Name: Generowanie, utrzymanie i identyfikacja wolnych od zarazków modeli danio pręgowanego od larw do stadiów młodocianych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-04-12T13:50:00.000+00:00
Duration: 5 min 38 s
Description: Poznaj metodę generowania i utrzymywania wolnych od zarazków zarodków danio pręgowanego od larw do stadiów młodocianych. Model ten umożliwia badanie interakcji gospodarz-mikrobiota oraz ich wpływu na rozwój i odporność.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Serdecznie dziękujemy za wsparcie od Chongqing Medical University Talent Project (nr R4014 dla DSP i R4020 dla PPJ), National Natural Science Foundation of China (NSFC, No.32200386 dla PPJ), Chongqing Postdoctoral Innovation Mentor Studio (X7928 DSP), oraz Program China-Sri Lanka Joint Center for Water Technology Research and Demonstration przez Chińską Akademię Nauk (CAS)/China-Sri Lanka Joint Center for Education and Research by CAS.

Optimizing GF Zebrafish Models: Generation, Maintenance, and Microbial Studies

Protokół GF Artemia został przyznany jako patent przez Chińską Narodową Administrację Własności Intelektualnej, który złagodzi ograniczone stosowanie metody po uzyskaniu zgody autorów. Autorzy oświadczają, że nie mają żadnych innych konkurencyjnych lub finansowych interesów.

Krytyczne kroki w protokołach przygotowywania ryb i żywności GF Podczas tworzenia modeli ryb GF zaangażowano kilka krytycznych etapów, w tym przygotowanie sterylnych materiałów, sterylizację zarodków, codzienną odnawianie GZM, pobieranie różnych próbek i sterylne badanie każdej próbki przy użyciu wielu metod. Jednym z tych etapów jest wstępne leczenie zarodków, które ma fundamentalne i decydujące znaczenie dla powodzenia modeli GF. Czynniki kontrolne, ich stężenia i czasy leczenia mają kluczowe znaczenie dla osiągnięcia optymalnych wskaźników sterylizacji i powodzenia wylęgu. Podczas obchodzenia się z zarodkami ryb GF do larw należy zachować szczególną ostrożność, obejmując codzienną wymianę podłoża i upewnienie się, że materiały i platformy są dokładnie sterylizowane przy użyciu światła ultrafioletowego lub autoklawowania podczas wyjmowania płytek z inkubatora. Monitorowanie warunków temperaturowych i czasu pracy w okresie zimowym jest niezbędne, aby zapobiec śmierci larw spowodowanej niższymi temperaturami na czystych ławach.
Sterylne żółtko jaja i artemia GF powinny zostać wykryte przed podaniem rybom po 7 dpf, aby zapewnić ich sterylny stan dla długoterminowych modeli GF. W okresie karmienia oczyszczanie resztek jedzenia jest ważne jako część próbek pobieranych w celu wykrycia podczas odnawiania podłoża odpadowego. Pojemnik, objętość GZM i masa pokarmu powinny być dostosowane wraz z etapami wzrostu i rozwoju, aby zapobiec utracie ryb GF z powodu ograniczonego otoczenia i problemów z jakością wody. Regularne monitorowanie i dostosowywanie tych parametrów przyczynia się do pomyślnej konserwacji modeli ryb GF.
Modyfikacje i znaczenie tych protokołów Uproszczony, trzyetapowy proces generowania zarodków danio pręgowanego GF, obejmujący zoptymalizowane czynniki, stężenia i czasy ekspozycji roztworów AB-GZM, PVP-I i NaClO, zapewnia wysoki wskaźnik sterylności i zdrowy rozwój modeli. Ponadto udoskonalono sterylne metody wykrywania próbek dziennych, aby obejmowały płytki i kultury płynnych pożywek w warunkach tlenowych i beztlenowych, a także techniki molekularne wykorzystujące popularne startery bakteryjne. Dalsze doświadczenia w testowaniu zanieczyszczeń bakteryjnych i grzybiczych mają na celu optymalizację zanieczyszczeń izolatorowych i sterylnych testów podczas technik GF na zwierzętach48.
Specyficzny protokół dla nauplii GF Artemia jako żywego pokarmu dla modeli ryb został zbadany w naszym badaniu, a patent został przyznany PPJ i DSP przez Chińską Narodową Administrację Własności Intelektualnej (nr 1. ZL202210482684.8). Długoterminowe modele ryb GF są konsekwentnie ograniczane przez nieodpowiednie i nieodpowiednie odżywianie, co pogłębia słabości funkcji jelitowych związanych z trawieniem i wchłanianiem. Jako wiarygodne źródło pożywienia dla modeli medaka i danio pręgowanego na różnych etapach życia, GF Artemia sp. powinna być łatwa do przygotowania dzięki prostej procedurze, krótkiemu czasowi inkubacji i sterylnemu wykrywaniu w czasie rzeczywistym do codziennego użytku. W tej metodzie normalne torbiele artemii są płukane w stężeniu NaClO wystarczającym do aseptyki, a następnie inkubowane w butelce pokrytej folią, a także na płytce i w płynnym podłożu w celu wykrycia. Obsługuje to świeżo wykluwające się nauplia do karmienia ryb GF. Wskaźnik sterylności i wskaźnik wylęgu artemii, a także długość ciała, waga i aktywność są doskonałe, co wskazuje na dostępne zastosowania w praktyce.
Znaczenie tych modyfikacji w protokołach żywieniowych dla ryb i GF przynosi korzyści naukowcom w tworzeniu modeli na zarodkach, larwach, stadiach młodocianych, a nawet we wczesnych stadiach dorosłych i dorosłych w modach morskich i słodkowodnych. Długoterminowe zwierzęta GF będą udzielać pozwolenia jako modele in vivo w badaniach nad badaniami przesiewowymi leków i funkcjami mikrobiologicznymi podczas wzrostu i rozwoju gospodarza, zwłaszcza w okresie dojrzałości odporności i powiązanych linii komórek jelitowych. Na przykład larwy danio pręgowanego posiadają odporność wrodzoną tylko w pierwszym tygodniu, a następnie rozwijają system odporności adaptacyjnej w ciągu 7-21 dpf, wraz z dojrzałością grasicy31,49. Co więcej, modele ryb GF mogą zapewnić możliwość analizy interakcji bakteria-bakteria i mikrobiota-gospodarz z obserwacją na żywo dynamicznych procesów kolonizacji i migracji w organizmach50,51.
Ograniczenia metody Hodowla ryb GF od osobników młodocianych do wczesnych osobników dorosłych (28 dpf-2,5 mpf) i dojrzałych płciowo osobników dorosłych (>2,5 mpf) pozostaje wyzwaniem ze względu na zwiększoną śmiertelność i ryzyko skażenia bakteryjnego podczas konserwacji modelu. Ograniczenia te wynikają przede wszystkim z braku odpowiednich systemów autokultury dla ryb żyjących w środowisku GF. Systemy te powinny obejmować czyste powietrze, wodę i system żywnościowy, aby skutecznie utrzymać zwierzęta i ich środowisko, zapewniając całkowitą izolację od mikroorganizmów zewnętrznych. W przeciwieństwie do innych modeli zwierzęcych GF, takich jak myszy i kurczaki52, uzyskanie zebry GF poprzez operacje anatomiczne od rodziców CR jest trudne ze względu na ich nawyki wodne i naturalny styl nawożenia.
Traktowanie dorosłych zwierząt jako całkowicie pozbawionych mikrobioty jelitowej jest również wyzwaniem. Podczas gdy antybiotykoterapia może wywołać stan podobny do stanu wolnego od określonych patogenów (SPF), charakteryzujący się zmniejszoną mikrobiotą wykrywaną w próbkach kału, osiągnięcie prawdziwych modeli GF dorosłych ryb pozostaje trudne. Wyzwania związane z ustanowieniem i utrzymaniem modeli GF, zwłaszcza w okresie przechodzenia ze stanów młodocianych do długotrwałych, są znaczące. Uznaje się znaczenie potomstwa GF, takiego jak jaja GF F1 lub F2 od dorosłych ryb GF, w badaniach mikrobiologicznych. Jednak pokonanie wyzwań związanych z ustanowieniem i utrzymaniem długoterminowych modeli dorosłych ryb GF wymaga znacznego czasu.
Warto zauważyć, że opracowano gnotobiotycznego danio pręgowanego ze specyficzną kolonizacją bakteryjną, wykazującego przewlekłą przeżywalność w oparciu o modele GF. Niemniej jednak nie ma pewności, czy modele te mogą służyć jako realna alternatywa dla modeli GF w infekcjach bakteryjnych i badaniach biomedycznych.
Przyszłe zastosowania modeli ryb GF W tym badaniu udoskonaliliśmy protokół generowania modeli danio pręgowanego GF, przechodząc od zarodków do osobników młodocianych. Postęp ten ma znaczące zastosowania w biologii rozwoju, immunologii, badaniach nad chorobami człowieka i organogenezie. Poprzez masową izolację i identyfikację, badanie bada funkcje, mechanizmy i metabolity pochodzenia jelitowego pojedynczych szczepów bakteryjnych. Badanie polega na zakażeniu modeli zebrykowatego GF po otwarciu otworu wentylacyjnego47,53. Dodatkowo znakowane bakterie z fluorescencją ułatwiają obserwację kolonizacji i dystrybucji w żywych larwach GF, wolnych od innych wpływów mikrobiologicznych54. Podobne modele ryb GF, takie jak medaka morska lub słodkowodniczna, mogą być tworzone przy użyciu porównywalnych metod z różnymi środkami lub zmianami podłoża.
Aby zbadać mechanizmy chorób u ludzi, w badaniu wykorzystano metody FMT, przenosząc próbki od pacjentów lub dawców do zdrowych zwierząt lub modeli GF55. W przeciwieństwie do zwierząt hodowanych konwencjonalnie (CR), modele GF dostarczają solidnych dowodów na funkcje mikrobiologiczne, wpływ lub reakcje gospodarza, szczególnie w połączeniu z bakteriofagami w celu regulacji docelowych bakterii w mikrobiocie46.
Podsumowując, danio pręgowany GF służy jako potężne modele do oceny bezpieczeństwa bakteryjnego, skuteczności leków, toksyczności zanieczyszczeń lub interferencji związków, ze względu na ich wrażliwe i czyste środowisko jelitowe. Przyszłe badania nad zastosowaniami ryb GF powinny obejmować różne dziedziny, z potrzebą stworzenia modeli dorosłych ryb GF w celu głębszego zrozumienia funkcji mikrobiologicznych na różnych etapach życia.

Mikrobiota (tj. archeony, bakterie, eukarya i wirusy) odgrywa kluczową rolę w utrzymaniu zdrowia gospodarza i przyczynia się do rozwoju różnych chorób, wpływając na procesy fizjologiczne i patologiczne poprzez symbiotyczne interakcje w obrębie bariery jelitowej, powierzchni nabłonka i funkcji mucyny u osób1,2,3. Skład mikrobioty na różnych etapach życia, od niemowlęctwa po młodość, dorosłość i starzenie się, a także jej obecność w różnych miejscach, takich jak nozdrza, jama ustna, skóra i jelita, jest dynamicznie kształtowany przez różne siedliska i środowiska4. Mikrobiota jelitowa organizmów bierze udział we wchłanianiu składników odżywczych, odpowiedzi immunologicznej, inwazji patogenów, regulacji metabolicznej itp5,6. Badania na pacjentach wykazały, że zaburzenia mikrobioty jelitowej są związane z otyłością u ludzi, zaburzeniami snu, depresją, nieswoistymi zapaleniami jelit (IBD), chorobami neurodegeneracyjnymi (choroba Parkinsona, Alzheimera), starzeniem się i różnymi nowotworami7,8,9. Co więcej, interaktywne szlaki między mikrobiotą jelitową a gospodarzami obejmują czynniki zapalne, neuroprzekaźniki, metabolity, barierę jelitową i stres oksydacyjny, jak zaobserwowano w poprzednich badaniach z wykorzystaniem modeli myszy i ryb10,11.
Ostatnio, wiele podejść lub terapii związanych z bakteriami, w tym potencjalne probiotyki i przeszczep mikrobioty kałowej (FMT), zostało zbadanych pod kątem tych zaburzeń w modelach klinicznych i zwierzęcych. Badania te opierają się na odkryciach związanych z osią mikrobiota-jelito-mózg/wątroba/nerki, produktami pochodzącymi z mikrobioty i zmienioną aktywnością receptorów12,13. Jednak rozwój, różne funkcje i mechanizmy systemu mikrobiota-gospodarz są nadal nie w pełni poznane i zidentyfikowane ze względu na złożoność społeczności mikrobiologicznej i wyzwanie związane z generowaniem potężnych modeli chorób podobnych do ludzkich.
Aby rozwiązać te problemy, w połowieXIX wieku pilnie zaproponowano modele zwierzęce wolne od zarazków (GF), które zostały opracowane głównie wXX wieku. Kolejne udoskonalenia, w tym modele poddane działaniu antybiotyków i gnotobiotyków, wraz z postępem w technologiach wykrywania i obserwacji drobnoustrojów, jeszcze bardziej udoskonaliły te modele14,15,16. Zwierzęta GF, stworzone przez wymazanie własnego tła i unikanie mikroorganizmów środowiskowych, oferują doskonałą strategię badania interakcji między mikroorganizmami a ich gospodarzami17. Dzięki zastosowaniu modeli zwierzęcych i udoskonalonych protokołów naukowcom udało się odtworzyć podobny skład mikrobiologiczny występujący u pacjentów myszy i ryb z GF. Ponadto inne modele zwierzęce GF, takie jak psy, kurczaki i świnie, zapewniają różnorodne opcje jako obiekty badań18,19,20,21. Podejście to umożliwiło badania nad potencjalnym wpływem terapeutycznym mikrobiomów komensalnych na różne choroby, w tym immunoterapię nowotworów u ludzi16,18. Modele GF oferują dokładniejszy wgląd w charakterystykę i mechanizmy kolonizacji, migracji, namnażania i interakcji określonych bakterii w obrębie gospodarzy. Dostarcza to nowych, kluczowych informacji na temat występowania i rozwoju chorób związanych z mikrobiotą22,23. Historia tworzenia i stosowania danio pręgowanego GF w badaniach mikrobiologicznych ewoluowała od raportów Rawlsa i in. w 2004 r. oraz Batesa i in. w 2006 r. do protokołu Melancon i in. z 2017 r16,24,25. Jednak wykonalność modeli GF dla dorosłych lub hodowlanych jest nadal długotrwałym procesem, któremu towarzyszy zmienna długowieczność, wskaźniki sukcesu i wyzwania zdrowotne.
Wśród różnych modeli zwierzęcych, danio pręgowany (Danio rerio) wyróżnia się jako kluczowe narzędzie zarówno dla badań podstawowych, jak i biomedycznych ze względu na korzystne podobieństwo do ludzkich organów i genomiki, krótki cykl rozwojowy, wysoką płodność i przezroczyste zarodki19,26. Danio pręgowany, służąc jako wiarygodne modele chorób człowieka, oferują wizualną reprezentację procesów fizjologicznych i patologicznych in vivo, dostarczając wglądu w atrakcyjne cechy interakcji gospodarz-mikroorganizm. Warto zauważyć, że danio pręgowany wykazuje odrębne linie komórkowe, co pozwala na obrazowanie fizjologii jelit, dynamiki drobnoustrojów, gonad i rozwoju reprodukcyjnego, dojrzewania układu odpornościowego gospodarza, zachowania i metabolizmu27. Zarodki danio pręgowanego rozwijają się w ochronnych pasmówkach aż do wyklucia, przekształcając się w larwy po 3 dniach od zapłodnienia (dpf). Aktywnie polują na pokarm w ilości 5 dpf i osiągają dojrzałość płciową około 3 miesiące po zapłodnieniu (mpf)28. Pierwszy udany wolny od zarazków (GF) grygowany, opisany przez Rawls et al.24, wykazał, że larwy karmione autoklawizowaną paszą po wchłonięciu żółtka wykazywały nekrozę tkanek od 8 dpf i całkowitą śmierć po 20 dpf. Wskazywało to na wpływ diety lub znaczenie uwzględnienia egzogennego zaopatrzenia w składniki odżywcze w eksperymentach z udziałem długoterminowego (>7 dpf) GF fish29. Kolejne badania udoskonaliły protokół generowania ryb GF, wykorzystując sterylny pokarm i metody udoskonalone w różnych modelach ryb16.
Jednak większość badań nad modelami zebry GF skupiała się na wczesnych etapach życia, obejmujących infekcję bakteryjną przy 5 dpf przez 24 godziny do 48 godzin, z próbkami pobranymi przed 7 dpf na zakończenie eksperymentów25,30,31. Powszechnie wiadomo, że mikrobiota organizmów, w tym ludzi i danio pręgowanego, jest kolonizowana na początku życia i kształtowana podczas wzrostu i rozwoju. Skład pozostaje stabilny w dojrzałych stadiach, a rola mikrobioty w organizmie gospodarza jest kluczowa przez całe życie, zwłaszcza w aspektach związanych ze starzeniem się, neurodegeneracją, otyłością metaboliczną i chorobami jelit3. W związku z tym perspektywy zwierząt GF o dłuższej przeżywalności mogą dostarczyć informacji na temat mechanizmów ról drobnoustrojów w rozwoju i funkcjach narządów gospodarza, biorąc pod uwagę niedojrzały układ odpornościowy i rozrodczy larw ryb we wczesnym okresie życia. Podczas gdy szczepy bakteryjne w jelitach danio pręgowanego zostały wyizolowane i zidentyfikowane w poprzednich badaniach, oferując możliwość infekowania modeli zwierzęcych GF w celu wyboru probiotyków lub badania funkcji bakteryjnych w host19,25, tworzenie i stosowanie modeli ryb GF było przede wszystkim ograniczone do wczesnych etapów życia. To ograniczenie, przypisywane złożonemu procesowi produkcji, wysokim kosztom utrzymania i związanym z tym problemom z żywnością i odpornością, utrudnia wysiłki badawcze mające na celu zbadanie rozwojowych i przewlekłych skutków mikrobioty u gospodarza.
Na przeżywalność, zachowanie, wzrost, dojrzewanie i ogólny stan zdrowia ryb, szczególnie w modelach wolnych od zarazków (GF), znaczący wpływ mają praktyki żywieniowe, obejmujące przyjmowanie i wchłanianie składników odżywczych w okresie otwartym od wczesnych larw do osobników młodocianych32,33. Jednak jednym z wyzwań w hodowli ryb GF jest niedobór odpowiedniej, sterylnej diety, co ogranicza skuteczność wsparcia żywieniowego dla podtrzymania wzrostu i przetrwania larw. Rozwiązanie tego problemu ma kluczowe znaczenie dla przywrócenia życia ryb GF, biorąc pod uwagę ich rozwojowe mechanizmy obronne i słabe zdolności trawienne z powodu braku mikrobiomu jelitowego. Jeśli chodzi o pokarm, żywe krewetki solankowe (Artemia sp.) jawią się jako najbardziej odpowiednia dieta dla larw z otwartymi ustami dla młodych ryb. Zaobserwowano, że ryby karmione żywymi krewetkami solankowymi wykazują wyższe wskaźniki wzrostu i przeżywalności w porównaniu z rybami karmionymi gotowanym żółtkiem jaja lub innymi naturalnymi i syntetycznymi przynętami34. Podczas gdy modele wczesnego życia ryb GF mogą przetrwać dzięki wsparciu żółtka, a modele larw GF mogą być utrzymywane dzięki sterylnemu karmieniu, tworzenie długoterminowych modeli od larw do osobników młodocianych i osiągnięcie dojrzałości płciowej pozostaje wyzwaniem. Ponadto żywność w płatkach lub w proszku jest ograniczona przez nierówny skład odżywczy i może wpływać na jakość wody. W przeciwieństwie do tego, żywa artemia ma takie zalety, jak przetrwanie zarówno w słonej, jak i słodkiej wodzie, mały rozmiar odpowiedni dla larw i dorosłych, łatwość grupowania i wyższa jakość wylęgu35. Opierając się na poprzednich metodach16,24,30, uprościliśmy złożony proces leczenia i rozwiązaliśmy problem diety, ustanawiając łatwą do inkubacji żywą odmianę GF Artemia sp. jako sterylny pokarm przez dłuższy czas niż ryby GF we wczesnym okresie życia.
To badanie przedstawia zoptymalizowany protokół obejmujący (1) generację, (2) utrzymanie, (3) identyfikację wskaźnika sterylności, oraz (4) utrzymanie i karmienie, aby zapewnić wzrost wolnego od zarazków (GF) danio pręgowanego od zarodków do larw i stadiów młodocianych. Wyniki dostarczają wstępnych dowodów na wylęg, przeżywalność, wzrost i bezpłodność danio pręgowanego GF, wraz z podstawowymi wskaźnikami dla GF Artemia sp. jako sterylnego pokarmu. Szczegółowe etapy generowania modeli i przygotowywania sterylnej żywej żywności zapewniają kluczowe wsparcie techniczne w konstruowaniu i stosowaniu długoterminowych modeli ryb GF, a także GF Artemia sp. w badaniach interakcji mikrobiota-gospodarz. Protokół dotyczy izolacji, identyfikacji i infekcji bakterii na modelach ryb GF, przedstawiając metody znakowania fluorescencji bakterii i obserwując ich kolonizację w jelitach ryb pod mikroskopem. Ryby GF, ryby gnotobiotyczne z infekcją bakteryjną lub przeniesione modele mikrobioty ludzkiej będą poddawane różnym detekcjom w celu wyjaśnienia ich funkcji i wpływu na odporność gospodarza, trawienie, zachowanie, regulację transkryptomiczną i aspekty metaboliczne. W dłuższej perspektywie protokół ten może zostać rozszerzony na różne gatunki ryb typu dzikiego, takie jak medaka morska, a potencjalnie na inne wybrane transgeniczne linie danio pręgowanego skorelowane z określonymi tkankami lub chorobami.

<table><tbody><tr><td>AB-GZM</td><td>Amfoterycyna:Solarbio; &nbsp; kanamycyna:Solarbio; Ampicylina: Solarbio.</td><td>Amfoterycyna: CAS: 1397-89-3; kanamycyna:CAS: 25380-94-0; Ampicylina: CAS: 69-52-313.</td><td>49,6 ml GZM, 50 &mikro; L roztwór podstawowy amfoterycyny (250 &mikro; g/ml), 25 i mikro; L roztwór podstawowy kanamycyny (10 mg/ml) i 250 &mikro; L roztwór podstawowy ampicyliny (20 mg/ml).</td></tr><tr><td>Probówki EP 1,5 mL, 15 mL, 50 ml</td><td>biosharp</td><td>BS-15-M</td><td>Do pobierania próbek i przechowywania środków</td></tr><tr><td>2,4 g/L NaClO</td><td>XILONG SCIENTIFIC Co., Ltd.</td><td>CAS: 7681-52-9</td><td>Rozcieńczony 8% wodnym roztworem podchlorynu sodu.</td></tr><tr><td>Płytki 6-dołkowe, 24-, 48-dołkowe</td><td>LABSELECT&nbsp;</td><td>11112</td><td>Do hodowli ryb</td></tr><tr><td>Aeronomas</td><td>NCBI baza danych</td><td>nr MK178499</td><td>2019-JPP-ESN</td></tr><tr><td>Beztlenowe płytki TSA</td><td>trypton: Oxoid ; pepton sojowy:Solarbio ; NaCl: Biosharp; agar w proszku: BioFroxx.</td><td>trypton:LP0042B; pepton sojowy:Cat#S9500; NaCl:BS112; proszek agarowy: 9002-18-0.</td><td>Płytki TSA przygotowano z 400 ml pożywki zawierającej 6 g tryptonu, 2 g peptonu sojowego, 2 g NaCl i 6 g proszku agarowego w systemie beztlenowym.</td></tr><tr><td>Beztlenowa stacja robocza</td><td>GENE SCIENCE</td><td>E200G</td><td>Izolacja bakteryjna, testy sterylne</td></tr><tr><td>Analiza</td><td>GraphPad Prism 5</td><td>v6.07</td><td>Do analizy danych</td></tr><tr><td>Zestawy API 20 E</td><td>&nbsp; BioMérieux SA, Francja</td><td>No.1005915090</td><td>Ref 20100 Zestawy do wykrywania metabolizmu bakterii</td></tr><tr><td>Artemia (krewetki solankowe)</td><td>Shangjia Aquarium Co., Ltd.</td><td>Cysty</td><td>artemii marki Aquamaster i jaja krewetek solankowych&nbsp;</td></tr><tr><td>System automatycznego cyklu do hodowli ryb</td><td>Ningbo Hairui Technology Co., Ltd</td><td>No Cat</td><td>Utrzymuj rybę</td></tr><tr><td>Autoklaw</td><td>Gorliwość Sposób</td><td>G154DWS</td><td>Przygotuj materiały</td></tr><tr><td>BHI Aerobic</td><td>Coolaber</td><td>Cat#PM0640</td><td>BHI przygotowano podłoże, w którym 100 ml podłoża zawierało 3,7 g proszku BHI.</td></tr><tr><td>BHI Anaebic</td><td>Coolaber Cat</td><td>#PM0640</td><td>Przygotowano pożywkę BHI i podzielono ją na rurki beztlenowe w systemie beztlenowym.</td></tr><tr><td>Inkubator biochemiczny</td><td>LongYue Co., Ltd</td><td>SPX</td><td>Dla ryb i talerzy Szafa</td></tr><tr><td>bezpieczeństwa biologicznego</td><td>Haier</td><td>HR40-IIA2</td><td>Sterylne leczenie i testowanie</td></tr><tr><td>Środek wybielający 0,02 g/L NaClO</td><td>XILONG SCIENTIFIC Co., Ltd.</td><td>CAS: 7681-52-9</td><td>Roztwór roboczy o stężeniu podchlorynu sodu (NaClO): Rozcieńczony 8% wodnym roztworem podchlorynu sodu lub 166,6 μl 6% podchlorynem sodu w 500 ml wody destylowanej.</td></tr><tr><td>Płytki krwi,</td><td>krew owcza: Solarbio</td><td>Nr kat. TX0030</td><td>Sterylnie defibrynowana krew owcza została dodana do TSA w celu przygotowania 5% płytek krwi.</td></tr><tr><td>Kolba do hodowli komórkowych</td><td>Corning</td><td>430639</td><td>Do hodowli ryb</td></tr><tr><td>CM-Dil barwniki</td><td>Sondy molekularne</td><td>Cat#C7000&nbsp; &nbsp;</td><td>Aby oznaczyć bakterie</td></tr><tr><td>Inkubator z wytrząsaniem w stałej temperaturze</td><td>Peiving Co., Ltd</td><td>HZQ-X100</td><td>Baza danych kultur bakteryjnych</td></tr><tr><td></td><td>NCBI</td><td>Baza danych bakterii i archeonów</td><td>Link: Archaea FTP: ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/TargetedLoci/Archaea/ Bakterie FTP: ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/TargetedLoci/Bacteria/</td></tr> <tr><td>Jednorazowa pipeta Pasteura</td><td>Biosharp</td><td>BS-XH-03L</td><td>Służy do wymiany wody i przenoszenia jaj</td></tr><tr><td>Jednorazowa szalka Petriego</td><td>Biosharp</td><td>BS-90-D</td><td>Do hodowli zestawów</td></tr><tr><td>DNA</td> ryb <td>Solaribio</td><td>Cat#D1600</td><td>Zestawy do ekstrakcji genomowego DNA bakteryjnego&nbsp;</td></tr><tr><td>Pipeta elektryczna</td><td>SCILOGEX</td><td>Levo me</td><td>Zmień wodę</td></tr><tr><td>Exiguobacterium</td><td>NCBI baza danych</td><td>nr MK178504</td><td>2019-JPP-ESN</td></tr><tr><td>GZM</td><td>Sól morska: LANDEBAO Co., Ltd.</td><td>Nie kot</td><td>Składa się z 1 l wody i 1,5 ml roztworu soli morskiej (40 g/l), w autoklawie. Zawartość soli morskiej w roztworze GZM wynosiła 60 mg/L.</td></tr><tr><td>Laboratoryjny system czystej wody</td><td>Hitech Co., Ltd</td><td>Prima-S15</td><td>Przygotuj środki</td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Nikon</td><td>SMZ18</td><td>Ze światłem fluorescencyjnym do obserwacji larw ryb</td></tr><tr><td>Zestawy PCR</td><td>TIANGEN</td><td>Cat#ET101</td><td>Taq Zestaw polimerazy DNA</td></tr><tr><td>Pipeta</td><td>LABSELECT&nbsp;</td><td>sp-013-10</td><td>Zmień wodę</td></tr><tr><td>Jod powidonu (PVP-I)</td><td>Aladdin</td><td>Lot#H1217005</td><td>Roztwór wodny jodu powidonu 0,4 g / L czysta woda.</td></tr><tr><td>Przetwornica rozrządu</td><td>PinYi Co., Ltd</td><td>AL-06</td><td>Do regulacji światła</td></tr><tr><td>TSA płytki</td><td>trypton: Oxoid ; pepton sojowy:Solarbio ; NaCl: Biosharp; agar w proszku: BioFroxx.</td><td>trypton:LP0042B; pepton sojowy:Cat#S9500; NaCl:BS112; proszek agarowy: 9002-18-0.</td><td>Płytki TSA przygotowano z 400 ml pożywki zawierającej 6 g tryptonu, 2 g peptonu sojowego, 2 g NaCl, 6 g proszku agarowego.</td></tr><tr><td>TSB Trypton tlenowy</td><td>:Oxoid ; pepton sojowy:Solarbio ; NaCl: Biosharp;</td><td>trypton:LP0042B; pepton sojowy:Cat#S9500; NaCl:BS112;</td><td>Przygotowano pożywkę TSB, w której 400 ml pożywki zawierało 6 g tryptonu, 2 g peptonu sojowego i 2 g NaCl.</td></tr><tr><td>TSB Trypton beztlenowy</td><td>: Oxoid ; pepton sojowy:Solarbio ; NaCl: Biosharp;</td><td>trypton:LP0042B; pepton sojowy:Cat#S9500; NaCl:BS112;</td><td>Pożywkę TSB przygotowano i podzielono na rurki beztlenowe w systemie beztlenowym.</td></tr><tr><td>Ultra-czysty stół warsztatowy</td><td>Airtech</td><td>SW-CJ-2FD</td><td>Sterylne leczenie i testowanie</td></tr><tr><td>Ultra-czysty system przepływu do hodowli ryb</td><td>Morski sprzęt biologiczny firma</td><td>Nie kot</td><td>Produkuj wodę dla ryb</td></tr><tr><td>VibrioNCBI</td> <td>baza danych</td><td>nr MK178501</td><td>2019-JPP-ESN</td></tr></tbody></table>

generowanie, utrzymanie i identyfikacja wolnych od zarazków modeli danio pręgowanego od larw do stadiów młodocianych

Generation, Maintenance, and Identification of Germ-Free Zebrafish Models from Larvae to Juvenile Stages

Danio pręgowany służy jako cenne modele do badań nad wzrostem, odpornością i mikrobiotą jelitową ze względu na ich genomiczne podobieństwa do ssaków, przezroczyste zarodki rozwijające się w stosunkowo czystym środowisku kosmówkowym i niezwykle szybki rozwój larw w porównaniu do modeli gryzoni. Danio pręgowany (Danio rerio) wolny od zarazków (GF) ma kluczowe znaczenie dla oceny toksyczności zanieczyszczeń i tworzenia modeli chorób podobnych do ludzkich związanych z funkcjami mikrobiologicznymi. W porównaniu z modelami hodowanymi konwencjonalnie (CR) (ryby we wspólnej hodowli), danio pręgowany GF pozwala na dokładniejszą manipulację mikrobiotą gospodarza, pomagając w określeniu związku przyczynowego między mikroorganizmami a gospodarzami. W związku z tym odgrywają one kluczową rolę w pogłębianiu naszego zrozumienia tych relacji. Jednak modele zebry z GF są zwykle generowane i badane we wczesnych stadiach życia (od zarodków do larw) ze względu na ograniczenia w funkcjonowaniu układu odpornościowego i wchłanianiu składników odżywczych. Badanie to optymalizuje tworzenie, utrzymanie i identyfikację wczesnych modeli danio pręgowanego GF bez karmienia i z długotrwałym karmieniem przy użyciu pokarmu GF (takiego jak Artemia sp., krewetki solankowe). W trakcie całego procesu codziennie pobierano próbki i przeprowadzano hodowlę, a następnie identyfikowano je za pomocą wielu detekcji, w tym płytek i sekwencjonowania 16S rRNA. Zarejestrowano wskaźnik aseptyki, przeżywalność i wskaźniki rozwoju zebry GF, aby zapewnić jakość i ilość wygenerowanych modeli. Co ważne, badanie to dostarcza szczegółowych informacji na temat technik izolacji bakterii i infekcji u ryb z GF, umożliwiając efektywne tworzenie modeli ryb GF od larw do stadiów młodocianych przy wsparciu pokarmowym GF. Stosując te procedury w badaniach biomedycznych, naukowcy mogą lepiej zrozumieć związki między funkcjami bakterii jelitowych a zdrowiem gospodarza.

Modele GF u danio pręgowanego można efektywnie wytworzyć, wykorzystując liczne jaja znieśione przez pary ryb, przy zastosowaniu protokołu zoptymalizowanego na podstawie wcześniejszych modeli ryb GF35. Pojedyncza płytka 6-dołkowa pozwala na hodowlę około 30-48 embrionów/larw, co umożliwia gromadzenie wystarczającej ilości danych i przeprowadzenie analizy statystycznej. Po sterylizacji embriony GF są hodowane w czystym inkubatorze aż do wyklucia się larw w czasie 48-72 h; GZM jest wymieniane codziennie wraz z analizą zebranych próbek, co jest kluczowe dla utrzymania stanu wolnego od drobnoustrojów (Rysunek 1). Po 7 dpf dla larw przechodzących w stadium młodociane należy przygotować pokarm w postaci żółtka jaj oraz żywych Artemia. Podczas wzrostu i rozwoju ryb objętość, pojemnik oraz gęstość GZM powinny być regulowane lub zmieniane w odpowiednim czasie, aby uniknąć śmiertelności i utraty sterylności. Jeśli badania nie wykazują zanieczyszczenia bakteryjnego, udane modele GF mogą być utrzymywane w sposób chroniczny od stadium młodocianego do wczesnej dorosłości, choć w praktyce przeżywalność jest znacznie niższa. Na koniec, w celu zbadania wpływu mikrobioty i w ramach przesiewu leków, można zmierzyć stopień sterylności, przeżywalność, indeks rozwoju, behawior, analizę histopatologiczną oraz profil transkrypcyjny modeli ryb GF i CR. W niniejszym badaniu porównano kluczowe indeksy rozwojowe (Rysunek uzupełniający 1); stopień wyklucia ryb GF był o 45,7% niższy niż u ryb CR, wynosząc 60% w 72 hpf. Częstość akcji serca larw GF w 7 dpf była znacząco niższa i wynosiła 18,2 uderzeń/10 s w porównaniu do ryb CR z wynikiem 22,6 uderzeń/10 s, jednak w 14 dpf nie odnotowano różnic między obiema grupami, przy wartościach 23,5-23,8 uderzeń/10 s. Przeżywalność ryb GF w 7 dpf była taka sama jak u ryb CR i wynosiła 86,7%, lecz spadła do 60% w 14 dpf w porównaniu do 80% u ryb CR. Niemniej jednak przeżywalność obu grup ryb, GF i CR, spadła do 25%-10% po okresie otwarcia pyska, gdy nabyły one zdolności lub nawyków żerowania. Niepowodzenie w utrzymaniu sterylności ryb było jedną z przyczyn niższej przeżywalności. Z tego względu karmienie i utrzymanie wartości odżywczych od stadium młodocianego do wczesnej dorosłości stanowią krytyczne wyzwania w hodowli ryb.
Kolejnym kluczowym czynnikiem wpływającym na wzrost i rozwój ryb jest żywienie. W niniejszej pracy badamy wiele metod pozyskiwania GF Artemia jako żywy pokarm dla długoterminowych larw, osobników młodocianych i dorosłych rybek danio pręgopłetwych (zebrafish) wolnych od drobnoustrojów jelitowych (GF) (proces przedstawiony w Rysunek 2). Ze względu na codzienne podawanie pokarmu rybom GF, zoptymalizowany protokół dla GF Artemia powinno być w praktyce łatwe, czasochłonne i ekonomiczne. Po porównaniu aktywnego ruchu oraz śmierci/unieruchomienia nauplii obserwowane pod mikroskopem, charakterystyka nauplii, niewyklutych jaj i skorup, metoda została dopracowana. Po codziennej inkubacji wskaźniki świeżych GF Artemia uzyskane z butelek, w tym wskaźnik wyklucia, przeżywalności i deformacji, a także długość i masa naupliiobserwowano i mierzono pod mikroskopem (Rycina 3). Po zastosowaniu preparatu stopień wyklucia Artemia odsetek cyst była wysoka i wynosiła średnio 88,15%, przeżywalność form pływających nauplii wyniosła 77,83%, a odsetek malformacji wyniósł 1,87%. Długość ciała nauplii było 546.70 µma wskaźnik masy ciała wynosił 3,80 mg/100, co jest odpowiednie dla odłowu i karmienia ryb od okresu otwarcia pęcherzyka żółtkowego larw do stadiów młodzieńczych i dorosłych.
Wykrywanie ryb GF oraz Artemia GF jest również istotne dla utrzymania modelu. W zależności od pobranych próbek i zastosowanych wielu metod testowych, wyniki mogą potwierdzić sukces w uzyskaniu zarodków zebrafish i cyst Artemia w stanie GF na płytkach hodowlanych oraz w medium płynnym (Rycyna 4). Różne próbki pobierane codziennie powinny wykazywać sterylność we wszystkich metodach testowych, co wskazuje na utrzymanie modeli GF w momencie pobrania. Obecność Artemia GF powinna zostać potwierdzona przed podaniem ich rybom GF, lub wyniki z płytek i inkubatora z medium powinny wskazywać na sterylność świeżych żywych nauplii. W tym celu hoduje się Artemia GF z cyst na płytkach TSA lub w szklanych naczyniach z medium płynnym TSB lub BHI w inkubatorze z wytrząsaniem, co pozwala na jednoczesne generowanie Artemia GF i weryfikację sterylności. Protokół dla Artemia GF pozwala na wykarmienie ograniczonej liczby larw. Podczas procesu karmienia zaobserwowano, że Artemia GF pływały wewnątrz GZM, a następnie były wyłapywane i zjadane przez larwy ryb GF.
Zastosowania modeli ryb GF obejmują różne dziedziny biologii i medycyny, umożliwiając między innymi badanie funkcji mikrobiologicznych, wzrostu i rozwoju, mechanizmów chorobowych oraz przesiewy probiotyków lub leków46. W niniejszym badaniu, na przykład, z danio-ostrobramka wyizolowano dwie główne bakterie jelitowe, Aeromonas sp. i Vibrio sp. Przeprowadzono analizę charakterystyki kolonii i identyfikację, a następnie za pomocą dostępnych komercyjnie zestawów zmierzono liczne funkcje metaboliczne in vitro (Rysunek 5). Bakterie te zostały wyizolowane i zidentyfikowane poprzez sekwencjonowanie 16S, a wyniki analizy BLAST przedstawiono w poprzednim raporcie42. Zidentyfikowane szczepy bakteryjne umożliwiają prowadzenie badań naukowych nad wpływem pojedynczej lub połączonej mikrobioty na zdrowie gospodarza poprzez zakażanie modeli ryb GF. Przezroczystość larw ryb pozwala na obserwację znakowanych fluorescencyjnie komórek bakteryjnych przy użyciu barwników CM-Dil, co ujawnia kolonizację i rozmieszczenie w jelitach ryb GF (pokazane na Rysunku 6). Po zakażeniu bakteryjnym w 5 dpf larwy danio-ostrobramka GF mogą być obrazowane za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego i stale obserwowane od 6 do 14 dpf, co dostarcza informacji o funkcjach mikrobiologicznych w połączeniu z indeksami rozwojowymi, zmianami histopatologicznymi i alteracjami molekularnymi47.
<img alt="Proces traktowania embrionów danio pręgowanego, cykle płukania, warunki hodowli, układ detekcji drobnoustrojów." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66512/66512fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Protokół uzyskiwania GF danio pręgowanego od stadium embrionalnego po larwy i osobniki młodociane. Kluczowe etapy generowania GF danio pręgowanego obejmują: (1) Zbieranie embrionów od danio pręgowanego typu dzikiego i umieszczanie ich w AB-GZM. (2) Traktowanie płukaniem z użyciem PVP-I oraz NaClO w celu zapewnienia pełnej sterylności. (3) Hodowlę embrionów/larw GF w płytkach 6-dołkowych z GZM, z codzienną wymianą medium. (4) Regulację warunków hodowli dla optymalnego wzrostu i rozwoju. (5) Pobieranie próbek na różnych etapach rozwoju, a następnie testowanie sterylności metodą posiewów na podłoża stałe i w mediach płynnych. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66512/66512fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Proces przygotowania cyst Artemia; płukanie, mieszanie, inkubacja, filtrowanie; zestaw do eksperymentu laboratoryjnego." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66512/66512fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Protokół przygotowania GF Artemia jako żywego pokarmu dla ryb GF. Kluczowe etapy obejmują: (1) Płukanie cyst Artemia w celu uzyskania pełnej sterylności. (2) Przygotowanie cyst GF w medium. (3) Inkubacja w roztworze soli przez 24 h w celu promowania wykluwania. (4) Filtrowanie niewyklutych i pustych jaj w celu zebrania aktywnych nauplii. (5) Mycie zebranych nauplii w celu usunięcia zanieczyszczeń, co zapewnia wysoką jakość i czystość żywego pokarmu. (6) Testy sterylności GF Artemia przed podaniem larwom ryb GF. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66512/66512fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Mikroskopia ziaren pyłku, obraz mikroskopowy, analiza eksperymentalna, skala 500-2000 μm." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66512/66512fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Wskaźniki cyst i nauplii GF Artemia inkubowanych przez 24 h. (A) Niepoddane działaniu czynników cysty Artemia z warstwą zanieczyszczeń (pasek skali: 500 µm). (B) Poddane działaniu czynników cysty Artemia z lekko wypukłą powierzchnią po absorpcji wody i czystszym wyglądem (pasek skali: 500 µm). (C) Badanie mikroskopowe świeżo inkubowanych żywych Artemia nauplii GF (pasek skali: 2000 µm) oraz (D) powiększenie z paskiem skali 1000 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66512/66512fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Eksperyment wzrostu drobnoustrojów; probówki i płytki z agarem; hodowla bakterii; analiza laboratoryjna." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66512/66512fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Wykrywanie jałowości ryb GF w każdym stadium życia oraz GF Artemia. (A) Testy jałowości próbek ryb CR i GF z wykorzystaniem pożywek płynnych TSB i BHI, agaru TSA oraz płytek z krwią w warunkach tlenowych i beztlenowych. (B) Testy jałowości nieprzetworzonych cyst Artemia, cyst GF Artemia oraz nauplii z wykorzystaniem pożywek płynnych TSB i BHI, agaru TSA oraz płytek z krwią w warunkach tlenowych i beztlenowych. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66512/66512fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wzrost kolonii bakteryjnych na agarze, chromatogramy sekwencjonowania DNA, identyfikacja bakterii poprzez analizę 16S rRNA." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66512/66512fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Izolacja i identyfikacja bakterii jelitowych u danio-ostrobramnego. (A) Szczepy bakteryjne, charakterystyka kolonii, mapy sekwencjonowania 16S (przykłady: Aeromonas sp. i Vibrio sp.). (B) Rodzaj i numery dostępowe NCBI. (C) Funkcje metaboliczne bakterii wyizolowanych z jelit danio-ostrobramnego. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66512/66512fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Eksperyment wzrostu mikroorganizmów; kultury bakteryjne, obrazy mikroskopowe, fluorescencja zebrafish, wykres danych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66512/66512fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6: Infekcja i kolonizacja szczepów bakterii jelitowych u zebrafish GF. (A) Odzyskiwanie wyizolowanych i zidentyfikowanych szczepów bakteryjnych do eksperymentów z infekcją. (B) Znakowanie bakterii barwnikami fluorescencyjnymi i infekcja larw zebrafish GF w 5 dpf. Powiększenie: 1x. (C) Obserwacja rozprzestrzeniania się i kolonizacji bakterii (Vibrio sp.) w tkankach jelita in vivo. Powiększenie: 3x. (D) Liczenie CFU bakterii (Aeromonas sp. i Vibrio sp.) w każdej larwie ryby poprzez codzienne próbkowanie. Dane przedstawiono jako średnia ± SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66512/66512fig06large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić większą wersję tego rysunku, kliknij tutaj.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody >
		<tr >
			<td >Startery</td>
			<td >Sekwencje (5’-3’)</td>
			<td >Długość produktu</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >27F</td>
			<td >AGAGTTTGATCMTGGCTCAG</td>
			<td rowspan="2">1465 bp</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1492R</td>
			<td >ACGGYTACCTTGTTACGACTT</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >63F</td>
			<td >CAGGCCTAACACATGCAAGTC</td>
			<td rowspan="2">1324 bp</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1387R</td>
			<td >GGGCGGWGTGTACAAGGC</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Startery użyte do detekcji bakterii.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Komponenty</td>
			<td>Jednostki</td>
			<td>Objętość (µL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polimeraza DNA Taq</td>
			<td>2,5 J/µL</td>
			<td>0.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bufor 10× (Mg2+)</td>
			<td>---</td>
			<td>2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mieszanina dNTP</td>
			<td>2,5 mM</td>
			<td>1.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Starter 27F</td>
			<td>10 µM</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Starter 1492R</td>
			<td>10 µM</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>wolne od DNA/RNA H2O</td>
			<td>---</td>
			<td>13.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matryca DNA</td>
			<td>---</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objętość całkowita</td>
			<td>---</td>
			<td>20</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Końcowe stężenie i objętość składników na jedną reakcję.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Krok</td>
			<td>Temperatura</td>
			<td>Czas</td>
			<td>Cykle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Denaturacja wstępna</td>
			<td>95 °C</td>
			<td>4 min</td>
			<td>--</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Denaturacja </td>
			<td>94 °C</td>
			<td>1 min</td>
			<td rowspan="3">35</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wyżarzanie</td>
			<td>55 °C</td>
			<td>1 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rozszerzenie</td>
			<td>72 °C</td>
			<td>1 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Końcowe przedłużenie</td>
			<td>72 °C</td>
			<td>10 min</td>
			<td>--</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Przytrzymać</td>
			<td>4 °C</td>
			<td>∞</td>
			<td>--</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 3: Program PCR dla amplifikacji genu 16S rRNA.
Rysunek uzupełniający 1: Krytyczne wskaźniki rozwojowe modeli zebrafish GF i CR. (A) Odsetek wyklucia się zebrafish CR i GF w 72 hpf oraz (B) liczba uderzeń serca/10 s ryb CR i GF w 7 dpf i 14 dpf. Przeżywalność (%) ryb CR i GF spadła od 7. i 14. dnia z 86%, 60%-80% do 10%-25% w 30 dpf. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66512/Supplementary%20Figure%201.zip" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Ten protokół przedstawia podstawowe kroki do uzyskania wolnych od zarazków (GF) zarodków ryb i utrzymania ich od larw do stadium młodocianego, w tym pobieranie próbek i wykrywanie ich sterylnego statusu. Zastosowanie modeli GF w przypadku infekcji jest ważne dla zrozumienia roli drobnoustrojów w zdrowiu gospodarza.

Generowanie, utrzymanie i identyfikacja wolnych od zarazków modeli danio pręgowanego od larw do stadiów młodocianych

Zebrafish serve as valuable models for research on growth, immunity, and gut microbiota due to their genomic similarities with mammals, transparent ...

Zakres tych badań polega na wygenerowaniu nowych, wolnych od zarazków modeli zwierzęcych, które będą pomocnymi i potężnymi narzędziami w badaniu różnych funkcji mikrobiomu. W tej dziedzinie ostatnio zastosowano wczesne modele ryb wolnych od zarazków, ale modele długoterminowe są nadal ograniczone ze względu na różne warunki hodowlane i obronę rozwojową personelu. Obecne modele ryb GF są zwykle modelami we wczesnym okresie życia.W związku z tym technologie, w tym sterylna waga, metody wykrywania próbek i dostarczanie sterylnej żywności, są bardzo ważnymi wyzwaniami, którym należy sprostać. Wolny od zarazków model danio pręgowanego ma kluczowe znaczenie dla badania interakcji między mikrobiotą gospodarza a a jego wpływem na rozwój oraz odporność i chorobę. Model ten pozwala naukowcom precyzyjnie manipulować pojedynczą bakterią jelitową i obserwować jej wpływ na przezroczyste zarodki danio pręgowanego.Dostarcza cennych informacji na temat roli drobnoustrojów jelitowych w dziedziczeniu choroby. W przyszłości nasze badania będą koncentrować się głównie na stworzeniu wolnego od zarazków modelu danio pręgowanego dla całego cyklu życia, aby lepiej zrozumieć funkcję mikrobiomu jelitowego.

generation-maintenance-identification-germ-free-zebrafish-models-from

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Przewodnik krok po kroku po generowaniu ukierunkowanych chimerycznych zarodków danio przewrotnego poprzez transplantację w stadium blastuli lub gastruli.

Generowanie chimerycznych embrionów ryby danio przez transplantację

Niniejszy protokół opisuje regularną konserwację i pielęgnację w celu utrzymania optymalnych warunków chowu danio pręgowanych. Film przedstawia procedurę konserwacji systemu, bieżącego utrzymania, karmienia, rozrodu oraz hodowli larw danio pręgowanych.

Regularna pielęgnacja i konserwacja laboratorium rybek danio (Danio rerio): wprowadzenie

Zarodek danio pręgowanego jest doskonałym modelem do badań nad biologią rozwojową. Podczas embriogenezy danio pręgowany rozwija się z masą żółtka, co stanowi trójwymiarowe wyzwanie dla obserwacji i analizy próbek. Protokół ten opisuje, w jaki sposób tworzyć dwuwymiarowe preparaty do montażu płaskiego całych próbek zarodków danio pręgowanego barwionych metodą montażu in situ (WISH).

Przygotowanie do obserwacji i analizy próbek zarodków danio pręgowanego wybarwionych metodą hybrydyzacji in situ metodą całego wierzchowca

Danio pręgowany jest potężnym modelowym systemem do badań nad biologią rozwojową i chorobami ludzkimi ze względu na ich genetyczne podobieństwo do wyższych kręgowców. Protokół ten opisuje metodologię tworzenia haploidalnych zarodków danio pręgowanego, które można wykorzystać do strategii przesiewowych w celu identyfikacji recesywnych mutacji w genach niezbędnych do wczesnej embriogenezy.

Produkcja haploidalnych zarodków danio pręgowanego metodą zapłodnienia in vitro

Danio pręgowany był używany jako wiarygodne modele genetyczne w badaniach biomedycznych, zwłaszcza wraz z pojawieniem się technologii edycji genów. Gdy spodziewane są fenotypy larw, ekstrakcja DNA i identyfikacja genotypu może być trudna. W tym miejscu opisujemy skuteczną procedurę genotypowania larw danio pręgowanego, poprzez obcinanie ogonów, już po 72 godzinach od zapłodnienia.

Wysokoprzepustowa ekstrakcja DNA i genotypowanie larw danio pręgowanego 3dpf poprzez obcinanie płetw

Regeneracja mięśni szkieletowych jest napędzana przez komórki macierzyste mięśni rezydujące w tkankach, które są upośledzone w wielu chorobach mięśni, takich jak dystrofia mięśniowa, co skutkuje niezdolnością mięśni do regeneracji. W tym miejscu opisujemy protokół, który pozwala na badanie regeneracji mięśni w modelach choroby mięśni danio pręgowanego.

Badanie regeneracji mięśni w modelach chorób mięśni danio pręgowanego

Tutaj prezentujemy metodę obrazowania embrionalnego mózgu danio pręgowanego in vivo, aż do stadium larwalnego i młodocianego. Ta mikroinwazyjna procedura, zaadaptowana z podejść elektrofizjologicznych, zapewnia dostęp do szczegółów komórkowych i subkomórkowych dojrzałego neuronu i może być połączona z badaniami optogenetycznymi i neurofarmakologicznymi w celu scharakteryzowania funkcji mózgu i interwencji farmakologicznej.

Obrazowanie in vivo w pełni aktywnej tkanki mózgowej u wybudzonych larw i osobników młodocianych danio pręgowanego poprzez usunięcie czaszki i skóry

Danio pręgowany został ostatnio wykorzystany jako model do walidacji potencjalnych modyfikatorów promieniowania. Niniejszy protokół opisuje szczegółowe kroki w celu wykorzystania zarodków danio pręgowanego do eksperymentów przesiewowych opartych na promieniowaniu oraz niektóre podejścia obserwacyjne do oceny wpływu różnych metod leczenia i promieniowania.

Larwy danio pręgowanego jako model do oceny potencjalnych radiosensybilizatorów lub obrońców

Prezentujemy protokół do uchwycenia dynamiki regeneracji płetw ogonowych larw danio pręgowanego w skali całej tkanki za pomocą stereomikroskopii opartej na jasnym polu. Technika ta umożliwia uchwycenie dynamiki regeneracji z rozdzielczością pojedynczej komórki. Metodologię tę można dostosować do każdego mikroskopu stereoskopowego wyposażonego w kamerę CCD i oprogramowanie do filmów poklatkowych.

Uchwycenie naprawy tkanek u larw danio pręgowanego za pomocą stereomikroskopii poklatkowej w jasnym polu

W tym badaniu opisujemy prostą metodę przeprowadzania analizy Evans Blue Dye (EBD) na larwach danio pręgowanego.  Technika ta jest potężnym narzędziem do charakteryzowania integralności mięśni szkieletowych i wyznaczania modeli dystrofii mięśniowej danio pręgowanego, a także jest cenną metodą opracowywania nowych metod terapeutycznych.

Analiza integralności mięśni szkieletowych larw danio pręgowanego za pomocą niebieskiego barwnika Evansa

Poznaj metodę generowania i utrzymywania wolnych od zarazków zarodków danio pręgowanego od larw do stadiów młodocianych. Model ten umożliwia badanie interakcji gospodarz-mikrobiota oraz ich wpływu na rozwój i odporność.

Generowanie, utrzymanie i identyfikacja wolnych od zarazków modeli danio pręgowanego od larw do stadiów młodocianych

Przeglądaj więcej filmów