Name: Wytwarzanie termoplastycznych kanałów mikroprzepływowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-02-03T23:56:00.000+00:00
Duration: 16 min
Description: Poznaj wytwarzanie termoplastycznych mikroprzepływowych układów metodą mikrohot embossingu i termicznego łączenia. Naucz się izolacji kwasów nukleinowych metodą ekstrakcji na fazie stałej z zastosowaniem cząstek krzemionki.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Kanały mikroprzepływowe są wytwarzane w cyklicznej poliolefina (Zeonex® 690R, Zeon Chemical Inc., Louisville, KY). Zeonex posiada temperaturę przejścia szklistego (Tg) wynoszącą 136°C i jest przezroczysty dla promieniowania UV, co jest niezbędne dla chemii sterowanej światłem, wykorzystywanej w formowaniu porowatych monolitów. Mikrokanały są wytwarzane metodą mikroprasowania na gorąco z użyciem elektroformowanej matrycy z NiCo, która posiada negatywowe (odwrócone) cechy platformy mikroprzepływowej. Prasowanie na gorąco przebiega w następujący sposób:
<ol>
<li>Formę oraz polimerowy podłoże umieszcza się pomiędzy dwiema równoległymi metalowymi płytami grzejnymi.</li>
<li>Płyty są podgrzewane do temperatury tłoczenia (166°C), która jest o 30ºC wyższa od Tg materiału Zeonex.</li>
<li>Następnie płyty są dociskane do siebie przez około 5 min przy utrzymaniu ciśnienia na poziomie 250 psi.</li>
<li>Formę i podłoże wyjmuje się z podgrzanych płyt, pozostawia do ochłodzenia na 1-2 min, a następnie rozdziela się je ręcznie.</li>
<li>Na końcach kanałów wierci się otwory o średnicy 1,5 mm w celu wprowadzania i pobierania próbek.</li>
<li>Wytłoczone plastikowe podłoże jest następnie termicznie łączone z innym kawałkiem Zeonex w celu utworzenia zamkniętych kanałów mikrofluidycznych. Przed termicznym łączeniem wytłoczone podłoże i element przykrywowy mogą zostać poddane działaniu ozonu UV lub plazmy, aby zwiększyć szczelność i zapewnić wierność odwzorowania struktury zamkniętego kanału (Bhattacharyya and Klapperich, 2007).</li>
</ol>
Wytwarzanie kolumny do ekstrakcji w fazie stałej (SPE) wewnątrz plastikowych kanałów mikrofluidycznych
Wytwarzanie fazy stałej jest procesem dwuetapowym. W pierwszej kolejności wykonane mikrokanały poddawane są modyfikacji powierzchniowej w celu poprawy adhezji kolumny SPE do plastikowego urządzenia. W celu funkcjonalizacji ścianek polimerowych mikrokanałów stosuje się szczepienie poprzez fotopolimeryzację powierzchniową.
Procedura szczepienia przebiega w następujący sposób:
<ol>
<li>Mikrokanały wypełnia się mieszaniną etylenediakrylanu (EDA) i metakrylanu metylu (MMA) w stosunku 1:1 z dodatkiem 3% benzofenonu, który pełni rolę fotoinicjatora wyrywającego wodór. EDA, MMA oraz benzofenon zakupiono od firmy Sigma-Aldrich, St. Louis, MO.</li>
<li>Następnie chip poddaje się naświetlaniu promieniowaniem UV przez 10 min przy długości fali 254 nm i energii 200 mJ/cm2 w urządzeniu do naświetlania ultrafioletowego (CL-1000 UV Crosslinker, UPV Inc., Upland, CA). Szczepienie zachodzi w procesie polimeryzacji z wyrywaniem wodoru, co prowadzi do powstania przytwierdzonych do powierzchni łańcuchów polimerowych, które zostają włączone w mieszaninę polimeryzacyjną wykorzystywaną do przygotowania monolitu w drugim etapie.</li>
<li>Nadmiar monomeru usuwa się z kanałów poprzez płukanie 15 μL metanolu z wykorzystaniem aspiracji próżniowej.</li>
</ol>
Po procesie fotoprzeszczepiania w mikrokanałach tworzy się mikroporowaty monolit polimerowy, który unieruchamia cząsteczki krzemionki służące do ekstrakcji DNA. Porowaty monolit jest przygotowywany in situ w następujący sposób:
<ol>
<li>Kanały z modyfikowaną powierzchnią wypełnia się mieszaniną prekursorów monolitu składającą się z BuMA (15% wag.), EDMA (10% wag.), 1-dodekanolu (52,5% wag.), cykloheksanolu (22,5% wag.), DMPAP (1% wag. w stosunku do monomerów) oraz cząstek krzemionki 0,7 μm (15% w stosunku do całkowitej objętości mieszaniny prepolimeru). Mikrosfery krzemionkowe zakupiono od Polysciences, Inc. (Warrington, PA), a monomery i rozpuszczalniki porogenne od Sigma-Aldrich, St. Louis, MO.</li>
<li>Chip poddaje się naświetlaniu UV w krzyżowniku UV dawką 200 mJ/cm2 przez 1,1 min w celu zainicjowania polimeryzacji, a nadmiar monomeru usuwa się z kanałów, płucząc je 15 μL metanolu za pomocą aspiracji próżniowej.</li>
<li>Następnie do studzienek doprowadzających i zbierających w kanałach mikrofluidycznych mocuje się złącza fluidyczne (złącza NanoPortsTM, Upchurch Scientific, Oak Harbor, WA).</li>
<li>Porowaty monolit płucze się ponownie metanolem przez co najmniej 30 min przy użyciu pompy strzykawkowej z przepływem 100mL/hour.</li>
</ol>
Wytwarzanie monolitu do lizy CNT wewnątrz plastikowych kanałów mikrofluidycznych
Wytwarzanie monolitu lizującego z CNT (nanorurek węglowych) jest procesem dwuetapowym. W pierwszym kroku powierzchnia wytworzonych mikrokanałów zostaje zmodyfikowana (zaszczepiona) w taki sam sposób, jak w przypadku kolumn SPE w urządzeniu plastikowym.
Po procesie fotoszczepiania w mikrokanale powstaje mikroporowaty monolit polimerowy impregnowany wielościennymi nanorurkami węglowymi. Porowaty monolit jest przygotowywany in situ w następujący sposób:
<ol>
<li>Wielościenne nanorurki resuspensuje się w cykloheksanolu do stężenia 2,27M. Zawiesinę poddaje się sonikacji przez 30 minut przy amplitudzie 50% i cyklu pracy 50% przy użyciu sonifikatora do rozbijania komórek (Sonifier S-250D, produkowany przez Branson Ultrasonic, Danbury, CT). Sonikacja pozwoliła na uzyskanie skutecznej i stabilnej zawiesiny CNT o stężeniu 0,5M. CNT zakupiono w firmie Nanolabs (Brighton, MA).</li>
<li>Kanały z modyfikowaną powierzchnią wypełnia się podobną mieszaniną prekursorów monolitu, z tą różnicą, że zastosowano roztwór cykloheksanolu + CNT. Mieszanina monolitu składa się z BuMA (15% wag.), EDMA (10% wag.), 1-dodekanolu (52,5% wag.) oraz cykloheksanolu + CNT (22,5% wag.). Do roztworu dodaje się fotoinicjator DMPAP (1,13% wag. w stosunku do monomerów). Monomery, rozpuszczalniki porogenne oraz DMPAPA zakupiono w firmie Sigma-Aldrich, St. Louis, MO.</li>
<li>Chip naświetla się promieniowaniem UV w sieciującym urządzeniu UV z dawką 120 mJ/cm2 przez 0,9 min w celu zainicjowania polimeryzacji. Urządzenie obraca się o 180 stopni w sieciarku i naświetla przez kolejne 0,9 min przy 120 mJ/cm2. Nadmiar monomeru usuwa się z kanałów poprzez płukanie 50 μL metanolu z wykorzystaniem aspiracji próżniowej.</li>
<li>Następnie do otworów wlotowych i wylotowych kanałów mikrofluidycznych mocuje się złącza fluidyczne (złącza NanoPortsTM, Upchurch Scientific, Oak Harbor, WA).</li>
</ol>
Przygotowanie próbki bakteryjnej do zastosowania z monolitem lizującym z CNT
Przygotowanie próbki bakteryjnej obejmuje pomiar gęstości optycznej przy 600nm, aby upewnić się, że próbka nie jest zbyt skoncentrowana, co pozwoli uniknąć zapchania kanału.
<ol>
<li>Zmierz gęstość optyczną (OD) bakterii w medium przy 600nm za pomocą biofotometru (Eppendorf BioPhotometer, Eppendorf Scientific, Inc., Westbury, NY). Rozcieńcz próbkę tak, aby odczyty OD mieściły się w zakresie 0,18-0,25 A.</li>
<li>Wirowarkuj próbkę przy 6 500 rpm przez 5 minut, a następnie odlej nadsącz.</li>
</ol>
Lizowanie
<ol>
<li>Resuspenduj bakterie w GuSCN* + .01%SDS + 4% Proteinase K (0.8mg/ml). Krótko wymieszaj w wirówce typu vortex (1ml bakterii w medium należy resuspendować w 1ml GuSCN). Do roztworu dodano Proteinase K, aby wspomóc denaturację białek związanych z bakteryjnym DNA oraz zahamować działanie DNAaz i RNAaz. Dodatkową zaletą Proteinase K jest pomoc w rozkładzie białek ściany komórkowej, co jest pożądane, ponieważ ściany komórkowe bakterii gram-dodatnich i gram-ujemnych zawierają duże ilości białek (choć bakterie gram-ujemne zazwyczaj mają ich więcej). Bufor chaotropowy dodatkowo wspomaga Proteinase K w denaturacji białek, podczas gdy detergent niszczy ścianę komórkową. Proteinase K oraz tiocyjanian guanidyny (GuSCN) zakupiono w Qiagen Inc. (Valencia, CA). SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) zakupiono w Pierce (Rockford, IL).</li>
<li>Przenieś natychmiast próbkę do strzykawki połączonej z rurką PEEK. Odessij zawartość strzykawki tak, aby w układzie nie pozostało powietrze. Podłącz rurkę do nanoportu i kanału.</li>
</ol>
Do eksperymentów wykorzystano pompę strzykawkową KDS100 (produkowaną przez KD Scientific, Holliston, MA), a przepływ zastosowany we wszystkich etapach wynosił 450 μL/hour. Przesunąć próbkę przez kanał lizy z przepływem 450 μL/hour.
<ol>
<li>Pobrać próbkę i przystąpić do ekstrakcji DNA metodą SPE (patrz protokół ekstrakcji DNA). UWAGA: W przypadku tej próbki bakteryjnej nie należy wykonywać Kroku 2 obciążania, ponieważ zawiesina znajduje się w GuSCN*.</li>
</ol>
Protokół ekstrakcji DNA
Procedura ekstrakcji składa się z 3 etapów:
<ol>
<li>Załadowanie.</li>
<li>Przemywanie.</li>
<li>Elucja.</li>
</ol>
Do eksperymentów wykorzystano pompę strzykawkową KDS100 (produkowaną przez KD Scientific, Holliston, MA), a zastosowana szybkość przepływu we wszystkich etapach wynosiła 300 μL/hour.
Załaduj
<ol>
<li>Przed rozpoczęciem eksperymentu przygotuj kanał, przepływając przez niego bufor chaotropowy (GuSCN*, tiocyjanian guanidyny) przez 1-2 min.</li>
<li>Wymieszaj próbkę z buforem chaotropowym w stosunku 1:1.</li>
<li>Przepływaj mieszaninę próbki przez kanał przez 3 min.</li>
</ol>
Przemyć
<ol>
<li>Przemyj kanał 70% etanolem przez 2 min.</li>
<li>Przemyj kanał 100% etanolem przez 2 min.</li>
</ol>
Eluuj
<ol>
<li>Eluuj wyekstrahowane DNA w wodzie millipore przez 3 min. Pobierz 15 μL oczyszczonego DNA gotowego do reakcji PCR.</li>
</ol>
*Użyto GuSCN z zestawu Qiagen (bufor RLT).
&nbsp;

<ol><li>Bhattacharyya, A., Klapperich, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+and+chemical+analysis+of+plasma+and+ultraviolet-ozone+surface+treatments+for+thermal+bonding+of+polymeric+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Mechanical and chemical analysis of plasma and ultraviolet-ozone surface treatments for thermal bonding of polymeric microfluidic devices.</a> Lab Chip. 7, 876-882 (2007).</li>
</ol>

Autorzy nie zgłaszają żadnych konfliktów interesów.

wytwarzanie termoplastycznych kanałów mikroprzepływowych

Fabrication of the Thermoplastic Microfluidic Channels

W naszym laboratorium z powodzeniem wyizolowaliśmy kwasy nukleinowe bezpośrednio z mikrolitrowych i submikrolitrowych objętości ludzkiej krwi, moczu i kału, wykorzystując mikroskalową lizę opartą na kompozycie polimer/nanocząsteczka oraz kolumny do ekstrakcji w fazie stałej. Odzyskane próbki są skoncentrowanymi próbkami o małej objętości, które nadają się do reakcji PCR bez konieczności dodatkowego oczyszczania. W niniejszym materiale demonstrujemy sposób wytwarzania termoplastycznych chipów mikroprzepływowych przy użyciu tłoczenia na gorąco i zgrzewania termicznego. Następnie pokazujemy, jak wykorzystać in situ szczepienie powierzchni sterowane światłem oraz polimeryzację przez zgrzany chip w celu utworzenia kompozytowych kolumn do ekstrakcji w fazie stałej. Demonstrujemy szczepienie i polimeryzację kolumny z kompozytu nanorurek węglowych/polimeru do lizy komórek bakteryjnych. Następnie przedstawiamy proces lizy, po którym następuje ekstrakcja kwasów nukleinowych z próbki na chipie w fazie stałej przy użyciu kolumny z kompozytu krzemionka/polimer. Załączone protokoły zawierają szczegółowe instrukcje dotyczące wykonania zarówno kolumn do lizy, jak i kolumn do ekstrakcji w fazie stałej.

W niniejszym materiale demonstrujemy sposób wytwarzania termoplastycznych chipów mikrofluidycznych z wykorzystaniem tłoczenia na gorąco i zgrzewania termicznego. Następnie pokazujemy, jak wykorzystać in situ szczepienie powierzchni sterowane światłem oraz polimeryzację przez zgrzany chip w celu utworzenia kompozytowych kolumn fazy stałej.

Wytwarzanie termoplastycznych kanałów mikroprzepływowych

W naszym laboratorium z powodzeniem wyizolowaliśmy kwasy nukleinowe bezpośrednio z mikrolitrowych i submikrolitrowych objętości ludzkiej krwi, moczu i kału, wykorzystując...

Witajcie, nazywam się Aida Pria i właśnie ukończyłam studia doktoranckie w laboratorium dr Katherine KLAS tutaj na bu. Dzisiaj zaprezentuję proces wytwarzania termoplastycznego urządzenia mikrofluidycznego z wykorzystaniem mikroprasowania na gorąco oraz wiązania termicznego. Następnie zademonstruję izolację kwasów nukleinowych przy użyciu fazy stałej zawierającej cząsteczki krzemionki, a wyekstrahowane kwasy nukleinowe będą mogły zostać następnie wykorzystane do amplifikacji PCR, detekcji lub w dowolnym innym module diagnostycznym.Witam, nazywam się Dominika Kalinski i jestem doktorantką w Laboratorium Biomedycznych Mikro urządzeń i Mikrośrodowisk na Uniwersytecie Bostońskim. Opowiem o tworzeniu monolitu do lizy z nanorurek węglowych oraz urządzenia mikrofluidycznego, a także o tworzeniu monolitu do ekstrakcji w fazie stałej do izolacji DNA oraz urządzenia mikrofluidycznego. Dzisiaj zaprezentujemy eksperyment dotyczący produkcji i zastosowania mikroskalowych kolumn do lizy oraz kolumn do ekstrakcji w fazie stałej w termoplastycznych kanałach mikrofluidycznych.Kolumny te mogą być wykorzystywane do lizy komórek bakteryjnych oraz izolacji kwasów nukleinowych z lizatu komórkowego. Pierwszym krokiem w procesie jest wykonanie urządzeń mikrofluidycznych. W przypadku cyklicznej poliolefinie stosujemy polimer dostępny pod nazwą handlową xx XX six 90 R, którego temperatura zeszklenia wynosi 136 °C i który jest przezroczysty dla promieniowania UV.Przezroczystość w zakresie UV jest kluczowa dla chemii indukowanej światłem, wykorzystywanej do wytwarzania porowatego monolitu wewnątrz kanałów mikrofluidycznych. Niniejsza platforma mikrofluidyczna jest wytwarzana przy użyciu mikroprasowania na gorąco oraz wiązania termicznego. W pierwszej kolejności zaprezentuję proces mikroprasowania na gorąco.Zaczynamy od formy matki, która jest formą elektroformowaną z niklu i kobaltu; posiada ona negatywowe lub odwrócone cechy elementów wymaganych na platformie mikrofluidycznej. Następnie umieszczamy palety Zion Nex na wierzchu elementów, które są nam potrzebne na podłożu plastikowym. Forma zostaje następnie umieszczona w prasie termicznej, która jest podgrzana do temperatury o 30 stopni wyższej niż temperatura zeszklenia polimeru.Następnie całość przykrywa się drugą metalową płytką i dociska z siłą od 50 do 500 PSI. Po pięciu minutach można zwolnić nacisk i usunąć PLA. Po krótkim schłodzeniu obie płytki są rozdzielane ręcznie, a forma zostaje oddzielona od podłoża.Tak wygląda podłoże. Po wyjęciu z formy wiercimy otwory o średnicy 1.5 mm na końcach kanału, które będą służyć jako otwory wlotowe i wylotowe. Następnie to tłoczone podłoże jest spajane termicznie z innym gładkim kawałkiem plastiku w celu uformowania i zamknięcia struktur mikroprzepływowych.Oba elementy są w ten sposób przyklejane do płyty grzejnej. Temperaturę obniża się do temperatury zeszklenia polimeru, która wynosi 136 °C. Następnie, w celu przeprowadzenia procesu spajania termicznego, płyty metalowe umieszcza się w prasie termicznej, rozgrzanej do temperatury zeszklenia, czyli 136 °C, i prasuje razem pod ciśnieniem 250 PSI przez dwie minuty.W temperaturze zeszklenia polimer zaczyna topnieć i spajać się, co pozwala na uzyskanie zamkniętych elementów mikrofluidycznych. Po dwóch minutach ciśnienie zostaje zwolnione. Tak wygląda gotowe urządzenie mikrofluidyczne z zamkniętymi kanałami oraz portami dostępowymi do wprowadzania i pobierania próbek. Przejdziemy teraz do przygotowania mikrokanałów do formowania porowatego monolitu polimerowego.Pierwszym krokiem tego procesu jest szczepienie. Zmieniamy chemię powierzchni mikrokanałów oraz platformy Xan X six 90 R. Jest to niezbędne, aby umożliwić kowalencyjne przytwierdzenie porowatego monolitu polimerowego wewnątrz mikrokanału.Ta modyfikacja powierzchni jest procesem szczepienia, który obejmuje stosunek 1:1 EDA do MMA z fotoinicjatorem benzofenonem. W związku z tym przygotowuję roztwór o równym stężeniu MMA i EDA. Dodaję 3% benzofenonu, aby umożliwić sieciowanie tego monolitu wewnątrz kanału.Po wymieszaniu roztworu do szczepienia wprowadzamy go pipetą do mikrokanału, który wypełnia się dzięki działaniu kapilarnemu. Po wypełnieniu kanału umieszczamy go w urządzeniu do sieciowania UV, gdzie poddajemy procesowi sieciowania przez 10 minut przy poziomie energii 200 millijoules per centimeter squared. Po 10 minutach ekspozycji na promieniowanie UV roztwór do szczepienia oraz mikrokanał płuczemy metanolem, wykorzystując w tym celu aspirację próżniową.W tym miejscu umieszczę metanol na jednym końcu kanału, a następnie za pomocą próżni przepłuczę kanał metanolem. Ma to na celu usunięcie nadmiaru nie spolimeryzowanego roztworu. Jest to porównanie cyclo, etanolu i cyclin, we wszystkich przypadkach z nanorurkami węglowymi w stężeniu 2,27 M.Cyclinę z nanorurkami węglowymi poddano mieszaniu w celu uzyskania równomiernej dyspersji nanorurek węglowych w roztworze. Po procesie szczepienia chemia powierzchni została zmodyfikowana i jest teraz gotowa do trwałego przytwierdzenia monolitu w mikrokanale. Teraz opiszę proces tworzenia monolitu VICIS z nanorurek węglowych.Skład mieszaniny obejmuje odczynniki, rozpuszczalniki oraz monomery. Czterema elementami zaangażowanymi w ten proces są al to ecol, metakrylan butylu i EDMA. Dodatkowo dodajemy fotoinicjator, aby umożliwić formowanie monolitu in situ za pomocą polimeryzacji UV.Przygotuję próbkę o objętości 100 µL. Pipetuję 52,5 µL ecol. Należy to zrobić powoli, ponieważ ecol jest lepki.Po dodaniu ecol dodamy nanorurki węglowe z cyklo-anolem. Roztwór ten należy energicznie wymieszać w wstrząsarze Vortex przez kilka minut, aby zapewnić odpowiednią dyspersję. Ponownie przypominamy, że cyklo-andale oraz nanorurki węglowe należy pipetować powoli, ponieważ jest to roztwór Abicus.Następnie dodajemy 15 µL butylmetakrylanu. Na koniec dodajemy 10 µL EDMA. Mieszaninę krótko wierzchamy w wstrząsarku wortex, dodajemy fotoinicjator, a następnie poddajemy sonikacji.Do monolitu lizującego dodajemy fotoinicjator DM PAP. Jest on dodawany w stężeniu 1,13 do całkowitej objętości tego 100 µL roztworu. Po dodaniu, ze względu na właściwości fotoinicjatora, należy przykryć roztwór w monolicie lizującym, aby zapobiec ekspozycji na światło podczas sonikacji.Próbkę poddaje się działaniu ultradźwięków przez 30 minut przy amplitudzie 50% i cyklu pracy 50%. Zastosowanie 50% cyklu pracy ma na celu zapobieganie przegrzaniu roztworu. Niezwykle ważne jest, aby po sonikacji niezwłocznie przystąpić do dalszych etapów pracy z roztworem.Dzieje się tak, ponieważ chcemy zapewnić równomierne rozproszenie nanorurek węglowych w roztworze, gdyż będziemy go pipetować do mikrokanału. Tutaj mamy roztwór lizujący. Bezpośrednio po sonikacji i działając bardzo sprawnie, pipetujemy odpowiednią objętość do mikrokanału, wykorzystując siły kapilarne, dzięki którym roztwór wpływa do kanału.Umieszczamy to w urządzeniu do sieciowania na 0,9 minuty przy poziomie energii 120 mJ/cm². Po tych 0,9 minuty odwracamy urządzenie. To odwrócenie służy w zasadzie zapewnieniu bardziej równomiernej polimeryzacji oraz bardziej równomiernego rozkładu nanorurek węglowych w kanale.Po spolimeryzowaniu monolitu i wypłukaniu go roztworem monomeru w metanolu, monolit wewnątrz nie będzie już przejrzysty, lecz przybierze intensywnie biały kolor z drobnymi czarnymi kropkami, które stanowią nanorurki węglowe w monolicie. Monolit do ekstrakcji do fazy stałej jest wykonany w sposób podobny do monolitu do lizy nanorurek węglowych. To są bakterie i kultura płynna, a tutaj mamy próbkę naszego medium.Po rozcieńczeniu próbki, przenosimy ją pipetą do probówki i wirujemy. Następnie odlewamy pożywkę, dbając o to, aby nie naruszyć osadu bakteryjnego znajdującego się z boku probówki typu Eppendorf. Następnie bakterie resuspensujemy w roztworze zawierającym gudo, dium, thio, SDS oraz proteazę K. Objętość pipetowanego tiocyjanianu gu diem jest taka sama, jak objętość roztworu, w którym zawieszono bakterie.W tym przypadku bakterie zawieszono w 1 ml, więc zawieszę je ponownie w 1 ml tiocyjanianu guanidyny. Dodam proteinazę K. Dodaję 45 µL oraz RNAs. Ostatnim roztworem, który dodaję, jest SDS.Następnie roztwór należy wymieszać w wirówce vortex. Po wymieszaniu próbkę bakterii przenosimy pipetą do jednorazowej strzykawki. W tym przypadku używamy jednorazowej strzykawki Excel o objętości 3 ml.Ten element posiada złączkę Luer, którą łączy się z rurką Peak, a następnie podłączymy ją do naszego urządzenia za pomocą nanoportów. Pipetuję teraz roztwór do jednorazowej strzykawki. Należy go zasysać, aby upewnić się, że w układzie nie ma powietrza.Należy kontynuować tę czynność do momentu, aż z drugiego końca wypłynie jedna lub dwie krople. Teraz, gdy roztwór jest gotowy do podłączenia do urządzenia, umieścimy jednorazową strzykawkę w pompie strzykawkowej KDS i podłączymy koniec złączki do naszego urządzenia, które posiada nanoporty z nakładkami na obu końcach. Pozwala to na zapewnienie szczelnego połączenia z urządzeniem.Są to złączki gwintowane; zazwyczaj zaleca się przymocowanie urządzenia taśmą, aby upewnić się, że się nie przesunie. Tutaj ustawimy szybkość przepływu na poziomie czterech lub pięciu ml/h. Jest to pompa wyporowa, która wymusi przepływ roztworu przez strzykawkę, przewod i złącze do kanału.Próbkę pobierzemy przez ten wylotowy nanoport. Zanieczyszczenie można pobrać za pomocą pipety, a następnie poddać je kolejnemu etapowi – procesowi ekstrakcji do fazy stałej w celu wyizolowania bakteryjnego DNA do izolacji kwasów nukleinowych. Faza stała zawierająca cząsteczki krzemionki jest kondycjonowana buforem lizującym zawierającym gwanidynian.Wykonuje się to poprzez napełnienie strzykawki buforem lizującym i podłączenie jej do pompy strzykawkowej, a następnie przepływ buforu przez kanał z prędkością 300 µL/h. Następnie następuje załadowanie próbki. Próbką w tym przypadku jest lizat komórek bakteryjnych otrzymany w poprzednim etapie lizy.Ponownie, podczas ładowania, próbkę tę ładuje się przez trzy minuty przy szybkości przepływu 300 µL/h. Następnie kanał płucze się 70% etanolem, ponownie przy szybkości przepływu 300 µL/h. Ten etap płukania usuwa wszystkie nieprzylegające białka i zanieczyszczenia, a odpady są zbierane w pojemniku na odpady.Następnie, po etapie płukania, który usuwa wszystkie zanieczyszczenia, używamy pipety. DNA związane z krzemionką jest następnie eluowane do wody. Jest to strzykawka zawierająca wodę wysokiej czystości.Jest on przytwierdzony do chipa, a następnie ponownie przepuszczana jest woda z przepływem 300 µL/h, a próbkę zbieramy z drugiego końca. Proces ten trwa trzy minuty, w wyniku czego otrzymujemy 15 µL eluatu, który stanowi czyste DNA w wodzie i jest gotowy do reakcji PCR w celu wykonania urządzenia z tworzywa termoplastycznego. Największym wyzwaniem jest kwestia łączenia termicznego, ponieważ proces ten odbywa się w bardzo wysokiej temperaturze, równej lub bliskiej temperaturze zeszklenia polimeru, przy zastosowaniu określonego nacisku; niewielkie zmiany ciśnienia lub temperatury mogą całkowicie zniszczyć kanał lub spowodować nieszczelne połączenie między dwiema plastikowymi częściami.Utrzymanie optymalnej temperatury i ciśnienia jest zatem bardzo ważne i może stanowić pewne wyzwanie. Kluczowym i trudnym elementem tego procesu jest uzyskanie równomiernego rozkładu nanorurek węglowych w roztworze monomeru, który jest polimeryzowany in situ za pomocą promieniowania UV. Jest to wyzwanie podobne do zapewnienia równomiernej dyspersji cząsteczek krzemionki w porowatym monolicie polimerowym stosowanym w ekstrakcji do fazy stałej.

fabrication-of-the-thermoplastic-microfluidic-channels

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Źródło: Kurz, D. L. i in. Platforma mikrofluidyczna do badania biozatkania w porowatych ośrodkach. J. Vis. Exp. (2022)Film demonstruje użycie urządzenia mikrofluidycznego do badania powstawania biofilmu. Do mikrokanału wprowadzana jest zawiesina bakteryjna, po której następuje inkubacja, umożliwiająca rozwój biofilmu. Następnie wznawia się przepływ, a monitorowanie ciśnienia wraz z obrazowaniem wykorzystuje się do wykrywania powstawania biofilmu i zatkania porów w czasie.

Urządzenie mikrofluidyczne do obrazowania w czasie rzeczywistym i śledzenia ciśnienia podczas tworzenia biofilmu

Platforma mikrokanałów na chipie została opracowana przez połączenie techniki fotorezystu fotolitografii rozpływowej, miękkiej litografii i mikrofluidyki. Platforma mikrokanalizacyjna naśladuje trójwymiarową (3D) geometrię mikronaczyń in vivo, działa w kontrolowanym ciągłym przepływie perfuzyjnym, umożliwia wysokiej jakości obrazowanie w czasie rzeczywistym i może być stosowana do badań mikronaczyniowych.

Procedura opracowywania wielogłębokościowych, okrągłych, śródbłonkowych mikrokanałów o przekroju międzybłonkowym na chipie

Dwa sąsiadujące ze sobą płyny przechodzące przez rowkowany kanał mikroprzepływowy mogą być skierowane tak, aby tworzyły osłonę wokół rdzenia prepolimerowego; określając w ten sposób zarówno kształt, jak i przekrój. Polimeryzacja inicjowana foto, taka jak chemia tiolowa, doskonale nadaje się do szybkiego zestalania płynu rdzeniowego w mikrofibrę o określonym rozmiarze i kształcie.

Mikroprzepływowa produkcja włókien polimerowych i biohybrydowych o wstępnie zaprojektowanym rozmiarze i kształcie

Opisano protokół wytwarzania plastikowych urządzeń mikroprzepływowych z przezroczystymi otworami do obrazowania światłem widzialnym i podczerwonym.

Miękka procedura litograficzna do wytwarzania plastikowych urządzeń mikroprzepływowych z otworami widokowymi przezroczystymi dla światła widzialnego i podczerwonego

Kanał mikroprzepływowy z odkształcalnymi ściankami bocznymi oferuje kontrolę przepływu, obsługę cząstek, dostosowywanie wymiarów kanału i inne rekonfiguracje podczas użytkowania. Opisujemy metodę wytwarzania kanału mikroprzepływowego ze ściankami bocznymi wykonanymi z układu pinów, który umożliwia zmianę ich kształtu.

Rekonfigurowalny kanał mikroprzepływowy z dyskretnymi ściankami bocznymi

Dostępnych jest kilka metod wytwarzania kanałów o przekrojach nieprostokątnych osadzonych w urządzeniach mikroprzepływowych z polidimetylosiloksanu. Większość z nich wiąże się z wieloetapową produkcją i rozległym wyrównaniem. W artykule przedstawiono jednoetapowe podejście do wytwarzania kanałów mikroprzepływowych o różnych przekrojach geometrycznych za pomocą sekwencyjnego trawienia na mokro polidimetylosiloksanu.

Jednoetapowe podejście do wytwarzania kanałów mikroprzepływowych z polidimetylosiloksanu o różnych przekrojach geometrycznych za pomocą sekwencyjnych procesów trawienia na mokro

Ten protokół opisuje wytwarzanie urządzeń mikroprzepływowych z MY133-V2000 w celu wyeliminowania artefaktów, które często powstają w mikrokanałach z powodu niezgodności współczynników załamania światła między strukturami mikrokanalików a roztworem wodnym. Protokół ten wykorzystuje akrylowy uchwyt do ściskania zamkniętego urządzenia, poprawiając przyczepność zarówno chemicznie, jak i mechanicznie.

Produkcja urządzeń o dopasowanym współczynniku załamania światła dla mikrofluidyki biomedycznej

Tutaj prezentujemy protokół do projektowania i produkcji niestandardowych urządzeń mikroprzepływowych przy minimalnym nakładzie finansowym i czasowym. Celem jest ułatwienie przyjęcia technologii mikroprzepływowych w biomedycznych laboratoriach badawczych i placówkach edukacyjnych.

Szybka produkcja niestandardowych urządzeń mikroprzepływowych do zastosowań badawczych i edukacyjnych

Mikrofluidyka to potężne narzędzie do tworzenia testów diagnostycznych. Jednak często wymagany jest drogi sprzęt i materiały, a także pracochłonne techniki wytwarzania i obsługi. W tym miejscu szczegółowo opisujemy protokół wytwarzania akrylowego urządzenia mikroprzepływowego do magnetycznych testów immunologicznych opartych na mikro- i nanocząsteczkach w tanich i prostych w użyciu.

Mikromielenie mikroprzepływowe urządzenia akrylowego sterowane numerycznie z ograniczeniem naprzemiennym dla testów immunologicznych opartych na nanocząstkach magnetycznych

Obecny protokół opisuje platformę mikroprzepływową do badania rozwoju biofilmu w porowatych ośrodkach quasi-2D poprzez połączenie obrazowania mikroskopowego o wysokiej rozdzielczości z jednoczesnymi pomiarami różnicy ciśnień. Platforma określa ilościowo wpływ wielkości porów i natężenia przepływu płynu w porowatych ośrodkach na biozatkanie.

Platforma mikroprzepływowa do badania biozatykania w pożywkach porowatych

Poznaj wytwarzanie termoplastycznych mikroprzepływowych układów metodą mikrohot embossingu i termicznego łączenia. Naucz się izolacji kwasów nukleinowych metodą ekstrakcji na fazie stałej z zastosowaniem cząstek krzemionki.

Wytwarzanie termoplastycznych kanałów mikroprzepływowych

Przeglądaj więcej filmów