3), 343-348 (1999).</li>
<li>vander Windt, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+islet+damage+after+direct+exposure+of+pig+islets+to+blood%3A+has+humoral+immunity+been+underestimated%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Early islet damage after direct exposure of pig islets to blood: has humoral immunity been underestimated.</a> Cell Transplant. 21 (8), 1791-1802 (2012).</li>
<li>Wright, M. J., Cavanagh, T. J., Fetterhoff, T. J., Wile, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+blood+content+on+porcine+pancreatic+dissociation+and+islet+yield%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Proc%22%5BJournal%5D)">Effect of blood content on porcine pancreatic dissociation and islet yield.</a> Transplant Proc. 26 (6), 3442(1994).</li>
<li>Toso, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+adult+porcine+islets+of+Langerhans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Isolation of adult porcine islets of Langerhans.</a> Cell Transplant. 9 (3), 297-305 (2000).</li>
</ol>

Autorzy nie zgłaszają konfliktu interesów.

Ksenotransplantacja wysp trzustkowych z wykorzystaniem dawców trzody chlewnej jest obiecującą strategią leczenia cukrzycy typu I. Izolacja wysp trzustkowych jest trudna, a końcowa żywotność i wydajność wysp trzustkowych są bardzo podatne na niedociśnienie i niedokrwienie tkanek występujące podczas pobierania narządów16,17. Aby zoptymalizować pobieranie i zachowanie trzustki, protokół ten przedstawia nową metodę kaniulacji aorty, izolacji trzewnej i perfuzji podczas pobierania trzustki świni przed izolacją wysp trzustkowych.
Powodzenie izolacji wysp trzustkowych świń zależy od optymalnego pozyskania i zachowania trzustki dawcy. Usunięcie całej krwi z tkanki trzustki ma kluczowe znaczenie dla optymalizacji izolacji wysp trzustkowych, ponieważ krew resztkowa w tkance prowadzi do aktywacji dopełniacza i zakrzepicy mikrokrążenia trzustki, co może pogorszyć wydajność i żywotność wysp trzustkowych 4,18. Poprzednie techniki obejmują również kaniulację aorty podnerkowej z płukaniem dotętniczym 13,14,15,19. Jednak główną zaletą przedstawionej tutaj techniki jest zastosowanie techniki Seldingera do kaniulacji aorty w celu utrzymania bezkrwawego pola operacyjnego. To nie tylko minimalizuje niestabilność hemodynamiczną przed zaciśnięciem krzyżowym aorty, ale także utrzymuje płaszczyzny rozwarstwienia w nieskazitelnym stanie dla pankreatektomii, umożliwiając szybszą regenerację narządów i minimalizując WIT. Technikę tę można również dostosować w zależności od wielkości świni, ponieważ osłona mniejszego kalibru może być używana dla mini-świń z aortami o mniejszej średnicy.
Dodatkowym atutem tej techniki jest znaczne zmniejszenie WIT. Wcześniejsze doniesienia cierpią na przedłużone okresy WIT po pankreatektomii po indukcji zatrzymania akcji serca lub wykrwawienia. Nawet w połączeniu z płukaniem dotętniczym i wewnątrzprzewodowym ex vivo , te techniki pozyskiwania są utrudnione przez WIT, na który trzustka świni jest szczególnie wrażliwa ze względu na specyficzną dla gatunku obfitość enzymów proteolitycznych i wysoką zawartość tłuszczu20. Przedłużony WIT może również zmienić wzdęcie tkanki trzustkowej, prawdopodobnie z powodu wzrostu oporu w przewodach trzustkowych. Może to znacznie zmniejszyć ilość enzymu docierającego do dystalnych przewodów trzustkowych, ogólną wydajność trawienia i wydajność izolacji wysp trzustkowych5.
Podczas udzielania zamówienia można napotkać pewne ograniczenia i pułapki, ale większości z nich można uniknąć dzięki starannemu planowaniu i jasnemu określeniu ról personelu na początku procedury. Chociaż pobranie operacyjne może być przeprowadzone przez dwóch operatorów, do przygotowania roztworu UW i pojemnika na trzustkę potrzebny jest trzeci asystent, który nie jest bezpłodny. Podczas wykonywania części zabiegu w klatce piersiowej ważne jest, aby wątroba była traktowana z delikatnym wycofaniem. Uraz i złamanie wątroby mogą prowadzić do uporczywego krwawienia przez cały czas trwania zabiegu. Jeśli tak się stanie, wątroba może być wypełniona wieloma poduszkami biodrowymi, aby ograniczyć krwawienie i ograniczyć krew zasłaniającą miejsce pobrania trzustki. Warto zauważyć, że identyfikacja i izolacja przewodu trzustkowego mają kluczowe znaczenie dla tej procedury.
Aby oczyszczanie przebiegło bez zakłóceń, do przeprowadzenia eksperymentu powinno być dostępnych dwóch dobrze wyszkolonych pracowników laboratorium. Zalecamy, aby jedna osoba zachowała bezpłodność podczas zabiegu, podczas gdy druga może być niesterylna. Pomoże to w przekazaniu krytycznych materiałów podczas zabiegu przy jednoczesnym zachowaniu sterylności podczas izolacji trzustki.
Podczas zabiegu perfuzji tętnice lędźwiowe, które wyłaniają się z aorty podnerkowej, zazwyczaj nie są identyfikowane i indywidualnie podwiązane. Może to prowadzić do znikomej objętości roztworu UW do dyspersji w wnętrznościach innych niż wnętrzności. Uważamy jednak, że zminimalizowanie czasu rozwarstwienia aorty i ryzyko uszkodzenia naczyń podczas manipulacji naczynia lędźwiowego przeważają nad niewielką nieefektywnością perfuzji UW, która nie dociera do tkanki trzustki.
Po zidentyfikowaniu przewodu trzustkowego należy wprowadzić cewnik przez przewód, aby kontynuować infuzję trzustki. Jeśli przewód trzustkowy jest uszkodzony, miąższ nie będzie się rozszerzał podczas późniejszej perfuzji roztworu trawiennego podczas izolacji wysp trzustkowych. W przypadku słabego rozdęcia izolacja wysp trzustkowych powinna zostać przerwana. Jeśli wzdęcie jest korzystne, pozostały enzym można wstrzyknąć do miąższu. Podsumowując, protokół ten zapewnia metodę izolacji trzewnej i perfuzji podczas pobierania trzustki świni w celu izolacji i oczyszczenia wysp trzustkowych. Zastosowanie techniki Seldingera do kaniulacji aorty minimalizuje zmiany hemodynamiczne i utratę krwi podczas pobierania. Metoda ta może być stosowana w połączeniu z izolacją wysp trzustkowych w celu zapewnienia wysepek trzody chlewnej do przyszłych badań, a ostatecznie do ksenotransplantacji.

Cukrzyca typu 1 jest spowodowana autoimmunologicznym niszczeniem komórek beta trzustki1. W związku z tym pacjenci są uzależnieni od egzogennej insuliny, co naraża ich na wysokie ryzyko wahań glikemii z epizodami hiper- i hipoglikemii2. Allotransplantacja wysp trzustkowych jest potencjalnym lekarstwem na cukrzycę typu I; Jednak ograniczona dostępność dawców narządów trzustki pozostaje główną przeszkodą w powszechnym przyjęciu tej procedury2,3. Ksenotransplantacja wysp trzustkowych od dawców świń jest obiecującą alternatywą, ponieważ zwierzęta te są łatwo dostępne. Optymalizacja i skalowanie izolacji wysp trzustkowych trzustki świń będzie miało kluczowe znaczenie dla postępu ksenotransplantacji wysp trzustkowych.
Chociaż kilka technik pobierania trzustki od świń zostało wcześniej opublikowanych, wiele z tych procedur opisuje pankreatektomię po indukcji śmierci sercowej lub wykrwawieniu4,5,6,7,8,9,10. Jedną z głównych wad tych technik jest zmienny ciepły czas niedokrwienny (WIT) występujący między czasem zgonu sercowego a rozpoczęciem dotętniczej i/lub wewnątrzprzewodowej infuzji roztworu konserwującego. Nawet 10 minut WIT negatywnie wpłynie na wydajność i żywotność wysepek5. Minimalizacja WIT wymaga szybkiej perfuzji trzustki roztworem konserwującym. Podczas pobierania narządów jamy brzusznej kaniulacja aorty, a następnie perfuzja śródustrojowa roztworem University of Wisconsin (UW) ma kluczowe znaczenie dla usuwania krwi, zapobiegania zakrzepicy wewnątrznaczyniowej, ochrony przed uszkodzeniem niedokrwiennym i minimalizacji uszkodzeń komórkowych11,12.
Poprzednie badania wykazały, że podczas pobierania trzustki u świń, niskociśnieniowe płukanie pnia trzewnego i tętnicy krezkowej górnej roztworem UW poprawia wydajność i czystość wysp trzustkowych4. Jednak wcześniej opublikowane metody pozyskiwania trzustki świń obejmują otwartą kaniulację aorty, która może być technicznie trudna, szczególnie w przypadku mniejszych świń13,14,15. W tym manuskrypcie przedstawiamy szczegółowy protokół krok po kroku wraz z towarzyszącymi pomocami wizualnymi do chirurgicznej perfuzji i pobrania trzustki świni, a następnie izolacji i oczyszczenia wysp trzustkowych. Ta nowa technika kaniulacji aorty podczas izolacji trzustki została opracowana specjalnie w celu zminimalizowania WIT i umożliwienia pobrania trzustki w polu bezkrwawym jako sposób na maksymalizację wydajności i żywotności izolacji wysp trzustkowych.

<table><tbody><tr><td>1 M NaOH, 100 ml</td><td>Millipore Sigma</td><td>1310-73-2</td><td></td></tr><tr><td>10x HBSS, 500 ml (15 do 30 &deg; C)</td> <td>Thermo Fisher</td><td>14065056</td><td></td></tr><tr><td>1x D-PBS, 500 ml</td><td>Thermo Fisher</td><td>14200075</td><td></td></tr><tr><td>1x HBSS, 1 L</td><td>Thermo Fisher</td><td>14025076</td><td></td></tr><tr><td>250 ml Probówki stożkowe</td><td>Millipore Sigma</td><td>CLS430236-6EA</td><td></td></tr><tr><td>Amfoterycyna B [50 mg]</td> <td>Millipore Sigma</td><td>PHR1662</td><td></td></tr><tr><td>Antyseptyczny Powidon Jod 10%</td><td>Millipore Sigma</td><td>25655-41-8</td><td></td></tr><tr><td>BioRad Gradient Former</td><td>BioRad</td><td>395</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek wapnia dwuwodny</td><td>Thermo Fisher</td><td>10035-04-8</td><td></td></tr><tr><td>Procesor komórkowy COBE</td><td>Ebay</td><td>317690&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Zbiornik obwodu trawienia, butelka Gibco, 1 L</td><td>Thermo Fisher</td><td>10341001</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>Thermo Fisher</td><td>85190</td><td></td></tr><tr><td>Dithizone</td><td>Thermo Fisher</td><td>60-10-6</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do łączenia gradientowego</td><td>BioRad</td><td>1652008</td><td></td></tr><tr><td>Heparyna [1000 U/mL]</td><td>Produkty ratownictwa medycznego</td><td>0409-2720-01</td><td></td></tr><tr><td>Bufor HEPES (1 m), 100 ml</td><td>Thermo Fisher</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy ludzkiej 25%, 100 ml</td><td>Celprogen</td><td>HSA2001-25-1</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Covetrus</td><td>Pozycja#:11695067772</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina</td><td>Patterson</td><td>Pozycja #:07-894-8462</td><td></td></tr><tr><td>Liberaza (100 mg)</td><td>Millipore Sigma</td><td>5401020001</td><td></td></tr><tr><td>ŻYWY/MARTWY Zestaw do żywotności/cytotoksyczności</td><td>Thermo Fisher</td><td>L3224</td><td></td></tr><tr><td>Limpholyte 1.1 Media 500 ml</td><td>Cedarlane Labs</td><td>CL5020</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex LS 16 Rurka</td><td>Masterfle</td><td>96419-16</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex Pompa perystaltyczna</td><td>Masterflex</td><td>07522-30</td><td></td></tr><tr><td>PenStrep (2 mg/ml)</td><td>Celprogen</td><td>PS-30-002</td><td></td></tr><tr><td>Pulmozyme (1 mg/ml, 2,5 ml/fiolkę)</td><td>Dornase Alfa</td><td>8931278</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka do odzysku, PIM(R)</td><td>Prodo Laboratories, Inc.</td><td>PIM-R001GMP</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Millipore Sigma</td><td>R8758-1L</td><td></td></tr><tr><td>Standardowa pożywka hodowlana, PIM(S)</td><td>Prodo Laboratories, Inc.</td><td>PIM-S001GMP</td><td></td></tr><tr><td>Tzed&trade; (tiletamina i zolazepam) Wstrzyknięcie C</td><td>Patterson</td><td>Pozycja #:07-894-6240</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór Uniwersytetu Wisconsin (UW), 3 l</td><td>Globalne roztwory do przeszczepów</td><td>1000-0046-06</td><td></td></tr><tr><td>Kąpiel wodna</td><td>Sigma Alderich</td><td>CLS6783-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Ksylazyna</td><td>Patterson</td><td>Pozycja #:07-891-6165</td><td></td></tr></tbody></table>

chirurgiczna perfuzja i izolacja trzustki świni w celu izolacji wysp trzustkowych

Surgical Perfusion and Isolation of the Porcine Pancreas for Islet Isolation

Przeszczep wysp trzustkowych jest nowym sposobem leczenia cukrzycy typu I; jednak jest ograniczony przez dopasowanie dawców i dostępność. Ksenotransplantacja wysepek trzustkowych świń stanowi obiecującą alternatywę dla allotransplantacji, z potencjałem do produkcji na dużą skalę funkcjonalnych wysepek trzustkowych na żądanie. Wydajność i żywotność izolowanych wysp trzustkowych jest wysoce podatna na jakość trzustki dawcy i sposób jej pozyskiwania, a zwłaszcza czas trwania ciepłego niedokrwienia. Aby poprawić zachowanie narządów, a następnie wydajność i żywotność wysp trzustkowych, opracowaliśmy protokół chirurgicznej perfuzji i resekcji trzustki świni. Protokół ten wykorzystuje bezpośrednią kaniulację aorty podnerkowej i perfuzję narządów, aby zarówno zminimalizować czas ciepłego niedokrwienia, jak i uprościć procedurę dla operatorów, którzy nie mają rozległej wiedzy chirurgicznej. Późniejsza perfuzja tętnicza trzustki przez aortę wypłukuje zastój krwi z mikrokrążenia, zmniejszając w ten sposób zakrzepicę i oksydacyjne uszkodzenie tkanki. Manuskrypt ten zawiera szczegółowy protokół chirurgicznej perfuzji i resekcji trzustki świni, a następnie izolacji i oczyszczenia wysp trzustkowych.

Układ operacyjny oraz laparotomię po linii środkowej przedstawiono na Rysunku 1. Cięcie laparotomijne powinno być zakrzywione, aby uniknąć otworu urogenitalnego (Rysunek 1B). Podczas przygotowania rozwieraka należy przymocować wspornik rozwieraka Omni lub Bookwaltera do lewego, dolnego rogu stołu. Optymalna retrakcja obejmuje dwa ramiona rozwieraka dla prawej ściany brzucha, dwa dla lewej ściany brzucha oraz 1-2 ramiona dla prawej strony okrężnicy i jelita cienkiego owiniętych w jałowy ręcznik (Rysunek 1C). W zależności od dostępności asysty oraz preferencji operatora można stosować ramiona rozwieracza do ściany ciała, narządów wewnętrznych lub ramiona plastyczne. W przypadku braku rozwieraka Omni lub Bookwaltera, do odciągnięcia ściany brzucha po obu stronach można użyć 1-2 samoprężnych rozwieraczy Balfoura. Asystent może wówczas zastosować retrakcję prawej części okrężnicy i jelita cienkiego owiniętego w jałowy ręcznik.
Disekcję zaotrzewnową przedstawioną na Rysunku 2 można przeprowadzić, stosując połączenie rozwarstwiania tępego i ostrego. Choć istotne jest uzyskanie obwodowej kontroli nad aortą oraz żyłą główną dolną (IVC) poniżej nerek, rozwarstwianie to nie musi być kontynuowane aż do rozwidlenia. Etap wewnątrzklatkowy procedury jest najtrudniejszy pod względem technicznym (Rysunek 3), ponieważ uszkodzenie odcinka wewnątrzklatkowego lubt zawątkowego IVC może spowodować znaczny krwotok i ograniczyć widoczność pola operacyjnego. Podczas identyfikacji zstępującej części aorty piersiowej należy tępo odseparować aortę od przełyku, używając kciuka i palca wskazującego. Aby uniknąć zerwania małych tętnic międzyżebrowych i następującego po tym krwawienia, kontrola obwodowa nie jest niezbędna, o ile zstępująca część aorty piersiowej jest dostępna i istnieje wyraźnie zdefiniowana przestrzeń umożliwiająca założenie zacisku aortalnego.
Kaniulację aorty podnerkowej przeprowadza się techniką Seldingera (Rysunek 4). Można to zrobić przy zaciśniętej proksymalnie i dystalnie aorcie podnerkowej (Rysunek 4A) lub bezpośrednio, bez zaciskania. Należy uważać, aby nie przebić igłą tylnej ściany aorty. W przypadku wystarczająco szerokiej aorty można zastosować większą osłonkę. Ważne jest usunięcie powietrza z przedłużenia linii dożylnej i sterylne połączenie linii IV z roztworem UW z osłonką 10Fr. Należy upewnić się, że kanał IV jest otwarty, choć przepływ nie rozpocznie się do momentu zaciśnięcia aorty (Rysunek 4B). Podczas wykonywania wenotomii w podnerkowej części żyły głównej dolnej (IVC), główny chirurg musi pewnie uchwycić IVC kleszczykami DeBakeya, aby nie zgubić miejsca wenotomii i uniknąć wylania dużej objętości krwi do pola operacyjnego. Wenotomia wykonana w oddaleniu od trzustki, wraz z szybkim zastosowaniem odessania z lejka, pozwala utrzymać bezkrwiste pole operacyjne z wyraźnymi płaszczyznami tkankowymi dla pankreatektomii (Rysunek 4C). Początkowy drenaż będzie składał się z ciemnej krwi żylnej, jednak jej kolor stanie się jaśniejszy w miarę upuszczania krwi świni i perfuzji narządów jamy brzusznej roztworem UW. Na tym etapie procedury należy użyć dużego pojemnika do odsysania.
Narządy wewnętrzne, a w szczególności trzustka, będą stawać się coraz bledsze w miarę perfuzji roztworem UW (Rysunek 5A). Przewód trzustkowy można zidentyfikować, śledząc przebieg części dwunastniczej trzustki w kierunku dwunastnicy. Przewód należy przeciąć pomiędzy dwiema jedwabnymi podwiązkami, aby uniknąć zanieczyszczenia treścią jelitową (Rysunek 5B). Chociaż miąższ trzustki powinien wydawać się blady i pozbawiony krwi, pozostała tkanka łączna otaczająca trzustkę powinna zostać oczyszczona przed izolacją wysepek (Rysunek 5C).
Pobrana trzustka może następnie zostać poddana wieloetapowemu procesowi izolacji i oczyszczania wysepek (Rycina 6). Rycina 7A przedstawia reprezentatywny rozkład wielkości wysepek po procesie izolacji i oczyszczania. Rycina 7B przedstawia oczyszczone wysepki w mikroskopii w polu jasnym oraz po barwieniu żywe/martwe, gdzie barwienie zielone i czerwone reprezentuje odpowiednio żywe i martwe komórki wysepek. Wydajność i czystość wysepek można ocenić za pomocą licznika komórek wysepek. Reprezentatywne wydajności z trzech niezależnych izolacji z trzustek świńskich zostały podsumowane na Rycynie 7C.
<img alt="Procedura chirurgiczna u znieczulonej świni, przedstawiająca laparotomię w linii środkowej i retraktor Omni." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66350/66350fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Schemat operacyjny. (A) Świnia ułożona w pozycji na plecach z jałowo przygotowanym brzuchem; (B) Laparotomia w linii środkowej wykonana od wyrostka mieczowatego do kości łonowej; (C) Przestrzeń zaotrzewnowa odsłonięta przy zastosowaniu retraktora Omni. Paski skali = 2 cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66350/66350fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat chirurgiczny ilustrujący dostęp zaotrzewnowy w celu kontroli podnerkowej IVC i aorty." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66350/66350fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Disekcja zaotrzewnowa. (A) Zakończona disekcja przestrzeni zaotrzewnowej z obwodową kontrolą podnerkowej IVC i żył nerkowych. Żółty prostokąt został powiększony na Rycini 2B; (B) Powiększony obraz podnerkowej IVC i żył nerkowych; (C) Podwiązane żyły nerkowe. Paski skali = 2 cm. Skrót: IVC = żyła główna dolna. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66350/66350fig02large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Procedura chirurgiczna na przeponie i wewnątrzklatkowej IVC; etapy nacięcia i kontroli obwodowej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66350/66350fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Uzyskanie kontroli nad naczyniami powyżej przepony (supraceliac). (A) Nacięcie prawej części przepony. Żółty kwadrat został powiększony na Rysunku 3B; (B) Rozszerzenie nacięcia prawej części przepony w celu odsłonięcia wewnątrzklatkowej IVC i zstępującej aorty piersiowej; (C) Uzyskanie kontroli obwodowej nad wewnątrzklatkową IVC. Paski skali = 2 cm. Skrót: IVC = żyła główna dolna. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66350/66350fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Proces operacji aorty podnerkowej, wprowadzenie pipety 10Fr, schemat, etapy interwencji naczyniowej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66350/66350fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Kanulacja aorty podnerkowej, izolacja trzewna i perfuzja. (A) Uzyskano kontrolę proksymalną i dystalną aorty podnerkowej; (B) wprowadzono pipetę 10Fr do aorty podnerkowej metodą Seldingera; (C) perfuzja trzewna poprzez pipetę aorty podnerkowej i drenaż poprzez wenotomię i ssak w dolnej części IVC. Paski skali = 2 cm. Skrót: IVC = dolna żyła główna. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66350/66350fig04large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Proces wycinania trzustki, opisana anatomia, badanie układu pokarmowego, eksperyment chirurgiczny." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66350/66350fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Całkowita pancreatektomia. (A) Narządy wewnętrzne stają się bledsze podczas perfuzji; (B) wyizolowany przewód trzustkowy; (C) wypreparowana trzustka świńska. Paski skali = 2 cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66350/66350fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat procesu izolacji i oczyszczania wysepek; trawienie enzymatyczne, zestaw do przetwarzania trzustki." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66350/66350fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6: Izolacja i oczyszczanie wysepek. Schematyczne przedstawienie infuzji roztworu enzymów, trawienia trzustki świńskiej, zbierania tkanek, płukania komórek za pomocą Cell Processor oraz hodowli i analizy komórek. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66350/66350fig06large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Izolacja wysepek trzustkowych; mikroskopia w polu jasnym i fluorescencyjna; wykres rozkładu wielkości; tabela czystości i wydajności." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66350/66350fig07.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 7"> 
Rycina 7: Reprezentatywna żywotność i wydajność wysepek po oczyszczaniu. (A) Wysepki świńskie po obrazowaniu w powiększeniu w polu jasnym oraz barwieniu żywe/martwe. Kolor zielony oznacza żywe komórki, a czerwony martwe komórki. Paski skali = 100µm (B) Histogram rozkładu wielkości wysepek świńskich po oczyszczaniu. (C) Tabela określająca czystość i wydajność wysepek z trzech izolacji wysepek trzustkowych świń. Skrót: IEQ = ekwiwalent wysepki, standardowa jednostka do ilościowego określania liczby wysepek. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66350/66350fig07large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Ten protokół zawiera przewodnik krok po kroku dotyczący pobierania trzustki świni do izolacji i oczyszczania wysp trzustkowych.

Chirurgiczna perfuzja i izolacja trzustki świni w celu izolacji wysp trzustkowych

Pancreatic islet transplantation is an emerging treatment for type I diabetes; however, it is limited by donor matching and availability. Porcine islet ...

Nasze laboratorium koncentruje się na mikrokapsułkowaniu do ksenotransplantacji wysp trzustkowych. Wymaga to niezawodnej izolacji i oczyszczania wysp trzustkowych. Radzimy sobie z tym wyzwaniem, izolując trzustkę bez uszkodzenia jej w wyniku niedokrwienia ciepłem lub urazu mechanicznego.A to zapewnia strategie skutecznego trawienia i wysoką wydajność wysepek. Izolowanie wysp trzustkowych jest bardzo trudne. Zarówno wydajność, jak i czystość zależą od tego, czy każda faza procesu jest wykonywana skutecznie i wydajnie, od pobrania narządów i trawienia po oczyszczanie wysp trzustkowych.Ponadto względy etyczne i humanitarne są ważne przy planowaniu procedur na zwierzętach, które ułatwią uzyskanie optymalnych wyników przy jednoczesnym zmniejszeniu cierpienia zwierząt. Więc tutaj pokazujemy, że możemy przezskórnie kanniulować aortę, aby selektywnie perfundować trzustkę. Ta technika pozwala nam skutecznie zachować trzustkę, a następnie wyizolować wyspy trzustkowe.Tak więc główną zaletą naszego protokołu jest zastosowanie techniki Seldingera do kaniulacji aorty. Pomaga to utrzymać bezkrwawe pole operacyjne i zachowuje płaszczyzny rozwarstwienia. Technikę tę można również łatwo dostosować do mniejszych świń, po prostu używając mniejszej osłony.Nasze laboratorium bada obecnie metody tworzenia podaży wysp trzustkowych na żądanie. W szczególności jesteśmy zainteresowani sprawdzeniem, czy zamknięcie wysp trzustkowych w hydrożelu może przedłużyć ich żywotność i poprawić ich funkcję w in vitro i w hodowli. Ostatecznym celem jest niezawodna izolacja wysp trzodowych świń w celu wykorzystania ich w badaniach transplantacyjnych, a nawet do ksenotransplantacji.Zacznij od przygotowania się do zabiegu. Aby wykonać rozwarstwienie zaotrzewnowe, należy naciąć otrzewną po prawej stronie linii środkowej od poziomu prawej nerki do rozwidlenia aorty za pomocą elektrokoagulacji. Ostro odsłonić prawą nerkę, prawą żyłę nerkową, prawą tętnicę nerkową i żyłę główną dolną, a także aortę.Korzystając z dużej pętli naczynia, uzyskaj obwodową kontrolę dystalnej aorty podnerkowej. Następnie uzyskaj kontrolę obwodową IVC w środkowej części podnerki i podwiąż IVC za pomocą jedwabnej opaski 2-0. Następnie uzyskaj kontrolę obwodową prawej i lewej tętnicy nerkowej i żył.Zwiąż te struktury za pomocą jedwabnych krawatów 2-0. Kontynuuj rozwarstwienie wewnątrz klatki piersiowej, cofając wątrobę niżej, aby odsłonić prawą półprzeponę. Przyłóż dwa zaciski Allis do błoniastej części prawej półmembrany i naciąć membranę między dwoma zaciskami za pomocą elektrokoagulacji.Przedłuż miotomię przepony w poziomie do około siedmiu centymetrów. Następnie należy uzyskać kontrolę obwodową IVC w obrębie klatki piersiowej. Umieść jedwabny krawat 2-0 wokół IVC wewnątrz klatki piersiowej i zatrzaśnij końce szwu małym hemostatem bez zasłaniania IVC.Następnie użyj dwóch zacisków Allis, aby cofnąć krawędź przepony dolnie i przedłużyć ją do lewej półmembrany. Podaj świni heparynę ogólnoustrojową w celu leczenia przeciwzakrzepowego przez obwodowy dostęp żylny i odczekaj co najmniej trzy minuty przed kontynuowaniem. Za pomocą igły do mikronakłuwania o rozmiarze 18 uzyskaj dostęp do aorty podnerkowej.Następnie przełóż drut j przez igłę do aorty i wyjmij igłę z drutu. Umieść 10 francuskiej osłony na drucie w aorcie i usuń drut. Następnie podłącz rurkę dożylną do 10 francuskich osłonek i wlej sterylny roztwór UW przez osłonkę w sterylny sposób z szybkością od 40 do 60 kropli na minutę.Następnie za pomocą zacisku aortalnego zaciśnij aortę podnerkową i zstępującą aortę piersiową. Związać IVC wewnątrz klatki piersiowej z wcześniej umieszczonym krawatem 2-0 i podać chlorek potasu przez obwodowy dostęp żylny w celu eutanazji. Następnie odizoluj przewód trzustkowy, lokalizując go przy wejściu do dwunastnicy.Podkleić kanał za pomocą dwóch jedwabnych opasek 3-0 i przeciąć kanał między opaskami. Ukończ pankreatektomię. Aby wstrzyknąć trzustkę roztworem enzymu, przepuść 60 mililitrowych bolusów do przewodu trzustkowego, aż cały roztwór enzymu zostanie wstrzyknięty.Umieść trzustkę w komorze Ricordi wraz z filtrem siatkowym i gumową uszczelką, a następnie przymocuj pokrywę do komory Ricordi, aby ją uszczelnić. Następnie umieść wężownicę grzewczą w gorącej łaźni wodnej ustawionej na 47 stopni Celsjusza. Włóż kaniule doprowadzające i odpływowe do zbiornika obwodu trawienia zawierającego 500 mililitrów 1X HBSS.Uruchomić pompę z natężeniem przepływu 450 mililitrów na minutę, aż cała komora zostanie wypełniona roztworem wytrawiającym. Następnie zmniejsz natężenie przepływu do 100 mililitrów na minutę, gdy płyn krąży w obwodzie. Aby rozpocząć, ustaw pompę na natężenie przepływu 200 mililitrów na minutę i załaduj 125 mililitrów roztworu gradientu o dużej gęstości do ciągłego kształtowania gradientu, a następnie do procesora komórkowego.Uruchom funkcję wirówki procesora komórkowego przy 1000 obr./min. Uwolnij powietrze z systemu i zalej go ponownie roztworem gradientowym o dużej gęstości. Następnie dodaj 125 mililitrów roztworu gradientowego o dużej gęstości i 130 mililitrów roztworu o niskiej gęstości do formy gradientu.Załaduj 100 mililitrów strawionej zawiesiny tkankowej. Zwiększ prędkość procesora komórkowego do 2000 obr./min na trzy minuty. Aby przygotować 16 50-mililitrowych stożkowych probówek do zbierania oczyszczonej frakcji wysp trzustkowych, dodaj 25 mililitrów pożywki RPMI do każdej probówki i ułóż je w kolejności rosnącej.Zbierz oczyszczone frakcje wysp trzustkowych w przygotowanych stożkowych probówkach. Aby poplamić wysepki. Zebrać od 100 do 200 mikrolitrów podwielokrotności z każdej oczyszczonej frakcji wysp trzustkowych i ocenić zawartość wysp trzustkowych za pomocą barwienia DTZ na 24-dołkowej płytce do hodowli tkankowej.Sprawdź każdą frakcję za pomocą mikroskopii świetlnej przy 4X, gdzie wysepki będą ciemnoczerwone lub czarne. Korzystając z tego protokołu, izolację wysp trzustkowych przeprowadzono u trzech świń. Obrazy w jasnym polu pokazały oczyszczone wyspy trzustkowe, które scharakteryzowano pod kątem żywotności przy użyciu barwienia żywego/martwego.Reprezentatywny rozkład wielkości wysepek po izolacji wysepek wykazał rozkład wielkości około 50 do 100 mikronów. Ponadto wydajność i czystość oceniano za pomocą licznika komórek wysp trzustkowych, co wskazuje na skuteczną izolację trzustki świni.

surgical-perfusion-isolation-porcine-pancreas-for-islet

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Uzyskanie wysokiej jakości i odpowiedniej ilości ludzkich wysepek trzustkowych jest jednym z głównych warunków koniecznych do pomyślnego przeszczepienia wysepek. W niniejszym filmie opisujemy krok po kroku procedury izolacji ludzkich wysepek trzustkowych (część I: trawienie i pobieranie tkanki trzustki) z wykorzystaniem zmodyfikowanej metody zautomatyzowanej.

Izolacja wysepek trzustkowych człowieka: Część I: Trawienie i pobieranie tkanki trzustki

Dostępność wysepek trzustkowych od osób z cukrzycą typu 2 do celów badawczych jest niewystarczająca. Przedstawiamy tutaj nasz protokół izolacji wysepek od pacjentów poddawanych częściowej pankreatektomii. Podejście to stanowi unikalną możliwość pozyskania wysepek od osób z cukrzycą typu 2 oraz klinicznie dopasowanych osób niediabetycznych w liczbie odpowiedniej do badań podstawowych i klinicznych.

Izolacja wysepek trzustkowych człowieka od pacjentów po częściowej pankreatektomii

Wyspy trzustkowe, zwane również wysepkami Langerhansa, to skupisko komórek endokrynnych, które produkują hormony do regulacji poziomu glukozy i innych ważnych funkcji biologicznych. Ten protokół wyjaśnia metodę izolowania wysp trzustkowych poprzez najpierw perfuzję kolagenazy przez Ampulla Vatera w celu trawienia zewnątrzwydzielniczej tkanki trzustki i uproszczone wirowanie gradientu gęstości w celu oczyszczenia wysp trzustkowych od myszy.

Izolacja wysp trzustkowych poprzez perfuzję kolagenazy: enzymatyczna metoda izolowania komórek wysp trzustkowych

Opisujemy tutaj protokół izolowania nienaruszonych wysepek od nowonarodzonych myszy. Trzustkę częściowo trawiono kolagenazą, a następnie myto i zbierano ręcznie. Od nowo narodzonych myszy można uzyskać od 20 do 80 klastrów wysp trzustkowych na trzustkę, które nadają się do kilku badań na wyspach trzustkowych.

Skuteczna izolacja funkcjonalnych wysp trzustkowych z trzustki noworodka myszy

Ten protokół izolacji wysp opisał nową drogę wstrzykiwania kolagenazy w celu trawienia tkanki zewnątrzwydzielniczej oraz uproszczoną procedurę gradientu do oczyszczania wysp trzustkowych z myszy. Obejmuje trawienie enzymatyczne, gradientową separację/oczyszczanie i ręczne zbieranie wysepek. Udana izolacja może dać 250–350 wysokiej jakości i w pełni funkcjonalnych wysepek na mysz.

Prosty protokół o wysokiej skuteczności izolacji wysp trzustkowych od myszy

Inżynieria tkankowa całej trzustki jest wyzwaniem ze względu na jej funkcje zewnątrzwydzielnicze i endokrynne. Przedstawiamy metodę preparacji nienaruszonej trzustki świni oraz proces udanej decelularizacji poprzez perfuzję detergentów Triton X-100, deoksycholanu sodu i dezoksyrybonukleazy.

Izolacja i decelularyzacja całej trzustki świni

Artykuł wideo podsumowuje technikę pankreatektomii i allotransplantacji trzustki w 3-dniowym modelu przeżycia świń, z opisem metody krok po kroku i naciskiem na chirurgiczne wskazówki i sztuczki, jak radzić sobie z niepewną i delikatną anatomią trzewną świni.

Porady i wskazówki chirurgiczne dotyczące wykonywania przeszczepu trzustki świń

W tym miejscu podajemy szczegółowe informacje na temat stymulowanego glukozą wydzielania insuliny (GSIS) poprzez perfuzję przez naczynia krwionośne myszy z nienaruszoną trzustką jako dodatkową technikę oceny funkcji endokrynnej trzustki z redukcją możliwych czynników zakłócających.

Stymulowane glukozą wydzielanie insuliny poprzez perfuzję przez naczynia krwionośne myszy z nienaruszoną trzustką

Badanie to opracowało uproszczoną metodę efektywnego wyodrębniania funkcjonalnych wysetek pierwotnych i komórek acynarnych z trzustki myszy, co stanowi cenne narzędzie do badania komunikacji międzykomórkowej w patogenezie ostrej cukrzycy indukowanej zapaleniem trzustki.

Prosta i szybka metoda jednoczesnej izolacji pierwotnych wysp i pierwotnych komórek acinowych trzustki od myszy

Protokół ten opisuje ustandaryzowaną metodę chirurgicznego pobierania brań, trawienia enzymatycznego oraz oczyszczania wysetek trzustkowych szczurów Lewisa w gęście, umożliwiając przygotowania o wysokiej wydajności i wysokiej czystości do bezpośredniego zastosowania w przeszczepach lub badaniach in vitro .

Izolacja i oczyszczanie wysepek trzustkowych od szczurów Lewisa za pomocą trawienia enzymatycznego i rozdzielania gęstościowo-gradientowego

Poznaj metodę chirurgicznej perfuzji i izolacji trzustki świni w celu uzyskania wysp trzustkowych o wysokiej czystości. Technika ta minimalizuje uszkodzenia mechaniczne i niedokrwienie, zapewniając optymalną wydajność izolacji.

Chirurgiczna perfuzja i izolacja trzustki świni w celu izolacji wysp trzustkowych

Przeglądaj więcej filmów