Name: Analizy zakażeń komórek nabłonkowych preparatem Shigella (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-09T14:20:00.000+00:00
Duration: 4 min 56 s
Description: Poznaj metody infekcji komórek nabłonkowych przez Shigella, w tym adherencję, inwazję i replikację wewnątrzkomórkową. Protokół ten umożliwia badanie mechanizmów patogenezy i opracowanie skuteczniejszych terapii przeciwko zakażeniom Shigella.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wsparcie dla autorów obejmuje Departament Pediatrii Massachusetts General Hospital, nagrodę Komitetu Wykonawczego ds. Tymczasowego Wsparcia Badań (ISF) 2022A009041, grant Narodowego Instytutu Alergii i Chorób Zakaźnych R21AI146405, oraz grant National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases Nutrition Obesity Research Center at Harvard (NORCH) 2P30DK040561-26. Fundatorzy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badania, gromadzeniu i analizie danych, podejmowaniu decyzji o publikacji lub przygotowaniu manuskryptu.

Protocols for Analyzing Shigella Infection in Colonic Epithelial Cells

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Protokół ten opisuje zestaw trzech standaryzowanych testów do badania przylegania, inwazji i wewnątrzkomórkowej replikacji komórek nabłonka jelitowego. Chociaż metody te są jedynie zmodyfikowanymi wersjami klasycznych testów gentamycyny stosowanych do badania inwazji i wewnątrzkomórkowej replikacji różnych patogenów bakteryjnych w komórkach gospodarza 49,50,51, podczas badania Shigella należy zastosować specjalne względy.
Shigella to fakultatywne beztlenowce, które rosną optymalnie w temperaturze 37 °C w bogatym podłożu z napowietrzeniem43. Podczas wykonywania tych testów w celu zbadania wpływu różnych sygnałów środowiskowych lub metabolitów na infekcje Shigella, zaleca się hodowlę Shigella w bogatych pożywkach przez noc, a następnie subkulturę w zdefiniowanych lub uzupełnionych pożywkach do połowy fazy logarytmicznej przed infekcją. Maksymalna ekspresja genu wirulencji zachodzi w logarytmicznej fazie wzrostu52,53. Tak więc, subkulturacja kultur Shigella przez noc i umożliwienie wzrostu bakterii do fazy wykładniczej (OD600 ~ 0,7) są niezbędnymi krokami do prawidłowej oceny zjadliwości Shigella. Co więcej, ekspresja genów wirulencji jest zależna od temperatury. Aby zapewnić swoistość ekspresji tylko podczas infekcji gospodarza, geny wirulencji są indukowane w temperaturach fizjologicznych gospodarza (37 °C) i ściśle tłumione w niższych temperaturach (np. 30 °C)54. Aby zapewnić ekspresję genów wirulencji, hodowla bakterii i infekcje muszą być przeprowadzane w temperaturze 37 °C, z należytą ostrożnością, aby temperatura nie spadła poniżej 37 °C. Duży, 220-kilozasadowy plazmid wirulencji, który koduje maszynerię molekularną wymaganą do inwazji i infekcji komórek nabłonkowych, jest niezbędnym wyznacznikiem wirulencji dla wszystkich Shigella spp5. Powtarzające się pasażowanie i przedłużony wzrost w temperaturze 37 °C sprzyjają niestabilności plazmidu wirulencji, co skutkuje utratą plazmidu i sprawia, że komórki Shigella stają się awirulentem55. Aby zapewnić utrzymanie plazmidu wirulencji i ekspresję kluczowych genów wirulencji, zaleca się ponowne przerzucanie bakterii bezpośrednio z zapasów zamrażarki co dwa tygodnie na świeże czerwone płytki wskaźnikowe TSB + Kongo. Czerwony agar Kongo może być używany do rozróżniania kolonii zjadliwych typu dzikiego (czerwony, CR+) i kolonii awirulentowych (białych, CR-), które utraciły zjadliwy plazmid45. Jeśli niestabilność plazmidu wirulencji jest wielokrotnie obserwowana, nocne kultury Shigella można inkubować w temperaturze 30 °C, aby zapobiec utracie plazmidu wirulencji, a następnie subkulturować w temperaturze 37 °C w celu promowania ekspresji genów wirulencji43. Wreszcie, jeśli przeprowadzane są analizy z mutantami i/lub komplementarnymi szczepami, w których markery antybiotykowe są obecne w tych szczepach bakteryjnych, zaleca się stosowanie odpowiedniej selekcji antybiotyków podczas etapów nocnego i podhodowli bakterii.
Zastosowanie monowarstw nabłonka HT-29 ma wiele zalet w badaniu molekularnych mechanizmów patogenezy Shigella in vitro. Ponieważ Shigella jest patogenem przystosowanym do potrzeb człowieka, małe modele zwierzęce nie odzwierciedlają dokładnie charakterystycznej patogenezy shigellozy obserwowanej u ludzi36. W związku z tym zastosowanie znormalizowanych protokołów infekcji linii komórkowych pochodzenia ludzkiego umożliwia ilościowe badanie poszczególnych etapów patogenezy bakteryjnej w celu scharakteryzowania wzajemnych oddziaływań molekularnych między tym patogenem a jego rodzimym gospodarzem. Historycznie rzecz biorąc, komórki HeLa były głównie wykorzystywane do badania interakcji gospodarz-patogen in vitro 25,56,57. Jednak komórki HeLa są unieśmiertelnioną linią komórkową raka szyjki macicy, która jest nienatywnymi komórkami gospodarza dla jelitowych patogenów bakteryjnych. W związku z tym badania in vitro patogenezy jelit przesunęły się na wykorzystanie linii komórkowych gruczolakoraka jelita grubego (np. HT-29, Caco-2 i T84), które wierniej odwzorowują morfologię nabłonka jelitowego i mogą być hodowane na transwellach jako monowarstwy nabłonkowe ze zróżnicowanymi powierzchniami wierzchołkowymi i podstawno-bocznymi 58,59,60. Chociaż każda linia komórkowa ma swoje indywidualne mocne i słabe strony, komórki HT-29 są wykorzystywane w opisanych tutaj testach ze względu na podobieństwa fenotypowe do enterocytów jelitowych i silną ekspresję receptorów powierzchniowych komórek i cytokin prozapalnych 58,59,61. Jednak każdy z tych omawianych modeli to linie komórkowe pochodzące z raka z nieprawidłowymi fenotypami metabolicznymi i wzrostowymi, które nie reprezentują dokładnie naturalnego stanu fizjologicznego nabłonka okrężnicy in vivo58. Ostatnie postępy w technikach hodowli tkanek ludzkich umożliwiły hodowlę ludzkich jelitowych komórek macierzystych, uzyskanych z biopsji tkanek, w organoidy lub pojedyncze dwuwymiarowe monowarstwy komórkowe, które podsumowują różne typy komórek obecnych w ludzkim przewodzie pokarmowym (GI) 62,63,64. Organoidy jelitowe można różnicować, obejmując enterocyty, komórki kubkowe wytwarzające śluz, komórki M i inne typy komórek specyficzne dla tkanki. Ostatnie badania potwierdziły użycie tych modeli organoidowych do badania patogenów jelitowych, w tym różnych patowarów Shigella spp., Salmonella enterica i Escherichia coli 62,63,64. Chociaż organoidy są dokładniejszymi modelami ludzkiego nabłonka przewodu pokarmowego i mogą być nawet hodowane w różnych warunkach odżywczych, aby reprezentować populację światową65, ich względna złożoność wymaga znacznego szkolenia i wiedzy technicznej, co skutkuje wyższymi kosztami i dłuższym czasem hodowli w porównaniu z tradycyjnymi liniami komórek nowotworowych58.
Protokół ten opisuje metody średnioprzepustowe, w których dwie 6-dołkowe płytki są używane do łącznie 12 monowarstw dostępnych do testowania. Jednak eksperymenty można łatwo skalować, aby zwiększyć liczbę zasiewanych monowarstw w celu dostosowania do dodatkowych powtórzeń technicznych lub testowania dodatkowych mutantów Shigella i sygnałów środowiskowych. Płytki do hodowli tkankowych z większą liczbą dołków (np. płytki 12-dołkowe lub 24-dołkowe) mogą być również używane z odpowiednimi dostosowaniami w celu uwzględnienia studzienek o mniejszych średnicach. W warunkach wzrostu HT-29 opisanych w kroku 3.2, miana HT-29 są wystarczające do wysiewu około sześciu 6-dołkowych płytek po hodowli z jednej kolby T75, z wystarczającą ilością pozostałych komórek, aby utrzymać hodowlę komórkową HT-29. Co więcej, wysiewanie monowarstw HT-29 i przygotowanie etapów inokulacji bakterii jest identyczne w testach adherencji bakteryjnej, inwazji i replikacji wewnątrzkomórkowej. W ten sposób testy testujące te same szczepy Shigella lub warunki subhodowli mogą być łatwo przeprowadzane równolegle, aby jednocześnie badać rolę każdego warunku eksperymentalnego w różnych etapach infekcji Shigella .
Miana odzysku dla bakterii adherentnych (krok 4), zaatakowanych (krok 5) i wewnątrzkomórkowych (krok 6) są określane przez posiew seryjnych rozcieńczeń zakażonych komórek HT-29 po lizie, co umożliwia ilościową ocenę skuteczności każdego etapu infekcji Shigella. Etapy wirowania w testach inwazji i replikacji wewnątrzkomórkowej, oparte na klasycznych testach 49,50,51, promują kontakt bakterii z komórkami gospodarza w celu natychmiastowej inwazji i zwiększają wskaźniki inwazji. W ten sposób wirowanie "pomija" etap przylegania, który później okazał się ważnym aspektem infekcji Shigella 17,18,19,66. Należy zauważyć, że etapu wirowania nie można wykonać ze spolaryzowanymi komórkami nabłonkowymi wysianymi na transwellach. Jednak w przypadku testu przylegania przyleganie nie jest wymuszane przez wirowanie, a gentamycyna nie jest dodawana do zakażonych komórek HT-29 przed lizą, co pozwala na zliczenie przylegających komórek bakteryjnych. Objętość pożywki do hodowli tkankowej jest zmniejszona do 1 ml (w przeciwieństwie do 2 ml w testach inwazji i replikacji wewnątrzkomórkowej), aby umożliwić bardziej efektywny kontakt bakterii z komórkami HT-29. Ponadto, w zależności od stopnia przylegania, podczas 3-godzinnej inkubacji może dojść do pewnej inwazji i replikacji wewnątrzkomórkowej, ale ilość ta jest zwykle znikoma (np. Tylko 0,05% odzyskanej populacji bakterii po lizie komórek gospodarza). Niemniej jednak, aby prawidłowo uwzględnić bakterie adherentne i wewnątrzkomórkowe podczas 3-godzinnej inkubacji, zaleca się przeprowadzenie równoległych testów, w których, oprócz podanego protokołu, druga płytka jest inkubowana z 50 μg/ml gentamycyny w 2 ml DMEM na studzienkę przez łącznie 45 minut (15 minut inkubacji, mycie, świeży DMEM + gentamycyna przez 30 minut) w celu dokładnej lizy bakterii zewnątrzkomórkowych. Po lizie komórek HT-29, jak zaznaczono w protokole, bakterie wewnątrzkomórkowe można policzyć, jak wspomniano powyżej, i będą reprezentować liczbę bakterii, które zostały zaatakowane. Wartość tę można następnie odjąć od bakterii wyliczonych na płytce bez traktowania gentamycyną, aby odpowiednio określić bakterie przylegające i zaatakowane. Można również przeprowadzić analizy równoległe, aby uzyskać lepszy wgląd w wewnątrzkomórkową replikację Shigella wewnątrz komórek HT-29 po inwazji, np. wykorzystując wiele punktów czasowych do wykonania wewnątrzkomórkowych krzywych wzrostu. Wreszcie, wraz z liczeniem bakterii wewnątrzkomórkowych po 18-godzinnej inkubacji gentamycyny, można zebrać supernatanty hodowlane i przeanalizować je pod kątem wydzielania cytokin przez zakażone komórki HT-29. Na przykład IL-8 jest chemokiną wydzielaną przez komórki nabłonkowe, która w dużej mierze działa w celu rekrutacji PMN do miejsca infekcji. Ilość IL-8 wydzielanej do pożywki hodowlanej zakażonych komórek HT-29 można analizować za pomocą testu IL-8 ELISA67.
Sole żółciowe okazały się ważnym sygnałem wirulencji dla Shigella podczas tranzytu przez ludzki układ pokarmowy i mogą być stosowane do uzupełniania pożywek rozwojowych bakterii w tych protokołach w celu odtworzenia typowych warunków przewodu pokarmowego. Naturalnie sole żółciowe są wprowadzane do dwunastnicy lub górnej części jelita cienkiego, aby wspomóc trawienie; A w końcowym jelicie krętym lub na końcu jelita cienkiego 95% soli żółciowych jest usuwanych i zawracanych z powrotem do krążenia w celu ostatecznego depozytu w woreczku żółciowym68. Sole żółciowe mają zwykle stężenie od 0,2% do 2,0% (w/v) w jelicie cienkim i są naturalnie bakteriobójcze. Jednak Shigella, podobnie jak większość bakterii jelitowych, jest odporna na sole żółciowe i wykorzystuje sygnały do wzmocnienia infekcji47. Kilka badań udokumentowało, w jaki sposób ekspozycja na sole żółciowe, czasami w połączeniu z innymi sygnałami jelita cienkiego, takimi jak glukoza, wpływa na przeżycie Shigella i regulację zjadliwości przed zakażeniem. Wykazano, że Shigella jest odporna na sole żółciowe, zmienia ekspresję genów oraz tworzy i rozprasza biofilm w warunkach, które odtwarzają pasaż jelita cienkiego17,69. Badania wykazały, że zmiany te skutkują hiperwirulentnym fenotypem, w którym przyleganie i inwazja są indukowane po późniejszym zakażeniu okrężnicy przez Shigella 17,18,19,48,66. Tak więc warunki opisane powyżej dokumentują, w jaki sposób subkulturować Shigella w solach żółciowych, aby naśladować pasaż jelita cienkiego przed wykonaniem testów adherencji, inwazji lub replikacji wewnątrzkomórkowej. Podany preparat TSB zawiera dodatek glukozy w stosunku do typowego bulionu Luria (LB)17. Tak więc, jeśli stosuje się LB, ważne jest, aby uzupełnić pożywkę glukozą (0,5%-2,0% [w/v]), aby odpowiednio uwzględnić sygnały glukozy w jelicie cienkim17. Ponadto, jak wspomniano powyżej, wszystkie subkultury Shigella są myte w celu usunięcia soli żółciowych i naśladowania przejścia do okrężnicy w celu analizy infekcji.
Tradycyjnie, jak podkreślono w powyższych wynikach (Ryc. 1 i Ryc. 2), testy infekcji są cenne dla określenia roli określonego genu w zakażeniu Shigella . Fenotyp różnych mutantów może jednak nie być w pełni doceniony bez odpowiedniej suplementacji pożywek bakteryjnych. Jak wykazały wcześniejsze badania, sole żółciowe znacząco zmieniają ekspresję genu S. flexneri , w tym geny odpowiedzialne za centralny metabolizm, czynniki transkrypcyjne, transportery cukru, oporność na leki i geny wirulencji kodowane na chromosomie lub plazmidziewirulencji 17. Geny te dają wgląd w to, w jaki sposób Shigella wykorzystuje sole żółciowe jako sygnał do zmiany ekspresji genów i przygotowania się do ewentualnej infekcji okrężnicy, a zatem kolejne analizy mutacji muszą być wykonywane w odpowiednich uzupełnionych pożywkach bakteryjnych przed zbadaniem wpływu na zjadliwość w testach adherencji, inwazji i replikacji wewnątrzkomórkowej. Jak widać powyżej na rycinie 1 i rycinie 2, mutacja ΔVF nie wpłynęła na przyleganie, ale wpłynęła na inwazję i replikację wewnątrzkomórkową. Ponieważ mutacja wzmocniła inwazję i replikację wewnątrzkomórkową, obecnie trwają eksperymenty mające na celu określenie, w jaki sposób produkt genu reguluje infekcję. Analizy mutantów służą jako przykład tego, w jaki sposób można badać nowe informacje na temat patogenezy Shigella , zwłaszcza w warunkach, które lepiej odwzorowują ludzki przewód pokarmowy. Zaleca się odpowiednie analizy komplementacji w celu walidacji fenotypów różnych mutantów.
W połączeniu, procedury te opisują eksperymenty ilościowe, które dostarczą ważnych informacji na temat mechanizmów molekularnych przylegania, inwazji i replikacji Shigella do komórek nabłonka okrężnicy HT-29 poprzez najlepsze naśladowanie naturalnego środowiska ludzkiego przewodu pokarmowego podczas infekcji. Przyszłe badania mogą poszerzyć zakres badań nad mutantami i warunkami eksperymentalnymi, aby lepiej zrozumieć, w jaki sposób Shigella przygotowuje się do zakażenia ludzkiego gospodarza i skutecznie go zakaża. Pomimo dziesięcioleci badań, wciąż jest o wiele więcej do odkrycia na temat infekcji Shigella.

Choroby biegunkowe wywołane przez patogeny bakteryjne jelit stanowią znaczące globalne obciążenie zdrowotne. W 2016 roku choroby biegunkowe były odpowiedzialne za 1,3 miliona zgonów na całym świecie i były czwartą najczęstszą przyczyną zgonów dzieci poniżej piątego roku życia1,2. Gram-ujemny, jelitowy patogen bakteryjny Shigella jest czynnikiem wywołującym shigellozę, główną przyczynę zgonów z powodu biegunki na całym świecie3. Shigeloza powoduje co roku znaczną zachorowalność i śmiertelność u dzieci z krajów o niższych i średnich dochodach4,5, podczas gdy infekcje w krajach o wysokich dochodach są związane z epidemiami w ośrodkach opieki dziennej, przenoszonych przez żywność i wodę6,7,8,9. Nieskuteczne opracowanie szczepionki10 i rosnące wskaźniki oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe (AMR)11,12 skomplikowały zarządzanie epidemiami Shigella na dużą skalę. Ostatnie dane Centers for Disease Control and Prevention pokazują, że prawie 46% zakażeń Shigella w Stanach Zjednoczonych wykazywało oporność na leki w 2020 roku13,14, podczas gdy Światowa Organizacja Zdrowia uznała Shigella za priorytetowy patogen AMR, dla którego pilnie potrzebne są nowe terapie15.
Infekcje Shigella są łatwo przenoszone drogą fekalno-oralną po spożyciu skażonego jedzenia lub wody, lub poprzez bezpośredni kontakt z człowiekiem. Shigella wyewoluowała, aby stać się skutecznym, przystosowanym do człowieka patogenem, z zakaźną dawką 10-100 bakterii wystarczającą do wywołania choroby16. Podczas pasażu jelita cienkiego Shigella jest narażona na sygnały środowiskowe, takie jak podwyższona temperatura i żółć17. Wykrycie tych sygnałów indukuje zmiany transkrypcyjne w celu ekspresji czynników wirulencji, które zwiększają zdolność bakterii do infekowania ludzkiego jelita grubego17,18,19. Shigella nie atakuje nabłonka okrężnicy z powierzchni wierzchołkowej, ale raczej przechodzi przez warstwę nabłonka po wychwycie do wyspecjalizowanych komórek mikrofałdowych prezentujących antygen (komórki M) w nabłonku związanym z pęcherzykami włosowymi20,21,22. Po transcytozie komórki Shigella są fagocytozowane przez rezydujące makrofagi. Shigella szybko ucieka z fagosomu i wywołuje śmierć komórek makrofagów, co powoduje uwolnienie cytokin prozapalnych5,23,24. Shigella następnie atakuje komórki nabłonka okrężnicy od strony podstawno-bocznej, lizuje wakuolę makropinocytarną i ustanawia niszę replikacyjną w cytoplazmie5,25. Cytokiny prozapalne, zwłaszcza interleukina-8 (IL-8), rekrutują polimorfojądrzaste leukocyty neutrofilowe (PMN) do miejsca zakażenia, co osłabia ścisłe połączenia nabłonkowe i umożliwia infiltrację bakteryjną wyściółki nabłonka w celu zaostrzenia infekcji podstawno-bocznej5. PMN niszczą zainfekowaną wyściółkę nabłonka, aby powstrzymać infekcję, co skutkuje charakterystycznymi objawami czerwonki bakteryjnej (krwawej) 5. Chociaż mechanizmy inwazji i replikacji wewnątrzkomórkowej zostały dokładnie scharakteryzowane, nowe badania pokazują ważne nowe koncepcje infekcji Shigella, w tym regulację wirulencji podczas pasażu żołądkowo-jelitowego (GI)17, adherence19, lepszy dostęp podstawno-boczny dzięki przepuszczalności bariery26 oraz bezobjawowe nosicielstwo u niedożywionych dzieci27.
Zdolność Shigella spp. do wywoływania choroby biegunkowej jest ograniczona do ludzi i naczelnych (NHP)28. Modele infekcji jelitowych Shigella zostały opracowane dla danio pręgowanego29, mice30, świnki morskie31, rabbits21,32,33 i pigs34,35. Jednak żaden z tych systemów modelowych nie jest w stanie dokładnie odtworzyć cech choroby obserwowanych podczas infekcji u ludzi36. Chociaż modele NHP shigellozy zostały stworzone w celu badania patogenezy Shigella, te systemy modelowe są kosztowne do wdrożenia i wymagają sztucznie wysokich dawek zakaźnych, do dziewięciu rzędów wielkości wyższych niż dawka zakaźna u ludzi37,38,39,40,41,42. Tak więc niezwykła adaptacja Shigelli do infekcji ludzkich gospodarzy wymaga użycia kultur komórkowych pochodzących od ludzi w celu odtworzenia fizjologicznie istotnych modeli do dokładnego badania patogenezy Shigella.
Tutaj opisane są szczegółowe procedury mierzące tempo przylegania, inwazji i replikacji Shigella w komórkach nabłonka okrężnicy HT-29. Korzystając z tych ustandaryzowanych protokołów, można zbadać mechanizmy molekularne, za pomocą których geny wirulencji bakteryjnej i sygnały środowiskowe wpływają na każdy etap infekcji Shigella, aby lepiej zrozumieć dynamiczną zależność interakcji gospodarz-patogen.

<table><tbody><tr><td>0,22 &m; m Filtr PES</td><td>Millipore-Sigma</td><td>SCGP00525</td><td>Sterylny, polieterosulfonowy filtr do sterylizacji pożywek do 50 ml</td></tr><tr><td>Probówki hodowlane 14 ml</td><td>Corning</td><td>352059</td><td>Probówki polipropylenowe 17 mm x 100 mm z nakrętką</td></tr><tr><td>Probówki stożkowe 50 ml</td><td>Corning</td><td>430829</td><td>50 ml przezroczyste polipropylenowe stożkowe probówki wirówkowe z szczelną nasadką</td></tr><tr><td>6-dołkowe płytki do hodowli tkankowych</td><td>Corning</td><td>3516</td><td>Płytki są poddawane obróbce w celu optymalnego przylegania komórek</td></tr><tr><td>Sole żółciowe</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B8756</td><td>Stosunek 1:1 cholanu do deoksycholanu</td></tr><tr><td>Czerwony barwnik Kongo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6277</td><td>Anionowy barwnik diazowy na bazie benzydyny, czystość >85%</td></tr><tr><td>Szkiełko komory do liczenia komórek Countess</td><td>Invitrogen</td><td>C10283</td><td>Do stosowania z automatycznym licznikiem komórek Countess</td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td>A wysoce polarny odczynnik organiczny</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Zmodyfikowane podłoże Eagle (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>10569-010</td><td>DMEM jest uzupełnione o wysoką zawartość glukozy, pirogronian sodu, GlutaMAX i fenol Czerwona</td></tr><tr><td>płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4135</td><td>Inaktywowana termicznie, sterylna</td></tr><tr><td>gentamycyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G3632</td><td>Stężenie zapasowe wynosi 50 mg / ml</td></tr><tr><td>Linia komórkowa HT-29</td><td>ATCC</td><td>HTB-38</td><td>Linia komórkowa gruczolakoraka; jelita grubego w pochodzenie</td></tr><tr><td>Folia parafinowa</td><td>Bemis</td><td>PM999</td><td>Laboratoryjna folia uszczelniająca</td></tr><tr><td>szalki Petriego</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>FB0875713</td><td>100 mm x 15 mm Szalki Petriego do mediów stałych</td></tr><tr><td>Sola buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010049</td><td>1x stężenie; pH 7,4</td></tr><tr><td>Wybierz agar</td><td>Invitrogen</td><td>30391023</td><td>Mieszanina polisacharydów ekstrahowana ze ścian komórkowych czerwonych wodorostów w celu wytworzenia pożywki do powlekania bakteryjnego</td></tr><tr><td>Kolby T75</td><td>Corning</td><td>430641U</td><td>Kolby do hodowli tkankowych</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Powszechny niejonowy środek powierzchniowo czynny i emulgator&nbsp;</td></tr><tr><td>Barwienie błękitem trypanowym</td><td>Invitrogen</td><td>T10282</td><td>Barwnik do wykrywania martwych komórek hodowli tkankowych; tylko żywe komórki mogą wykluczyć barwnik</td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td>Odczynnik do dysocjacji komórek do utrzymania i pasażowania linii komórkowych</td></tr><tr><td>Tryptyczny bulion sojowy (TSB)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8907</td><td>Pożywka do wzrostu bakterii</td></tr></tbody></table>

analizy zakażeń komórek nabłonkowych preparatem shigella

Epithelial Cell Infection Analyses with Shigella

Przystosowany do człowieka patogen bakteryjny jelitowy Shigella powoduje miliony infekcji każdego roku, powoduje długoterminowe efekty wzrostu wśród pacjentów pediatrycznych i jest główną przyczyną zgonów z powodu biegunki na całym świecie. Zakażenie wywołuje wodnistą lub krwawą biegunkę w wyniku przejścia patogenu przez przewód pokarmowy i zakażenia komórek nabłonka wyściełających okrężnicę. Przy oszałamiającym wzroście oporności na antybiotyki i obecnym braku zatwierdzonych szczepionek, ustandaryzowane protokoły badawcze mają kluczowe znaczenie dla badania tego groźnego patogenu. W tym miejscu przedstawiono metodologie badania molekularnej patogenezy Shigella przy użyciu analiz in vitro przylegania, inwazji i replikacji wewnątrzkomórkowej bakterii w komórkach nabłonka okrężnicy. Przed analizą infekcji fenotyp zjadliwości kolonii Shigella został zweryfikowany poprzez wychwyt czerwonego barwnika Kongo na płytkach agarowych. Uzupełnione pożywki laboratoryjne mogą być również brane pod uwagę podczas hodowli bakteryjnej w celu naśladowania warunków in vivo. Komórki bakteryjne są następnie wykorzystywane w znormalizowanym protokole do infekowania komórek nabłonka okrężnicy na płytkach do hodowli tkankowych przy ustalonej wielokrotności infekcji z adaptacjami do analizy każdego etapu infekcji. W celu przeprowadzenia testów adhezyjnych komórki Shigella są inkubowane ze zmniejszonymi poziomami pożywki, aby ułatwić kontakt bakterii z komórkami nabłonka. Zarówno w testach inwazji, jak i replikacji wewnątrzkomórkowej gentamycyna jest stosowana w różnych odstępach czasu w celu wyeliminowania bakterii zewnątrzkomórkowych i umożliwienia oceny inwazji i/lub ilościowego określenia szybkości replikacji wewnątrzkomórkowej. Wszystkie protokoły infekcji wyliczają bakterie przylegające, zaatakowane i/lub wewnątrzkomórkowe poprzez seryjne rozcieńczanie zakażonych lizatów komórek nabłonka i posiewanie jednostek tworzących kolonie bakteryjne w stosunku do mian infekcji na czerwonych płytkach agarowych Kongo. Łącznie protokoły te umożliwiają niezależną charakterystykę i porównania komórek nabłonkowych dla każdego etapu infekcji Shigella w celu pomyślnego zbadania tego patogenu.

Testy adhezji, inwazji oraz replikacji wewnątrzkomórkowej przeprowadzono w celu porównania szczepu dzikiego (WT) S. flexneri 2457T ze szczepem S. flexneri ΔVF (ΔVF), mutantem, który według hipotezy negatywnie reguluje wirulencję Shigella . Ponieważ Shigella wykorzystuje sole żółciowe jako sygnał do regulacji wirulencji17,18,47, eksperymenty przeprowadzono po subkulturze bakterii w pożywce TSB, a także w TSB uzupełnionej o 0,4% (w/v) soli żółciowych18. Ekspozycja na sole żółciowe podczas etapu subkultury służy jako wstępna obróbka w celu odwzorowania przejścia przez jelito cienkie przed infekcją jelita grubego17,18,47. Rysunek 1 analizuje wpływ mutacji ΔVF na zdolność S. flexneri do adhezji do komórek nabłonka jelita grubego HT-29. Procent adhezji naniesiono na oś y; reprezentuje on stosunek odzyskanych bakterii po lizie komórek HT-29 do liczby bakterii wprowadzonych do układu. Zgodnie z oczekiwaniami, oba szczepy, S. flexneri WT oraz ΔVF , wykazały znaczący wzrost adhezji po subkulturze z dodatkiem soli żółciowych w porównaniu do pożywki TSB bez dodatku soli żółciowych18. Jednakże, w obrębie każdego z warunków subkultury nie stwierdzono różnic w adhezji do komórek HT-29 między szczepem WT a mutantem ΔVF . Dane te wskazują, że mutacja ΔVF nie wpływa na zdolność S. flexneri do adhezji do komórek nabłonka HT-29, niezależnie od zastosowania wstępnej obróbki solami żółciowymi.
Na Rysunku 2 przeanalizowano wpływ mutacji ΔVF na zdolność S. flexneri do inwazji (Rysunek 2A) i replikacji (Rysunek 2B) wewnątrz komórek nabłonkowych jelita grubego HT-29, z uprzednią obróbką solami żółciowymi lub bez niej. Procent odzysku przedstawiono na osi y; reprezentuje on stosunek odzyskanych komórek bakteryjnych po lizie komórek HT-29 w odniesieniu do liczby wprowadzonych bakterii. Na Rysunku 2A odnotowano oczekiwany istotny wzrost zdolności szczepu WT S. flexneri 2457T do inwazji w komórki HT-29 po uprzedniej ekspozycji na sole żółciowe48, podczas gdy mutant S. flexneri ΔVF wykazał mniejszy wzrost inwazji po uprzedniej ekspozycji na sole żółciowe w porównaniu ze szczepem WT. Mutant ΔVF wykazywał zwiększony stopień inwazji komórek HT-29 w porównaniu do szczepu WT podhodowanego w TSB, ale wykazywał stopień inwazji podobny do WT w przypadku podhodowania w TSB uzupełnionym o sole żółciowe (Rysunek 2A). Wyniki te sugerują, że mutacja ΔVF zwiększa zdolność S. flexneri do inwazji komórek HT-29, co osłabia efekt uprzedniej ekspozycji na sole żółciowe, mimo że zdolność inwazyjna mutanta ΔVF uległa dalszemu zwiększeniu po podhodowaniu w solach żółciowych.
Ogólnie rzecz biorąc, po inkubacji nocnej odzyskano 10-krotnie więcej bakterii (Rycyna 2B) w porównaniu do inkubacji trwającej 90 min (Rycyna 2A), co wykazuje różnice odpowiednio w monitorowaniu wzrostu wewnątrzkomórkowego oraz inwazji. Gdy zakażone komórki HT-29 inkubowano przez 18 h, aby umożliwić wewnątrzkomórkową replikację bakterii (Rycyna 2B), wpływ wstępnej obróbki solami żółciowymi zmalał zarówno dla szczepu WT, jak i ΔVF. Jednakże zmniejszony efekt wstępnej obróbki solami żółciowymi podczas replikacji wewnątrzkomórkowej był bardziej wyraźny w przypadku mutanta ΔVF. Ponieważ wzrost replikacji wewnątrzkomórkowej obu szczepów po uprzedniej ekspozycji na sole żółciowe był mniejszy niż wzrost tempa inwazji w tych samych warunkach, stawiamy hipotezę, że sole żółciowe mają większy wpływ na wczesne etapy patogenezy S. flexneri. Mutant ΔVF wykazał zwiększony procent odzysku po nocnej replikacji w komórkach HT-29 w porównaniu do WT (Rycyna 2B) po obu warunkach subkultury. Jednakże procent odzysku mutanta ΔVF był podobny niezależnie od wstępnej ekspozycji na sole żółciowe. Trendy tych danych sugerują, że mutant ΔVF replikuje się w komórkach HT-29 wydajniej niż WT oraz że wstępna ekspozycja na sole żółciowe nie wpływa na zdolność mutanta ΔVF do replikacji wewnątrzkomórkowej, w przeciwieństwie do tego, co zaobserwowano dla WT (Rycyna 2B). Ponieważ różnica między szczepem mutantem a WT w warunkach wstępnej ekspozycji na sole żółciowe nie została zaobserwowana podczas 90-minutowego testu inwazji, hipotetyzujemy, że produkt kodowany przez usunięty gen VF może również regulować replikację S. flexneri w komórkach HT-29. Łącznie obie analizy wykazują, że mutant ΔVF jest bardziej wirulentny w stosunku do WT, co sugeruje, że produkt genu VF jest negatywnym regulatorem wirulencji S. flexneri.
<img alt="Wykres słupkowy adhezji szczepów bakteryjnych; TSB vs TSB+BS; istotność statystyczna zaznaczona gwiazdkami." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66426/66426fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1Wcześniejsza ekspozycja na sole żółciowe indukuje adhezję S. flexneri do komórek HT-29. S. flexneri 2457T WT oraz ΔVF komórki mutantów poddawano pasażowaniu w pożywce TSB lub TSB uzupełnionej o 0,4% (w/v) soli żółciowych (TSB+BS). Następnie bakterie naniesiono na komórki HT-29 z wielokrotnością infekcji (MOI) wynoszącą 100 i inkubowano przez 3 h w celu zbadania adhezji. Po inkubacji zainfekowane komórki HT-29 przemyto i poddano lizie, a następnie seryjne rozcieńczenia odzyskanych bakterii wysiano na płytki w celu oznaczenia liczby jednostek tworzących kolonie na ml (CFU/ml). Liczbę bakterii adherentnych przedstawiono w stosunku do miana bakterii wyjściowych, aby określić procent adhezji. Dane są reprezentatywne dla jednej powtórki biologicznej z trzema powtórkami technicznymi (pojedyncze kropki). Słupki błędów wskazują błąd standardowy średniej (SEM). Istotność statystyczną określono za pomocą testu t Studenta (*p &lt; 0.05; ***p &lt; 0.001). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66426/66426fig01large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić większą wersję tej ryciny, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Wykres słupkowy; porównanie procentowej odzyskiwalności po zastosowaniu różnych warunków hodowli (TSB vs TSB+BS) dla poszczególnych szczepów." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66426/66426fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2Wcześniejsza ekspozycja na sole żółciowe zwiększyła WT S. flexneri inwazja i replikacja wewnątrzkomórkowa. S. flexneri 2457T WT oraz ΔVF komórki mutantów pod hodowano w pożywce TSB lub TSB uzupełnionej o sole żółciowe (TSB+BS). Następnie bakterie naniesiono na komórki HT-29 przy MOI wynoszącym 100, odwirowano je na komórki i inkubowano w 37 °C z 5% CO2 przez 45 min. Komórki przemyto PBS, a bakterie pozakomórkowe zlizowano poprzez dodanie gentamycyny do DMEM, aby odzyskać wyłącznie bakterie wewnątrzkomórkowe. Po 90 min (A, inwazji bakteryjnej) lub 18 h (B, inkubacje związane z replikacją wewnątrzkomórkową) zakażone komórki HT-29 przemyto i poddano lizie, a następnie wykonano rozcieńczenia seryjne odzyskanych bakterii i wysiano je na płytki w celu określenia liczby jednostek tworzących kolonie na ml (CFU/ml). Liczbę bakterii wewnątrzkomórkowych przedstawiono w stosunku do początkowych mian bakterii w celu ustalenia procentu odzysku. Dane są reprezentatywne dla jednej repliki biologicznej, z trzema replikami technicznymi dla każdej z nich (poszczególne kropki). Słupki błędu oznaczają SEM. Istotność statystyczną określono za pomocą testu t Studenta (*p &lt; 0,05). Należy zwrócić uwagę na różnice w skalach osi y pomiędzy panelami (A) i (B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66426/66426fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>

Obecny protokół opisuje testy infekcji do badania przestrzegania Shigella, inwazji i replikacji wewnątrzkomórkowej przy użyciu linii komórkowych nabłonka in vitro.

Analizy zakażeń komórek nabłonkowych preparatem Shigella

The human-adapted enteric bacterial pathogen Shigella causes millions of infections each year, creates long-term growth effects among pediatric patients, ...

Shigella jest znaczącym globalnym patogenem, który każdego roku powoduje niszczycielskie wskaźniki infekcji. Shigella infekuje przewód pokarmowy, powodując biegunkę lub czerwonkę. Nasze badania mają na celu lepsze zrozumienie infekcji, aby pomóc w opracowaniu skuteczniejszych środków terapeutycznych, takich jak szczepionki i inne produkty przeciwdrobnoustrojowe.Po pierwsze, modele zwierzęce i nowe techniki hodowli tkankowych pozwalają nam lepiej zrozumieć fizjologię infekcji Shigella i wiernie odtworzyć złożoność ludzkiego przewodu pokarmowego. Po drugie, charakterystyka klinicznych izolatów Shigella pomogła uchwycić różnorodność tego rodzaju, zidentyfikować ważne geny wirulencji i poprawić naszą wiedzę na temat infekcji. Wykorzystaliśmy sygnały żołądkowo-jelitowe, takie jak sole żółciowe i glukoza, aby zrozumieć, w jaki sposób Shigella przeżywa tranzyt w jelicie cienkim i reguluje ekspresję genów wirulencji w przypadku infekcji w jelicie grubym.Wykazaliśmy, w jaki sposób Shigella jest odporna na sole żółciowe i wykazaliśmy, że Shigella wytwarza białka adhezyjne, które pomagają zainicjować kontakt z komórkami nabłonka w celu rozpoczęcia infekcji. Protokoły te mają na celu przyjrzenie się kluczowym aspektom infekcji nabłonkowej, takim jak przyleganie, inwazja i przeżycie wewnątrzkomórkowe Shigella. Wykonujemy te protokoły przy użyciu standardowej linii komórek nabłonkowych, ale dostosowaliśmy również metody do zaawansowanych modeli ludzkiego przewodu pokarmowego, które są obecnie dostępne.Protokoły te rozpatrują każdą fazę infekcji niezależnie, co ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia kluczowych etapów infekcji Shigella. Podkreślają również, że połączone analizy mogą ułatwić lepsze zrozumienie infekcji Shigella na poziomie holistycznym. Szczepy Shigella należy ponownie rozbarwić na płytkach agarowych zawierających czerwony barwnik Kongo, aby zapewnić zjadliwość kolonii i zapobiec wykorzystaniu niezjadliwych kolonii w testach infekcji.Na początek weź wyhodowane przez noc kultury Shigella i zawiruj je. Dodaj 100 mikrolitrów kultury do pięciu mililitrów świeżego TSB w probówce hodowlanej. Inkubuj kultury w temperaturze 37 stopni Celsjusza, wstrząsając z prędkością 250 obr./min, aż do osiągnięcia gęstości optycznej 0,7 przy 600 nanometrach.Przenieś dwa razy 10 do ośmiu jednostek tworzących kolonie subkultury Shigella do dwóch mililitrowych probówek wirówek mikrowirówek. Komórki osadu przez odwirowanie w stężeniu 17 000 G przez dwie minuty w temperaturze pokojowej. Odessać supernatant.Dodaj jeden mililitr ciepłego PBS i dokładnie zawieś granulkę. Po ponownym odwirowaniu komórki, ponownie zawieś osad w dwóch mililitrach ciepłego DMEM i zwiruj zawiesinę komórki. Następnie dodaj jeden mililitr ponownie zawieszonej Shigelli i jeden mililitr DMEM do każdej studzienki monowarstw nabłonka okrężnicy HT-29 na płytkach sześciodołkowych.Aby zapewnić kontakt bakteryjny z komórkami HT-29, odwiruj sześciodołkowe płytki o sile 2 000 G przez 10 minut w temperaturze pokojowej lub 37 stopni Celsjusza. Inkubować sześciodołkowe płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez 45 minut. Aby określić miano infekcji bakteryjnej, należy przygotować dziesięciokrotne seryjne rozcieńczenia ponownie zawieszonych komórek Shigella w PBS.Umieść 100 mikrolitrów rozcieńczeń jeden razy 10 do ujemnych pięciu i jeden razy 10 do ujemnych sześciu na czerwonych płytkach Kongo z TSB i inkubuj przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po inkubacji odessać pożywkę z każdej studzienki. Dodaj jeden mililitr ciepłego PBS do każdej studzienki i delikatnie umyj.Następnie dodaj dwa mililitry ciepłego DMEM z 50 mikrogramami na mililitr gentamycyny i inkubuj przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. Umyj zainfekowane komórki HT-29 trzykrotnie jednym mililitrem PBS. Dodaj dwa mililitry ciepłego DMEM z gentamycyną do każdej studzienki i inkubuj do 24 godzin w celu replikacji wewnątrzkomórkowej w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla.Pod koniec inkubacji umyć komórki dwa razy jednym mililitrem PBS. Dodaj jeden mililitr PBS z 1% tritonem X-100 do każdego dołka, aby zlizować komórki HT-29. Następnie za pomocą skrobaka do komórek lub wygiętej końcówki pipety zeskrob zlizowane komórki z dna studzienki i przenieś mieszaninę do 1,7 mililitrowej probówki mikrowirówkowej.Wiruj każdą probówkę przez co najmniej 30 sekund, aby jeszcze bardziej wyprzeć Shigellę z lizowanych komórek eukariotycznych. Przygotować dziesięciokrotne seryjne rozcieńczenia lizatów w PBS. Umieść 100 mikrolitrów seryjnych rozcieńczeń na czerwonych płytkach Kongo z TSB i inkubuj przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

epithelial-cell-infection-analyses-with-shigella

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Źródło: Vonaesch, P. i in., Analiza immunofluorescencji powstawania ziaren stresowych po bakteryjnym wyzwaniu komórek ssaków. J. Vis. Exp. (2017)Ten film pokazuje zakażenie komórek nabłonkowych patogenną bakterią Shigella flexneri oraz powstałą w wyniku tego odpowiedź komórkową gospodarza. Bakteryjne białka efektorowe zakłócają translację gospodarza, wywołując powstawanie organelli bez błony zwanej granulami stresowymi, które odzwierciedlają adaptacyjną odpowiedź komórki na infekcję.

Tworzenie ziaren stresowych podczas infekcji komórek nabłonka nowotworowego Shigella

Source: Poore, K., et al. Epithelial Cell Infection Analyses with Shigella. J. Vis. Exp. (2024)This video demonstrates an in vitro assay to assess Shigella invasion and intracellular replication in human colonic epithelial monolayers. It highlights steps for infection, antibiotic selection, host cell lysis, and recovery of intracellular bacteria for downstream analysis.

Intracellular Replication Assay for Shigella in Human Colonic Epithelial Cells

Ten film demonstruje technikę wykrywania lokalnej i globalnej reakcji jonów wapnia na zakażenie Shigella ludzkimi komórkami nabłonkowymi. Shigella atakuje komórki gospodarza i uwalnia efektory inwazji, wpływając na wewnątrzkomórkowy poziom wapnia. Amplitudę i częstość lokalnego i globalnego cytozolowego wapnia bada się za pomocą wskaźnika fluorescencyjnego.

Technika obrazowania do badania odpowiedzi wapnia w komórkach zakażonych bakteriami

Opisujemy metodę śledzenia pęknięcia błony wewnętrznej wywołanego przez wewnątrzkomórkowe bakterie Shigella flexneri i Mycobacterium tuberculosis po inwazji komórek gospodarza. Nasz test wykorzystuje CCF4, cytoplazmatyczną sondę FRET gospodarza w żywych lub utrwalonych komórkach. Ten reporter jest degradowany przez aktywność enzymatyczną obecną na powierzchni bakterii.

Pomiary pojedynczych komórek pęknięcia wakuolarnego spowodowanego przez patogeny wewnątrzkomórkowe

Aby przeciwdziałać rozprzestrzenianiu się patogenów, komórki gospodarza reorganizują swój cytoszkielet, aby podzielić bakterie na grupy i wywołać autofagię. Za pomocą zakażenia Shigella komórek hodowli tkankowej identyfikowane i charakteryzowane są determinanty gospodarza i patogenu leżące u podstaw tego procesu. Korzystając z modeli zakażenia Shigella danio pręgowanego, bada się rolę odkrytych cząsteczek i mechanizmów in vivo.

Zastosowanie Shigella flexneri do badania interakcji autofagia-cytoszkielet

Tutaj prezentujemy protokoły wizualizacji odpowiedzi wapnia (Ca2+) wywołanych przez komórki HeLa zakażone przez Shigella. Optymalizując parametry infekcji bakteryjnej i obrazując za pomocą sond fluorescencyjnychCa2+, scharakteryzowano nietypowe globalne i lokalne sygnały Ca2+ indukowane przez bakterie w szerokim zakresie kinetyki infekcji.

Obrazowanie odpowiedzi Ca2+ podczas zakażenia komórek nabłonkowych Shigella

Komórki M w wyspecjalizowanym nabłonku związanym z mieszykami, pokrywającym kępki Peyera, odgrywają istotną rolę w nadzorze immunologicznym błony śluzowej w tkance limfatycznej związanej z jelitami. W niniejszej pracy opisaliśmy metodę oceny transcytozy bakteryjnej przez komórki M in vivo. Metoda ta pozwala na zrozumienie funkcji komórek M w układzie odpornościowym.

Zastosowanie testu pętli jelitowej z podwiązaną plamką Peyer’a u myszy do oceny wychwytu bakterii przez komórki M

Przezroczyste zarodki rybek danio-ostrolepisnych okazały się użytecznymi modelami gospodarzy do wizualizacji i funkcjonalnego badania oddziaływań między komórkami odporności wrodzonej a wewnątrzkomórkowymi patogenami bakteryjnymi, takimi jak Salmonella typhimurium oraz Mycobacterium marinum. Mikrowstrzykiwanie bakterii oraz wielobarwne obrazowanie fluorescencyjne to kluczowe techniki stosowane w modelach infekcji zarodków rybek danio-ostrolepisnych.

Zakażanie zarodków danio pręgowanego wewnątrzkomórkowymi patogenami bakteryjnymi

Opisujemy metodę szybkiej izolacji pierwotnych pęcherzykowych komórek nabłonkowych typu II (AECII) myszy za pomocą negatywnej selekcji cytometrycznej. Uzyskane komórki AECII wykazują wysoką żywotność oraz czystość i nadają się do szerokiego zakresu badań funkcjonalnych i molekularnych dotyczących ich roli w schorzeniach układu oddechowego, takich jak choroby autoimmunologiczne lub zakaźne.

Izolacja pierwotnych komórek nabłonkowych pęcherzyków płucnych typu II myszy metodą cytometrii przepływowej do badań funkcjonalnych i molekularnych

Zakażenie człowieka przez Entamoeba histolytica prowadzi do amebii, głównej przyczyny biegunki w krajach tropikalnych. Zakażenie jest inicjowane przez interakcje patogenu z komórkami nabłonka jelitowego, powodując otwarcie kontaktów komórka-komórka, a w konsekwencji biegunkę, po której czasami następuje zakażenie wątroby. W tym artykule przedstawiono model do oceny wczesnych interakcji gospodarz-patogen, aby lepiej zrozumieć patogenezę amebiozy.

Analiza uszkodzeń nabłonka wywołanych zakażeniem Entamoeba histolytica

Poznaj metody infekcji komórek nabłonkowych przez Shigella, w tym adherencję, inwazję i replikację wewnątrzkomórkową. Protokół ten umożliwia badanie mechanizmów patogenezy i opracowanie skuteczniejszych terapii przeciwko zakażeniom Shigella.

Analizy zakażeń komórek nabłonkowych preparatem Shigella

Przeglądaj więcej filmów