Name: Podanie wektorowe dokanałowo u młodych szczurów przez wstrzyknięcie do spłuczki lędźwiowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 38 s
Description: Poznaj metodę podawania wektorów terapii genowej do spłuczki lędźwiowej u młodych szczurów. Ten protokół chirurgiczny umożliwia ocenę skuteczności leczenia chorób układu nerwowego u młodszych pacjentów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Stevenowi Grayowi, Matthew Rioux, Nandzie Regmi i Lacey Stearman z UT Southwestern za owocną dyskusję na temat wyzwania, jakie stanowią młode szczury do wstrzykiwania dooponowego. Prace te były częściowo wspierane przez fundusze z Jaguar Gene Therapy (dla JLFK).

To badanie zostało zatwierdzone przez Emory University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). W niniejszej pracy wykorzystano szczury Sprague-Dawley (wiek 28-30 dni, masa w zakresie około 90-135 g, samce i samice).
1. Przygotowanie wektora
<ol>
	<li>Na początku procedury rozmrozić wektor AAV9 (patrz Tabela materiałów) na lodzie.</li>
	<li>Odwiruj rurkę mikrowirówki zawierającą wektor na krótko w wirówce stołowej, aby upewnić się, że cała ciecz znajduje się na dnie probówki.</li>
	<li>Delikatnie przesuń probówkę mikrowirówki, aby upewnić się, że roztwór jest dobrze wymieszany.</li>
</ol>
2. Przygotowanie klatki regeneracyjnej
<ol>
	<li>Umieść czystą klatkę na kocu elektrycznym (patrz Tabela materiałów) tak, aby tylko połowa klatki stykała się z kocem.</li>
	<li>Ustaw temperaturę koca na ~37 °C.</li>
</ol>
3. Przygotowanie platformy chirurgicznej
<ol>
	<li>Podgrzej podkładkę izotermiczną (patrz Tabela Materiałów) do 39 °C w kuchence mikrofalowej lub łaźni wodnej, aby zawartość stała się płynna.</li>
	<li>Umieść podkładkę izotermiczną na platformie operacyjnej i przykryj ją czystą, chłonną podkładką stołową.</li>
</ol>
4. Przygotowanie zwierząt
<ol>
	<li>Znieczulić szczury izofluranem w przezroczystym pudełku (zgodnie z instytucjonalnie zatwierdzonymi protokołami). Rozpocznij indukcję znieczulenia od 5% izofluranu i zmniejszaj o 1% na minutę, aż osiągniesz 2%. Trzymaj zwierzę na 2% przez dodatkowe 3 minuty.</li>
	<li>Przenieś pudełko ze zwierzęciem do dygestoria i otwórz pudełko. 
	UWAGA: Ogranicza to ekspozycję chirurga na środek znieczulający.</li>
	<li>Usuń sierść z grzbietu zwierzęcia za pomocą elektrycznych maszynek do strzyżenia włosów. 
	UWAGA: Alternatywnie można użyć kremu do depilacji lub ręcznej maszynki do golenia i kremu do golenia.</li>
	<li>Umieść zwierzę na platformie operacyjnej z pyskiem w stożku nosowym do znieczulenia. 
	UWAGA: Zwierzę może zacząć odzyskiwać przytomność podczas usuwania sierści z miejsca operacji. Jeśli tak się stanie, znieczul go ponownie, jak opisano powyżej.</li>
	<li>Nałóż nawilżającą maść do oczu na każde oko, aby zapobiec wysuszeniu rogówki podczas zabiegu.</li>
	<li>Zdezynfekuj obszar operacyjny za pomocą trzech naprzemiennych aplikacji chusteczek z jodonem i izopropanolem.</li>
	<li>Wstrzyknąć środek przeciwbólowy (przeciwbólowe) podskórnie. 
	UWAGA: Buprenorfinę stosuje się zazwyczaj w dawce 0,01-0,05 mg/kg mc., podając co 12 godzin. Alternatywnie, forma tego leku o powolnym uwalnianiu może być podawana jednorazowo w dawce 1 mg/kg, aby zapewnić odpowiednią kontrolę bólu przez 72 godziny. Skonsultuj się z IACUC instytucji, aby uzyskać wytyczne dotyczące leczenia bólu.</li>
	<li>Wstrzyknąć 100 μl 1% lidokainy podskórnie powyżej wyrostków kolczystych od L2 do L6, aby zapewnić znieczulenie miejscowe.</li>
	<li>Umieść rolkę ręcznika papierowego lub rurkę o średnicy 1,5 cm pod zwierzęciem, po prostu rostralnie do bioder. Pomaga to zgiąć kręgosłup, ułatwiając włożenie igły między dwie blaszki.</li>
	<li>Umieść zasłonę z okienkami (patrz Tabela materiałów) na zwierzęciu, wyśrodkowując okienko nad odcinkiem lędźwiowym kręgosłupa.</li>
</ol>
5. Odsłanianie odcinka lędźwiowego kręgosłupa
<ol>
	<li>Potwierdź głębokość znieczulenia, szczypiąc każdą z łap zwierzęcia i szukając braku reakcji odstawienia.</li>
	<li>Używając ostrza skalpela #11, wykonaj nacięcie o długości około 3 cm w skórze wzdłuż linii środkowej od L2 do L6.</li>
	<li>Poluzuj skórę od mięśnia, wkładając sterylną zakrzywioną parę nożyczek chirurgicznych między mięsień a skórę, a następnie otwierając końcówki.</li>
	<li>Usuń powięź pokrywającą wyrostki kolczyste L2-L5.</li>
</ol>
6. Ładowanie strzykawki
<ol>
	<li>Odpipetować 25-35 μl wektora (w celu uzyskania pożądanej dawki) do nakrętki sterylnej probówki do mikrowirówki.</li>
	<li>Pobrać całą objętość do strzykawki insulinowej. 
	UWAGA: Uważaj, aby podczas tego procesu nie zasysać powietrza.</li>
</ol>
7. Wykonywanie iniekcji
<ol>
	<li>Zidentyfikuj wyrostki kolczyste L5 i L4. 
	UWAGA: L6 znajduje się bezpośrednio między dwoma grzebieniami biodrowymi, a jego wyrostek kolczysty powinien być łatwy do zidentyfikowania przez sondowanie narzędziem. Instrument można następnie delikatnie przesunąć w górę tyłu, aby znaleźć granice procesów L5 i L4.</li>
	<li>Połóż jedną rękę tak, aby kciuk delikatnie spoczywał na ogonie zwierzęcia i jednej nodze. Użyj palca, aby ustabilizować strzykawkę.</li>
	<li>Ustawić igłę strzykawki tak, aby znajdowała się na lewo od wyrostka kolczystego L5 i zbieżna z końcem ogonowym. Ustawić strzykawkę tak, aby znajdowała się około 30° poza linią środkową i 30° w górę od płaszczyzny stołu. 
	UWAGA: Pomocne może być użycie mikroskopu chirurgicznego w celu lepszej identyfikacji punktów orientacyjnych i ustawienia końcówki igły.</li>
	<li>Przesunąć igłę strzykawki do przodu o około 8 mm, nad górną częścią blaszki L5, a następnie pod blaszką L4 do spłuczki lędźwiowej, aż do uderzenia w kość. Prawidłowe ułożenie spowoduje drgnięcie nogi i/lub ogona, które może być widoczne lub wyczuwalne przez kciuk spoczywający na nodze/ogonie. Jeśli nie ma drgań, wyjmij igłę i spróbuj wykonać procedurę z lewej strony. Jeśli nadal nie ma drgań, w razie potrzeby powtórz procedurę między L4/L3 i L3/L2.</li>
	<li>Powoli wciskać tłok przez około 5 s. 
	UWAGA: Podczas wstrzyknięcia może wystąpić drganie nogi lub ogona.</li>
	<li>Trzymać strzykawkę w miejscu przez około 30 s po całkowitym wciśnięciu tłoka, aby umożliwić wyrównanie ciśnienia i zminimalizować refluks wstrzykniętego wstrzykiwacza po wyjęciu igły.</li>
	<li>Powoli wyjmować igłę.</li>
</ol>
8. Zamknięcie nacięcia
<ol>
	<li>Przybliż krawędzie nacięcia.</li>
	<li>Zaczynając od jednego końca rany, użyj szwu 4-0 (patrz tabela materiałów) lub zszywek chirurgicznych, aby zamknąć nacięcie.</li>
</ol>
9. Odzyskiwanie i monitorowanie
<ol>
	<li>Umieść zwierzę w rozgrzanej klatce.</li>
	<li>Sprawdzaj zwierzę co najmniej co 15 minut, aż do momentu, gdy będzie w pełni zdolne do chodzenia. 
	UWAGA: Powinno to zająć od 15 minut do 45 minut.</li>
	<li>Przez następne trzy dni wykonuj kontrole stanu zdrowia co najmniej codziennie. Zapewnij leki przeciwbólowe przez pierwsze 2 dni po zabiegu chirurgicznym lub zgodnie z wymaganiami IACUC.</li>
	<li>Tydzień po zabiegu usuń szwy lub zszywki.</li>
</ol>
10. Procedura uzupełniająca
UWAGA: Aby określić dokładność techniki iniekcji, wstrzyknij niebieski barwnik trypanowy, jak opisano powyżej, a następnie natychmiast poddaj zwierzę eutanazji (zgodnie z instytucjonalnie zatwierdzonymi protokołami) i wykonaj laminektomię, aby zobaczyć wynik.
<ol>
	<li>Podczas gdy zwierzę pozostaje pod narkozą, należy je poddać eutanazji, podając śmiertelną dawkę pentobarbitalu we wstrzyknięciu dootrzewnowym w dawce 150 mg/kg.</li>
	<li>Gdy oddychanie i czynność serca ustaną, otwórz klatkę piersiową, aby zapewnić śmierć. Przedłuż nacięcie chirurgiczne w górę pleców do szyi.</li>
	<li>Wykonaj nacięcie o długości 4 cm w mięśniu równolegle do kręgosłupa po obu stronach wyrostków kolczystych, trzymając się jak najbliżej wyrostków.</li>
	<li>Za pomocą cienkich kleszczy lub nożyczek usuń mięsień spomiędzy wyrostków kolczystych.</li>
	<li>Usuń wyrostki kolczyste od L6 do dolnej części klatki piersiowej kręgosłupa za pomocą rongeur (patrz Tabela materiałów). Unikaj ruchów skrętnych, ponieważ może to uszkodzić rongeurs.</li>
	<li>Włóż dolną końcówkę rongeur pod blaszkę L5 i usuń kość pokrywającą rdzeń kręgowy, wyjmując z niej kilka "kęsów". 
	UWAGA: Odciągnięcie wyrostka kolczystego L6 może ułatwić włożenie końcówki rongeur. Należy zachować ostrożność, aby zapobiec uszkodzeniu rdzenia kręgowego.</li>
	<li>Kontynuuj rozszerzanie laminektomii o co najmniej cztery blaszki rostralne. Sprawdzić wewnętrzną powierzchnię blaszek pod kątem śladów barwnika, które mogą wskazywać na nieudane wstrzyknięcie.</li>
</ol>

Lumbar Puncture Delivery of AAV9 in Juvenile Rats for CNS Gene Therapy

<ol><li>Wurster, C., Petri, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+spinal+muscular+atrophy+research%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurol%22%5BJournal%5D)">Progress in spinal muscular atrophy research.</a> Curr Opin Neurol. 35 (5), 693-698 (2022).</li>
<li>Wu, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinitis+pigmentosa%3A+Novel+therapeutic+targets+and+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Retinitis pigmentosa: Novel therapeutic targets and drug development.</a> Pharmaceutics. 15 (2), 685(2023).</li>
<li>Larkin, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+FDA-approved+gene+therapy+for+hemophilia%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">First FDA-approved gene therapy for hemophilia.</a> JAMA. 329 (1), 14(2023).</li>
<li>Lee, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nadofaragene+firadenovec%3A+First+approval%5BTitle%5D)+AND+%22Drugs%22%5BJournal%5D)">Nadofaragene firadenovec: First approval.</a> Drugs. 83 (4), 353-357 (2023).</li>
<li>Taghian, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+safe+and+reliable+technique+for+CNS+delivery+of+AAV+vectors+in+the+cisterna+magna%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">A safe and reliable technique for CNS delivery of AAV vectors in the cisterna magna.</a> Mol Ther. 28 (2), 411-421 (2020).</li>
<li>Donsante, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracerebroventricular+delivery+of+self-complementary+adeno-associated+virus+serotype+9+to+the+adult+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Intracerebroventricular delivery of self-complementary adeno-associated virus serotype 9 to the adult rat brain.</a> Gene Ther. 23 (5), 401-407 (2016).</li>
<li>Pellot, J. E., Jesus, O. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suboccipital+puncture.+%5BUpdated+2022+Jul+25%5D%5BTitle%5D)+AND+%22StatPearls+%5BInternet%5D%22%5BJournal%5D)">Suboccipital puncture. [Updated 2022 Jul 25].</a> StatPearls [Internet]. , StatPearls Publishing. Treasure Island (FL). (2022).</li>
<li>Elliger, S. S., Elliger, C. A., Aguilar, C. P., Raju, N. R., Watson, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elimination+of+lysosomal+storage+in+brains+of+MPS+vii+mice+treated+by+intrathecal+administration+of+an+adeno-associated+virus+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Elimination of lysosomal storage in brains of MPS vii mice treated by intrathecal administration of an adeno-associated virus vector.</a> Gene Ther. 6 (6), 1175-1178 (1999).</li>
<li>De La Calle, J. L., Paino, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+procedure+for+direct+lumbar+puncture+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Bull%22%5BJournal%5D)">A procedure for direct lumbar puncture in rats.</a> Brain Res Bull. 59 (3), 245-250 (2002).</li>
<li>O'connor, D. M., Lutomski, C., Jarrold, M. F., Boulis, N. M., Donsante, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lot-to-lot+variation+in+adeno-associated+virus+serotype+9+%28AAV9%29+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther+Methods%22%5BJournal%5D)">Lot-to-lot variation in adeno-associated virus serotype 9 (AAV9) preparations.</a> Hum Gene Ther Methods. 30 (6), 214-225 (2019).</li>
<li>Manfredsson, F. P., Rising, A. C., Mandel, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAV9%3A+A+potential+blood-brain+barrier+buster%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">AAV9: A potential blood-brain barrier buster.</a> Mol Ther. 17 (3), 403-405 (2009).</li>
<li>Hudry, E., Vandenberghe, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+AAV+gene+transfer+to+the+nervous+system%3A+A+clinical+reality%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Therapeutic AAV gene transfer to the nervous system: A clinical reality.</a> Neuron. 101 (5), 839-862 (2019).</li>
<li>Georg-Fries, B., Biederlack, S., Wolf, J., Zur Hausen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+proteins%2C+helper+dependence%2C+and+seroepidemiology+of+a+new+human+parvovirus%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Analysis of proteins, helper dependence, and seroepidemiology of a new human parvovirus.</a> Virology. 134 (1), 64-71 (1984).</li>
<li>Schulz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+and+neutralizing+anti-aav+antibodies%3A+Detection+and+implications+for+rAAV-mediated+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Binding and neutralizing anti-aav antibodies: Detection and implications for rAAV-mediated gene therapy.</a> Mol Ther. 31 (3), 616-630 (2023).</li>
<li>Gray, S. J., Nagabhushan Kalburgi, S., Mccown, T. J., Samulski, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+CNS+gene+delivery+and+evasion+of+anti-aav-neutralizing+antibodies+by+intrathecal+aav+administration+in+non-human+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Global CNS gene delivery and evasion of anti-aav-neutralizing antibodies by intrathecal aav administration in non-human primates.</a> Gene Ther. 20 (4), 450-459 (2013).</li>
<li>Meyer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+single+injection+CSF+delivery+of+AAV9-mediated+gene+therapy+for+sma%3A+A+dose-response+study+in+mice+and+non-human+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Improving single injection CSF delivery of AAV9-mediated gene therapy for sma: A dose-response study in mice and non-human primates.</a> Mol Ther. 23 (3), 477-487 (2015).</li>
<li>Hinderer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+intrathecal+routes+of+administration+for+adeno-associated+viral+vectors+in+large+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Evaluation of intrathecal routes of administration for adeno-associated viral vectors in large animals.</a> Hum Gene Ther. 29 (1), 15-24 (2018).</li>
<li>Wang, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebrospinal+fluid+leakage+and+headache+after+lumbar+puncture%3A+A+prospective+non-invasive+imaging+study%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Cerebrospinal fluid leakage and headache after lumbar puncture: A prospective non-invasive imaging study.</a> Brain. 138, 1492-1498 (2015).</li>
<li>Hordeaux, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus-induced+dorsal+root+ganglion+pathology%29%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus-induced dorsal root ganglion pathology).</a> Hum Gene Ther. 31 (15-16), 808-818 (2020).</li>
<li>Semple, B. D., Blomgren, K., Gimlin, K., Ferriero, D. M., Noble-Haeusslein, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+development+in+rodents+and+humans%3A+Identifying+benchmarks+of+maturation+and+vulnerability+to+injury+across+species%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Brain development in rodents and humans: Identifying benchmarks of maturation and vulnerability to injury across species.</a> Prog Neurobiol. 106-107, 1-16 (2013).</li>
<li>Fang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+adeno-associated+virus+serotypes+and+delivery+methods+for+cardiac+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther+Methods%22%5BJournal%5D)">Comparison of adeno-associated virus serotypes and delivery methods for cardiac gene transfer.</a> Hum Gene Ther Methods. 23 (4), 234-241 (2012).</li>
</ol>

Dr Donsante jest wynalazcą w oczekującym patencie dotyczącym podawania wektorów AAV9 przez płyn mózgowo-rdzeniowy.

Na OUN wpływa wiele różnych chorób. Zapewnienie funkcjonalnej kopii odpowiedniego genu za pośrednictwem wektora wirusowego jest atrakcyjną strategią leczenia w przypadku tych, które mają charakter recesywny i monogenowy, takich jak rdzeniowy zanik mięśni. Jednak bariera krew-mózg (BBB) wyklucza większość wektorów terapii genowej podawanych dożylnie11. Te, które mogą przekroczyć barierę krew-mózg, takie jak AAV9, muszą być podawane w dużych dawkach, aby przezwyciężyć utratę wektora spowodowaną transdukcją obwodową12. Barierą jest również wiek. Narażenie środowiskowe na różne serotypy AAV wzrasta w wieku13 lat i często prowadzi do produkcji przeciwciał, które mogą neutralizować wektory terapeutyczne14. W związku z tym dożylne podawanie wektorów terapii genowej w zaburzeniach ośrodkowego układu nerwowego jest na ogół ograniczone do niemowląt i nie jest stosowane u pacjentów zdiagnozowanych w późniejszym życiu. 
W przypadku starszych pacjentów bezpośrednie wstrzyknięcie wektora do płynu mózgowo-rdzeniowego może spowodować szeroką transdukcję w OUN, omijając zarówno barierę krew-mózg, jak i istniejące wcześniej przeciwciała anty-AAV15. Ponieważ podejście to jest ukierunkowane, można również stosować niższe dawki wektorów. W warunkach klinicznych istnieją dwa podstawowe podejścia: (1) nakłucie lędźwiowe i (2) wstrzyknięcie do komór bocznych. To ostatnie niesie ze sobą większe ryzyko, ale generalnie zapewnia większą transdukcję mózgu. Nakłucie lędźwiowe jest bezpieczniejsze, ale transdukcja jest przekrzywiona w kierunku rdzenia kręgowego. Transdukcja mózgu może być wzmocniona przez ustawienie pacjenta w pozycji Trendelenburga, ale dane na ten temat są niejednoznaczne 16,17. Użycie cewnika w celu dotarcia do cisterna magna poprzez nakłucie lędźwiowe może stanowić lepszą opcję w klinice, ale jest to wczesna faza użycia5. Mogą istnieć inne wyzwania związane z przełożeniem podejść opracowanych na modelach zwierzęcych do celów klinicznych, takie jak utrata wektora z powodu wycieku płynu mózgowo-rdzeniowego18 i toksyczność w zwojach korzenia grzbietowego19.
W większości badań nad terapiami ukierunkowanymi na OUN przeprowadzanymi u gryzoni wykorzystuje się noworodki lub dorosłe zwierzęta (w wieku >60 dni). Noworodki mają tę zaletę, że mają mały rozmiar ciała, co pozwala na stosowanie wyższych skutecznych dawek, oraz niedojrzały układ odpornościowy, co pozwala uniknąć powikłań związanych z odpowiedzią immunologiczną przeciwko terapii. Jednak pod względem rozwoju mózgu nowonarodzona mysz lub szczur lepiej reprezentuje etap płodowy u ludzi. W przypadku terapii przeznaczonych dla dzieci w wieku 5-10 lat młodociany szczur (25-35 dni) jest lepszym modelem pod względem rozwoju neurologicznego20. Ponieważ metoda wstrzykiwania dooponowego nie została wcześniej opisana u młodych szczurów, a metody ustalone dla dorosłych myszy i szczurów okazały się nieskuteczne u szczurów w tym wieku, opracowano opisane powyżej podejście. Żeby było jasne, młode szczury są nie tylko mniejsze niż dorosłe, ale mogą również różnić się elastycznością opony twardej, która chroni rdzeń kręgowy, co sprawia, że procedura, która działa w celu nakłucia tej warstwy u dorosłego szczura, jest nieskuteczna u młodocianego.
Ucząc się, jak wykonywać wstrzyknięcie dooponowe u młodych szczurów, konieczne jest użycie barwnika (takiego jak błękit trypanowy) jako substytutu środka terapeutycznego, a użytkownik powinien być wysoce pewny swojej zdolności do skutecznego i powtarzalnego wykonania procedury przed rozpoczęciem badania z lekiem. Osiągnięcie biegłości w tej technice będzie wymagało praktyki, aby zdobyć doświadczenie w tym, jak strzykawka czuje się, gdy trajektoria jest celna, a nie niecelna. Istnieją dwa typowe błędy. Jeśli kąt natarcia jest zbyt płytki, igła uderzy w górną część jednej z blaszek lub w tył blaszki rostralnej. Nie będzie drgań, a odległość, na jaką przesuwa się igła, będzie o kilka milimetrów krótsza niż 8 mm. Jeśli kąt natarcia jest zbyt duży, istnieje ryzyko, że igła przejdzie między dwiema blaszkami i przebije jamę brzuszną. Kiedy tak się stanie, igła przesunie się znacznie dalej niż 8 mm. Jeśli tak się stanie, wyjmij igłę, zmień położenie i spróbuj ponownie. W nielicznych przypadkach, w których tak się stało, przejściowe wejście do jamy brzusznej na kilka milimetrów przed wycofaniem i zmianą pozycji nie spowodowało żadnych widocznych trwałych szkód dla zwierząt. 
Stwierdzono, że obserwacja fizycznej reakcji na umieszczenie igły ma kluczowe znaczenie dla osiągnięcia odtwarzalności z wysokim wskaźnikiem powodzenia tej procedury. W przypadku braku odpowiedzi, wskaźnik powodzenia wstrzyknięcia był niski. Jednak w niektórych przypadkach zwierzę wymagało prób w wielu miejscach, aby uzyskać odpowiedź, a śladowe ilości barwnika zaobserwowano w jednej lub kilku poprzednich śladach igły. Nie zaobserwowano barwnika w przestrzeni zewnątrzoponowej, co sugeruje, że niektóre z poprzednich ukłuć igłą przeniknęły do opony twardej, nie powodując drgania ogona lub nogi. Ponieważ refluks był minimalny (podobny do tego, który obserwuje się w śladzie igły po wstrzyknięciu), uważa się, że wpływ poprzednich ukłuć igłą na skuteczność podawania w tych przypadkach był znikomy. 
Gdy ktoś osiągnie biegłość w technice porodu, może napotkać drugie, niechirurgiczne wyzwanie. W szczególności u dorosłych szczurów (w wieku ~ 70 dni) siła wektorów AAV9 do dostarczania dokanałowego do rdzenia kręgowego i mózgu może się znacznie różnić w zależności od partii, nawet jeśli są one generowane przez ten sam rdzeń wektora. Niektóre partie będą działać zgodnie z oczekiwaniami, powodując transdukcję istoty szarej rdzenia kręgowego na całej jego długości. Inne jednak nie zdołają przeniknąć do istoty szarej, przede wszystkim transdukując zwoje korzenia grzbietowego10. Przyczyna tej zmienności jest niejasna, ponieważ wektory są silne w warunkach in vitro i po wstrzyknięciu bezpośrednio do rdzenia kręgowego. Zaleca się przeprowadzenie badania pilotażowego na 3-4 zwierzętach z każdą nową partią wirusa w celu potwierdzenia, że nowa partia działa zgodnie z oczekiwaniami przed rozpoczęciem dużego badania. Siłę działania można ocenić za pomocą barwienia immunohistochemicznego lub immunofluorescencyjnego produktu transgenu białka lub ilościowego określenia ilości transgenowego mRNA lub genomów wektorowych za pomocą ilościowego PCR lub ddPCR21. Oprócz nieznanych zmiennych, które odróżniają partie wirusa, niewielkie różnice w wieku zwierząt, objętości wstrzyknięcia, szybkości dostarczania i stężeniu wektora mogą powodować zmienność wyników. Przed rozpoczęciem dużego badania może być konieczne zoptymalizowanie ich pod kątem każdego wirusa lub innego potencjalnego środka terapeutycznego.
Po przeszkoleniu doświadczony chirurg może wykonać procedurę wstrzyknięcia dooponowego młodemu szczurowi w ciągu około 30 minut, od wprowadzenia znieczulenia do początku okresu rekonwalescencji. Pozwala to na leczenie dużych kohort w krótkim czasie. Rekonwalescencja po operacji jest również szybka. Większość zwierząt porusza się normalnie w ciągu 20-30 minut. Po wykonaniu ponad 200 takich operacji nie stwierdzono żadnych negatywnych skutków tej procedury. 
Wreszcie, minimalizacja stresu zwierząt i zapewnienie dobrostanu zwierząt podczas zabiegów chirurgicznych są najważniejszymi kwestiami. W związku z tym wymagane jest odpowiednie stosowanie środków znieczulających i przeciwbólowych, a temperatura ciała musi być utrzymywana podczas zabiegu i do momentu, gdy zwierzę w pełni wyzdrowieje ze znieczulenia. Odpowiednie organy regulacyjne i personel weterynaryjny w różnych instytucjach mogą mieć różne wymagania i zalecenia dotyczące tych tematów. Stosowanie środków znieczulających i przeciwbólowych opisanych w tej procedurze zostało opracowane w porozumieniu z weterynarzami Uniwersytetu Emory i personelem IACUC. Naukowcy powinni ściśle współpracować z lokalnymi lekarzami weterynarii i IACUC, aby osiągnąć potrzebne cele.
Istnieją pewne ograniczenia tej procedury. Opisana tutaj metoda została opracowana do stosowania u młodych szczurów, a niezliczone różnice strukturalne i inne różnice między ludźmi a szczurami mogą ograniczać translację tych procedur na ludzi. Celem umożliwienia dokanałowego wstrzyknięcia dokanałowego środka terapeutycznego u młodych szczurów jest ułatwienie wykorzystania modelu młodego szczura do testowania skuteczności potencjalnego leczenia terapeutycznego - nawet jeśli dokładny sposób podawania musiałby zostać zmieniony w celu zastosowania u pacjentów.

Obietnica terapii genowych za pośrednictwem wirusa została w końcu zrealizowana w ostatnich latach dzięki zatwierdzeniu przez FDA metod leczenia rdzeniowego zaniku mięśni, dystrofii siatkówki, hemofilii czynnika IX, raka i innych1,2,3,4. Obecnie opracowywane są niezliczone inne terapie. Terapia genowa ma na celu dostarczenie genu terapeutycznego do komórek pacjenta. Produkty tego nowego genu mogą zastąpić brakującą aktywność z niedoboru genu endogennego, hamować toksyczny gen, zabijać komórki rakowe lub zapewniać inne korzystne funkcje.
W przypadku chorób wpływających na ośrodkowy układ nerwowy (OUN), często pożądane jest dostarczenie wektora terapii genowej bezpośrednio do tkanki docelowej. Podejścia niesystemowe zapewniają dwie korzyści: minimalizują skutki uboczne poza celem, które mogą być spowodowane transdukcją obwodową, oraz znacznie zmniejszają ilość wektora potrzebną do osiągnięcia odpowiedniego poziomu transdukcji w tkance docelowej5.
Istnieje wiele różnych podejść do dostarczania wektorów terapii genowej do OUN. Wstrzyknięcie śródmiąższowe, czyli wstrzyknięcie wektora bezpośrednio do rdzenia kręgowego lub tkanki mózgowej, może być stosowane do dostarczania do określonego regionu. Jednak w przypadku wielu chorób pożądana jest szeroka transdukcja OUN. Można to osiągnąć, dostarczając wektor do płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF)5, płynu, który przepływa w mózgu i rdzeniu kręgowym oraz wokół nich. Istnieją trzy podstawowe sposoby dostarczania wektorów do płynu mózgowo-rdzeniowego. Najbardziej inwazyjnym podejściem jest poród śródmózgowo-komorowy, który polega na wywierceniu otworu w czaszce i wprowadzeniu igły przez mózg do komór bocznych. W ten sposób dochodzi do transdukcji w całym mózgu. Jednak procedura może spowodować krwotok śródczaszkowy, a podejście to na ogół powoduje tylko ograniczoną transdukcję rdzenia kręgowego6. Wstrzyknięcie w cisterna magna u podstawy czaszki jest mniej inwazyjne, ale niesie ze sobą ryzyko uszkodzenia pnia mózgu. Chociaż często stosowany w badaniach na zwierzętach5, wstrzyknięcie do cisterna magna nie jest już rutynowo stosowane w klinice7. Nakłucie lędźwiowe jest najmniej inwazyjnym podejściem dostępu do płynu mózgowo-rdzeniowego. Polega to na umieszczeniu igły między dwoma kręgami lędźwiowymi i w spłuczce lędźwiowej.
Nakłucie lędźwiowe w celu dostarczenia wektora jest rutynowo wykonywane u dorosłych szczurów i myszy oraz u noworodków myszy8,9. Autorzy tego badania przeprowadzili niedawno nakłucia lędźwiowe u młodych szczurów (w wieku 28-30 dni) w celu dostarczenia wektorów serotypu 9 (AAV9) związanego z adenowirusem. U dorosłych szczurów igłę do nakłucia lędźwiowego noworodka umieszczono pionowo między kręgami L3 i L49. Prawidłowe umieszczenie powoduje ruch ogonem i przepływ płynu mózgowo-rdzeniowego do zbiornika igły. Jednak u młodych szczurów żaden z tych odczytów nie mógł zostać osiągnięty. Następnie autorzy podjęli próbę adaptacji procedury na dorosłej myszy przy użyciu strzykawki insulinowej 27 G umieszczonej pod kątem między L5 i L610. U dorosłych myszy, które są zazwyczaj mniejsze niż szczury P28, nie powoduje to machania ogonem, ale nieprawidłowe umieszczenie igły jest widoczne w przepływie wstecznym wstrzykniętego. Jednak u młodych szczurów takie podejście jednolicie prowadziło do wstrzykiwania zewnątrzoponowego, co prawdopodobnie wynikało z różnej elastyczności warstw tkanek otaczających rdzeń kręgowy między dorosłymi myszami a młodymi szczurami. Następnie oceniano podejścia cewnikowe. W szczególności cewnik został wprowadzony przez nacięcie w oponie twardej spłuczki lędźwiowej i do środkowej części klatki piersiowej rdzenia kręgowego; Jednak takie podejście doprowadziło do znacznego refluksu wstrzyknięcia z powrotem z miejsca nacięcia podczas porodu. Próby wprowadzenia cewnika do przestrzeni dooponowej przezskórnie za pomocą igły prowadzącej również zakończyły się niepowodzeniem. Ze względu na wąską szerokość międzywarstwową, cewnik prawdopodobnie uderzyłby w blaszkę rostralną i nie posunąłby się naprzód.
Tutaj opisana jest metoda pozwalająca na skuteczne i powtarzalne dostarczenie roztworu poprzez nakłucie lędźwiowe u młodego szczura. Podejście to może być stosowane w przypadku wektorów wirusowych, a prawdopodobnie także w przypadku komórek, farmaceutyków i innych środków terapeutycznych.

<table><tbody><tr><td>200 i mikro; L końcówki do pipet z filtrem</td><td>MidSci</td><td>PR-200RK-FL</td><td>Wirus do pipetowania</td></tr><tr><td>AAV9-GFP</td><td>Vector Builder</td><td>P200624-1005ynr</td><td>AAV9 wektor wyrażający wchłanialny szew GFP</td></tr><tr><td>z pokrytą igłą Vicryl Polyglactin 910 FS-2 3/8 Okrągła igła do odwróconego cięcia Rozmiar 4 - 0 Plecionka</td><td>McKesson</td><td>J422H</td><td></td></tr><tr><td>Podkładka do</td> szwów <td>VWR</td><td>56616-031</td><td>Chirurgia</td></tr><tr><td>Podkładki izotermiczne Braintree Scientific, 8'' x 8''</td> <td>Fisher Scientific</td><td>50-195-4664</td><td>Utrzymuje temperaturę ciała</td></tr><tr><td>Buprenorfina</td><td>McKesson</td><td>1013922</td><td>Przeciwbólowy</td></tr><tr><td>Buprenorfina-ER (1 mg / ml)</td><td>Zoopharma</td><td></td><td>Waciki przeciwbólowe o przedłużonym uwalnianiu</td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>19-365-409</td><td>Usuwanie krwi</td></tr><tr><td>Serwetka, mysz, przezroczysty plastik, 12" x 12", z klejem Stolarka</td><td>Steris</td><td>1212CPSTF</td><td>Serweta chirurgiczna</td></tr><tr><td>Dumont #5 Kleszcze</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td>Kleszcze</td></tr><tr><td>Koc elektryczny</td><td>CVS Health</td><td></td><td>CVS Health Series 500 Extra długa podkładka grzewcza</td></tr><tr><td>Eppendorf Research plus, pipeta 1-kanałowa, zmienna, 20&ndash; 200 i mikro; L</td><td>Eppendorf</td><td>3123000055</td><td>Wirus do pipetowania</td></tr><tr><td>Cienkie nożyczki</td><td>Fine Science Tools</td><td>14059-11</td><td>Zakrzywione nożyczki chirurgiczne</td></tr><tr><td>Friedman-Pearson Rongeurs</td><td>Fine Science Tools</td><td>16121-14</td><td>Laminektomia</td></tr><tr><td>Uchwyty do igieł Halseya</td><td>Fine Science Tools</td><td>12001-13</td><td>Sterownik igłowy</td></tr><tr><td>Strzykawki insulinowe z ultracienką igłą 12,7 mm x 30 G 3/10 ml / cc</td><td></td><td>Strzykawka</td>BD <td>328431</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>McKesson</td><td>803250</td><td>Znieczulające</td></tr><tr><td>chusteczki izopropanolowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-031-350</td><td>Dezynfekcja skóry</td></tr><tr><td>Lidokaina, 1%</td> <td>McKesson</td><td>239935</td><td>Znieczulenie miejscowe</td></tr><tr><td>Probówki wirówkowe: 1,5 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-137</td><td>Ładowanie strzykawki</td></tr><tr><td>Powidon-jod</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-118-0481</td><td></td></tr><tr><td>Rękojeść skalpela</td> do dezynfekcji skóry - #4 <td>Fine Science Tools</td><td>10004-13</td><td>Uchwyt ostrza skalpela</td></tr><tr><td>Komora indukcyjna Sure-Seal</td><td>Braintree</td><td>Scientific EZ-17</td><td>Pudełko anestezjologiczne</td></tr><tr><td>Ostrze chirurgiczne Miltex Stal węglowa nr 11 Sterylne jednorazowe pakowane pojedynczo</td><td>McKesson</td><td>4-111</td><td>#11 Ostrze skalpela</td></tr><tr><td>SYSTANE NA NOC Maść do oczu</td><td>Alcon</td><td></td><td>Maść do oczu</td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>VWR</td><td>97063-702</td><td>Iniekcja</td></tr></tbody></table>

podanie wektorowe dokanałowo u młodych szczurów przez wstrzyknięcie do spłuczki lędźwiowej

Intrathecal Vector Delivery in Juvenile Rats via Lumbar Cistern Injection

Terapia genowa to potężna technologia dostarczania pacjentowi nowych genów do leczenia choroby, czy to w celu wprowadzenia funkcjonalnego genu, dezaktywacji toksycznego genu, czy też dostarczenia genu, którego produkt może modulować biologię choroby. Metoda podawania wektora terapeutycznego może przybierać różne formy, od infuzji dożylnej do podania ogólnoustrojowego po bezpośrednie wstrzyknięcie do tkanki docelowej. W przypadku zaburzeń neurodegeneracyjnych często pożądane jest pochylenie transdukcji w kierunku mózgu i/lub rdzenia kręgowego. Najmniej inwazyjne podejście ukierunkowane na cały ośrodkowy układ nerwowy polega na wstrzyknięciu do płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF), dzięki czemu terapia dociera do dużej części ośrodkowego układu nerwowego. Najbezpieczniejszym podejściem do dostarczenia wektora do płynu mózgowo-rdzeniowego jest śródkanałowe wstrzyknięcie lędźwiowe, w którym igła jest wprowadzana do spłuczki lędźwiowej rdzenia kręgowego. Ta technika, znana również jako nakłucie lędźwiowe, jest szeroko stosowana u noworodków i dorosłych gryzoni oraz w dużych modelach zwierzęcych. Chociaż technika ta jest podobna u różnych gatunków i etapów rozwoju, subtelne różnice w rozmiarze, strukturze i elastyczności tkanek otaczających przestrzeń śródoponową wymagają dostosowania w podejściu. W artykule opisano metodę wykonywania nakłucia lędźwiowego u młodych szczurów w celu dostarczenia wektora serotypu 9 związanego z adeno. W tym przypadku do spłuczki lędźwiowej wstrzyknięto 25-35 μl wektora, a do oceny profilu transdukcji wynikającego z każdego wstrzyknięcia użyto reportera z zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP). Omówiono korzyści i wyzwania związane z tym podejściem.

Aby ocenić dokładność techniki wstrzykiwania, jako substytut preparatu terapeutycznego zastosowano barwnik, błękit trypanu. Barwnik ten łatwo wiąże się z białkami, dzięki czemu zazwyczaj pozostaje w obrębie struktury, do której został wstrzyknięty. Oznacza to, że barwnik może nie odzwierciedlać dokładnie rozmieszczenia preparatu terapeutycznego po wstrzyknięciu; służy on jedynie do weryfikacji precyzji samego wkłucia. Po pomyślnym wprowadzeniu do cysterny lędźwiowej błękit trypanu wiąże się z oponą twardą, barwiąc obwód rdzenia kręgowego na niebiesko. Jednak w przypadku, gdy igła nie przebije opony twardej, barwnik przedostaje się do przestrzeni nadtwardówkowej. Wówczas zarówno opona twarda, jak i tkanki otaczające (powierzchnia kości oraz więzadła i mięśnie łączące blaszki łukowe) zostaną zabarwione na niebiesko. Wzorce te są łatwo dostrzegalne gołym okiem.
Różnica między prawidłowo a nieprawidłowo wykonanym wstrzyknięciem jest trudna do oceny, jeśli wykona się jedynie przekrój poprzeczny rdzenia kręgowego i kolumny kręgosłupa. Zamiast tego zaleca się wykonanie laminektomii przy użyciu kleszczyków krawędziowych, zaczynając od blaszki łukowej L5 i przesuwając się w kierunku rostralnym. Należy uważać, aby w tym procesie nie uszkodzić opony twardej. Wykorzystanie mikroskopu dissectingowego ułatwia ten proces. Rysunek 1 przedstawia porównawcze przykłady udanych oraz tylko częściowo udanych wstrzyknięć. Przy udanym wstrzyknięciu, podczas wycofywania igły, obserwuje się niewielki lub brak refluksu wzdłuż toru igły. Po udanym wstrzyknięciu usunięcie blaszki łukowej w celu odsłonięcia rdzenia kręgowego ujawnia obecność błękitu trypanowego wewnątrz rdzenia kręgowego, ale nie na powierzchni kości (Rysunek 1A). Barwnik jest również widoczny w pniu mózgu i móżdżku po udanym wstrzyknięciu (Rysunek 1B). W przeciwieństwie do tego, częściowo udane wstrzyknięcie objawia się znacznym refluksem barwnika w górę toru igły podczas procesu wstrzykiwania i/lub widoczną obecnością barwnika na kości (Rysunek 1C).
Stosując powyższą procedurę, 28 µL wektora AAV9 wykazującego ekspresję wzmocnionego zielonego białka fluorescencyjnego (GFP) w stężeniu 3 x 1013 genomów wektora/ml, co daje całkowitą dawkę 8,4 x 1011 kopii genomu wektora na zwierzę. Po czterech tygodniach zwierzęta uśmiercono i poddano perfuzji 4% paraformaldehydem10Następnie pobrano mózg oraz rdzeń kręgowy i przygotowano je do cięcia w zamrożeniu. 40 µm wykonano grube przekroje, które następnie barwiono na GFP. Rycina 2 przedstawia przykłady wzorca transdukcji uzyskanego za pomocą tego wektora. Transdukcja była zazwyczaj najwyższa w rdzeniu kręgowym, szczególnie w odcinku lędźwiowym (Rysunek 2A-C), prawdopodobnie ze względu na bliskość miejsca wstrzyknięcia. Transdukcja mózgu została osiągnięta (Rycina 2D-F), lecz zgodnie z oczekiwaniami miało ono tendencję do bycia bardziej ograniczone niż to, co zaobserwowano w rdzeniu kręgowym.
Aby zilustrować powtarzalność wyników osiągniętych przez jednego, doświadczonego chirurga przy użyciu jednej partii wirusa, na Rysunku 3 oraz Rysunku 4 przedstawiono odpowiednio barwione przekroje móżdżku i kory z każdego z 15 szczurów poddanych iniekcji w ramach niniejszego badania. Przedstawiono również barwione przekroje szyjnego odcinka rdzenia kręgowego dla 7 z tych 15 szczurów (Rysunek 5). Oczywiście zakres transdukcji mózgu może wykazywać jeszcze większą zmienność w zależności od zastosowanych dawek, partii wektora oraz operatora10.
<img alt="Pooperacyjne badanie histologiczne próbek tkanek, z uwzględnieniem struktur naczyniowych i tkankowych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66463/66463fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Odsłonięcie rdzenia kręgowego po wstrzyknięciu barwnika. Wykonano laminektomie po wstrzyknięciu błękitu trypanu. (A) Rdzeń kręgowy jest zabarwiony na niebiesko przy prawidłowo wykonanym wstrzyknięciu, a barwnika nie widać na kości usuniętej podczas laminektomii (strzałki). (B) Barwnik można zaobserwować również wokół pnia mózgu. (C) W przypadku wstrzyknięcia, podczas którego wystąpił znaczny refluks, w rdzeniu znajduje się mniej barwnika, natomiast barwnik jest obecny na powierzchni kości (strzałki). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66463/66463fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza histologiczna mózgu i rdzenia kręgowego na obrazach mikroskopowych; wzór barwienia istoty szarej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66463/66463fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Przykłady wzorów transdukcji uzyskanych po dokanałowej podaży AAV9-GFP. Przekroje o grubości 40 µm (A) szyjnego, (B) piersiowego i (C) lędźwiowego odcinka rdzenia kręgowego poddano barwieniu immunohistochemicznemu na GFP (barwienie czarne). Na wszystkich poziomach zaobserwowano wysoki poziom transdukcji istoty szarej. (D) W przeciwieństwie do tego, w mózgu widoczna jest rzadsza transdukcja ogólna. Lewy i prawy obszar zaznaczony ramką są odpowiednio powiększone w (E) i (F). (E) Większość barwienia występuje w móżdżku, głównie w neuronach Purkinjego (strzałki). (F) W korze mózgowej dotknięte transdukcją są neurony (strzałki) oraz astrocyty (groty strzałek). Paski skali: (A-C) 325 µm; (D) 5 mm oraz (E,F) 200 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66463/66463fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Mikroskopowe obrazy histologiczne mózgu, przedstawiające przekroje wieńcowe do badań neuroanatomicznych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66463/66463fig03v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Powtarzalność transdukcji w móżdżku. Powtarzalność transdukcji w móżdżkach 15 szczurów, w których iniekcje przeprowadził ten sam chirurg, stosując tę samą dawkę i partię wirusa. Pasek skali: 1 mm. Numery na obrazach wskazują numery identyfikacyjne szczurów („miot lymphocyte” . „osobnik”). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66463/66463fig03largev2.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Barwienie kory GFP, 4 tygodnie po iniekcji, mikrografie, wynik eksperymentu, badanie tkanki nerwowej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66463/66463fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Powtarzalność transdukcji w korze. Powtarzalność transdukcji w korze 15 szczurów, u których iniekcje zostały wykonane przez tego samego chirurga przy użyciu tej samej dawki i partii wirusa. Pasek skali: 500 µm. Numery na obrazach oznaczają numery identyfikacyjne szczurów ('miot'.'osobnik'). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66463/66463fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Proces barwienia GFP, obrazy odcinka szyjnego kręgosłupa, 4 tygodnie po wstrzyknięciu dokanałowym, wyniki naukowe." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66463/66463fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Powtarzalność transdukcji w rdzeniu kręgowym odcinka szyjnego. Powtarzalność transdukcji w rdzeniu kręgowym odcinka szyjnego u 7 szczurów, którym ten sam chirurg wstrzyknął tę samą dawkę i partię wirusa. Pasek skali: 500 µm. Numery na obrazach oznaczają numery identyfikacyjne szczurów („miotz'.'osobnik”). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66463/66463fig05large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Opisano procedurę chirurgiczną polegającą na wykonaniu zastrzyków do spłuczki lędźwiowej młodego szczura. Podejście to zostało wykorzystane do dokanałowego dostarczania wektorów terapii genowej, ale przewiduje się, że podejście to może być stosowane w różnych terapiach, w tym komórkach i lekach.

Podanie wektorowe dokanałowo u młodych szczurów przez wstrzyknięcie do spłuczki lędźwiowej

Gene therapy is a powerful technology to deliver new genes to a patient for the treatment of disease, be it to introduce a functional gene, inactivate a ...

Nasze badania koncentrują się na rozwoju terapii genowych w chorobach ośrodkowego układu nerwowego. Od grudnia 2023 r. FDA zatwierdziła terapie genowe oparte na AAV dla kilku zaburzeń genetycznych, w tym rdzeniowego zaniku mięśni, wrodzonej ślepoty Lebera, dystrofii mięśniowej Duchenne'a oraz hemofilii A i B. Obecnie w badaniach przedklinicznych i klinicznych badanych jest wiele innych metod leczenia. Opracowanie bezpiecznych i skutecznych interwencji w chorobach genetycznych wymaga wykorzystania szeregu podejść, od dokładnych badań historii naturalnej na pacjentach po prace przedkliniczne w hodowlach tkankowych i modelach zwierzęcych, a terapia genowa jest tak naprawdę tylko jedną z kilku technologii stosowanych w tym celu.W wielu eksperymentach z terapią genową wykorzystuje się noworodki lub dorosłe zwierzęta. Niewielu ocenia leczenie u osób młodocianych, mimo że stanowią one znaczną populację pacjentów z zaburzeniami genetycznymi. Tak więc w przypadku starszych dzieci wielkość ciała i układ odpornościowy stanowią istotną barierę w dożylnym podawaniu terapii genowych.Podawanie dokanałowe może przezwyciężyć ten problem, ale potrzebujemy odpowiednich modeli, aby przetestować tę hipotezę. Ta opracowana przez nas procedura pozwoli nam ocenić skuteczność tego podejścia u młodych szczurów. Aby rozpocząć, weź probówkę zawierającą wektor AAV9.Za pomocą wirówki stołowej krótko odwiruj probówkę. Następnie delikatnie przesuń probówkę, aby upewnić się, że roztwór jest dobrze wymieszany. Następnie ustaw czystą klatkę na kocu elektrycznym i dostosuj temperaturę koca do około 37 stopni Celsjusza.Za pomocą kuchenki mikrofalowej lub łaźni wodnej podgrzej podkładkę izotermiczną w temperaturze 239 stopni Celsjusza. Następnie umieść tę podkładkę na platformie operacyjnej i przykryj ją czystą, chłonną podkładką stołową. Zacznij od umieszczenia znieczulonego zwierzęcia na platformie chirurgicznej.Nałóż smarującą maść do oczu na oczy każdego zwierzęcia, aby zapobiec wysuszeniu rogówki podczas operacji. Zdezynfekuj ogolone miejsce operacji trzema naprzemiennymi rundami jodu powidonu i izopropanolu. Następnie umieść rolkę ręcznika papierowego lub rurkę o średnicy 1,5 cm pod zwierzęciem tak rostralnie do bioder.Ułóż zwierzę zasłoną z okienkami, centrując okienko nad kręgosłupem lędźwiowym w celu uzyskania dostępu chirurgicznego. Aby zweryfikować głębokość znieczulenia u zwierzęcia, uszczypnij każdą łapę i obserwuj, czy nie ma żadnej reakcji na wycofanie. Następnie, używając ostrza skalpela numer 11, wykonaj nacięcie skóry o długości 3 cm wzdłuż linii środkowej od kręgów L2 do L6.Teraz włóż sterylną zakrzywioną parę nożyczek chirurgicznych między mięsień a skórę i delikatnie otwórz końcówki, aby oddzielić skórę od leżącego pod nią mięśnia. Usuń powięź pokrywającą wyrostki kolczyste kręgów od L2 do L5. Odpipetować od 25 do 35 mikrolitrów wektora AAV9 do nasadki sterylnej probówki do mikrowirówki.Pobrać całą objętość wektora z nasadki do strzykawki insulinowej. Następnie zidentyfikuj wyrostki kolczyste L5 i L4 na zwierzęciu. Umieścić igłę strzykawki po lewej stronie wyrostka kolczystego L5, wyrównując ją z ogonowym końcem wyrostka.Przesunąć igłę strzykawki do przodu o około 8 mm nad blaszką L5, a następnie pod blaszką L4 do spłuczki lędźwiowej, aż do zetknięcia się z kością. Powoli wciskać tłok strzykawki przez około pięć sekund. Następnie powoli wyjmować igłę z miejsca wkłucia.Używając szwu 4-0 lub zszywek chirurgicznych, zacznij zamykać nacięcie na jednym końcu rany. Aby ocenić powodzenie wstrzyknięcia barwnika, po eutanazji zwierzęcia należy wykonać 4-centymetrowe nacięcie w mięśniu równolegle do kręgosłupa po obu stronach wyrostków kolczystych. Użyj cienkich kleszczy lub nożyczek, aby delikatnie usunąć mięsień między wyrostkami kolczystymi.Za pomocą rongeur wyekstrahuj wyrostki kolczyste od L6 do dolnej części odcinka piersiowego kręgosłupa. Włóż dolną końcówkę rongeura pod blaszkę L5 i metodycznie usuń kość leżącą nad rdzeniem kręgowym, wykopując z niej kilka kęsów.

intrathecal-vector-delivery-juvenile-rats-via-lumbar-cistern

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Źródło: Smit, R. D., et al. Celowanie w przewód korowo-rdzeniowy u noworodków szczurów za pomocą podwójnego wektora wirusowego przy użyciu połączonej chirurgii mózgu i kręgosłupa. J. Vis. Exp. (2021)Ten film pokazuje ukierunkowane dostarczanie wektorów wirusowych do neuronów korowo-rdzeniowych u nowonarodzonego szczura. Protokół umożliwia precyzyjną ekspresję genów za pomocą następczych i wstecznych iniekcji wirusowych, ułatwiając badania nad regeneracją i plastycznością neuronów po urazie...

Ukierunkowane dostarczanie wirusa do neuronów korowo-rdzeniowych u nowonarodzonego szczura w celu zbadania urazu rdzenia kręgowego

Źródło: Chen, Y., et al. Dokanałowe dostarczanie oligonukleotydów antysensownych w ośrodkowym układzie nerwowym szczura. J. Vis. Exp. (2019 rok)Ten film demonstruje dostarczanie badanego związku do płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF) przez cewnik wszczepiony w odcinek lędźwiowy kręgosłupa modelu szczurzego. Związek krąży wzdłuż płynu mózgowo-rdzeniowego do mózgu i rdzenia kręgowego, wnika do neuronów i oferuje potencjał terapeutyczny.

Dokanałowe podawanie badanego związku do ośrodkowego układu nerwowego szczura

Źródło: Keefe, KM i wsp. Bezpośrednie wstrzyknięcie wektora lentiwirusowego uwypukla wiele ścieżek motorycznych w rdzeniu kręgowym szczura. J. Vis. Exp. (2019).Ten film pokazuje wstrzyknięcie wysoce wydajnego wektora wirusowego transportu wstecznego (HiRet) do rdzenia kręgowego szczura w celu śledzenia ścieżek neuronalnych. Wirus ma glikoproteiny do wnikania synaptycznego i gen kodujący białka fluorescencyjne. Igłę wprowadza się do rdzenia kręgowego, a zawiesinę wirusa podaje się w...

Wstrzyknięcie wektora wirusowego do rdzenia kręgowego szczura w celu wstecznego śledzenia neuronów

Źródło: Li, D., et al. Bezpośrednie wstrzyknięcie dooponowe rekombinowanych wirusów związanych z adenowirusami u dorosłych myszy. J. Vis. Exp. (2019 rok)Ten film przedstawia procedurę dokanałowego wstrzykiwania wirusów związanych z adenowirusem (AAV) do płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF) obudzonej myszy, obejmującą przygotowanie strzykawki, wyrównanie kręgosłupa i precyzyjne wprowadzenie igły. Metoda ta weryfikuje celowane dostarczanie genów, potwierdzając jej potencjał w terapiach OUN.

Dokanałowe podawanie wirusów w modelu mysim w leczeniu chorób ośrodkowego układu nerwowego

Ten raport opisuje prostą i szybką technikę dokanałowego nakłuwania igły w celu miejscowej transfekcji siRNA w odcinku lędźwiowym rdzenia kręgowego u myszy w krótkotrwałym znieczuleniu światłem.

In vivo (in vivo) Transfekcja SiRNA i knockdown genu w rdzeniu kręgowym poprzez szybkie nieinwazyjne wstrzyknięcia dooponowe w odcinek lędźwiowy u myszy

Tutaj prezentujemy technikę bezpośredniego wstrzykiwania dokanałowego przy użyciu 1% chlorowodorku lidokainy w roztworze wirusa, aby zapewnić efektywne dostarczanie wirusa związanego z adenowirusem małym zwierzętom i ustanowić system punktacji do przewidywania skuteczności transdukcji w ośrodkowym układzie nerwowym w zależności od stopnia przejściowego osłabienia wywołanego przez lidokainę.

Bezpośrednie wstrzyknięcie dooponowe rekombinowanych wirusów związanych z adenowirusami u dorosłych myszy

Ten protokół demonstruje wstrzyknięcie wstecznie transportowalnego wektora wirusowego do tkanki rdzenia kręgowego szczura. Wektor jest wychwytywany w synapsie i transportowany do ciała komórkowego docelowych neuronów. Model ten nadaje się do wstecznego śledzenia ważnych ścieżek rdzeniowych lub celowania w komórki do zastosowań w terapii genowej.

Bezpośrednie wstrzyknięcie wektora lentiwirusowego uwydatnia wiele ścieżek motorycznych w rdzeniu kręgowym szczura

Tutaj opisujemy metodę dostarczania leków do ośrodkowego układu nerwowego szczura poprzez wszczepienie cewnika w śródoponową przestrzeń lędźwiową kręgosłupa. Koncentrujemy się na dostarczaniu oligonukleotydów antysensownych, chociaż ta metoda nadaje się również do dostarczania innych metod terapeutycznych.

Dokanałowe dostarczanie oligonukleotydów antysensownych w ośrodkowym układzie nerwowym szczura

Ten protokół demonstruje nowatorską metodę stosowania terapii genowych do subpopulacji komórek u noworodków szczurów w wieku postnatalnym 5-10 dni poprzez wstrzyknięcie następczego modyfikatora chemogenetycznego do kory somatomotorycznej i wstecznie transportowanej rekombinazy Cre do rdzenia kręgowego szyjnego.

Celowanie w korowo-rdzeniowy przewód moczowy u noworodków szczurów za pomocą podwójnego wektora wirusowego przy użyciu połączonej chirurgii mózgu i kręgosłupa

Tutaj wprowadzamy zmodyfikowaną metodę cewnikowania dokanałowego u szczurów, która stanowi proste, wygodne i niezawodne podejście do powtarzalnego dokanałowego podawania leków.

Zmodyfikowana metoda cewnikowania dooponowego u szczurów

Wstrzyknięcie dooponowe lędźwiowe stanowi translacyjnie istotną drogę podania dla dostarczania terapii genowej do ośrodkowego układu nerwowego. Ten kompleksowy, ustandaryzowany protokół wstrzyknięć dooponowych w odcinek lędźwiowy u noworodków, młodych i dorosłych myszy i szczurów ma na celu pomóc naukowcom w przyjęciu tej techniki do przedklinicznych badań nad terapią genową.

Lędźwiowe wstrzyknięcie dooponowe wektorów terapii genowej do celowania w ośrodkowy układ nerwowy u myszy i szczurów

Poznaj metodę podawania wektorów terapii genowej do spłuczki lędźwiowej u młodych szczurów. Ten protokół chirurgiczny umożliwia ocenę skuteczności leczenia chorób układu nerwowego u młodszych pacjentów.

Podanie wektorowe dokanałowo u młodych szczurów przez wstrzyknięcie do spłuczki lędźwiowej

Przeglądaj więcej filmów