Wykrywanie i izolacja Campylobacter spp. z surowego mięsa

Badanie to zapewnia szybki i solidny protokół izolacji Campylobacter z produktu spożywczego. Przezwycięża ona szereg wad istniejących metod i oferuje korzyści w zakresie późniejszego wykrywania i charakteryzowania izolatów. Nabłyszczacze w terenie są często 10 000 razy większe niż próbki używane w testach wykrywania bezpieczeństwa żywności, takich jak PCR.

Istnieje potrzeba zmniejszenia błędu podpróbkowania, aby zapewnić, że wyniki są reprezentatywne dla populacji będącej przedmiotem zainteresowania. Protokół ten został wykorzystany do wyizolowania ponad 50 szczepów Campylobacter, które następnie zostały wykorzystane w badaniach genomicznych. Nasze dane i analizy przyczyniły się do zrozumienia mechanizmów molekularnych gospodarza i produkcji Campylobacter.

I takie rozmiary, gdzie ułatwiono opracowanie nowych strategii terapeutycznych w leczeniu Campylobacterlosis. Protokół ten daje możliwość zmniejszenia liczby podpróbek o współczynnik 13, a także skraca czas potrzebny do wyizolowania Campylobacter z surowego mięsa o 24 godziny, czyli w ciągu 8-godzinnego dnia pracy. Przyszłe badania mogą zastosować tę metodologię do izolacji Campylobacter, nie tylko z produktów spożywczych, ale także z próbek środowiskowych.

Może to pomóc w wyeliminowaniu wyników fałszywie ujemnych i zapewnić dokładniejsze określenie ilościowe liczby zanieczyszczonych próbek. Na początek pokrój 450 gramów kawałków kurczaka z opakowania i umieść je w żołądku lub torbie. Dodaj 200 mililitrów 0,1% buforowanej wody peptonowej do worka żołądkowego zawierającego kurczaka.

Ręcznie masować lub dotykać próbki od zewnątrz żołądka lub worka przez 2 minuty. Za pomocą zmotoryzowanego kontrolera pipet zbierz cały płyn do płukania kurczaka z przefiltrowanej strony worka i przelej go do sterylnych butelek wirówek. Następnie odwirować płukanie kurczaka w temperaturze 10 000 G przez 10 minut w temperaturze pokojowej.

Korzystanie z zmotoryzowanego kontrolera pipet z 25-mililitrową jednorazową plastikową pipetą serologiczną. Ostrożnie zebrać supernatant i wyrzucić go. W celu wzbogacenia Campylobacter dodaj 25 mililitrów krwi późnej końskiej do wysterylizowanych 500 mililitrów bulionu Bolton.

Rozpuść 1 fiolkę suplementu antybiotykowego w 5 mililitrach 50% etanolu i dodaj odtworzony suplement antybiotykowy do bulionu Bolton. Następnie ponownie zawiesić granulkę w 50 mililitrach bulionu Bolton zawierającego krew konia jeziornego i antybiotyki. Umieść próbki w szczelnie zamkniętym pojemniku, w którym znajduje się mieszanina gazów składająca się z 85% azotu, 10% dwutlenku węgla i 5% tlenu.

Próbki należy inkubować w temperaturze 42 stopni Celsjusza przez 24 godziny. Na początek umieść płytki agarowe Brucella z otwartymi pokrywkami w komorze bezpieczeństwa biologicznego w celu wysuszenia. Umieść filtr z octanu celulozy na środku płytki agarowej Brucella.

Odpipetować 4 krople na filtr i 20 mikrolitrów na kroplę próbki wzbogaconej Campylobacter na filtr. Po inkubacji kropli w temperaturze pokojowej przez 15 minut ostrożnie wyjmij filtry, a następnie inkubuj płytki w temperaturze 42 stopni Celsjusza przez około 24 godziny. Po inkubacji wybierz charakterystyczne kolonie Campylobacter o określonych cechach.

Kolonie uliczne na płytkach agarowych Brucella w celu oczyszczenia. Do długotrwałego przechowywania zbierz kolonie Campylobacter wyhodowane na płytkach agarowych Brucella i zaszczep bulion Bolton. Umieść próbki w szczelnie zamkniętym pojemniku, w którym znajduje się mieszanina gazów składająca się z 85% azotu, 10% dwutlenku węgla i 5% tlenu.

Próbki inkubować w temperaturze 42 stopni Celsjusza przez noc. Następnie dodaj 900 mikrolitrów wyhodowanej przez noc kultury Campylobacter do dwumililitrowej fiolki kriogenicznej zawierającej 100 mikrolitrów DMSO. Szybko schłodzić w kąpieli etanolowej z suchym lodem przez 10 minut i przenieść do zamrażarki o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.

Porównanie membran filtracyjnych o różnych rozmiarach porów wykazało, że więcej komórek było w stanie przejść przez filtr 0,65 mikrometra w porównaniu z filtrem 0,45 mikrometra. Na początek weź płytki agarowe Brucella z koloniami Campylobacter, rozprowadź oczyszczone kolonie Campylobacter na 96-dołkowej płytce ze 100 mikrolitrami roztworu ekstrakcyjnego na studzienkę. Próbki należy poddawać lizie w temperaturze 99 stopni Celsjusza przez 10 minut, a następnie schładzać w temperaturze 20 stopni Celsjusza przez 2 minuty w termocyklerze.

Następnie odwirować płytkę o stężeniu 8 000 G przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Przygotuj mieszaninę reakcyjną o pojemności 20 mikrolitrów składającą się z mieszanki głównej, próbki DNA, wewnętrznej matrycy kontrolnej amplifikacji, startera i sondy. Załaduj wszystkie próbki w trzech egzemplarzach na 96-dołkową płytkę optyczną pokrytą folią optyczną i umieść je w systemie PCR w czasie rzeczywistym.