Monitorowanie oscylacji okołodobowych za pomocą reportera bioluminescencji w organoidach
February 16th, 2024
Rytmy okołodobowe, które istnieją w większości organizmów, regulują czasową organizację organoidów biologicznych processes. 3D ostatnio pojawiły się jako fizjologicznie istotny model in vitro. Protokół ten opisuje zastosowanie bioluminescencyjnych reporterów do obserwacji rytmów okołodobowych w organoidach, umożliwiając badania in vitro rytmów okołodobowych w układach wielokomórkowych.
Nasz obecny zakres badań polega na zbadaniu roli rytmów okołodobowych w proliferacji i różnicowaniu komórek nabłonka jelitowego. Próbujemy ustalić, czy zegar okołodobowy reguluje proliferację i różnicowanie komórek z jelitowych komórek macierzystych. Protokół ten przedstawia metodę monitorowania w czasie rzeczywistym dla badań okołodobowych w trójwymiarowych organoidach przy użyciu testu bioluminescencji.
W przeciwieństwie do przeprowadzania testu bioluminescencji w konwencjonalnej dwuwymiarowej hodowli komórkowej, to podejście umożliwia nam badanie rytmów okołodobowych i ich funkcji w bardziej fizjologicznie istotnym modelu organoidowym. Nasze odkrycia wskazują na destrukcyjne rytmy okołodobowe w warunkach wzbogaconych w komórki macierzyste, jednocześnie wykazując silne oscylacje okołodobowe w zróżnicowanych enteroidach jelitowych człowieka, co sugeruje przebudowę maszynerii zegara okołodobowego z komórek macierzystych na komórki zróżnicowane. Wykorzystanie organoidów pochodzących od pacjentów z okołodobowymi bioluminescencyjnymi reporterami pomoże nam pogłębić naszą wiedzę na temat rytmów okołodobowych w narządach obwodowych i różnych stanach chorobowych.
Na początek ułóż wszystkie materiały potrzebne do pakowania ludzkich enteroidów jelitowych lub HIE na platformie roboczej. Wymieszaj HIE z matrycą hodowli 3D o obniżonym współczynniku wzrostu. Wysiewaj mieszaninę na 24-dołkową płytkę z trzema kroplami po 10 mikrolitrów matrycy hodowlanej 3D na dołek i inkubuj przez 20 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.
Następnie dodaj 350 mikrolitrów pożywki wzrostowej HIE. Po siedmiu dniach zbierz HIE z czterech studzienek do 1,5-mililitrowych probówek. Odwirować HIE przy 2000 G przez 40 sekund, aby usunąć zanieczyszczenia.
Za pomocą pipety usuń nadmiar matrycy hodowlanej 3D z probówki. Dodaj 0,5 mililitra zimnego PBS do probówki. Używając jednomililitrowej strzykawki insulinowej, zastosuj turbulencje fizyczne za pomocą strzykawki do 10 razy, aby oddzielić HIEs.
Odwirować zdysocjowane HIE przy 2000 G przez 40 sekund i delikatnie usunąć supernatant. Następnie umieść probówkę na lodzie na około trzy minuty. Dodaj matrycę hodowlaną 3D o obniżonym współczynniku wzrostu do probówki i wymieszaj ją z osadem.
Zasiej mieszaninę HIE w matrycy hodowlanej 3D na środku okrągłej naczynia o średnicy 35 milimetrów. Inkubuj naczynie w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 20 minut, aby zestalić matrycę hodowli 3D. Następnie dodaj dwa mililitry wstępnie podgrzanej pożywki wzrostowej organoidów jelitowych do naczynia i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez 48 godzin.
Trzeciego dnia zastąp pożywkę wzrostową dwoma mililitrami wstępnie podgrzanej pożywki różnicującej i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez 48 godzin. W piątym dniu zastąp pożywkę enteroidową dwoma mililitrami wstępnie podgrzanej pożywki różnicującej i kontynuuj inkubację przez 24 godziny. Rozpocząć od wyjęcia z inkubatora naczynia zawierającego zróżnicowane HIEs.
Aby zsynchronizować zegar molekularny enteroidów, dodaj dwa mikrolitry 100 mikromolowego deksametazonu do naczynia i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez godzinę. Podczas inkubacji ustaw procent dwutlenku węgla i temperaturę luminometru odpowiednio na 5% i 37 stopni Celsjusza. Po synchronizacji zegara uzupełnij enteroidy trzema mililitrami wstępnie podgrzanego podłoża różnicującego zawierającego 200 mikromolową D-lucyferynę.
Umieścić naczynie w ośmiodołkowym stole do naczyń inkubatora i przykryć stół z naczyniami na próbki pokrywką. Umieść dwie komory nawilżacza z mokrą chusteczką lub gąbką na stole z naczyniami na próbki i zamknij pokrywę urządzenia. W oprogramowaniu do bioluminescencji kliknij zakładkę warunek, aby dostosować ustawienia liczby naczyń, czasu pomiaru, przetwarzania w tle i typu filtra.
Następnie kliknij OK, aby zapisać ustawienia. Aby rozpocząć eksperyment, kliknij kartę uruchamiania, a następnie przycisk Start. Następnie kliknij zakładki surowe, filtrowane szumami lub detrendowane u góry ekranu, aby obserwować sygnały dla wybranych danych.
Po nagraniu kliknij przycisk zatrzymania, aby zatrzymać bieg. Przejdź do zakładki plik, wybierz zapisz jako i zapisz dane w formacie Kronos. Na koniec kliknij plik i wybierz eksportuj jako format Excel, aby wyeksportować dane do arkusza kalkulacyjnego.
Zapis bioluminescencyjny oceniał rytmiczność okołodobową HIE w warunkach wzbogaconych komórkami macierzystymi i indukujących różnicowanie. Szybka analiza transformaty Fouriera wykazała, że w warunkach różnicowania bioluminescencja lucyferazy Bmal1 wykazywała silne oscylacje okołodobowe ze średnią okresowością 22,92 godziny. Z kolei HIE wykazały zakłócony rytm okołodobowy w warunkach wzbogaconych komórkami macierzystymi.
Przegląd
To badanie bada role rytmów dobowych w proliferacji i różnicowaniu komórek nabłonka jelitowego za pomocą trójwymiarowych organoidalnych struktur. Protokół opisuje metodę bioluminescencyjnego testu do monitorowania oscylacji dobowych, ujawniając istotne różnice w rytmice na podstawie stanu różnicowania komórek.
Kluczowe elementy badania
Obszar badań
- Rytmy dobowe
- Biologia nabłonka jelitowego
- Proliferacja i różnicowanie komórek
Tło
- Rytmy dobowe regulują różne procesy biologiczne w wielokomórkowych organizmach.
- Organoidy reprezentują bardziej fizjologicznie istotny model w porównaniu z tradycyjnymi 2D kulturami.
- Zrozumienie regulacji dobowych w komórkach macierzystych a komórkach zróżnicowanych jest kluczowe dla biologii rozwojowej.
Zastosowane metody
- Test bioluminescencyjny do monitorowania w czasie rzeczywistym rytmów dobowych
- Ludzkie jelitowe enteroidy (HIEs) jako model biologiczny
- Użycie organoidów pochodzących od pacjenta z bioluminescencyjnymi reporterami dobowymi
Główne wyniki
- Odnotowano mocne oscylacje dobowe w zróżnicowanych ludzkich jelitowych enteroidach.
- Warunki wzbogacone komórkami macierzystymi wykazywały zaburzone rytmy dobowe.
- Analiza szybkiej transformacji Fouriera potwierdziła średnią okresowość 22,92 godziny w warunkach różnicowania.
Wnioski
- Badanie pokazuje różnicowe regulacje rytmów dobowych podczas różnicowania jelitowego.
- Uzyskane wglądy mogą poszerzyć zrozumienie biologii dobowej w stanach chorobowych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Real-time bioluminescence monitoring of circadian oscillations in human intestinal organoids enables discovery teams to interrogate temporal regulation of cell proliferation and differentiation in a physiologically relevant 3D system. This approach advances predictive confidence in target validation for pathways influenced by circadian biology, supporting risk-adjusted decisions at early discovery and preclinical inflection points. Integration of patient-derived organoids further enhances translational continuity for disease-relevant research portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables mechanistic interrogation of circadian regulation in stem cell proliferation and differentiation.
- Supports biological de-risking by modeling multicellular interactions absent in 2D cultures.
- Improves predictive confidence for targets modulated by temporal cellular processes.
Screening & Assay Development
- Establishes validated 3D organoid systems for quantitative circadian readouts.
- Facilitates assay reproducibility and standardization through real-time bioluminescence measurement.
- Prepares robust platforms for compound evaluation in disease-relevant contexts.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro findings with in vivo physiology using patient-derived organoids.
- Enables investigation of circadian disruption in disease models for translational biomarker discovery.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation in peripheral organ systems.
Pipeline & Workflow Integration
This bioluminescence-based circadian monitoring method bridges early discovery, target validation, and preclinical research by providing quantitative, physiologically relevant data in 3D organoid models.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on circadian regulation of cell fate decisions.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative circadian outputs for assay development.
- Analytics: Provides time-series bioluminescence data and fast Fourier transform analysis for robust comparison of experimental conditions.
- Translational Research: Enables disease-relevant modeling using patient-derived organoids.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, reusable platform for diverse circadian and differentiation studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in circadian pathway studies.
- Operational Value: Standardizes real-time monitoring and enhances reproducibility in complex 3D systems.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and improves capital efficiency by de-risking early-stage targets.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of programs involving temporal regulation or disease-relevant circadian disruption.
Implementation Considerations
- Requires expertise in 3D organoid culture and bioluminescence assay setup.
- Needs access to incubating luminometers and analytical software for time-series data analysis.
- Demands cross-team standardization for reproducible circadian measurements.
- May require adaptation for different organoid types or disease models.
- Dependent on robust synchronization and differentiation protocols for consistent outputs.
