Śledzenie fibrynolizy skrzepów krwi pełnej uformowanych w pętli Chandlera pod wpływem przepływu ścinającego w modelu trombolizy in vitro
19 kwietnia 2024
Testy trombolizy in vitro często miały trudności z odtworzeniem warunków in vivo, czy to w trawionej skrzeplinie, czy w środowisku, w którym tromboliza zachodzi. W tym artykule badamy, w jaki sposób sprzężenie pętli Chandlera i testu fluorometrycznej fibrynolizy przepływowej w czasie rzeczywistym (RT-FluFF) jest wykorzystywane do monitorowania lizy skrzepów ex vivo o wysokiej wierności.
Zakrzepica wiąże się z wieloma schorzeniami, a obecne leczenie grozi ciężkim krwawieniem. Przepływ w układzie krążenia znacząco wpływa na strukturę skrzepów krwi. Włączenie przepływu do modeli in vitro może poprawić ich znaczenie fizjologiczne, zwiększając wybór lepszych kandydatów do badań in vivo.
Testy do badania fibrynolitycznego wykorzystują głównie statyczne układy skrzepowe lub mikroprzepływowe do oceny właściwości, takich jak czas lizy, struktura skrzepu lub lepkosprężystość. Statyczne testy lizy skrzepów zazwyczaj opierają się na pomiarach spektrofotometrycznych lub określeniu masy skrzepu jako punktach końcowych w celu oceny skuteczności fibrynolizy. Obecne badania trombolityczne to statycznie uformowane skrzepy, które różnią się strukturalnie od tych powstających w warunkach przepływu.
Systemy mikroprzepływowe uwzględniają dynamikę przepływu, ale ich mniejsze skale tworzą unikalną hemodynamikę i struktury skrzepów. Obecnie opracowany esej RT-FluFF zapewnia łatwość monitorowania lizy w czasie rzeczywistym w fizjologicznych warunkach przepływu. Oznacza to, że mamy teraz platformę, która pozwala na kontrolę nad wieloma parametrami, aby naśladować stan bliższy modelom badawczym w celu lepszej translacji podczas badań przesiewowych nowych trombolityków.
Na początek dodaj fluorescencyjnie znakowany fibrynogen do trzech mililitrów cytrynowanej ludzkiej krwi pełnej, aby osiągnąć końcowe stężenie 60 mikrogramów na mililitr. Ustaw pętlę Chandlera z bębnem o średnicy 120 milimetrów w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Wytnij standardową probówkę PCR o pojemności 200 mikrolitrów i podłącz końce rurki.
Aby zainicjować krzepnięcie krwi, dodaj 176 mikrolitrów 200-milimolowego chlorku wapnia do trzech mililitrów krwi pełnej. Po prawidłowym wymieszaniu z delikatną inwersją, za pomocą trzymililitrowej strzykawki, załaduj krew do rurki, natychmiast umieść rurkę na bębnie pętlowym Chandlera, łącząc końce. W warunkach słabego oświetlenia obracaj bęben częściowo zanurzony w łaźni wodnej z prędkością 40 obr./min.
Po 40 do 60 minutach usuń skrzepy z rurki. Charakterystyka krwi pełnej znakowanej fibrynogenem w pętli Grossa Chandlera FITC wykazała równomierne rozproszenie fluorescencji w świetle ultrafioletowym. Co więcej, zmiana stopnia fibrynogenu FITC we krwi pełnej nie zmienia masy skrzepów.
Aby rozpocząć, podłącz urządzenie do pętli przepływu i upewnij się, że wszystkie połączenia są bezpieczne. Włącz monitor ciśnienia. Upewnij się, że monitor odczytuje zero milimetrów rtęci zarówno dla czujników wlotowych, jak i wylotowych.
Włącz łaźnię wodną i dostosuj temperaturę do 37 stopni Celsjusza, aby naśladować fizjologiczną temperaturę ludzkiego ciała. Uruchom pompę z żądanym natężeniem przepływu, aby sprawdzić, czy nie ma wycieków, i potwierdź prawidłowe działanie czujników ciśnienia. Wyłącz pompę, aby ułatwić fazę ruchomą plazmy i ładowanie skrzepu.
Aby zmierzyć wcześniej przygotowaną masę skrzepu krwi pełnej ludzkiej, delikatnie osusz skrzepy na chusteczkach laboratoryjnych, aż nie zostanie uwolniona znacząca ilość płynu. Zanurz skrzep w dopasowanym do typu wyciągniętym osoczu w krążku wagowym. Usuń środkową część rurki pętli przepływu między czujnikami wlotowymi i wylotowymi i podłącz 10-mililitrową strzykawkę do jednego końca rurki.
Przez wolny koniec zalać rurkę niewielką ilością plazmy. Po zidentyfikowaniu głowy i ogona skrzepu ustaw głowicę w kierunku czujnika ciśnienia wlotowego. Umieścić rurkę na końcu końcowego skrzepu i zassać do rurki za pomocą strzykawki.
Podłącz rurkę do aparatu pętli przepływu, ustawiając skrzep najbliżej czujnika ciśnienia wylotowego z głowicą skierowaną na zewnątrz. Aby zabezpieczyć skrzep na miejscu, przebij rurkę i główkę skrzepu dwiema igłami o rozmiarze 30 w kształcie litery X. Przenieś pozostały roztwór fazy ruchomej do 50-mililitrowej probówki jako zbiornika.
Umieść zbiornik w łaźni wodnej. Następnie włóż rurkę doprowadzającą i wylotową do zbiornika. Włącz fluorometr i sprawdź, czy wartość początkowa jest odpowiednia, porównując ją z linią bazową systemu tylko z ruchomą fazą.
Dodaj 500 mikrolitrów tkankowego aktywatora plazminogenu bezpośrednio do zbiornika. Uruchom pompę i dostosuj natężenie przepływu do 160 mililitrów na minutę. Następnie system napełnia się płynem i pęcherzykami.
Gdy bąbelki znikną, wyłącz światło i rozpocznij akwizycję danych. Nagrywaj, aż skrzep ulegnie znacznemu zniszczeniu. Podczas przepływu osocza należy monitorować ciśnienie w układzie przed i po zakrzepie, które będzie się zmieniać w trakcie procesu trawienia skrzepu wraz ze zmniejszaniem się masy skrzepu.
Po wytrawieniu skrzepu zmniejsz objętościowe natężenie przepływu i wyjmij rurkę wlotową, gdy pompa nadal pracuje, aby wepchnąć większość płynu do zbiornika. Odłącz sekcję rurki zawierającą skrzep po stronie czujnika ciśnienia wylotowego i opuść ją do łodzi wagowej. Usuń igły, aby zebrać pozostały płyn i fragmenty skrzepu.
Zważyć pozostały skrzep. Pomiędzy próbkami załaduj ciepłą wodę do zbiornika i przepuść przez system przez dwie minuty z prędkością 150 obr./min. Po przeprowadzeniu wszystkich próbek na dany dzień należy wyjąć i wyrzucić rurkę.
Wyszoruj skrzyżowania T gorącą wodą i szczotką z włosia, aż będą czyste i pozostaw je do wyschnięcia. Wypłukać strzykawki dampers gorącą wodą i przetrzeć 70% etanolem, aby zachować sterylność.
Przegląd
To badanie bada ograniczenia metod trombolizy in-vitro w replikacji warunków in-vivo. Łącząc pętlę Chandlera z metodą Real-Time Fluorometric Flowing Fibrinolysis Assay (RT-FluFF), badania mają na celu poprawę wierności monitorowania lizy skrzeplin in-vivo.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Tromboza
- Tromboliza
- Fibrynoliza
Tło
- Tromboza jest związana z różnymi stanami medycznymi.
- Obecne leczenie trombozy niesie ryzyko poważnego krwawienia.
- Przepływ krwi znacząco wpływa na strukturę skrzeplin.
- Statyczne testy mogą nie dokładnie odzwierciedlać warunków in-vivo.
Cel badania
- Poprawić fizjologiczne znaczenie testów trombolizy in-vitro.
- Poprawić selekcję kandydatów do testów in-vivo.
- Ocenić wpływ przepływu na efektywność lizy skrzeplin.
Zastosowane metody
- Pętla Chandlera do symulacji przepływu krwi.
- Real-Time Fluorometric Flowing Fibrinolysis Assay (RT-FluFF).
- Monitorowanie lizy skrzeplin w kontrolowanym środowisku.
- Porównanie warunków statycznych i przepływowych.
Główne wyniki
- Warunki przepływu znacząco wpływają na strukturę i lizę skrzeplin.
- RT-FluFF zapewnia wysokiej wierności monitorowanie lizy skrzeplin.
- Łączenie metod poprawia istotność wyników testów.
- Ulepszone testy mogą prowadzić do lepszych kandydatów terapeutycznych.
Wnioski
- Włączenie przepływu do testów trombolizy poprawia dokładność.
- Monitorowanie ex-vivo może lepiej naśladować warunki in-vivo.
- Przyszłe badania powinny skupiać się na udoskonaleniu tych metod.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Physiologically relevant in-vitro thrombolysis models are critical for improving predictive confidence in thrombolytic drug discovery and reducing translational failure rates. The RT-FluFF assay enables real-time, quantitative assessment of clot lysis under controlled shear flow, directly addressing the limitations of static assays. This platform supports more informed candidate triage and de-risking at the preclinical stage, enhancing portfolio decision-making.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of thrombolytic mechanisms under physiologically relevant flow conditions.
- Supports functional validation of drug targets by mimicking arterial, venous, and pulmonary environments.
- Improves predictive confidence for candidate selection by aligning in-vitro outputs with in-vivo relevance.
Screening & Assay Development
- Facilitates preparation of standardized, flow-formed clots for reproducible screening workflows.
- Delivers quantitative, real-time lysis measurements for robust compound evaluation.
- Enables assay scalability and platform reuse across diverse thrombolytic agents and flow regimes.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in-vitro assay conditions with disease-relevant hemodynamics to improve translational continuity.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by providing physiologically meaningful efficacy data.
- Reduces reliance on animal models by increasing the fidelity of preclinical in-vitro testing.
Pipeline & Workflow Integration
The RT-FluFF assay bridges early discovery and preclinical evaluation by providing a high-fidelity, quantitative platform for thrombolytic candidate assessment under controlled flow conditions.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing and mechanistic de-risking by simulating in-vivo clot formation and lysis dynamics.
- Screening: Provides reproducible, quantitative readouts for compound comparison and assay standardization.
- Analytics: Supports continuous and endpoint measurements, facilitating robust statistical analysis of lysis kinetics.
- Translational Research: Enhances biomarker alignment and preclinical continuity by modeling physiologically relevant shear and flow.
- Enterprise Reuse: Offers a flexible, adaptable platform for repeated use across multiple drug discovery programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in thrombolytic screening.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable assay workflows.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions and capital efficiency by improving early-stage data quality.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of thrombolytic candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in hemodynamics, clot biology, and quantitative assay design.
- Needs instrumentation for controlled flow, temperature regulation, and real-time fluorometric detection.
- Demands cross-team standardization of clot formation and digestion protocols.
- Adaptable to various flow rates and clot types to model different vascular conditions.
- Dependent on access to human whole blood and specialized analytical infrastructure.
