Izolacja jądrowa z kriokonserwowanych komórek krwi pochodzących z in vitro
15 marca 2024
Opisujemy protokół ekstrakcji wysokiej jakości jąder z indukowanych kriokonserwowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych pochodzących ze zrębu/śródbłonka i komórek krwi, aby wspierać analizy sekwencjonowania nowej generacji pojedynczego jądra. Wytwarzanie wysokiej jakości, nienaruszonych jąder jest niezbędne w eksperymentach multiomicznych, ale dla niektórych laboratoriów może stanowić barierę wejścia w tę dziedzinę.
Moje laboratorium bada geny i mechanizmy, które wpływają na tworzenie się krwinek. Produkujemy komórki krwi z indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych i chcemy to robić bardziej wydajnie, aby wspierać produkcję na skalę kliniczną terapii komórkowych dostosowanych do konkretnych pacjentów. Używamy modalności genomiki pojedynczej komórki, aby zidentyfikować wzorce ekspresji genów i innych czynników, które mogą pomóc w tworzeniu komórek krwi.
Jednym z głównych wyzwań związanych z produkcją komórek krwi in vitro jest to, że jest ona kosztowna i nieefektywna. Używamy podejść genetycznych, aby temu zaradzić. Chcemy wykorzystać wskazówki z genetyki człowieka i hematopoezy in vivo, aby pokierować ulepszeniami, które wprowadzamy do systemu in vitro.
Próbujemy wykorzystać genomikę funkcjonalną i analizy pojedynczego jądra, aby posunąć naprzód tę dziedzinę w zakresie identyfikacji genów i sieci sygnałowych, które napędzają tworzenie odpowiednich typów komórek krwi in vitro. Stworzenie wysokiej jakości zestawu danych multiomicznych pomogło nam odkryć czynniki transkrypcyjne, energię i regularną maszynerię, które napędzają różnicowanie komórek krwi in vitro. Wykorzystujemy te dane do zrozumienia danych genetycznych człowieka, takich jak loci GUS i inne pewne czynniki, które napędzają różnicowanie, których wcześniej nie byliśmy w stanie zaobserwować.
Jesteśmy bardzo podekscytowani, że możemy wykorzystać spostrzeżenia z tych multimodalnych zestawów danych, które udało nam się wygenerować w oparciu o izolację jąder wysokiej jakości. Zamierzamy skoncentrować nasze przyszłe badania na genach i mechanizmach rozwojowych, które mogą ostatecznie wytwarzać typy komórek krwi na skalę kliniczną in vitro. Na początek wyjmij kriowial z komórkami z ciekłego azotu i rozmrażaj go w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie minuty.
Po przeniesieniu rozmrożonych komórek do 15-mililitrowej probówki, stopniowo dodawaj 10 mililitrów wstępnie podgrzanej pożywki i odwiruj probówkę. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w jednym mililitrze uzupełnionego DPBS zawierającego FBS i chlorek wapnia. Następnie wymieszaj jeden mililitr zawiesiny komórkowej z 50 mikrolitrami każdego z koktajli do usuwania martwych komórek i koktajlu selekcji biotyny w pięciomililitrowej probówce z okrągłym dnem z polistyrenu i inkubuj.
Po wirowaniu dodaj 100 mikrolitrów kulek Dekstranu do zawiesiny komórek i delikatnie wymieszaj dwukrotnie pipetą. Następnie dodaj 1,3 mililitra uzupełnionego DPBS do mieszaniny i inkubuj z magnesem przez trzy minuty w temperaturze pokojowej. Odwróć magnes i rurkę, aby wlać zawiesinę żywych komórek do nowej 15-mililitrowej stożkowej rurki.
Zanurzyć komórki w wirówce. Po usunięciu większości supernatantu ponownie zawiesić komórki w jednym mililitrze DPBS zawierającym 0,04% albuminy surowicy bydlęcej. Na początek należy uzyskać wzbogaconą, żywą zawiesinę komórek pochodzącą z iPSC w stożkowej probówce i odwirować ją w temperaturze 460 g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Po odrzuceniu supernatantu dodać 100 mikrolitrów świeżo przygotowanego 0,5x zimnego buforu do lizy. Używając P100, pipetuj w górę i w dół 10 razy, aby wymieszać komórki, a następnie inkubuj probówkę na lodzie przez trzy minuty. Następnie do lizatu dodać 500 mikrolitrów schłodzonego buforu do płukania.
Odwirować probówkę i wyrzucić supernatant. Po powtórzeniu płukania ponownie zawiesić osad w 120 mikrolitrach schłodzonego, rozcieńczonego buforu jąder. Za pomocą sitka komórkowego o średnicy 40 mikrometrów przefiltruj zawiesinę komórek i dodaj 0,4% błękitu trypanowego do filtratu.
Na koniec oceń jakość izolowanych jąder pod mikroskopem. Korzystając z tej techniki, wyizolowano wysokiej jakości jądra z kriokonserwowanych ludzkich hematopoetycznych komórek progenitorowych pochodzących z iPSC.
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia protokół izolacji wysokiej jakości jąder komórkowych z krio konserwowanych typów komórek krwi oraz komórek nabłonkowych/śródbłonkowe pochodzących z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych. Proces ten jest niezbędny do przeprowadzenia analiz sekwencjonowania nowej generacji na poziomie pojedynczych jąder, które są kluczowe dla eksperymentów multiomicznych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia komórek macierzystych
- Genomika
- Terapia komórkowa
Wprowadzenie
- Indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSCs) mogą różnicować się w różne typy komórek.
- Wysokiej jakości jądra komórkowe są niezbędne do skutecznych analiz multiomicznych.
- Wyzwaniem pozostaje uzyskanie nienaruszonych jąder do sekwencjonowania.
- Udoskonalenie produkcji komórek krwi in vitro jest kluczowe dla zastosowań klinicznych.
Cel badania
- Zwiększenie wydajności produkcji komórek krwi z iPSC.
- Wsparcie rozwoju spersonalizowanych terapii komórkowych.
- Rozwiązanie problemów w eksperymentach multiomicznych związanych z ekstrakcją jąder komórkowych.
Zastosowane metody
- Ekstrakcja jąder z krio konserwowanych typów komórek.
- Analizy sekwencjonowania następnej generacji pojedynczych jąder.
- Podejścia genetyczne w celu poprawy procesu tworzenia komórek krwi.
- Wykorzystanie wiedzy z zakresu genetyki człowieka do kierowania ulepszeniami eksperymentalnymi.
Główne wyniki
- Skuteczna ekstrakcja wysokiej jakości jąder z różnych typów komórek.
- Identyfikacja wzorców ekspresji genów wspierających proces powstawania komórek krwi.
- Wykazanie zwiększonej wydajności w metodach produkcji komórek.
- Zastosowanie wiedzy uzyskanej z hematopoezy in vivo w systemach in vitro.
Wnioski
- Protokół ten zwiększa wykonalność analiz multiomicznych w badaniach nad komórkami macierzystymi.
- Udoskonalone metody mogą prowadzić do lepszych zastosowań klinicznych terapii komórkowych.
- Dalsze badania są niezbędne w celu dopracowania produkcji komórek krwi in vitro.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Wysokiej jakości izolacja jąder z kriokonserwowanych komórek krwi pochodzących z iPSC ma kluczowe znaczenie dla umożliwienia rzetelnej multiomiki pojedynczych jąder, co bezpośrednio wpływa na walidację celów oraz ograniczanie ryzyka mechanistycznego w odkrywaniu nowych terapii hematologicznych. Możliwość ta zwiększa pewność predykcyjną w badaniu genów i szlaków sygnałowych, ułatwiając dostosowany do poziomu ryzyka rozwój kandydatów na terapie komórkowe. Niezawodna ekstrakcja jąder z różnych typów komórek zapewnia ciągłość translacyjną oraz skalowalność portfolio w przypadku terapeutyków krwi nowej generacji.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania leków i walidacja celu
- Umożliwia funkcjonalne badania genomiczne w zakresie szlaków różnicowania hematopoetycznego.
- Wspiera identyfikację czynników transkrypcyjnych i regulatorowych w procesie powstawania komórek krwi.
- Ułatwia mechanistyczną redukcję ryzyka poprzez wyjaśnienie zależności między genem a funkcją in vitro.
- Zwiększa pewność predykcyjną przy wyborze potencjalnych celów w procesach rozwoju terapii komórkowych.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Zapewnia zwalidowane preparaty jąder komórkowych dla powtarzalnych analiz sekwencjonowania pojedynczych jąder.
- Standaryzuje jakość materiału wejściowego dla przepływów pracy multiomicznych w różnych typach komórek.
- Umożliwia ilościową ocenę ekspresji genów i dostępności chromatyny.
- Wspiera skalowalny screening zaburzeń genetycznych i farmakologicznych w modelach komórek krwi.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Koreluje wyniki in vitro z ludzkimi danymi genetycznymi w celu priorytetyzacji celów istotnych dla danej choroby.
- Zapewnia ciągłość procesu od genomiki odkrywczej po walidację przedkliniczną kandydatów do terapii komórkowej.
- Zmniejsza ryzyko translacyjne, umożliwiając wysokowierną profilację molekularną terapeutycznych populacji komórek.
- Wspiera odkrywanie biomarkerów służących do monitorowania różnicowania i aktywności produktów komórkowych.
Integracja rurociągu i przepływu pracy
Niniejszy protokół izolacji jąder komórkowych integruje etap wczesnych odkryć z badaniami przedklinicznymi, umożliwiając płynne przejście od genomiki opartej na hipotezach do walidacji translacyjnej w układach komórek krwi pochodzących z iPSC.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych dzięki wysokiej jakości danym multiomicznym.
- Przesiewanie: Zapewnia powtarzalne wejściowe jądra komórkowe dla skalowalnych analiz pojedynczych jąder.
- Analityka: Dostarcza ilościowych odczytów do porównywania ekspresji genów i stanów chromatyny w różnych warunkach.
- Badania translacyjne: Łączy mechanistyczne wglądy in vitro z oceną kandydatów w badaniach przedklinicznych.
- Zastosowania przedsiębiorstw: Możliwość adaptacji do różnych typów komórek kriozachowanych, co wspiera szerokie potrzeby portfolio B+R.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną i zmniejsza niejednoznaczność w walidacji celu.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje izolację jąder komórkowych dla powtarzalnych i skalowalnych przepływów pracy multiomicznych.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie świadomych decyzji go/no-go oraz efektywne kapitałowo rozwijanie programów terapii komórkowej.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz integrację danych między programami.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza z zakresu hodowli komórek macierzystych oraz technik izolacji jąder komórkowych.
- Wymagany jest dostęp do platform sekwencjonowania pojedynczych jąder oraz platform analitycznych multiomiki.
- Konieczna jest standaryzacja obsługi próbek i oceny jakości pomiędzy zespołami.
- Metoda jest dostosowywalna do różnych typów komórek krwi pierwotnych oraz pochodzących z iPSC po optymalizacji protokołu.
- Potencjalne ograniczenia obejmują specyficzne dla typu komórek wymagania dotyczące lizy oraz zmienność indukowaną kriokonserwacją.
