Analizy zakażeń komórek nabłonkowych preparatem Shigella

Shigella jest znaczącym globalnym patogenem, który każdego roku powoduje niszczycielskie wskaźniki infekcji. Shigella infekuje przewód pokarmowy, powodując biegunkę lub czerwonkę. Nasze badania mają na celu lepsze zrozumienie infekcji, aby pomóc w opracowaniu skuteczniejszych środków terapeutycznych, takich jak szczepionki i inne produkty przeciwdrobnoustrojowe.

Po pierwsze, modele zwierzęce i nowe techniki hodowli tkankowych pozwalają nam lepiej zrozumieć fizjologię infekcji Shigella i wiernie odtworzyć złożoność ludzkiego przewodu pokarmowego. Po drugie, charakterystyka klinicznych izolatów Shigella pomogła uchwycić różnorodność tego rodzaju, zidentyfikować ważne geny wirulencji i poprawić naszą wiedzę na temat infekcji. Wykorzystaliśmy sygnały żołądkowo-jelitowe, takie jak sole żółciowe i glukoza, aby zrozumieć, w jaki sposób Shigella przeżywa tranzyt w jelicie cienkim i reguluje ekspresję genów wirulencji w przypadku infekcji w jelicie grubym.

Wykazaliśmy, w jaki sposób Shigella jest odporna na sole żółciowe i wykazaliśmy, że Shigella wytwarza białka adhezyjne, które pomagają zainicjować kontakt z komórkami nabłonka w celu rozpoczęcia infekcji. Protokoły te mają na celu przyjrzenie się kluczowym aspektom infekcji nabłonkowej, takim jak przyleganie, inwazja i przeżycie wewnątrzkomórkowe Shigella. Wykonujemy te protokoły przy użyciu standardowej linii komórek nabłonkowych, ale dostosowaliśmy również metody do zaawansowanych modeli ludzkiego przewodu pokarmowego, które są obecnie dostępne.

Protokoły te rozpatrują każdą fazę infekcji niezależnie, co ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia kluczowych etapów infekcji Shigella. Podkreślają również, że połączone analizy mogą ułatwić lepsze zrozumienie infekcji Shigella na poziomie holistycznym. Szczepy Shigella należy ponownie rozbarwić na płytkach agarowych zawierających czerwony barwnik Kongo, aby zapewnić zjadliwość kolonii i zapobiec wykorzystaniu niezjadliwych kolonii w testach infekcji.

Na początek weź wyhodowane przez noc kultury Shigella i zawiruj je. Dodaj 100 mikrolitrów kultury do pięciu mililitrów świeżego TSB w probówce hodowlanej. Inkubuj kultury w temperaturze 37 stopni Celsjusza, wstrząsając z prędkością 250 obr./min, aż do osiągnięcia gęstości optycznej 0,7 przy 600 nanometrach.

Przenieś dwa razy 10 do ośmiu jednostek tworzących kolonie subkultury Shigella do dwóch mililitrowych probówek wirówek mikrowirówek. Komórki osadu przez odwirowanie w stężeniu 17 000 G przez dwie minuty w temperaturze pokojowej. Odessać supernatant.

Dodaj jeden mililitr ciepłego PBS i dokładnie zawieś granulkę. Po ponownym odwirowaniu komórki, ponownie zawieś osad w dwóch mililitrach ciepłego DMEM i zwiruj zawiesinę komórki. Następnie dodaj jeden mililitr ponownie zawieszonej Shigelli i jeden mililitr DMEM do każdej studzienki monowarstw nabłonka okrężnicy HT-29 na płytkach sześciodołkowych.

Aby zapewnić kontakt bakteryjny z komórkami HT-29, odwiruj sześciodołkowe płytki o sile 2 000 G przez 10 minut w temperaturze pokojowej lub 37 stopni Celsjusza. Inkubować sześciodołkowe płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez 45 minut. Aby określić miano infekcji bakteryjnej, należy przygotować dziesięciokrotne seryjne rozcieńczenia ponownie zawieszonych komórek Shigella w PBS.

Umieść 100 mikrolitrów rozcieńczeń jeden razy 10 do ujemnych pięciu i jeden razy 10 do ujemnych sześciu na czerwonych płytkach Kongo z TSB i inkubuj przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po inkubacji odessać pożywkę z każdej studzienki. Dodaj jeden mililitr ciepłego PBS do każdej studzienki i delikatnie umyj.

Następnie dodaj dwa mililitry ciepłego DMEM z 50 mikrogramami na mililitr gentamycyny i inkubuj przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. Umyj zainfekowane komórki HT-29 trzykrotnie jednym mililitrem PBS. Dodaj dwa mililitry ciepłego DMEM z gentamycyną do każdej studzienki i inkubuj do 24 godzin w celu replikacji wewnątrzkomórkowej w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla.

Pod koniec inkubacji umyć komórki dwa razy jednym mililitrem PBS. Dodaj jeden mililitr PBS z 1% tritonem X-100 do każdego dołka, aby zlizować komórki HT-29. Następnie za pomocą skrobaka do komórek lub wygiętej końcówki pipety zeskrob zlizowane komórki z dna studzienki i przenieś mieszaninę do 1,7 mililitrowej probówki mikrowirówkowej.

Wiruj każdą probówkę przez co najmniej 30 sekund, aby jeszcze bardziej wyprzeć Shigellę z lizowanych komórek eukariotycznych. Przygotować dziesięciokrotne seryjne rozcieńczenia lizatów w PBS. Umieść 100 mikrolitrów seryjnych rozcieńczeń na czerwonych płytkach Kongo z TSB i inkubuj przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza.