Name: Produkcja kultur zawiesinowych i oczyszczanie wirusa związanego z adenowirusem za pomocą wirowania w gradicynacji gradientu gęstości jodiksanolu do zastosowań in vivo (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-09T14:30:00.000+00:00
Duration: 3 min 52 s
Description: Poznaj metodę oczyszczania wirusa AAV za pomocą wirowania w gradientu gęstości jodiksanolu do zastosowań in vivo. Technika ta umożliwia uzyskanie wysokiej czystości wektorów do terapii genowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Skład roztworów i buforów wykorzystanych w tym protokole przedstawiono w Tabeli 1.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Roztwór</td>
			<td colspan="2">Skład</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="4">Bufor do lizy AAV</td>
			<td colspan="2">1,2 ml 5 M roztworu NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">2 ml 1 M roztworu Tris-HCl o pH 8,5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">80 µL 1 M MgCl22 roztwór</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">wodę mQ do 40 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">Roztwór do wytrącania AAV</td>
			<td colspan="2">40 g PEG 8000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">50 ml 5 M roztworu NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">wody mQ do 100 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="5">frakcja 15% iodiksanolu</td>
			<td colspan="2">7,5 ml OptiPrep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">3 ml 10X DPBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">6 ml 5 M roztworu NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">30 µL MgCl₂ o stężeniu 1 M2 roztwór</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">mQ do 30 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="5">frakcja 25% jodiksanolu</td>
			<td colspan="2">12. 5 mL OptiPrep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">3 ml 10X DPBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">30 μL 1 M MgCl22 roztwór</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">60 µL roztworu czerwieni fenolowej</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">30 ml mQ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="4">frakcja 40% jodiksanolu</td>
			<td colspan="2">33,3 ml OptiPrep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">5 ml 10X DPBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">50 µl 1 M MgCl22 roztwór</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">50 ml wody mQ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">frakcja 60% jodiksanolu</td>
			<td colspan="2">50 ml OptiPrep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">100 $\mu$L roztworu czerwieni fenolowej</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">roztwór buforowy AAV</td>
			<td colspan="2">8 ml 5 M NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">20 µL 10% Pluronic F-68</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">PBS do 200 ml</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Składy roztworów stosowanych w niniejszym protokole.
1. Potrójna transfekcja komórek Expi293
<ol>
	<li>Zasiać komórki Expi293 (patrz Tabela materiałów) przy początkowej gęstości 5 x 105 żywych komórek (vc)/mL.</li>
	<li>Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przy 8% CO2 i prędkości wytrząsania 125 rpm, aż osiągną gęstość 3-5 x 106 vc/mL. Monitorować gęstość i żywotność komórek za pomocą metody wykluczania błękitu trypanu z wykorzystaniem automatycznego licznika komórek (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Po osiągnięciu przez komórki pożądanej gęstości, rozcieńczyć je w stosunku 1:10, dodając świeżą pożywkę w taki sposób, aby całkowita objętość była dziesięciokrotnością objętości początkowej. W razie potrzeby przenieść komórki do większej kolby. Przywrócić do inkubacji.</li>
	<li>Kontynuować namnażanie komórek zgodnie z krokami 1.2-1.3, aż osiągną gęstość co najmniej 2 x 106 vc/mL w 250 mL pożywki w kolbie o pojemności 1 L.</li>
	<li>W dniu poprzedzającym transfekcję rozcieńczyć komórki do stężenia 2 x 106 vc/mL w 250 mL pożywki, usuwając nadmiar komórek, jeśli jest to konieczne. Inkubować komórki przez noc.</li>
	<li>W dniu transfekcji odwirować połowę komórek przy 58 x g przez 5 min w 18 °C. Resuspendować osad komórkowy w takiej samej objętości (125 mL) świeżej pożywki. Żywotność komórek powinna wynosić blisko 98%.</li>
	<li>Przygotować dwie probówki stożkowe o pojemności 50 mL. Jedną opisać jako „PEI”, a drugą jako „DNA”.</li>
	<li>W probówce stożkowej opisanej jako PEI rozcieńczyć 1,2 mL PEI (polyethylenimine, patrz Tabela materiałów) do całkowitej objętości 12,5 mL w pożywce OptiMEM.</li>
	<li>W probówce stożkowej opisanej jako DNA przygotować ekvimolarny roztwór plazmidowego DNA o całkowitej ilości 500 µg DNA w całkowitej objętości 12,5 mL w pożywce OptiMEM.</li>
	<li>Dodać roztwór DNA do roztworu PEI, kilkukrotnie odwrócić probówkę w celu dokładnego wymieszania i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 min. 
	UWAGA: Kluczowe jest, aby roztwór DNA-PEI inkubował się przez pełne 10 min, aby PEI mógł utworzyć naładowane kompleksy z DNA.</li>
	<li>Po 10-minutowej inkubacji roztworu DNA-PEI, za pomocą pipety serologicznej powoli nanieść roztwór DNA-PEImax do komórek Expi293. Przenieść transfektowane komórki z powrotem do inkubatora i inkubować przez 72 h (Rysunek 1).</li>
</ol>
<img alt="Obraz z mikroskopii fluorescencyjnej komórek; analiza wzbudzenia optycznego i emisji, pasek skali 100 µm." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66460/66460fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Komórki Expi293 wykazujące ekspresję GFP dwa dni po transfekcji. Po transfekcji plazmidem zawierającym gen GFP, komórki Expi293 przejściowo eksponują eGFP. Morfologia komórek jest okrągła. Obraz został zarejestrowany przy czasie ekspozycji 15 ms. Zdjęcia mikroskopowe wykonano za pomocą mikroskopu odwróconego wyposażonego w oświetlenie epi-fluorescencyjne i obiektyw 10x/0,30. Pasek skali = 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66460/66460fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
2. Oczyszczanie wektora rAAV
<ol>
	<li>Po 72 h przenieść komórki w zawiesinie do dwóch probótek stożkowych o pojemności 250 mL i odwirować przy 415 x g przez 10 min w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przelać supernatant z medium do nowej probótki stożkowej o pojemności 500 mL i przechowywać w temperaturze 0 °C na lodzie do dalszej obróbki.</li>
	<li>Resuspendować każdy osad komórkowy w 10 mL buforu do lizy AAV (Tabela 1). Połączyć oba lizaty w jednej z probótek. Przepłukać drugą probótkę dodatkowymi 5 mL buforu do lizy AAV, a następnie dodać go do połączonych lizatów. Zamrozić w temperaturze -70 °C. 
	UWAGA: Na tym etapie można przerwać eksperyment. Supernatant z medium należy przechowywać w temperaturze -70 °C zamiast na lodzie.</li>
	<li>Dodać do supernatantu z medium z kroku 2.2 roztwór do wytrącania AAV w stosunku objętości 1:4. Odwrócić probówkę kilka razy, aby dokładnie wymieszać, i inkubować w temperaturze 0 °C na lodzie przez co najmniej 2 h lub przez noc.</li>
	<li>Odwirować zainkubowany roztwór przy 3000 x g przez 1 h w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Odlać supernatant i resuspendować osad zawierający wytrąconego wirusa w 5 mL buforu do lizy AAV.</li>
	<li>Rozmrozić lizat komórkowy w kąpieli wodnej w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Połączyć wytrąconego wirusa z lizatem komórkowym. Otrzymano w ten sposób lizat surowy. Przepłukać probówkę do wirowania, w której znajdował się wytrącony wirus, dodatkowymi 5 mL buforu do lizy AAV i połączyć z lizatem surowym.</li>
	<li>Zamrozić lizat surowy w temperaturze -70 °C, a następnie rozmrozić w temperaturze 37 °C. Powtórzyć ten cykl jeszcze raz. 
	UWAGA: Lizatu surowego nie należy pozostawiać w temperaturze 37 °C dłużej, niż jest to konieczne do jego rozmrożenia.</li>
	<li>Po trzecim rozmrożeniu natychmiast dodać 4 µL benzonukleazy do lizatu surowego, odwrócić w celu wymieszania i inkubować przez 30 min w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Odwirować lizat surowy przez 10 min przy 650 x g w temperaturze 18 °C.</li>
	<li>Przenieść supernatant do czystej probótki stożkowej o pojemności 50 mL. Jest to wirus surowy. Odrzucić osad.</li>
	<li>Odwirować wirusa surowego przez dodatkowe 30 min przy 3000 x g w temperaturze 18 °C, aby usunąć zanieczyszczające białka.</li>
	<li>Przenieść supernatant do czystej probótki stożkowej o pojemności 50 mL. Jest to wirus oczyszczony. 
	UWAGA: Na tym etapie można przerwać eksperyment. Zamrozić oczyszczonego wirusa w temperaturze -70 °C.</li>
	<li>Przygotować wielokanałową pompę perystaltyczną z czterema przewodami perystaltycznymi (patrz Tabela materiałów). Do obu końców każdego przewodu przymocować kapilary.</li>
	<li>Umieścić kapilary po stronie wejściowej pompy w zlewce wypełnionej wodą dejonizowaną. Umieścić kapilary po stronie wyjściowej pompy w pustej zlewce. Uruchomić pompę perystaltyczną z prędkością 25,0 obr./min, aby przemyć przewody wodą dejonizowaną (DI).</li>
	<li>Po dokładnym przemyciu opróżnić przewody perystaltyczne, uruchamiając pompę do momentu, aż w przewodach pozostanie samo powietrze. Położyć wszystkie kapilary na czystej, niepozostawiającej włókien ściereczce.</li>
	<li>Umieścić cztery probówki do ultrawirowania w statywie po stronie wyjściowej pompy.</li>
	<li>Za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 mL ostrożnie nalać 10 mL oczyszczonego wirusa do każdej probówki do ultrawirowania. Należy uważać, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza. 
	UWAGA: Jeśli jest to konieczne, objętość oczyszczonego wirusa w każdej probówce można zwiększyć do 12 mL. W takim przypadku odpowiednio zmniejszyć ilość 60% jodiksanolu w kroku 2.25 poniżej.</li>
	<li>Pod oczyszczonego wirusa należy wprowadzić frakcje jodiksanolu (Tabela 1) od najniższej do najwyższej gęstości przy użyciu pompy perystaltycznej. Najpierw dodaje się frakcję 15%, następnie frakcję 25%, frakcję 40% i na koniec frakcję 60%. Przenieść 22 mL (5,5 mL na probówkę do ultrawirowania) 15% frakcji jodiksanolu do czystej probótki stożkowej o pojemności 50 mL. Umieścić kapilary po stronie wejściowej pompy w probówce, dbając o to, aby wszystkie kapilary dotykały dna probówki.</li>
	<li>Uruchomić pompę i pozwolić, aby przewody wypełniły się frakcją jodiksanolu. Gdy frakcja jodiksanolu dotrze do końców kapilar po stronie wyjściowej pompy, zatrzymać pompę.</li>
	<li>Włożyć jedną kapilarę wyjściową do każdej z probówek do ultrawirowania z oczyszczonym wirusem, dbając o to, aby kapilary dotykały dna każdej probówki. 
	UWAGA: Kluczowe jest, aby w kapilarach nie pozostało powietrze. Jodiksanol może przepływać przez przewody perystaltyczne z nieco różną prędkością, dlatego przed włożeniem kapilary do oczyszczonego wirusa należy upewnić się, że każda pojedyncza kapilara wyjściowa jest całkowicie wypełniona jodiksanolem. Może być konieczne kilkukrotne zatrzymywanie i uruchamianie pompy.</li>
	<li>Uruchomić pompę i pozwolić probówkom do ultrawirowania wypełnić się. Gdy ostatnia część frakcji 15% będzie pobierana do kapilar wejściowych, zatrzymać pompę. Krytyczne jest, aby do przewodów perystaltycznych nie dostały się pęcherzyki powietrza. 
	UWAGA: Jeśli pęcherzyki powietrza dostaną się do kapilar wejściowych, można krótko uruchomić pompę w kierunku odwrotnym, aby je wypchnąć.</li>
	<li>Przenieść 22 mL (5,5 mL na probówkę do ultrawirowania) 25% frakcji jodiksanolu do probótki stożkowej 50 mL. Upewnić się, że wszystkie kapilary dotykają dna probówki, i uruchomić pompę. Gdy ostatnia część frakcji 25% będzie pobierana do kapilar wejściowych, zatrzymać pompę.</li>
	<li>Powtórzyć krok 2.24 z 20 mL (5 mL na probówkę do ultrawirowania) 40% frakcji jodiksanolu, a następnie z 24 mL (6 mL na probówkę do ultrawirowania) 60% frakcji.</li>
	<li>Jeśli w probówce do ultrawirowania pozostała wolna przestrzeń, kontynuować dodawanie 60% frakcji, aż probówki zostaną całkowicie wypełnione cieczą.</li>
	<li>Napełnić każdą probówkę tak, aby lizat utworzył wypukłość nad górną krawędzią, ale nie wylał się z probówki. Zatrzymać pompę i ostrożnie wyjąć każdą kapilarę wyjściową, dbając o to, aby nie zaburzyć gradientu jodiksanolu.</li>
	<li>Zamknąć każdą probówkę do ultrawirowania za pomocą dystansera i załadować ją do rotora typu 70 Ti (patrz Tabela materiałów). 
	UWAGA: Upewnić się, że rotor jest odpowiednio zrównoważony. Nie próbować obsługi ultrawirowki bez odpowiedniego przeszkolenia.</li>
	<li>Załadować rotor typu 70 Ti do ultrawirowki i wirować przy 489 000 x g przez 1 h w temperaturze 18 °C.</li>
	<li>Po wirowaniu wyjąć rotor z ultrawirowki. Używając szczypiec półokrągłych, ostrożnie wyjąć każdą probówkę z rotora, dbając o to, aby nie zaburzyć gradientu jodiksanolu.</li>
	<li>Użyć statywu z uchwytem, aby unieruchomić jedną probówkę do ultrawirowania.</li>
	<li>Do strzykawki 5 mL przymocować igłę 20 GA i odstawić na bok. Zdjąć zakrętkę z probówki do ultrawirowania za pomocą ściereczki niepozostawiającej włókien.</li>
	<li>Przebić ściankę probówki do ultrawirowania igłą około 3 mm poniżej granicy między 40% a 60% jodiksanolem (Rysunek 2).</li>
	<li>Powoli odessać granicę faz oraz część frakcji 40%. Unikać zasysania górnej części frakcji 40%, pobierając łącznie około 4 mL.</li>
	<li>Przykrywając palcem otwartą górę probówki do ultrawirowania, wyciągnąć strzykawkę i przenieść odessaną frakcję AAV do probótki stożkowej 50 mL. Strzykawkę wyrzucić do pojemnika na odpady ostre. Probówkę do ultrawirowania wyrzucić.</li>
	<li>Powtórzyć kroki 2.31-2.35 dla każdej probówki do ultrawirowania.</li>
	<li>Rozcieńczyć odessaną frakcję AAV około dwukrotnie w buforze do lizy AAV do objętości 40 mL.</li>
	<li>Przemyć przewody perystaltyczne zgodnie z opisem w krokach 2.16-2.17. 
	UWAGA: Na tym etapie można przerwać eksperyment. Rozcieńczoną frakcję AAV należy przechowywać w temperaturze 0 °C przez noc.</li>
	<li>Nalać po 20 mL rozcieńczonej frakcji AAV do dwóch nowych probówek do ultrawirowania.</li>
	<li>W przypadku drugiej rundy wirowania w gradiencie gęstości jodiksanolu, rozcieńczoną frakcję AAV nakłada się na warstwy zgodnie z opisem powyżej, używając tylko 10 mL (5 mL na probówkę do ultrawirowania) frakcji 40% i 14 mL (7 mL na probówkę do ultrawirowania) frakcji 60%. Powtórzyć kroki 2.29-2.36 dla ultrawirowania i aspiracji. 
	UWAGA: Przed odłożeniem pompy perystaltycznej i przewodów, należy przemyć przewody wodą DI zgodnie z opisem w krokach 2.16-2.17.</li>
</ol>
<img alt="Wynik wirowania w gradiencie gęstości; probówki z warstwowymi roztworami wykazujące separację makrocząsteczek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66460/66460fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Gradient jodiksanolu z oznakowanym interfejsem 40%-60% jodiksanolu. (A) Pierwszy gradient jodiksanolu. Czerwony fenol jest stosowany w frakcjach 40% jodiksanolu i 60% jodiksanolu. Ma on inny kolor ze względu na różnicę pH między obiema frakcjami. Strzałka wskazuje miejsce wprowadzenia strzykawki w celu pobrania frakcji rAAV, tuż poniżej interfejsu 40%-60% jodiksanolu. (B) Drugi gradient jodiksanolu. W tym kroku stosowane są tylko frakcje 40% i 60% jodiksanolu. Strzałka wskazuje miejsce wprowadzenia strzykawki w celu pobrania frakcji rAAV. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66460/66460fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
3. Wymiana buforu i koncentracja wirusa
<ol>
	<li>Po uzyskaniu frakcji AAV z drugiej rundy wirowania w gradiencie gęstości jodiksanolu, rozcieńczyć ją dwukrotnie roztworem buforu AAV.</li>
	<li>Urównoważyć filtr wirówkowy, dodając 20 mL roztworu buforu AAV do górnej części filtra. Wirować aparat przy 3000 x g w temperaturze 18 °C przez 5 min i odrzucić filtrat.</li>
	<li>Przenieść rozcieńczoną frakcję AAV do filtra wirówkowego. Wirować aparat przy 3000 x g w temperaturze 18 °C przez 5 min i odrzucić filtrat.</li>
	<li>Dodać 20 mL roztworu buforu AAV do górnej części filtra. Wirować aparat przy 3000 x g w temperaturze 18 °C przez 5 min i odrzucić filtrat. 
	UWAGA: Jeśli membrana filtra wirówkowego ulegnie zapchaniu, co spowoduje nieefektywny przepływ roztworu, ostrożnie użyć mikropipety P200, aby kilkakrotnie wciągnąć i wypuścić roztwór znajdujący się w górnej części filtra. Należy zachować szczególną ostrożność, aby nie dotknąć filtra końcówką mikropipety.</li>
	<li>Powtórzyć krok 3.4 jeszcze dwa razy. 
	UWAGA: Aby zapobiec nadmiernej koncentracji AAV, należy utrzymać objętość co najmniej 1 mL w górnej części filtra. Może być konieczne dostosowanie czasu wirowania, aby zapobiec nadmiernemu zagęszczeniu. W przypadku nadmiernej koncentracji AAV może dojść do wytrącenia.</li>
	<li>Aby uzyskać końcowy miano w zakresie 1012 vg/mL, wirować wirusa do końcowej objętości około 1 mL. 
	UWAGA: W zależności od użytego szkieletu serotypu i wydajności pakowania wirusa, może być konieczne skoncentrowanie wirusa w mniejszej objętości.</li>
	<li>Użyć mikropipety p1000, aby przenieść skoncentrowany AAV z górnej części filtra wirówkowego do probówki do mikrocentryfugi. Użyć mikropipety p200, aby przemyć filtr wirówkowy 50 µL buforu AAV w celu zebrania pozostałego wirusa i połączyć go z resztą skoncentrowanego AAV.</li>
	<li>Odstawić alikwot 2 µL skoncentrowanego AAV do oznaczania miana. Zob. Supplementary Table 1 w celu zapoznania się z primerami ITR, które można wykorzystać do qPCR.</li>
	<li>Przepuścić skoncentrowany AAV przez filtr strzykawkowy 0,2 µm w celu jego sterylizacji. 
	UWAGA: Podczas sterylizacji małej objętości należy wybrać filtr strzykawkowy o małej średnicy, aby zminimalizować straty wirusa. Użycie filtra o małej średnicy z niskim wiązaniem białek pozwoli na minimalną utratę wirusa (dane nie przedstawiono).</li>
	<li>Sterylowany AAV można wykorzystać niezwłocznie do transdukcji komórek lub przechowywać w temperaturze 4 °C do wykorzystania w ciągu czterech tygodni. Do dłuższego przechowywania należy go przechowywać w temperaturze -70 °C.</li>
</ol>

AAV Isolation by Double Iodixanol Density Gradient Centrifugation

<ol><li>Strauss, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Onasemnogene+abeparvovec+for+presymptomatic+infants+with+three+copies+of+SMN2+at+risk+for+spinal+muscular+atrophy%3A+the+Phase+III+SPR1NT+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Onasemnogene abeparvovec for presymptomatic infants with three copies of SMN2 at risk for spinal muscular atrophy: the Phase III SPR1NT trial.</a> Nat Med. 28 (7), 1390-1397 (2022).</li>
<li>Fuller-Carter, P. I., Basiri, H., Harvey, A. R., Carvalho, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focused+update+on+AAV-based+gene+therapy+clinical+trials+for+inherited+retinal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22BioDrugs%22%5BJournal%5D)">Focused update on AAV-based gene therapy clinical trials for inherited retinal degeneration.</a> BioDrugs. 34 (6), 763-781 (2020).</li>
<li>George, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiyear+factor+VIII+expression+after+AAV+gene+transfer+for+hemophilia+A%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Multiyear factor VIII expression after AAV gene transfer for hemophilia A.</a> N Engl J Med. 385 (21), 1961-1973 (2021).</li>
<li>Naso, M. F., Tomkowicz, B., Perry, W. L., Strohl, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-Associated+Virus+%28AAV%29+as+a+vector+for+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Biodrugs%22%5BJournal%5D)">Adeno-Associated Virus (AAV) as a vector for gene therapy.</a> Biodrugs. 31 (4), 317-334 (2017).</li>
<li>Atchison, R. W., Casto, B. C., Hammon, W. M. cD. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus-associated+defective+virus+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Adenovirus-associated defective virus particles.</a> Science. 149 (3685), 754-756 (1965).</li>
<li>Wu, Z., Yang, H., Colosi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+genome+size+on+AAV+vector+packaging%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Effect of genome size on AAV vector packaging.</a> Mol Ther. 18 (1), 80-86 (2010).</li>
<li>Samulski, R. J., Muzyczka, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAV-mediated+gene+therapy+for+research+and+therapeutic+purposes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Virol%22%5BJournal%5D)">AAV-mediated gene therapy for research and therapeutic purposes.</a> Annu Rev Virol. 1 (1), 427-451 (2014).</li>
<li>Zolotukhin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+recombinant+adeno-associated+virus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Production of recombinant adeno-associated virus vectors.</a> Hum Gene Ther. 16 (5), 551-557 (2005).</li>
<li>Penaud-Budloo, M., François, A., Clément, N., Ayuso, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacology+of+recombinant+adeno-associated+virus+production%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+-+Methods+Clin+Dev%22%5BJournal%5D)">Pharmacology of recombinant adeno-associated virus production.</a> Mol Ther - Methods Clin Dev. 8, 166-180 (2018).</li>
<li>Costa-Verdera, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+and+Tackling+immune+responses+to+adeno-associated+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Understanding and Tackling immune responses to adeno-associated viral vectors.</a> Hum Gene Ther. 34 (17-18), 836-852 (2023).</li>
<li>Ertl, H. C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitigating+serious+adverse+events+in+gene+therapy+with+AAV+Vectors%3A+Vector+dose+and+immunosuppression%5BTitle%5D)+AND+%22Drugs%22%5BJournal%5D)">Mitigating serious adverse events in gene therapy with AAV Vectors: Vector dose and immunosuppression.</a> Drugs. 83 (4), 287-298 (2023).</li>
<li>Pupo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAV+vectors%3A+The+Rubik%27s+cube+of+human+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">AAV vectors: The Rubik's cube of human gene therapy.</a> Mol Ther. 30 (12), 3515-3541 (2022).</li>
<li>Marsic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vector+design+tour+de+force%3A+Integrating+combinatorial+and+rational+approaches+to+derive+novel+adeno-associated+virus+variants%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Vector design tour de force: Integrating combinatorial and rational approaches to derive novel adeno-associated virus variants.</a> Mol Ther. 22 (11), 1900-1909 (2014).</li>
<li>Grimm, D., Zolotukhin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E+Pluribus+Unum%3A+50+Years+of+research%2C+millions+of+viruses%2C+and+one+goal-tailored+acceleration+of+AAV+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">E Pluribus Unum: 50 Years of research, millions of viruses, and one goal-tailored acceleration of AAV evolution.</a> Mol Ther. 23 (12), 1819-1831 (2015).</li>
<li>Biswas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+and+in+vitro+selection+of+a+novel+AAV3B+variant+with+high+hepatocyte+tropism+and+reduced+seroreactivity%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+-+Methods+Clin+Dev%22%5BJournal%5D)">Engineering and in vitro selection of a novel AAV3B variant with high hepatocyte tropism and reduced seroreactivity.</a> Mol Ther - Methods Clin Dev. 19, 347-361 (2020).</li>
<li>Perabo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+selection+of+viral+vectors+with+modified+tropism%3A+the+adeno-associated+virus+display%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">In vitro selection of viral vectors with modified tropism: the adeno-associated virus display.</a> Mol Ther. 8 (1), 151-157 (2003).</li>
<li>Crosson, S. M., Dib, P., Smith, J. K., Zolotukhin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helper-free+production+of+laboratory+grade+AAV+and+purification+by+iodixanol+density+gradient+centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+-+Methods+Clin+Dev%22%5BJournal%5D)">Helper-free production of laboratory grade AAV and purification by iodixanol density gradient centrifugation.</a> Mol Ther - Methods Clin Dev. 10, 1-7 (2018).</li>
<li>Chan, C., Harris, K. K., Zolotukhin, S., Keeler, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+design+of+AAV-rh74%2C+AAV3B%2C+and+AAV8+with+limited+liver+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Rational design of AAV-rh74, AAV3B, and AAV8 with limited liver targeting.</a> Viruses. 15 (11), 2168(2023).</li>
<li>Schmidt, O. W., Cooney, M. K., Foy, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+in+adenovirus+type+3+conjunctivitis%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus in adenovirus type 3 conjunctivitis.</a> Infect Immun. 11 (6), 1362-1370 (1975).</li>
<li>Grimm, D., Kern, A., Rittner, K., Kleinschmidt, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+tools+for+production+and+purification+of+recombinant+adenoassociated+virus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Novel tools for production and purification of recombinant adenoassociated virus vectors.</a> Hum Gene Ther. 9 (18), 2745-2760 (1998).</li>
<li>Zolotukhin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+adeno-associated+virus+purification+using+novel+methods+improves+infectious+titer+and+yield%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Recombinant adeno-associated virus purification using novel methods improves infectious titer and yield.</a> Gene Ther. 6 (6), 973-985 (1999).</li>
<li>Clark, K. R., Liu, X., Mcgrath, J. P., Johnson, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+purified+recombinant+adeno-associated+virus+vectors+are+biologically+active+and+free+of+detectable+helper+and+wild-type+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Highly purified recombinant adeno-associated virus vectors are biologically active and free of detectable helper and wild-type viruses.</a> Hum Gene Ther. 10 (6), 1031-1039 (1999).</li>
<li>Debelak, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cation-exchange+high-performance+liquid+chromatography+of+recombinant+adeno-associated+virus+type+2%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+B+Biomed+Sci+App%22%5BJournal%5D)">Cation-exchange high-performance liquid chromatography of recombinant adeno-associated virus type 2.</a> J Chromatogr B Biomed Sci App. 740 (2), 195-202 (2000).</li>
<li>Burova, E., Ioffe, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatographic+purification+of+recombinant+adenoviral+and+adeno-associated+viral+vectors%3A+methods+and+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Chromatographic purification of recombinant adenoviral and adeno-associated viral vectors: methods and implications.</a> Gene Ther. 12 (1), S5-S17 (2005).</li>
<li>Adams, B., Bak, H., Tustian, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moving+from+the+bench+towards+a+large+scale%2C+industrial+platform+process+for+adeno-associated+viral+vector+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Moving from the bench towards a large scale, industrial platform process for adeno-associated viral vector purification.</a> Biotechnol Bioeng. 117 (10), 3199-3211 (2020).</li>
<li>Grieger, J. C., Choi, V. W., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+characterization+of+adeno-associated+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Production and characterization of adeno-associated viral vectors.</a> Nat Protoc. 1 (3), 1412-1428 (2006).</li>
<li>Florea, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+purification+of+divergent+AAV+serotypes+using+AAVX+affinity+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Methods+Clin+Dev%22%5BJournal%5D)">High-efficiency purification of divergent AAV serotypes using AAVX affinity chromatography.</a> Mol Ther Methods Clin Dev. 28, 146-159 (2022).</li>
<li>Chamberlain, K., Riyad, J. M., Weber, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expressing+transgenes+that+exceed+the+packaging+capacity+of+adeno-associated+virus+capsids%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther+Methods%22%5BJournal%5D)">Expressing transgenes that exceed the packaging capacity of adeno-associated virus capsids.</a> Hum Gene Ther Methods. 27 (1), 1-12 (2016).</li>
<li>Green, E. A., Hamaker, N. K., Lee, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+vector+elements+and+process+conditions+in+transient+and+stable+suspension+HEK293+platforms+using+SARS-CoV-2+receptor+binding+domain+as+a+model+protein%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Comparison of vector elements and process conditions in transient and stable suspension HEK293 platforms using SARS-CoV-2 receptor binding domain as a model protein.</a> BMC Biotechnol. 23 (1), 7(2023).</li>
<li>Erbacher, P., Zou, S., Bettinger, T., Steffan, A. M., Remy, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chitosan-based+vector%2FDNA+complexes+for+gene+delivery%3A+Biophysical+characteristics+and+transfection+ability%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm+Res%22%5BJournal%5D)">Chitosan-based vector/DNA complexes for gene delivery: Biophysical characteristics and transfection ability.</a> Pharm Res. 15 (9), 1332-1339 (1998).</li>
<li>Vandenberghe, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+serotype-dependent+release+of+functional+vector+into+the+culture+medium+during+adeno-associated+virus+manufacturing%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Efficient serotype-dependent release of functional vector into the culture medium during adeno-associated virus manufacturing.</a> Hum Gene Ther. 21 (10), 1251-1257 (2010).</li>
<li>Summerford, C., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane-associated+heparan+sulfate+proteoglycan+is+a+receptor+for+adeno-associated+virus+type+2+virions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Membrane-associated heparan sulfate proteoglycan is a receptor for adeno-associated virus type 2 virions.</a> J Virol. 72 (2), 1438-1445 (1998).</li>
<li>Wright, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+factors+that+contribute+to+recombinant+AAV2+particle+aggregation+and+methods+to+prevent+its+occurrence+during+vector+purification+and+formulation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Identification of factors that contribute to recombinant AAV2 particle aggregation and methods to prevent its occurrence during vector purification and formulation.</a> Mol Ther. 12 (1), 171-178 (2005).</li>
<li>Gruntman, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stability+and+compatibility+of+recombinant+adeno-associated+virus+under+conditions+commonly+encountered+in+human+gene+therapy+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther+Methods%22%5BJournal%5D)">Stability and compatibility of recombinant adeno-associated virus under conditions commonly encountered in human gene therapy trials.</a> Hum Gene Ther Methods. 26 (2), 71-76 (2015).</li>
<li>Srivastava, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rationale+and+strategies+for+the+development+of+safe+and+effective+optimized+AAV+vectors+for+human+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Rationale and strategies for the development of safe and effective optimized AAV vectors for human gene therapy.</a> Mol Ther Nucleic Acids. 32, 949-959 (2023).</li>
<li>Mullard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FDA+approves+first+gene+therapy+for+Duchenne+muscular+dystrophy%2C+despite+internal+objections%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">FDA approves first gene therapy for Duchenne muscular dystrophy, despite internal objections.</a> Nat Rev Drug Discov. 22 (8), 610-610 (2023).</li>
<li>Center for Biologics Evaluation and Research. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Approved+Cellular+and+Gene+Therapy+Products%5BTitle%5D)+AND+%22US+Food+Drug+Adm%22%5BJournal%5D)">Approved Cellular and Gene Therapy Products.</a> US Food Drug Adm. , (2023).</li>
<li>Kang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAV+vectors+applied+to+the+treatment+of+CNS+disorders%3A+Clinical+status+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22J+Control+Release+Off+J+Control+Release+Soc%22%5BJournal%5D)">AAV vectors applied to the treatment of CNS disorders: Clinical status and challenges.</a> J Control Release Off J Control Release Soc. 355, 458-473 (2023).</li>
<li>De Wolf, D., Singh, K., Chuah, M. K., VandenDriessche, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemophilia+gene+therapy%3A+The+end+of+the+beginning%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Hemophilia gene therapy: The end of the beginning.</a> Hum Gene Ther. 34 (17-18), 782-792 (2023).</li>
<li>Simons, E. J., Trapani, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+opportunities+and+challenges+of+gene+therapy+for+treatment+of+inherited+forms+of+vision+and+hearing+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">The opportunities and challenges of gene therapy for treatment of inherited forms of vision and hearing loss.</a> Hum Gene Ther. 34 (17-18), 808-820 (2023).</li>
</ol>

Autorzy nie mają żadnych ujawnień do przekazania.

Protokół oczyszczania z podwójnym gradientem gęstości jodiksanolu jest metodą uniwersalną, ponieważ ma zastosowanie do wszystkich wariantów zmutowanych AAV, niezależnie od ich specyficzności receptorowej. Wczesne metody oczyszczania AAV opierały się na gęstości cząstek i obejmowały wirowanie izopikenne w CsCl oraz ciągłe wirowanie w gradionym poziomie gęstości sacharozy19. Później opracowano podejścia specyficzne dla serotypu, w których wykorzystano przeciwciała monoklonalne związane z kolumnami sepharose20. W 1999 r. opracowano nowatorską metodę oczyszczania opartą na gęstości przy użyciu nieciągłego gradientu jodiksanolu, która pozwoliła uzyskać izolaty AAV o wyższej zakaźności niż te wyizolowane z gradientów CsCl21. Metody oczyszczania AAV były nadal rozwijane do początku 2000 roku, ponieważ niektóre grupy stosowały wysokosprawną chromatografię cieczową do oczyszczania rAAV z odzyskiem z surowego lizatu przekraczającym 70%22,23,24. Metody te są nadal stosowane w procesach produkcyjnych na dużą skalę25. Pomimo rozwoju metod chromatograficznych do izolowania AAV, oczyszczanie za pomocą wirowania w gradicynie gęstości jodiksanolu jest nadal szeroko stosowane ze względu na niższy koszt i agnostycyzm serotypowy26,27.
Chociaż metoda ta dobrze nadaje się do efektywnej czasowo produkcji przedklinicznej rAAV, jej skalowalność i możliwość dostosowania do produkcji cGMP jest bardzo ograniczona25. Tak więc, jak opisano powyżej, inne metody oczyszczania są preferowane do produkcji na dużą skalę. Dodatkowo zdolność transgenowa wektorów rAAV jest ograniczona. Stwierdzono, że limit rozmiaru genomu AAV, który może być upakowany w stanie nienaruszonym, wynosi około 5,2 kb, dla maksymalnego rozmiaru transgenu 4,9 kb, co odpowiada ITR6. Komplikuje to ekspresję białek, których cDNA przekracza tę zdolność. Białka te nie mogą być wyrażane przez opisany tutaj system bez modyfikacji samego transgenu lub użycia podzielonego systemu wektorowego. Chamberlain i wsp. opisują kilka metod ekspresji transgenów większych niż 4,9 kb28.
Metoda ta jest szczególnie przydatna do wytwarzania kombinatorycznych bibliotek kapsydów o wysokiej złożoności zawierających kapsydy AAV o zróżnicowanych właściwościach biochemicznych ze względu na mutacje obecne na powierzchni kapsydu. Jeśli preparat rAAV jest przeznaczony do wstrzykiwań u zwierząt, zwłaszcza u naczelnych innych niż ludzie, kluczowe znaczenie ma ograniczenie zanieczyszczenia endotoksynami. Należy zachować szczególną ostrożność, aby oddzielić obszary wykorzystywane do hodowli bakterii od produkcji rAAV, aby zapobiec skażeniu bakteryjnemu na wszystkich etapach. Całą pracę z komórkami ludzkimi i surowym AAV wykonuj w komorze bezpieczeństwa biologicznego przy użyciu jednorazowych plastikowych naczyń. Zapobiega to skażeniu bakteryjnemu i jest niezbędne do pracy z AAV, ponieważ jest to środek BSL1.
Jeśli laboratorium nie ma dostępu do inkubatora CO2 z wytrząsarką, zamiast zawiesinowej hodowli komórek Expi293 można zastosować przylegającą hodowlę komórkową z komórkami HEK293. Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi subkulturacji i stosuj protokół transfekcji opisany w Crosson i in., 201817.
Krytycznymi etapami tego protokołu są transfekcja Expi293, przygotowanie gradientu jodixanolu i aspiracja frakcji jodixanol zawierającej AAV. Błędy podczas któregokolwiek z tych etapów mogą skutkować nieoptymalnymi plonami rAAV lub niemożnością wytworzenia rAAV.
Transfekcja komórek Expi293 jest krytycznym krokiem w produkcji rAAV przy użyciu tego protokołu. W dniu transfekcji komórki są ponownie zawieszane w połowie objętości świeżej pożywki, aby dostarczyć im składników odżywczych niezbędnych do powrotu do zdrowia po transfekcji29; Transfekcja jest bardzo wymagającym procesem dla komórek. Jednak kondycjonowane podłoże nie jest całkowicie odrzucane, ponieważ zawiera czynniki wzrostu i inne metabolity ważne dla utrzymania i wzrostu komórek. Bardzo ważne jest, aby PEI i DNA inkubowały się przez pełne dziesięć minut przed nałożeniem na komórki, aby utworzyć naładowany kompleks30. Bez utworzenia kompleksu z PEI DNA nie będzie skutecznie wychwytywane przez komórki.
Podczas wytwarzania rAAV proporcja wirusa znajdującego się w pożywce zależy od interakcji danego serotypu z receptorami komórkowymi Expi293. Niektóre serotypy są uwalniane do pożywek komórkowych z większą szybkością niż inne31, co wymaga wytrącania cząstek wirusa z pożywki komórkowej w celu uzyskania jak najwyższej wydajności i zapobieżenia utracie jakichkolwiek wariantów w oparciu o brak powinowactwa do receptorów komórkowych Expi293. W przeciwieństwie do tego, serotyp AAV2 ma silne interakcje receptorowe z proteoglikanami siarczanu heparanu obecnymi w 293 komórkach, więc w pożywce znajduje się bardzo mało upakowanego wirusa32. Wytwarzając pochodną AAV2, należy pominąć etap wytrącania PEG. Do produkcji kombinatorycznych bibliotek kapsydów lub rAAV alternatywnych serotypów odpowiednie jest wytrącanie cząstek wirusa za pomocą PEG.
Bardzo ważne jest, aby 1 M chlorek sodu był obecny w 15% frakcji jodiksanolu, aby oddzielić zagregowane cząstki AAV podczas ultrawirowania. Pominięcie NaCl w tej frakcji może prowadzić do niepożądanych skutków, takich jak zmniejszenie wydajności transdukcji i immunogenności33. Na koniec należy zachować szczególną ostrożność przy zasysaniu AAV z gradientu jodiksanolu. Odsysanie zbyt dużej ilości frakcji jodiksanolu może skutkować obecnością pustych kapsydów w produkcie końcowym17.
Metoda ta może być wykorzystana do pakowania kombinatorycznych bibliotek kapsydów rAAV do wykorzystania w eksperymentach ewolucji kierowanych dalej w celu identyfikacji kapsydów o wyższym tropizmie dla niektórych typów komórek ludzkich. rAAV jest stabilny w temperaturze 4 °C przy krótkotrwałym stosowaniu i w temperaturze -70 °C przy długotrwałym przechowywaniu34. Obecnie rekombinowany AAV jest stosowany w pięciu zatwierdzonych przez FDA lekach leczących schorzenia, w tym dystrofię mięśniową Duchenne'a 35,36,37. Istnieje kilka dodatkowych terapii rAAV w badaniach klinicznych i przedklinicznych 38,39,40. Dalsze badania nad tym wektorem mają zatem kluczowe znaczenie dla opracowania dodatkowych terapii genowych.

Rekombinowane wektory wirusowe związane z adenowirusem (rAAV) są szeroko stosowanymi narzędziami do leczenia chorób genetycznych, w tym rdzeniowego zaniku mięśni, dystrofii siatkówki i hemofilii A1,2,3. Wektory rAAV są zaprojektowane tak, aby nie zawierały genów wirusowych obecnych w dzikich typach AAV4, mały, bezotoczkowy wirus dwudziestościenny z liniowym jednoniciowym genomem DNA o wielkości 4,7 kb. AAV został po raz pierwszy odkryty w latach sześćdziesiątych XX wieku jako zanieczyszczenie preparatami adenowirusa5. Pomimo małego rozmiaru kapsydu, który ogranicza rozmiar transgenu, który może być upakowany do maksymalnie 4,9 kb, z wyłączeniem ITRs6, AAV jest przydatny do dostarczania transgenu, ponieważ jest niepatogenny u ludzi, umożliwia ekspresję transgenu w wielu typach komórek dzielących i niedzielących się oraz ma ograniczone działanie immunogenne7.
Jako członkowie rodzaju dependoparvovirus, produkcja rAAV opiera się na ekspresji genów pomocniczych obecnych w adenowirusie lub wirusie opryszczki pospolitej8. Opracowano kilka strategii wytwarzania rAAV, ale produkcja w komórkach HEK293 transformowanych za pomocą adenowirusowych genów pomocniczych E1A/E1B jest najbardziej uznaną metodą stosowaną obecnie9. Ogólne podejście do produkcji rAAV rozpoczyna się od transfekcji komórek HEK293 z trzema plazmidami zawierającymi transgen w odwróconych powtórzeniach końcowych (ITR), odpowiednio geny AAV rep i cap oraz dodatkowe geny pomocnicze adenowirusa. Siedemdziesiąt dwie godziny po transfekcji komórki są zbierane i przetwarzane w celu oczyszczenia rAAV zawierającego transgen.
W rozwoju nowych wektorów rAAV do celów terapeutycznych, głównym celem jest produkcja wektorów o zwiększonej wydajności transdukcji. Wzrost wydajności transdukcji komórek docelowych oznaczałby zmniejszenie niezbędnej dawki klinicznej rAAV, zmniejszając w ten sposób prawdopodobieństwo wystąpienia niepożądanych skutków immunogennych, począwszy od neutralizacji za pośrednictwem przeciwciał, a skończywszy na toksyczności ostrej10,11. Aby poprawić skuteczność transdukcji wektorów rAAV, można wprowadzić zmiany w upakowanym genomie lub w kapsydzie. Realne metody dostrajania skuteczności transdukcji za pomocą projektowania upakowanego genomu obejmują włączenie silnych i specyficznych tkankowo promotorów, przemyślany wybór elementów przetwarzających mRNA oraz optymalizację sekwencji kodowania w celu poprawy wydajności translacji12. Zmiany w kapsydzie są dokonywane w celu zwiększenia tropizmu dla docelowych typów komórek ludzkich. Wysiłki zmierzające do opracowania nowych kapsydów wektorów dostarczania transgenu rAAV charakteryzują się na ogół skupieniem się na racjonalnym projektowaniu kapsydów AAV ze specyficznymi mutacjami ukierunkowanymi na określone receptory komórkowe lub ukierunkowanej ewolucji w celu identyfikacji kapsydów z tropizmem dla określonych typów komórek z kombinatorycznych bibliotek kapsydów o wysokiej złożoności bez celowania w jeden konkretny receptor (chociaż niektóre grupy łączą te podejścia)13, 14,15. W podejściu ewolucji ukierunkowanej, kombinatoryczne biblioteki kapsydu są konstruowane przy użyciu określonego szkieletu serotypu ze zmutowanymi regionami zmiennymi na kapsydzie exterior16. Kombinatoryczne biblioteki kapsydu są często konstruowane z serotypów AAV nie pochodzących od ludzi, co zmniejsza ryzyko wystąpienia wcześniej istniejącej odporności podczas stosowania klinicznego10. Dlatego metody oczyszczania, które można zastosować do dowolnego serotypu, są idealne do wyeliminowania potrzeby optymalizacji specyficznej dla serotypu dla rzadziej używanych serotypów służących jako szkielet dla tych bibliotek.
Wirowanie w gradionym gradimencie gęstości jodiksanolu jest wykorzystywane do oczyszczania wysokich mian rAAV o wysokiej zakaźności17. W tym protokole rAAV jest wytwarzany w zawiesinowej hodowli komórkowej w celu zmniejszenia ilości pracy potrzebnej do wytworzenia dużych mian AAV. Uwzględniono również etap wirowania w celu usunięcia lizatu komórkowego w celu zmniejszenia obecności zanieczyszczających białek i zmniejszenia ryzyka wytrącania się wirusa. Protokół ten jest opłacalną metodą wytwarzania preparatów rAAV o wysokiej czystości, odpowiednich do użytku przedklinicznego.

<table><tbody><tr><td>Wirówka stołowa 5810 R</td><td>Eppendorf</td><td>22625501</td><td></td></tr><tr><td>8-kanałowa pompa perystaltyczna&nbsp;</td><td>Watson-Marlow</td><td>020.3708.00A</td><td></td></tr><tr><td>Automatyczny licznik komórek&nbsp;</td>Wirówka szybkoobrotowa <td>NanoEntek</td><td>EVE-MC</td><td></td></tr><tr><td>Avanti J-E</td><td>Beckman Coulter</td><td>369001</td><td></td></tr><tr><td>Benzonase</td><td>Thermo Scientific</td><td>88701</td><td></td></tr><tr><td>Szafa bezpieczeństwa biologicznego</td><td>Labconco</td><td>322491101</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator CO2 z wytrząsarką&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Ustaw na 8% CO2 oraz 37 &deg; C</td></tr><tr><td>Stożkowe probówki wirówkowe</td><td>Thermo Scientific</td><td>339652</td><td>50 ml</td></tr><tr><td>Stożkowe probówki wirówkowe</td><td>Thermo Scientific</td><td>339650</td><td>15 mL</td></tr><tr><td>Jednorazowe mikropipety</td><td>Fisherbrand</td><td>21-164-2G</td><td>Kapilary</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco bez CaCl2 i MgCl2&nbsp; (DPBS) (10x)</td>Mikroskop odwrócony <td>Sigma-Aldrich</td><td>D1408</td><td></td></tr><tr><td>ECLIPSE Ts2R-FL</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Expi293 Expression Medium</td><td>Gibco</td><td>A1435101</td><td></td></tr><tr><td>Komórki Expi293F</td><td>Gibco</td><td>A14527</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki filtrujące</td><td>USA Scientific</td><td>1126-7810</td><td>1000 &micro; L</td></tr><tr><td>Końcówki filtrów</td><td>USA Scientific</td><td>1120-8810</td><td>200 &micro; L</td></tr><tr><td>Końcówki filtracyjne</td><td>USA Scientific</td><td>1120-1810</td><td>20 &micro; L</td></tr><tr><td>Końcówki filtrów</td><td>USA Scientific</td><td>1121-3810</td><td>10 &micro; L</td></tr><tr><td>Igły podskórne</td><td>Tyco Healthcare</td><td>820112</td><td>20 GA x 1-1/2 A Wiadro</td></tr><tr><td>na lód z pokrywką</td><td>VWR</td><td>10146-184</td><td></td></tr><tr><td>Rotor JS-5.3</td><td>Beckman Coulter</td><td>368690</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór chlorku magnezu (1 M)</td><td>Millipore Sigma</td><td>M1028-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Metalowy stojak i zacisk&nbsp;</td><td>Fisherbrand</td><td>05-769-6Q</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek</td><td>Eppendorf</td><td>22600028</td><td>1,5 ml</td></tr><tr><td>Szczypce półokrągłe</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultrawirówka Optima XE-90</td><td>Beckman Coulter</td><td>A94471</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I Medium o obniżonej surowicy</td><td>Gibco</td><td>31985062</td><td></td></tr><tr><td>OptiPrep pożywka o gradiencie gęstości (jodiksanol)</td><td>Serumwerk</td><td>AXS-1114542</td><td>60% roztwór jodu</td></tr><tr><td>P1000 Pipet</td><td>Gilson</td><td>F144059M</td><td></td></tr><tr><td>P2 Pipet</td><td>Gilson</td><td>F144054M</td><td></td></tr><tr><td>P20 Pipet</td><td>Gilson</td><td>F144056M</td><td></td></tr><tr><td>P200 Pipet</td><td>Gilson</td><td>F144058M</td><td></td></tr><tr><td>Fenol czerwony&nbsp; roztwór</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0290</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4474</td><td></td></tr><tr><td>Kontroler pipet Pipet-Aid XP</td><td>Drummond Scientific</td><td>4-000-101</td><td></td></tr><tr><td>Plazmid pCapsid</td><td>De novo lub Addgene itp.&nbsp;</td><td>Nie dotyczy</td><td>Użyliśmy pACGrh74.&nbsp;</td></tr><tr><td>Plazmid pHelper</td><td>Addgene</td><td>112867</td><td></td></tr><tr><td>Plazmid pTransgene</td><td>De novo lub Addgene itp.&nbsp;</td><td>Nie dotyczy</td><td>Użyliśmy pdsAAV-GFP.</td></tr><tr><td>Pluroniczny roztwór poliolu F-68 (10%)</td><td>Mp Biomedicals</td><td>92750049</td><td></td></tr><tr><td>Glikol polietylenowy 8000</td><td>Research Products International</td><td>P48080-500.0</td><td></td></tr><tr><td>Polietylenina HCl Max (PEI-Max)</td><td>Polysciences</td><td>NC1038561</td><td>Rozcieńczyć w wodzie do 40 &mu; M</td></tr><tr><td>Probówki wirówkowe polipropylenowe, sterylne</td><td>Corning</td><td>431123</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Probówki wirówkowe polipropylenowe, sterylne</td><td>Corning</td><td>430776</td><td>250 mL</td></tr><tr><td>Probówki polipropylenowe Optiseal</td><td>Beckman Coulter</td><td>361625</td><td></td></tr><tr><td>Pipety serologiczne</td><td>Alkali Scientific</td><td>SP250-B</td><td>50 ml</td></tr><tr><td>Pipety serologiczne</td><td>Alkali Scientific</td><td>SP225-B</td><td>25 ml</td></tr><tr><td>Pipety serologiczne</td><td>Alkali Scientific</td><td>SP210-B</td><td>10 ml</td></tr><tr><td>Pipety serologiczne</td><td>Alkali Scientific</td><td>SP205-B</td><td>5 ml</td></tr><tr><td>Kolby do wytrząsania</td><td>Fisherbrand</td><td>PBV1000</td><td>1 l</td></tr><tr><td>Termosy</td><td>Fisherbrand</td><td>PBV50-0</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Kolby do wytrząsania</td><td>Fisherbrand</td><td>PBV250</td><td>250 ml</td></tr><tr><td>Kolby do wytrząsania</td><td>Fisherbrand</td><td>PBV12-5</td><td>125 ml</td></tr><tr><td>Roztwór chlorku sodu (5 M)</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC1752640</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne strzykawki</td><td>Fisherbrand</td><td>14-955-458</td><td>5 ml</td></tr><tr><td>Filtr strzykawkowy</td><td>Milipore</td><td>SLGV013SL</td><td>0,22 mikrona</td></tr><tr><td>Tris-HCl pH 8,5 (1 M)</td><td>Kd Medical</td><td>RGE3363</td><td></td></tr><tr><td>Trypan niebieski rozwiązanie</td><td>Gibco</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Montaż stojaka na probówki</td><td>Beckman Coulter</td><td>361646</td><td></td></tr><tr><td>Dystanse rurowe (x4)</td><td>Beckman Coulter</td><td>361669</td><td></td></tr><tr><td>Rurka do pompy perystaltycznej</td><td>Fisher Scientific</td><td>14190516</td><td></td></tr><tr><td>Type 70 Ti o stałym kącie nachylenia Wirnik</td><td>Beckman Coulter</td><td>337922</td><td></td></tr><tr><td>Zamrażarka niskotemperaturowa</td><td></td><td></td><td>Ustawione na -70 &deg; C</td></tr><tr><td>Koncentrator odśrodkowy Vivaspin 20</td><td>Sartorius</td><td>VS2041</td><td></td></tr><tr><td>Łaźnia wodna&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Ustawiony na 37 stopni; Z</td></tr></tbody></table>

produkcja kultur zawiesinowych i oczyszczanie wirusa związanego z adenowirusem za pomocą wirowania w gradicynacji gradientu gęstości jodiksanolu do zastosowań in vivo

Suspension Culture Production and Purification of Adeno-Associated Virus by Iodixanol Density Gradient Centrifugation for In Vivo Applications

Ten protokół opisuje produkcję i oczyszczanie rekombinowanego wirusa związanego z adenowirusem (rAAV) za pomocą wirowania w gradicynie gęstości jodixanol, niezależnej od serotypów metody oczyszczania AAV, po raz pierwszy opisanej w 1999 roku. Wektory rAAV są szeroko stosowane w terapiach genowych do dostarczania transgenów do różnych typów komórek ludzkich. W tej pracy rekombinowany wirus jest wytwarzany przez transfekcję komórek Expi293 w hodowli zawiesinowej z plazmidami kodującymi transgen, kapsyd wektorowy i geny pomocnicze adenowirusa. Wirowanie w gradiencie gęstości jodixanolu oczyszcza pełne cząstki AAV na podstawie gęstości cząstek. Dodatkowo, ta obecnie wszechobecna metodologia obejmuje trzy etapy mające na celu zwiększenie całkowitej wydajności wirusa, zmniejszenie ryzyka wytrącania się z powodu zanieczyszczających białek i dalszą koncentrację końcowego produktu wirusowego, odpowiednio: wytrącanie cząstek wirusa z pożywki komórkowej przy użyciu roztworu glikolu polietylenowego (PEG) i chlorku sodu, wprowadzenie drugiej rundy wirowania w gradionym gradionym gęstości jodiksanolu, i wymiana przez filtr odśrodkowy. Stosując tę metodę, możliwe jest konsekwentne osiąganie mian w zakresie10-12 cząstek wirusa/ml o wyjątkowej czystości do stosowania in vivo.

Metodę tę można zastosować w celu uzyskania mian na poziomie co najmniej 1012 cząsteczek wirusa na ml. Miano można uzyskać (Rysunek 3) metodą qPCR przy użyciu starterów ITR dostarczonych w Tabela uzupełniająca 1, metodą ddPCR lub jakąkolwiek inną metodą miareczkowania. Suboptymalne miana mogą wynikać z zastosowania zakrętka gen kodujący kapsyd o niskiej wydajności pakowania.
Innym możliwym źródłem nieoptymalnych wyników jest niska wydajność transdukcji komórek Expi293. Zaleca się, aby komórki znajdowały się w zagęszczeniu 3-4 x 106 vc/ml w dniu transfekcji oraz że żywotność komórek wynosi blisko 98%. W niniejszym badaniu autorzy uzyskali miano 1,07 x 1012 vg zgodnie z powyższym protokołem. Wydajność ta jest zgodna z wcześniejszymi wydajnościami uzyskanymi podczas pakowania AAVrh7418.
<img alt="Wykres amplifikacji qPCR i krzywa wzorcowa; schemat; detekcja SYBR; analiza kwantyfikacji cykli." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66460/66460fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Wyznaczanie miana metodą qPCR. Krzywa 1 została wygenerowana przy stężeniu wzorca 3,66 x 1011 vg/mL, krzywa 2 przy stężeniu wzorca 3,66 x 1010 vg/mL, krzywa 3 reprezentuje końcową próbkę skoncentrowanego AAV, krzywa 4 została wygenerowana przy stężeniu wzorca 3,66 x 109 vg/mL, a krzywa 5 przy stężeniu wzorca 3,66 x 108 vg/mL. Każda reakcja qPCR była przeprowadzana w duplikacie. (A) Krzywa amplifikacji qPCR. Wzorce przygotowano poprzez seryjne rozcieńczenie standardu AAV o mianie wyznaczonym metodą ddPCR. Stężenie nierozcieńczonego wzorca wynosiło 3,66 x 1012 vg/mL. (B) Krzywa wzorcowa wygenerowana metodą qPCR. Ustalono, że otrzymany AAV ma stężenie 1,85 x 1011 vg/mL w objętości 5,75 mL, co daje całkowitą wydajność 1,07 x 1012 vg. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66460/66460fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Tabela uzupełniająca 1: Sekwencje starterów bezpośrednich i odwrotnych dla odwróconych powtórzeń końcowych (ITRs) AAV. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66460/supplementarymaterial.zip" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Wirus związany z adenowirusem jest wytwarzany w hodowli komórek zawiesinowych i oczyszczany przez wirowanie w gradiacji gęstości podwójnego jodixanolu. Uwzględniono kroki mające na celu zwiększenie całkowitej wydajności wirusa, zmniejszenie ryzyka wytrącania się wirusa i dalszą koncentrację końcowego produktu wirusowego. Oczekiwane końcowe miana osiągają10-12 cząstek wirusa/ml i nadają się do przedklinicznego stosowania in vivo.

Produkcja kultur zawiesinowych i oczyszczanie wirusa związanego z adenowirusem za pomocą wirowania w gradicynacji gradientu gęstości jodiksanolu do zastosowań in vivo

This protocol describes recombinant adeno-associated virus (rAAV) production and purification by iodixanol density gradient centrifugation, a ...

Stosujemy podejście ukierunkowanej ewolucji w celu identyfikacji kapsydów wirusowych związanych z adenowirusem o wyższym tropizmie dla docelowych typów komórek ludzkich. Dzięki tym badaniom zamierzamy wyprodukować rekombinowane wektory wirusowe związane z adenowirusem o ulepszonej transdukcji komórek docelowych i znaczeniu klinicznym w dziedzinie terapii genowej. Nasza grupa niedawno zdetargetowała kilka serotypów AAV z wątroby, włączając reszty kapsydu oryginalne do serotypu AAV, który naturalnie ma obniżony tropizm wątrobowy.Jeśli uda się rozszerzyć na dodatkowe serotypy, stanowi to podstawę do zmniejszenia niezbędnej dawki klinicznej rAAV przez wstrzyknięcie obwodowe i zmniejszenia niekorzystnych wyników u pacjentów. Metoda oczyszczania jodiksanolu, choć jest opłacalna, jest trudna do zwiększenia na większą skalę. Dodatkowo, w dalszych zastosowaniach, podejście oparte na ukierunkowanej ewolucji jest przeprowadzane na modelach zwierzęcych lub in vitro.Tak więc kapsydy wyizolowane w drodze ukierunkowanej ewolucji mogą nie przekształcać celów in vivo u ludzi w takim samym stopniu, jak w modelach przedklinicznych. Ten protokół jest przystępny cenowo i dostępny dla mniejszych laboratoriów. Ponadto metoda ta pozwala uzyskać rekombinowany wirus związany z adenowirusem o wysokiej czystości, który może być stosowany do dalszych przedklinicznych zastosowań in vivo.Na początek uzyskaj oczyszczonego wirusa z hodowanych komórek. Umieść probówki ultrawirówek w stojaku po stronie wyjściowej wielokanałowej pompy perystaltycznej. Za pomocą pipety serologicznej ostrożnie dozuj 10 mililitrów oczyszczonego wirusa do każdej probówki ultrawirówki.Następnie przenieś 22 mililitry 15% frakcji jodiksanolu do czystej stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów. Umieść kapilary po prawej stronie pompy w rurce i uruchom pompę. Zatrzymaj pompę, gdy frakcja jodiksanolu dotrze do końca kapilar po stronie wyjściowej pompy.Włożyć kapilarnę wyjściową do każdej probówki ultrawirówki z oczyszczonym wirusem i uruchomić pompę. Zatrzymaj pompę, gdy ostatnia z 15% frakcji ma zostać pobrana do kapilar wejściowych. Następnie przenieś 22 mililitry 25% frakcji jodoksanolu do 50-mililitrowej stożkowej probówki.Po włączeniu pompy pozwól, aby cała frakcja została pobrana do kapilar wejściowych i zatrzymaj pompę. W razie potrzeby dodaj więcej frakcji 60% i napełnij każdą probówkę, aż lizat utworzy kopułę na górze, ale nie przeleje się. Zatrzymaj pompę i ostrożnie wyjmij kapilarnę wyjściową.Przykryj rurkę ultrawirówki przekładką i załaduj ją do wirnika typu 70 Ti. Po odwirowaniu zaciśnij probówkę ultrawirówki do stojaka wsporczego. Za pomocą niestrzępiącej się chusteczki zdejmij nasadkę z probówki ultrawirówki.Następnie przymocuj igłę o rozmiarze 20 do pięciomililitrowej strzykawki i przebij ściankę probówki ultrawirówki igłą około trzech mililitrów poniżej granicy faz 40 i 60% jodiksanalu. Powoli zasysaj interfejs i część frakcji 40%. Trzymając jeden palec nad otwartą górną częścią probówki ultrawirówki, wyciągnij strzykawkę i przenieś zasysaną frakcję AAV do stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów.Na koniec odessaną frakcję wirusa rozcieńczyć dwukrotnie w buforze do lizy AAV do objętości 40 mililitrów. Po przepłukaniu rurki perystaltycznej załaduj 20 mililitrów rozcieńczonej frakcji AAV do nowej probówki ultrawirówkowej w celu przeprowadzenia drugiej rundy frakcjonowania.

suspension-culture-production-purification-adeno-associated-virus

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Wektory rekombinowanego wirusa towarzyszącego adenowirusom (rAAVs) stają się coraz bardziej cenne w badaniach in vivo na zwierzętach. Opisujemy, w jaki sposób rAAVs mogą być produkowane w laboratorium oraz jak można oznaczać miano tych wektorów, aby uzyskać dokładny odczyt liczby wyprodukowanych cząstek zakaźnych.

Produkcja i miareczkowanie rekombinowanych wektorów wirusowych opartych na wirusie towarzyszącym adenowirusom (AAV)

Tutaj opisujemy efektywną i powtarzalną strategię produkcji, mianowania i kontroli jakości partii wektorów wirusowych związanych z adeno. Pozwala na uzyskanie preparatu wektorowego o wysokim mianie (≥1 x10 13 genomów wektorowych/ml) i wysokiej czystości, gotowego do użycia in vitro lub in vivo.

Produkcja, oczyszczanie i kontrola jakości wektorów wirusowych związanych z adenowirusem

Tutaj prezentujemy protokół produkcji adenowirusa za pomocą systemu pAdEasy. Technologia obejmuje rekombinację plazmidów pAdTrack i pAdEasy-1, pakowanie i amplifikację adenowirusa, oczyszczanie cząstek adenowirusa z lizatu komórkowego i pożywki hodowlanej, miareczkowanie wirusa oraz testowanie funkcjonalne adenowirusa.

Skuteczna metoda produkcji adenowirusa

Tutaj przedstawiamy szczegółową procedurę produkcji na dużą skalę wektorów AAV klasy badawczej przy użyciu przylegających komórek HEK 293 hodowanych w stosach komórkowych i oczyszczania metodą chromatografii powinowactwa. Protokół ten konsekwentnie daje &gt;1 x 1013 genomów wektorowych/ml, zapewniając ilości wektorów odpowiednie dla badań na dużych zwierzętach.

Produkcja wektorów wirusowych związanych z adenowirusem w stosach komórkowych do badań przedklinicznych na dużych modelach zwierzęcych

W tym protokole, wektor AAV2 jest wytwarzany przez kokulturację komórek owadów Spodoptera frugiperda (Sf9) z białkiem zielonej fluorescencji (GFP) wirusa bakulowirusa (BV)-AAV2-AAV2 lub genem terapeutycznym oraz komórkami Sf9 zakażonymi BV-AAV2-rep-cap w hodowli zawiesinowej. Cząsteczki AAV są uwalniane z komórek za pomocą detergentu, klarowane, oczyszczane za pomocą chromatografii kolumnowej powinowactwa i zagęszczane przez filtrację o przepływie stycznym.

Opracowanie procesu produkcji i oczyszczania wektora wirusa związanego z adenowirusem (AAV)2 przy użyciu systemu hodowli komórek bakulowirusa i owadów

Tutaj przedstawiamy szczegółową procedurę produkcji, oczyszczania i kwantyfikacji rekombinowanego wirusa rzekomego pomoru drobiu o wysokim mianie. Protokół ten konsekwentnie daje &gt; 6 × 109 jednostek tworzących blaszki miażdżycowe/ml, zapewniając ilości wirusa odpowiednie do badań in vivo na zwierzętach. Opisano dodatkowe testy kontroli jakości w celu zapewnienia bezpieczeństwa in vivo.

Wytwarzanie rekombinowanego wirusa rzekomego pomoru drobiu o wysokim mianie z płynu omoczniowego

Tutaj prezentowany jest protokół produkcji zawiesiny HEK293 oparty na komórkach AAV, co skutkuje zmniejszeniem czasu i pracy potrzebnej do produkcji wektorów przy użyciu komponentów, które są dostępne do celów badawczych od komercyjnych dostawców.

Produkcja wysokowydajnych partii wektorów związanych z adeno przy użyciu komórek zawiesinowych HEK293

Ten manuskrypt opisuje szczegółowy protokół generowania i oczyszczania wektorów wirusowych związanych z adenowirusem przy użyciu zoptymalizowanej metody chromatografii powinowactwa opartej na heparynie. Przedstawia proste, skalowalne i ekonomiczne podejście, eliminując potrzebę ultrawirowania. Otrzymane wektory wykazują wysoką czystość i aktywność biologiczną, co dowodzi ich wartości w badaniach przedklinicznych.

Izolacja wektorów wirusowych związanych z adenowirusem za pomocą jednoetapowego i częściowo zautomatyzowanego protokołu chromatografii powinowactwa do heparyny

Wraz z rozwojem terapii genowej, rośnie zapotrzebowanie na innowacyjne metody, które mogą sprostać tym wyzwaniom. Zaprezentowano tu unikalną metodę, która usprawnia proces generowania wysokowydajnych i czystych wektorów AAV z wykorzystaniem platformy fabryki komórek, spełniającej standardy jakości dla badań in vivo.

Uproszczona i ustandaryzowana procedura generowania wysokiej jakości wektorów wirusowych związanych z adenowirusem o wysokim mianie z wykorzystaniem platformy Cell Factory

W niniejszym artykule opisujemy identyfikację serotypu 3 wirusa towarzyszącego adenowirusom (AAV3) jako najskuteczniejszego wektora do celowania w ludzkie komórki raka wątroby.<br...

Wysokoefektywna transdukcja komórek raka wątroby za pomocą wektorów rekombinowanego wirusa adeno-zależnego serotypu 3

Poznaj metodę oczyszczania wirusa AAV za pomocą wirowania w gradientu gęstości jodiksanolu do zastosowań in vivo. Technika ta umożliwia uzyskanie wysokiej czystości wektorów do terapii genowej.

Produkcja kultur zawiesinowych i oczyszczanie wirusa związanego z adenowirusem za pomocą wirowania w gradicynacji gradientu gęstości jodiksanolu do zastosowań in vivo (Wideo) | JoVE Journal

Produkcja kultur zawiesinowych i oczyszczanie wirusa związanego z adenowirusem za pomocą wirowania w gradicynacji gradientu gęstości jodiksanolu do zastosowań in vivo

Przeglądaj więcej filmów