Produkcja kultur zawiesinowych i oczyszczanie wirusa związanego z adenowirusem za pomocą wirowania w gradicynacji gradientu gęstości jodiksanolu do zastosowań in vivo
9 lutego 2024
Wirus związany z adenowirusem jest wytwarzany w hodowli komórek zawiesinowych i oczyszczany przez wirowanie w gradiacji gęstości podwójnego jodixanolu. Uwzględniono kroki mające na celu zwiększenie całkowitej wydajności wirusa, zmniejszenie ryzyka wytrącania się wirusa i dalszą koncentrację końcowego produktu wirusowego. Oczekiwane końcowe miana osiągają10-12 cząstek wirusa/ml i nadają się do przedklinicznego stosowania in vivo.
Stosujemy podejście ukierunkowanej ewolucji w celu identyfikacji kapsydów wirusowych związanych z adenowirusem o wyższym tropizmie dla docelowych typów komórek ludzkich. Dzięki tym badaniom zamierzamy wyprodukować rekombinowane wektory wirusowe związane z adenowirusem o ulepszonej transdukcji komórek docelowych i znaczeniu klinicznym w dziedzinie terapii genowej. Nasza grupa niedawno zdetargetowała kilka serotypów AAV z wątroby, włączając reszty kapsydu oryginalne do serotypu AAV, który naturalnie ma obniżony tropizm wątrobowy.
Jeśli uda się rozszerzyć na dodatkowe serotypy, stanowi to podstawę do zmniejszenia niezbędnej dawki klinicznej rAAV przez wstrzyknięcie obwodowe i zmniejszenia niekorzystnych wyników u pacjentów. Metoda oczyszczania jodiksanolu, choć jest opłacalna, jest trudna do zwiększenia na większą skalę. Dodatkowo, w dalszych zastosowaniach, podejście oparte na ukierunkowanej ewolucji jest przeprowadzane na modelach zwierzęcych lub in vitro.
Tak więc kapsydy wyizolowane w drodze ukierunkowanej ewolucji mogą nie przekształcać celów in vivo u ludzi w takim samym stopniu, jak w modelach przedklinicznych. Ten protokół jest przystępny cenowo i dostępny dla mniejszych laboratoriów. Ponadto metoda ta pozwala uzyskać rekombinowany wirus związany z adenowirusem o wysokiej czystości, który może być stosowany do dalszych przedklinicznych zastosowań in vivo.
Na początek uzyskaj oczyszczonego wirusa z hodowanych komórek. Umieść probówki ultrawirówek w stojaku po stronie wyjściowej wielokanałowej pompy perystaltycznej. Za pomocą pipety serologicznej ostrożnie dozuj 10 mililitrów oczyszczonego wirusa do każdej probówki ultrawirówki.
Następnie przenieś 22 mililitry 15% frakcji jodiksanolu do czystej stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów. Umieść kapilary po prawej stronie pompy w rurce i uruchom pompę. Zatrzymaj pompę, gdy frakcja jodiksanolu dotrze do końca kapilar po stronie wyjściowej pompy.
Włożyć kapilarnę wyjściową do każdej probówki ultrawirówki z oczyszczonym wirusem i uruchomić pompę. Zatrzymaj pompę, gdy ostatnia z 15% frakcji ma zostać pobrana do kapilar wejściowych. Następnie przenieś 22 mililitry 25% frakcji jodoksanolu do 50-mililitrowej stożkowej probówki.
Po włączeniu pompy pozwól, aby cała frakcja została pobrana do kapilar wejściowych i zatrzymaj pompę. W razie potrzeby dodaj więcej frakcji 60% i napełnij każdą probówkę, aż lizat utworzy kopułę na górze, ale nie przeleje się. Zatrzymaj pompę i ostrożnie wyjmij kapilarnę wyjściową.
Przykryj rurkę ultrawirówki przekładką i załaduj ją do wirnika typu 70 Ti. Po odwirowaniu zaciśnij probówkę ultrawirówki do stojaka wsporczego. Za pomocą niestrzępiącej się chusteczki zdejmij nasadkę z probówki ultrawirówki.
Następnie przymocuj igłę o rozmiarze 20 do pięciomililitrowej strzykawki i przebij ściankę probówki ultrawirówki igłą około trzech mililitrów poniżej granicy faz 40 i 60% jodiksanalu. Powoli zasysaj interfejs i część frakcji 40%. Trzymając jeden palec nad otwartą górną częścią probówki ultrawirówki, wyciągnij strzykawkę i przenieś zasysaną frakcję AAV do stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów.
Na koniec odessaną frakcję wirusa rozcieńczyć dwukrotnie w buforze do lizy AAV do objętości 40 mililitrów. Po przepłukaniu rurki perystaltycznej załaduj 20 mililitrów rozcieńczonej frakcji AAV do nowej probówki ultrawirówkowej w celu przeprowadzenia drugiej rundy frakcjonowania.
Przegląd
Niniejsze badanie koncentruje się na ewolucji sterowanej kapsydów wirusów towarzyszących adenowirusom (AAV) w celu zwiększenia ich tropizmu do konkretnych typów ludzkich komórek. Celem badań jest opracowanie rekombinowanych wektorów AAV, które poprawią transdukcję komórek docelowych, co ma kluczowe znaczenie dla zastosowań w terapii genowej.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Terapia genowa
- Wirusy towarzyszące adenowirusom
- Opracowywanie wektorów wirusowych
Wstęp
- Wirusy towarzyszące adenowirusom (AAV) są wykorzystywane w terapii genowej ze względu na ich bezpieczeństwo i skuteczność.
- Poprawa tropizmu może prowadzić do lepszych wyników terapeutycznych.
- Obecne metody produkcji i oczyszczania AAV mogą być trudne do przeskalowania.
- Ewolucja sterowana oferuje strategię ulepszania właściwości wektorów wirusowych.
Cel badania
- Identyfikacja kapsydów AAV o zwiększonym tropizmie do ludzkich komórek.
- Ograniczenie tropizmu do wątroby w wybranych serotypach AAV.
- Potencjalne obniżenie dawki klinicznej wymaganej dla skutecznej terapii genowej.
Zastosowane metody
- Podejście ewolucji sterowanej w celu modyfikacji kapsydu.
- Wykorzystanie modeli zwierzęcych oraz układów in vitro do testów.
- Centryfugacja w gradiencie gęstości jodiksanolu w celu oczyszczania wirusów.
- Ocena wydajności otrzymywania cząstek wirusowych oraz efektywności transdukcji.
Główne wyniki
- Identyfikacja kapsydów o poprawionym tropizmie do komórek docelowych.
- Skuteczne odsterowanie serotypów AAV z wątroby.
- Wykazanie zwiększonych możliwości transdukcji w modelach przedklinicznych.
- Opracowanie skalowalnej metody oczyszczania, mimo że stanowiło to wyzwanie.
Wnioski
- Ewolucja sterowana może skutecznie poprawić właściwości kapsydu AAV.
- Zredukowany tropizm wątrobowy może prowadzić do bezpieczniejszych zastosowań w terapii genowej.
- Dalsze badania są niezbędne, aby rozszerzyć te wnioski na dodatkowe serotypy.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Produkcja w kulturach zawiesinowych oraz oczyszczanie gradientem gęstości jodiksanolu rAAV umożliwiają dostarczenie wektorów o wysokiej czystości do przedklinicznych badań in vivo, co wspiera rozwój projektów terapii genowej. Ten protokół, niezależny od serotypu, ułatwia generowanie różnorodnych kapsydów AAV, w tym tych zmodyfikowanych w celu zmiany tropizmu, i stanowi powtarzalną podstawę dla translacyjnego rozwoju wektorów. Dostępność tej metody oraz powtarzalność wydajności są kluczowe dla optymalizacji wektorów na wczesnym etapie i selekcji portfolio.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia wytwarzanie wariantów rAAV w celu funkcjonalnej oceny wydajności dostarczania genów do docelowych typów komórek.
- Wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez dostarczanie wektorów do badań nad transdukcją specyficzną dla tkanek i szlaków sygnałowych.
- Ułatwia szybkie prototypowanie i walidację zmodyfikowanych kapsydów o zmienionym tropizmie.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Zapewnia wysoką czystość i stężenie rAAV, odpowiednie do ilościowych analiz przesiewowych in vitro oraz in vivo.
- Standaryzuje ilość wprowadzanego wektora, co pozwala na powtarzalny rozwój testów i porównywanie wyników między badaniami.
- Umożliwia skalowalność przy przesiewaniu wielu wariantów kapsydu lub konstruktów transgenów.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Zapewnia wektory do badań na przedklinicznych modelach zwierzęcych w celu oceny celowania tkankowego oraz efektów poza-celowych.
- Wspiera dostosowanie biomarkerów translacyjnych poprzez umożliwienie walidacji działania wektora in vivo.
- Zmniejsza ryzyko wystąpienia zakłócających zanieczyszczeń białkowych w późniejszych badaniach nad skutecznością i bezpieczeństwem.
Integracja potoku i przepływu pracy
Niniejszy protokół stanowi pomost pomiędzy wczesną fazą odkryć a walidacją przedkliniczną, dostarczając wysokiej jakości rAAV zarówno do badań mechanistycznych, jak i badań translacyjnych. Jest on pozycjonowany jako kluczowa kompetencja w zakresie inżynierii wektorów, przesiewania oraz procesów dowodzenia koncepcji (proof-of-concept) in vivo.
- Biologia odkrywcza: Dostarcza wektory do testowania hipotez dotyczących modyfikacji kapsydów i celowania tkankowego.
- Przesiewanie: Zapewnia standaryzowany rAAV o wysokim mianie, niezbędny do opracowania wiarygodnych testów i analiz porównawczych.
- Analityka: Umożliwia ilościowy pomiar wydajności i czystości cząstek wirusowych w celu optymalizacji procesu.
- Badania translacyjne: Wspiera ciągłość przejścia od przesiewania in vitro do walidacji in vivo w modelach zwierzęcych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje szeroko stosowany, niezależny od serotypu schemat postępowania dla różnorodnych programów terapii genowej.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w zakresie wydajności wektora i walidacji celu.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalną, skalowalną i kosztowo efektywną produkcję rAAV dla zespołów badawczo-rozwojowych (R&D).
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie świadomych decyzji o kontynuacji lub przerwaniu prac (go/no-go) dla kandydatów na wektory i zmniejsza ryzyko biologiczne na późniejszych etapach.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację zmodyfikowanych kapsydów i konstruktów transgenów z uwzględnieniem analizy ryzyka.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w technikach hodowli komórek w zawiesinie, transfekcji oraz ultrawirowania.
- Wymaga dostępu do ultrawirowarek, pomp perystaltycznych oraz narzędzi analitycznych do oceny miana i czystości.
- Standaryzacja pomiędzy zespołami jest niezbędna dla zapewnienia powtarzalności i porównywalności między badaniami.
- Adaptacja do produkcji na dużą skalę jest ograniczona przez skalowalność wirowania w gradiencie iodixanolu.
- Protokół jest zoptymalizowany pod kątem dostarczania wektorów w skali badawczej, a nie produkcji w standardzie klinicznym.
