Name: Śledzenie fibrynolizy skrzepów krwi pełnej uformowanych w pętli Chandlera pod wpływem przepływu ścinającego w modelu trombolizy in vitro (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-04-19T13:40:00.000+00:00
Duration: 6 min 16 s
Description: Poznaj metodę RT-FluFF do monitorowania fibrynolizy skrzepów krwi w warunkach przepływu przy użyciu pętli Chandlera. To podejście poprawia fizjologiczną relewantność badań trombolitycznych in vitro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badania opisane w tej publikacji były wspierane przez National Heart, Lung, And Blood Institute of the National Institutes of Health pod numerem R01HL167877. Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i nie muszą one reprezentować oficjalnych poglądów National Institutes of Health.

Wszystkie metody wymienione poniżej są zgodne z protokołami instytucjonalnej komisji rewizyjnej (IRB) i instytucjonalnym komitetem etyki badań na ludziach. Wszyscy zdrowi ochotnicy wyrazili pisemną i świadomą zgodę przed oddaniem krwi. Warto zauważyć, że wszystkie materiały, do których odwołuje się protokół, znajdują się w Tabeli Materiałów. Podczas gdy ludzkie WB i osocze są omawiane w tym protokole, można kupić i zastąpić je krwią zwierząt badawczych i produktami krwiodawczymi zubożonymi w czynniki.
1. Pobieranie krwi pełnej
<ol>
	<li>Pobrać pełną krew żylną (WB) od zdrowych ochotników, którzy wyrazili na to zgodę, stosując standardowe techniki flebotomii. 
	UWAGA: Upewnij się, że przestrzegane są uniwersalne środki ostrożności w celu zmniejszenia ryzyka kontaktu z krwią lub innymi potencjalnie zakaźnymi materiałami w całym tym protokole. Konieczne jest użycie rękawiczek, fartucha laboratoryjnego i przyłbicy.</li>
	<li>Zebrać ~50 ml WB bezpośrednio do probówek z 3,2% cytrynianem sodu i natychmiast zebrać w probówkach o pojemności 50 ml do późniejszego użycia. 
	UWAGA: Konieczne jest wyrzucenie probówki przed pobraniem krwi do probówki z cytrynianem, a także upewnienie się, że probówki są napełnione do objętości zalecanej przez producenta. Świeżo pobrany WB najlepiej odtworzy dynamikę krzepnięcia gospodarza. Dopuszczalne jest krótkotrwałe przechowywanie WB w temperaturze pokojowej (≤4 h przed użyciem). WB nie jest przechowywany przez noc, ponieważ wykazano, że wpływa to na dynamikę krzepnięcia podczas badania za pomocą tromboelastografii15.</li>
</ol>
2. Tworzenie się skrzepów
<ol>
	<li>Do 3 ml cytrynowanej krwi pełnej dodać fluorescencyjnie (izotiocyjanian fluoresceiny [FITC]) znakowany fibrynogenem (FITC-Fg) do końcowego stężenia 60 μg/ml (stosunek 1:50 fluorescencyjnie znakowanego fibrynogenu do niezmodyfikowanego fibrynogenu przy założeniu endogennego stężenia fibrynogenu w osoczu 3 mg/ml). 
	UWAGA: Stosunek ten można zwiększyć nawet do 1:10 przy minimalnym wpływie na morfologię skrzepu. 13, 14 Fluorescencyjnie oznaczony fibrynogen można kupić lub wytworzyć w wyniku reakcji fibrynogenu z izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC). Mieszanie fibrynogenu należy wykonać ≤5 minut przed rozpoczęciem biegu.
	<ol>
		<li>Jeśli fibrynogen został wcześniej podzielony na porcje i zamrożony, należy sprawdzić rozmrożony FITC-Fg, aby upewnić się, że polimeryzacja nie rozpoczęła się przedwcześnie, co czyni go bezużytecznym (upewnić się, że w roztworze nie ma cząstek stałych lub włókien).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj zestaw pętli Chandlera z bębnem o średnicy 120 mm w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). Upewnij się, że urządzenie pętli Chandlera jest w stanie obracać się ze stałą prędkością obrotową 0-90 obr./min podczas całego procesu tworzenia skrzepów. 
	UWAGA: Dodatkowe ustawienia i modyfikacje pętli Chandlera można znaleźć w Zeng et al.16.</li>
	<li>Wytnij rurkę (średnica wewnętrzna 5/32", średnica zewnętrzna 7/32") i uformuj pętle, które mocno, ale nie ciasno przylegają do bębna. Aby uzyskać omówiony tutaj zalecany rozmiar rurki, wytnij standardową probówkę PCR o pojemności 200 μl, która będzie używana jako łącznik do łączenia końców rurki w celu utworzenia zamkniętej pętli. 
	UWAGA: Różne rozmiary rurek mogą być wykorzystane do produkcji skrzepów o różnych rozmiarach16.</li>
	<li>Zainicjuj krzepnięcie krwi, dodając 200 mM roztworu chlorku wapnia w stosunku 1:17 roztworu wapnia do krwi pełnej. Załaduj krew do rurki (wypełnij ~50% objętości probówki) za pomocą strzykawki o pojemności 3 ml. Natychmiast umieść pętlę na bębnie pętli Chandlera, łącząc końce i rozpocznij obrót.
	<ol>
		<li>Upewnij się, że przed załadowaniem należy zapewnić prawidłowe wymieszanie z delikatnym odwróceniem, aby uniknąć problemów wynikających z osadzania się składników WB.</li>
		<li>Upewnij się, że przy każdym uruchomieniu do każdej probówki dodawana jest taka sama ilość krwi, ponieważ może to wpłynąć na rozmiar skrzepu, jeśli nie będzie utrzymywana na stałym poziomie.</li>
		<li>Ponieważ pęcherzyki w kolumnie krwi mogą również wpływać na krzepliwość krwi, usuń je, delikatnie przesuwając rurkę w sposób przypominający "huśtawkę", aby ułatwić ucieczkę pęcherzyków przed załadowaniem ich do bębna.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obracaj bęben częściowo zanurzony w łaźni wodnej z prędkością obrotową 40 obr./min, aby uzyskać obliczoną szybkość ścinania ~450 s-1. 
	UWAGA: Zapoznaj się z Zeng et al., aby uzyskać informacje na temat obliczanych nożyc na podstawie rozmiaru rurki i prędkości obrotowej (od 20 do 60 obr./min)16. Typowe szybkości ścinania żył i tętnic wynoszą odpowiednio 20-200 s-1 i 300-1,000 s-1, przy czym ~ 400-500 s-1 jest reprezentatywne dla tętnicy płucnej.</li>
	<li>Pozwól na tworzenie się skrzepów przez 40-60 minut w warunkach słabego oświetlenia, aby zminimalizować fotowybielanie fluorescencyjnie znakowanego fibrynogenu.</li>
	<li>Po osiągnięciu pożądanego czasu krzepnięcia usuń skrzepy z rurki i natychmiast je zużyj. Aby zapewnić delikatne usunięcie skrzepów bez naruszania struktury, delikatnie odwróć rurkę, aby skrzep powoli wysunął się z rurki do małego pojemnika. 
	UWAGA: Przechowywanie powstałych skrzepów w osoczu cytrynianowym lub PBS przez noc w temperaturze 4 °C może mieć wpływ na późniejszą analizę trawienia skrzepów w pętli przepływu.</li>
</ol>
3. Konfiguracja urządzenia RT-FluFF
<ol>
	<li>Upewnij się, że aparat pętli przepływu jest podłączony, jak pokazano na Rysunek 2 i że wszystkie połączenia są bezpieczne. Krótko mówiąc, aparat pętli przepływu obejmuje, w kolejności kierunku przepływu: pompę > przepustnicę > czujnik ciśnienia wlotowego > czujnik ciśnienia skrzepu > wylotowego > fluorometr > podgrzewany zbiornik > pompę. Dostosuj wybór wydajności pompy, eksperymentalnego natężenia przepływu, średnicy i długości rurki, temperatury, objętości zbiornika oraz rozmiaru/geometrii skrzepu, aby dopasować go do potrzeb eksperymentalnych unikalnych dla każdego badania. 
	UWAGA: W tym przykładzie rurka o tej samej średnicy, która została użyta w pętli Chandlera, została użyta dla RT-FluFF. Rurka może być używana do wielu przebiegów tego samego dnia, ale musi być monitorowana pod kątem degradacji lub wycieku i wymieniana/płukana w razie potrzeby. Zaleca się płukanie ciepłą wodą destylowaną między cyklami. W zależności od projektu eksperymentalnego może być konieczna wymiana rurki po każdym uruchomieniu.</li>
	<li>Po zabezpieczeniu wszystkich przewodów włącz monitor ciśnienia. Sprawdź, czy monitor ciśnienia wskazuje 0 mmHg zarówno dla czujnika wlotowego, jak i wylotowego. Jeśli tak się nie stanie, otwórz zawory, aby upewnić się, że czujniki ciśnienia są otwarte na ciśnienie atmosferyczne i wyzeruj czujniki.</li>
	<li>Włącz używany blok grzewczy lub łaźnię wodną i monitoruj temperaturę w trakcie eksperymentu. Utrzymuj temperaturę bliską 37 °C, aby naśladować fizjologiczną temperaturę ludzkiego ciała.</li>
	<li>Włącz pompę do żądanego natężenia przepływu, aby sprawdzić, czy nie ma wycieków i sprawdzić, czy czujniki ciśnienia działają. 
	UWAGA: Natężenie przepływu ~160 ml/min w tym rozmiarze rurki będzie reprezentować szybkość ścinania ~500 s-1.</li>
	<li>Wyłącz pompę, aby ułatwić ładowanie skrzepu.</li>
</ol>
4. Ładowanie skrzepu do pętli przepływu
<ol>
	<li>Jeśli wcześniej wykonany skrzep, który był przechowywany, jest używany, należy doprowadzić skrzep do temperatury pokojowej przed załadowaniem go do systemu pętli przepływu.</li>
	<li>Utrata masy skrzepu jest ważnym pomiarem końcowym w testach trombolizy. Najlepszą praktyką jest pomiar masy skrzepu tuż przed załadowaniem go do pętli przepływu, zamiast polegania na wcześniejszych pomiarach.
	<ol>
		<li>Pomiary masy skrzepów powinny być zawsze wykonywane w ten sam sposób za każdym razem, aby zapewnić spójność między próbkami i w różnych dniach testu, ponieważ zawartość cieczy w skrzepach i na nich może znacząco wpływać na ich masę. Najlepszą praktyką jest delikatne osuszanie skrzepów na chusteczkach laboratoryjnych, aż przestaną uwalniać znaczną ilość płynu na chusteczkę, uważając, aby nie ściskać skrzepu przez cały proces pomiaru.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zanurzyć skrzep w osoczu (autologicznym lub z dopasowanym typem) lub innym roztworze fazy ruchomej używanym w pętli przepływu (takim jak PBS lub pożywka zdefiniowana) w płytkim pojemniku, takim jak szalka wagowa. Roztwór fazy ruchomej powinien być pobierany bezpośrednio ze zbiornika systemowego o pojemności 50 ml w celu kontroli całkowitej objętości systemu. Na etapie ładowania skrzepu nie powinien być obecny żaden środek trombolityczny ani farmaceutyczny. Zaleca się, aby całkowita objętość fazy ruchomej do uruchomienia pętli przepływu wynosiła ≥50 ml i powinna być spójna we wszystkich próbkach.</li>
	<li>Zdejmij środkową część rurki pętli przepływowej (między czujnikami wlotowymi i wylotowymi) i podłącz strzykawkę o pojemności 10 ml do jednego końca rurki.</li>
	<li>Używając wolnego końca rurki, umieść ją w plazmie (lub fazie ruchomej) i nabierz niewielką objętość roztworu, aby zagruntować rurkę. Następnie umieść wlot rurki w pobliżu skrzepu, dokładnie badając skrzep, aby zidentyfikować głowę (zwykle nieco grubszy koniec skrzepu) i ogon (koniec naprzeciwko głowy). Głowica skrzepu powinna być ustawiona w kierunku czujnika ciśnienia wlotowego i z dala od wylotu. Umieść rurkę na "ogonowym" końcu skrzepu i zassaj ją do rurki za pomocą strzykawki. 
	UWAGA: w przypadkach, gdy nie można wizualnie określić kierunku głowy/ogona skrzepu, kierunkowość najlepiej przypisać na podstawie znajomości kierunku obrotu z pętli Chandlera - głowa skrzepu jest skierowana w przeciwnym kierunku niż obrót bębna.</li>
	<li>Podłącz rurkę z powrotem do głównego aparatu tak, aby skrzep znajdował się najbliżej czujnika ciśnienia wylotowego (głowa skrzepu powinna być skierowana w stronę przeciwną do czujnika wylotu). Zabezpiecz skrzep w jego pozycji, nakłuwając rurkę i główkę skrzepu dwiema igłami 30 G w kształcie "X". Pozostaw te igły na czas trwania biegu. 
	UWAGA: W zależności od ustawień dampener i pompy, mogą być konieczne dodatkowe igły, aby zapewnić, że skrzep nie rozpadnie się przedwcześnie. W razie potrzeby do rurki za skrzepem można dodać sitko, aby zapobiec cyrkulacji fragmentów skrzepu w systemie. Po ustaleniu ustalonej liczby igieł do utrzymania skrzepu, utrzymuj ją stałą we wszystkich warunkach.</li>
	<li>Pobrać pozostałą część roztworu fazy ruchomej i umieścić ją w probówce o pojemności 50 ml jako zbiornik.</li>
	<li>Umieść zbiornik w łaźni wodnej i włóż rurkę wlotową i wylotową (wylot pochodzi z fluorometru, a wlot wchodzi do głowicy pompy).</li>
	<li>Sprawdź, czy używany fluorometr jest podłączony i monitorowany. Sprawdzić, czy wartość początkowa jest odpowiednia w porównaniu z punktem odniesienia dla systemu opartego wyłącznie na fazie ruchomej na początku eksperymentu. 
	UWAGA: Jeśli fluorometr in-line nie jest dostępny, seryjne okresowe pobieranie próbek ze zbiornika może być przeprowadzane w określonych odstępach czasu przez cały okres analizy pętli przepływu. Zebrane frakcje można odczytać za pomocą 96-dołkowej płytki natychmiast po zakończeniu eksperymentu na dowolnym dostępnym na rynku spektrofotometrze.</li>
	<li>Dodaj 500 μl 100 000 ng/ml tPA bezpośrednio do objętości zbiornika, aby uzyskać końcowe stężenie 1 000 ng/ml tPA w 50 ml. Objętość, stężenie i konkretny dodany lek będą zależeć od pożądanego docelowego stężenia w krążeniu i objętości zbiornika systemu.</li>
	<li>Przed uruchomieniem pompy należy sprawdzić następujące elementy:
	<ol>
		<li>Wszystkie skrzyżowania są bezpieczne.</li>
		<li>Dwa zawory nad czujnikami ciśnienia znajdują się w odpowiedniej pozycji zamkniętej.</li>
		<li>Wszelkie resztki osocza (lub płynu) zostały wymienione w zbiorniku.</li>
		<li>Trombolityk został dodany do zbiornika i odpowiednio wymieszany.</li>
		<li>Rurka doprowadzająca znajduje się blisko dna zbiornika (zapewnia to minimalne pęcherzyki).</li>
		<li>Rurka wylotowa jest zabezpieczona i znajduje się na odpowiedniej wysokości dla żądanego ciśnienia (w zależności od tego, która lokalizacja naczynia jest modelowana).</li>
		<li>Kierunek obrotów pompy jest prawidłowy (Kolejność przepływu: Pompa > Dampener > Clot > Fluorometr > Zbiornik > Pompa).</li>
		<li>Jeśli obroty pompy są ustawione bardzo wysoko (>150 obr./min), zacznij od mniejszej prędkości i zwiększaj, aby upewnić się, że szybka zmiana ciśnienia nie rozdrobni skrzepu ani nie spowoduje wycieku z rurki.</li>
		<li>Upewnij się, że system odpowiednio rejestruje dane z fluorometru i/lub materiały są przygotowane do okresowego pobierania próbek fazy ruchomej w celu odczytów punktów czasowych po eksperymencie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Włącz pompę i ustaw ją tak, aby osiągnęła żądane objętościowe natężenie przepływu 160 ml/min lub zwiększ natężenie przepływu, aż do osiągnięcia żądanego ciśnienia. System wypełni się płynem i pęcherzykami. Bąbelki sztucznie podniosą odczyty fluorometryczne, więc obserwuj, aż bąbelki się znikną. Gdy to zrobią, wyłącz światła i rozpocznij pobieranie danych.</li>
	<li>Pozostawić pompę pracującą do momentu, gdy skrzep ulegnie znacznemu zmniejszeniu lub upłynie pożądany czas eksperymentu (≥60 min). W razie potrzeby dodawaj odczynniki do systemu przez cały czas trwania eksperymentu przez zbiornik, aby stworzyć unikalne warunki eksperymentalne testujące różne warianty trombolityczne. 
	UWAGA: Czas eksperymentu będzie zależał od natężenia przepływu pompy (poziomu ścinania) i stężenia trombolitycznego.</li>
	<li>Po zakończeniu testu zmniejsz objętościowe natężenie przepływu i wyjmij rurkę wlotową, gdy pompa nadal pracuje, aby wepchnąć większość płynu z układu do zbiornika (w rurce pozostanie pewna faza ruchoma). Odłącz sekcję rurki zawierającą skrzep po stronie czujnika ciśnienia wylotowego rurki i opuść ją do łodzi wagowej.</li>
	<li>Usuń igły, które utrzymują skrzep na miejscu, aby zebrać resztki płynu z wnętrza systemu i fragmenty skrzepu/skrzepu. W razie potrzeby należy użyć strzykawki, aby oczyścić system.</li>
	<li>Zważyć i przetworzyć pozostały skrzep do dodatkowej analizy, takiej jak obliczenie procentu utraconej masy lub do badania histologicznego.</li>
</ol>
5. Czyszczenie systemu
<ol>
	<li>Pomiędzy próbkami przepłukać cały układ ciepłą wodą o wysokiej prędkości obrotowej (>150 obr./min). Załaduj wodę do zbiornika i przepuść przez system przez co najmniej 2 minuty, opróżnij i uruchom ponownie, aby wykonać dwa pełne płukania systemu. Po tych płukaniach, jeśli odczyt fluorometru nie powróci do wartości wyjściowej, powtórz proces płukania dla dodatkowego cyklu. Jeśli nadal nie powróciła do linii podstawowej, całkowicie wymień rurkę przed oznaczeniem następnej próbki. 
	UWAGA: Podczas eksperymentów rurki mogą być ponownie używane między próbkami; Jednak ze względu na perforację za pomocą igieł służących do utrzymywania skrzepu na miejscu, odcinek rurki między czujnikami ciśnienia wlotowego i wylotowego należy wymieniać po każdym uruchomieniu. W niektórych warunkach eksperymentalnych może być konieczna wymiana całego zestawu przewodów po każdym uruchomieniu lub próbach grupowania w celu wyeliminowania zanieczyszczenia krzyżowego próbki.</li>
	<li>Po uruchomieniu wszystkich próbek do eksperymentów tego dnia usuń wszystkie rurki i wyrzuć. Wyszoruj złącza teowe gorącą wodą i szczotką z włosia, aż będą czyste, pozostaw do wyschnięcia, a następnie spłucz strzykawki dampeners gorącą wodą. Użyj 70% EtOH, aby pomóc w bezpłodności.</li>
</ol>

Combining the Chandler Loop and RT-FluFF for Ex Vivo Clot Lysis Monitoring

<ol><li>Ali, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aspect+of+thrombolytic+therapy%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+World+Journal%22%5BJournal%5D)">Aspect of thrombolytic therapy: a review.</a> Scientific World Journal. 2014, 586510(2014).</li>
<li>Bhogal, P., Andersson, T., Maus, V., Mpotsaris, A., Yeo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+thrombectomy-A+brief+review+of+a+revolutionary+new+treatment+for+thromboembolic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Neuroradiol%22%5BJournal%5D)">Mechanical thrombectomy-A brief review of a revolutionary new treatment for thromboembolic stroke.</a> Clin Neuroradiol. 28 (3), 313-326 (2018).</li>
<li>Fluri, F., Schuhmann, M. K., Kleinschnitz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+ischemic+stroke+and+their+application+in+clinical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Des+Devel+Ther%22%5BJournal%5D)">Animal models of ischemic stroke and their application in clinical research.</a> Drug Des Devel Ther. 9, 3445-3454 (2015).</li>
<li>Kaiser, E. E., West, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+animal+ischemic+stroke+models%3A+replicating+human+stroke+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Regen+Res%22%5BJournal%5D)">Large animal ischemic stroke models: replicating human stroke pathophysiology.</a> Neural Regen Res. 15 (8), 1377-1387 (2020).</li>
<li>Elnager, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+whole+blood+clot+lysis+for+fibrinolytic+activity+study+using+d-dimer+and+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Hematol%22%5BJournal%5D)">In vitro whole blood clot lysis for fibrinolytic activity study using d-dimer and confocal microscopy.</a> Adv Hematol. 2014, 814684(2014).</li>
<li>Prasad, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+in+vitro+model+to+study+clot+lysis+activity+of+thrombolytic+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+J%22%5BJournal%5D)">Development of an in vitro model to study clot lysis activity of thrombolytic drugs.</a> Thromb J. 4, 14(2006).</li>
<li>Robbie, L. A., Young, S. P., Bennett, B., Booth, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombi+formed+in+a+Chandler+loop+mimic+human+arterial+thrombi+in+structure+and+RAI-1+content+and+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Thrombi formed in a Chandler loop mimic human arterial thrombi in structure and RAI-1 content and distribution.</a> Thromb Haemost. 77 (3), 510-515 (1997).</li>
<li>Mutch, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model+thrombi+formed+under+flow+reveal+the+role+of+factor+XIII-mediated+cross-linking+in+resistance+to+fibrinolysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Model thrombi formed under flow reveal the role of factor XIII-mediated cross-linking in resistance to fibrinolysis.</a> J Thromb Haemost. 8 (9), 2017-2024 (2010).</li>
<li>Blinc, A., Kennedy, S. D., Bryant, R. G., Marder, V. J., Francis, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+through+clots+determines+the+rate+and+pattern+of+fibrinolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Flow through clots determines the rate and pattern of fibrinolysis.</a> Thromb Haemost. 71 (2), 230-235 (1994).</li>
<li>Mutch, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+the+Chandler+loop+to+examine+the+interaction+potential+of+NXY-059+on+the+thrombolytic+properties+of+rtPA+on+human+thrombi+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">The use of the Chandler loop to examine the interaction potential of NXY-059 on the thrombolytic properties of rtPA on human thrombi in vitro.</a> Br J Pharmacol. 153 (1), 124-131 (2008).</li>
<li>Herbig, B. A., Yu, X., Diamond, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+microfluidic+devices+to+study+thrombosis+in+pathological+blood+flows%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Using microfluidic devices to study thrombosis in pathological blood flows.</a> Biomicrofluidics. 12 (4), 042201(2018).</li>
<li>Jigar Panchal, H., Kent, N. J., Knox, A. J. S., Harris, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics+in+haemostasis%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Microfluidics in haemostasis: A review.</a> Molecules. 25 (4), 833(2020).</li>
<li>Zeng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescently+conjugated+annular+fibrin+clot+for+multiplexed+real-time+digestion+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mater+Chem+B%22%5BJournal%5D)">Fluorescently conjugated annular fibrin clot for multiplexed real-time digestion analysis.</a> J Mater Chem B. 9 (45), 9295-9307 (2021).</li>
<li>Zeng, Z., Christodoulides, A., Alves, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+tracking+of+fibrinolysis+under+constant+wall+shear+and+various+pulsatile+flows+in+an+in-vitro+thrombolysis+model%5BTitle%5D)+AND+%22Bioeng+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Real-time tracking of fibrinolysis under constant wall shear and various pulsatile flows in an in-vitro thrombolysis model.</a> Bioeng Transl Med. 8 (3), e10511(2023).</li>
<li>Christodoulides, A., Zeng, Z., Alves, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-vitro+thromboelastographic+characterization+of+reconstituted+whole+blood+utilizing+cryopreserved+platelets%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Coagul+Fibrinolysis%22%5BJournal%5D)">In-vitro thromboelastographic characterization of reconstituted whole blood utilizing cryopreserved platelets.</a> Blood Coagul Fibrinolysis. 32 (8), 556-563 (2021).</li>
<li>Zeng, Z., Nallan Chakravarthula, T., Christodoulides, A., Hall, A., Alves, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+Chandler+loop+shear+and+tubing+size+on+thrombus+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mater+Sci+Mater+Med%22%5BJournal%5D)">Effect of Chandler loop shear and tubing size on thrombus architecture.</a> J Mater Sci Mater Med. 34 (5), 24(2023).</li>
<li>Touma, H., Sahin, I., Gaamangwe, T., Gorbet, M. B., Peterson, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Numerical+investigation+of+fluid+flow+in+a+chandler+loop%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech+Eng%22%5BJournal%5D)">Numerical investigation of fluid flow in a chandler loop.</a> J Biomech Eng. 136 (7), (2014).</li>
<li>Wojdyla, M., Raj, S., Petrov, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absorption+spectroscopy+of+single+red+blood+cells+in+the+presence+of+mechanical+deformations+induced+by+optical+traps%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Opt%22%5BJournal%5D)">Absorption spectroscopy of single red blood cells in the presence of mechanical deformations induced by optical traps.</a> J Biomed Opt. 17 (9), (2012).</li>
<li>Wu, J. H., Diamond, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluorescence+quench+and+dequench+assay+of+fibrinogen+polymerization%2C+fibrinogenolysis%2C+or+fibrinolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A fluorescence quench and dequench assay of fibrinogen polymerization, fibrinogenolysis, or fibrinolysis.</a> Anal Biochem. 224 (1), 83-91 (1995).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Tworzenie i etykietowanie skrzepów Wykazano, że pętla Chandlera zapewnia łatwy i skuteczny sposób powtarzalnego generowania skrzepów, które naśladują skrzepliny 16 in vivo. Precyzyjne parametry dostrajania, takie jak rozmiar rurki, prędkości obrotowe, średnica bębna i czas krzepnięcia, pozwalają na szybkie generowanie skrzepów w różnych warunkach ścinania, które mogą uchwycić cechy architektoniczne cenione w szeregu skrzeplin naśladujących zarówno źródła tętnicze, jak i żylne. Dodatkowa elastyczność wynikająca z możliwości wprowadzenia markerów, takich jak FITC-Fg, rozszerza potencjalne zastosowania tych skrzeplin, jak wykazaliśmy w systemie RT-FluFF. Jakkolwiek podstawowe zasady pętli Chandlera są podstawowe, pozostaje stroma początkowa krzywa uczenia się związana z konsekwentnym tworzeniem skrzepów przy jednoczesnym obchodzeniu się z krwią i produktami krwiopochodnymi w całym procesie tworzenia skrzepów. Wynika to z faktu, że krzepnięcie WB jest niezwykle wrażliwe na obchodzenie się z nim w momentach poprzedzających i następujących po rozpoczęciu krzepnięcia. Szczególne znaczenie ma wybór rurki używanej na etapie tworzenia skrzepu w pętli Chandlera, ponieważ interakcje powierzchni krwi mogą wpływać na postęp tworzenia skrzepów. Rurki powinny być klasy medycznej lub chirurgicznej (niepirogenne i niehemolityczne) wykazujące niską bioreaktywność. Jak omówiono w naszych wynikach, w początkowych fazach uczenia się techniki oczekuje się zmienności w powstałych skrzepach podczas opracowywania optymalnego przepływu pracy w oparciu o skalę eksperymentalną i unikalne modyfikacje testu. Ostateczne osiągnięcie odtwarzalności ma kluczowe znaczenie, biorąc pod uwagę wpływ architektury skrzepu na zachowanie skrzepu podczas fibrynolizy. Wreszcie, należy się również spodziewać zmian w krzepnięciu, nawet wśród zdrowych ochotników, i należy je uwzględnić podczas projektowania eksperymentalnego.
Test RT-FluFF Fluorometryczna/spektrofotometryczna kwantyfikacja fibrynolizy z FITC-Fg jako markerem zapewnia wiele korzyści w porównaniu z klasycznymi technikami, które opierały się głównie na ocenie masy skrzepu w punkcie końcowym. Możliwość monitorowania, w czasie rzeczywistym lub prawie rzeczywistym, dynamiki fibrynolizy w środowisku, które przybliża fizjologiczne parametry przepływu, stanowi znaczną poprawę w porównaniu z tradycyjnymi badaniami przesiewowymi leków fibrynolitycznych. Test ten został celowo zaprojektowany w przedstawionej skali, aby bardziej przypominał klinicznie istotne rozmiary skrzepów, pole przepływu, objętościowe natężenie przepływu i obciążenie masą skrzepu, zamiast przyjmować w pełni zminiaturyzowane podejście mikroprzepływowe. Zmniejszenie skali aparatury RT-FluFF oznaczałoby, że musiałoby się zastosować rurki o mniejszej średnicy i/lub krótsze odległości przewodów. W rezultacie system zacząłby odbiegać od pożądanych wzorców przepływu i znaczenia fizjologicznego. Podobnie jak pętla Chandlera, system RT-FluFF pozwala na kontrolę parametrów, takich jak szybkość ścinania poprzez modulację ciśnienia przepływu przy stałym przepływie i kontrolę nad tym, które przepływające media są wykorzystywane. Dodatkowo, system RT-Fluff może również dostosować się do przepływu pulsacyjnego i unikalnej geometrii trawienia skrzepów, jednocześnie umożliwiając okresowe pobieranie próbek fazy ruchomej podczas całego procesu mineralizacji, co nie jest możliwe w pętli Chandlera ze względu na obrotową zamkniętą konfigurację mineralizacji. Wpływ tych parametrów na lizę skrzepów został dogłębnie zbadany w ramach Zeng i wsp.14.
Podsumowując, skrzepy uformowane w pętli Chandlera i rurki testowe RT-FluFF mogą mieć tę samą średnicę lub różnić się zarówno na etapie tworzenia skrzepu, jak i trawienia skrzepu, aby osiągnąć różne poziomy okluzji, modelując się przez prawie pełną niedrożność naczyń w celu naśladowania choroby zakrzepowo-zatorowej. We wszystkich opisanych tutaj testach wykorzystano tę samą średnicę rurki zarówno w pętli Chandlera, jak i w systemie RT-FluFF. Przy zwiększonej średnicy rurki w systemie RT-FluFF może być konieczne zwiększenie objętości ruchomego zbiornika fazowego, aby pomieścić dodatkową objętość potrzebną do napełnienia systemu. Zwiększenie objętości zbiornika może również zwiększyć niezbędną ilość trombolitu/leku, który musi zostać dodany do systemu, a także zwiększyłoby zapotrzebowanie na plazmę lub fazę ruchomą. Chociaż zastosowanie autologicznego osocza byłoby idealne, wymagałoby to niezwykle dużych ilości krwi do pobrania od indywidualnych dawców, aby dostosować się do tworzenia się skrzepów pętli Chandlera i objętości fazy ruchomej RT-FluFF we wszystkich testach i powtórzeniach potrzebnych do ukończenia całego eksperymentu. Z tego powodu powszechnie stosowano pulę osocza z dopasowanym typem uzyskanym w centrum krwiodawstwa lub zakupionym od komercyjnego dostawcy. Chociaż ogólne rurki testowe RT-FluFF można do pewnego stopnia skrócić, istnieją ograniczenia, takie jak to, że wszystkie komponenty mają wystarczająco dużo miejsca, aby pozostać w pętli w celu przeprowadzenia eksperymentów trawienia. Szczególne znaczenie ma długa część rurki wykorzystywana przed samym skrzepem, która musi przekraczać minimalną długość, obliczoną na podstawie średnicy rurki i natężenia przepływu, tak aby przepływ laminarny był osiągany przez czas, w którym przepływ dotrze do zawieszonego skrzepu. Niezależnie od wybranego rozmiaru przewodów, te same uwagi dotyczące przewodów, które szczegółowo opisano na etapie tworzenia skrzepów w pętli Chandlera, powinny być również stosowane w przypadku przewodów systemu RT-FluFF. Ważne jest, aby powtórzyć, że rurka między czujnikami ciśnienia, w której skrzep uformowany w pętlę Chandlera jest zamocowany za pomocą dwóch włożonych igieł w kształcie "X", musi być wymieniana po każdym teście, aby zapobiec występowaniu wycieków w miejscach nakłucia igły. Użycie igieł do utrzymywania skrzepu na miejscu podczas trawienia w przepływie ogranicza tworzenie się skrzepów w grupy i zapewnia możliwość orientacji skrzepu względem kierunku przepływu w celu poprawy spójności między testami. Podczas gdy w niniejszym dokumencie opisano pojedynczą reprezentatywną próbę trawienia skrzepów przy użyciu tPA, pętla Chandlera i test RT-FluFF zapewniają wysoki stopień dostosowania do szerokiej gamy struktur skrzepów, cząsteczek reporterowych, szybkości ścinania i warunków trawienia w celu przetestowania nowych fibrynolityków.
Ograniczenia Podobnie jak w przypadku każdej z obecnych platform lub metod stosowanych do badań przesiewowych leków fibrynolitycznych, test RT-FluFF również ma pewne słabości, które należy przyznać. Po pierwsze, skrzepy utworzone w pętli Chandlera, chociaż wykazują motywy powszechnie obecne w skrzepach in vivo , nadal powstają w innym środowisku niż skrzepy in vivo , w których występuje pulsacyjny przepływ i interakcja ze śródbłonkiem17 Dodatkowo, mimo że stężenia FITC-Fg zostały zoptymalizowane w celu zminimalizowania wpływu na architekturę skrzepu, dodanie zmodyfikowanego fibrynogenu nadal stanowi odejście od warunków fizjologicznych. Wybór pożywki z fazą ruchomą osocza może mieć wpływ na użycie fluorometru, ponieważ będzie istniała niewielka ilość sygnału tła, który jest związany z zawartością białka i lipidów w osoczu, która może się różnić w zależności od dawcy. Potencjalnie istotnym ograniczeniem konfiguracji RT-FluFF jest negatywny wpływ erytrocytów na odczyty fluorometryczne, co ogranicza stosowanie WB jako fazy ruchomej przy użyciu FITC jako fluorescencyjnego markera trawienia skrzepów. Wykonalną metodą złagodzenia tego zjawiska jest wprowadzenie etapu wirowania w celu osadzania erytrocytów przed odczytem dyskretnych punktów czasowych na spektrofotometrze lub wykorzystanie innego znacznika reportera trawienia skrzepów, na który obecność erytrocytów ma mniejszy wpływ18. Należy dokładnie rozważyć projekt testu, aby upewnić się, że ważne zmienne są kontrolowane. Na przykład, jeśli osocze jest fazą ruchomą z wyboru, najlepiej jest połączyć osocze od wielu dawców, aby zminimalizować krzepnięcie między dawcami i zmienność fibrynolizy. Wreszcie, podobnie jak w przypadku każdego białka znakowanego fluorescencyjnie, kwestia wygaszania naturalnie pojawia się, ponieważ znacznik FITC jest obecny we względnej bliskości siebie na powierzchni fibrynogenu19.
Wnioski i kierunki na przyszłość Badanie dynamicznego procesu, takiego jak tromboliza, wymaga równie dynamicznego środowiska, w którym można odtworzyć warunki fizjologiczne i jednocześnie kontrolować wiele parametrów. System RT-FluFF o wysokiej wierności wypełnia tę lukę i będzie służył jako ważne narzędzie w przyszłym opracowywaniu i badaniach przesiewowych nowych leków trombolitycznych przed ich translacją na modele zwierzęce. RT-FluFF to bardzo wszechstronna platforma, z wieloma możliwościami, które nie zostały tutaj omówione, ale z pewnością mogą być włączone do protokołów w zależności od unikalnych potrzeb projektowania leków farmaceutycznych, sposobu działania lub replikacji różnych stanów choroby krzepnięcia. Korzyści, które udało nam się docenić w ramach systemu RT-FluFF, są następujące: (a) zmienna geometria i konfiguracja przewodów, (b) monitorowanie ciśnienia w czasie rzeczywistym skorelowane ze stopniem niedrożności światła, (c) pomiary fluorescencji w czasie rzeczywistym niewymagające interwencji użytkownika, (d) czas trwania testu i elastyczność częstotliwości próbki, (e) wykorzystanie zbiornika do naśladowania warunków in vivo , (f) wzorce przepływu ścinającego podobne do in vivo , g) możliwość uwzględnienia przepływu pulsacyjnego, (h) znaczna elastyczność w tworzeniu w pętli Chandlera odrębnych reprezentatywnych dla choroby analogów skrzepów, (i) możliwość badania wpływu leku na tworzenie skrzepów lub trawienie skrzepów, oraz (j) bezpośrednie obrazowanie substratu skrzepu w celu śledzenia masowego trawienia skrzepów przez przezroczyste rurki dodatkowo pozwala na trawienie po trawieniu, Podłużna analiza wideo.

Choroby zasadniczo wynikające z etiologii zakrzepowo-zatorowej stanowią główne źródło zachorowalności i śmiertelności w dzisiejszym społeczeństwie. Objawy patogenezy zakrzepowo-zatorowej obejmują między innymi zawały mięśnia sercowego, udary niedokrwienne, zakrzepice żył głębokich i zatorowość płucną1. Ogromna liczba trwających badań, obejmujących wiele dyscyplin, koncentruje się na opracowaniu bezpiecznych i skutecznych metod radzenia sobie z patogenną zakrzepicą. Różnice w tętniczych i żylnych objawach zakrzepicy oraz różne lokalizacje anatomiczne doprowadziły do opracowania różnych podejść do leczenia. Jednak leczenie doraźne na ogół opiera się na stosowaniu trombolizy farmakologicznej za pomocą aktywatorów plazminogenu z możliwością trombektomii mechanicznej w pewnych okolicznościach klinicznych2.
Rozwój nowatorskich strategii leczenia farmakologicznego opiera się zasadniczo zarówno na modelach zwierzęcych in vivo, jak i modelach trawienia in vitro do testów przedklinicznych3,4. Modele in vivo w naturalny sposób korzystają z ich zdolności do uchwycenia złożonej interakcji różnych parametrów fizjologicznych na skuteczność leczenia, które obejmują klirens środków farmaceutycznych, a także interakcje komórkowe z lekami. Jednak ta sama złożoność często sprawia, że takie modele są dość kosztowne i wprowadzają dodatkowe problemy przy próbie wyizolowania leżącej u podstaw farmakodynamiki/kinetyki u zwierząt, które znacznie różnią się od fizjologii człowieka. Opracowanie modeli in vitro przyczyniło się do tego, że umożliwiło przeprowadzenie destylowanych warunków testowych, w których można opracowywać leki i przeprowadzać badania przesiewowe, ale często brakuje im wierności niezbędnej do odtworzenia badanego stanu chorobowego. 
Powszechnie spotykane protokoły in vitro do testowania nowych trombolityków polegają na wykorzystaniu skrzepów powstałych i poddanych lizie w warunkach statycznych, gdzie resztkowa masa skrzepu służy jako pierwszorzędowy punkt końcowy5,6. Niestety, takie techniki nie uwzględniają mechanicznych aspektów lizy skrzepów, takich jak przepływ turbulentny i spadki ciśnienia transskrzepliny, które mogą znacząco zmienić farmakodynamikę badanych leków. Dodatkowo skrzepy powstające w warunkach statycznych zawierają mikroarchitekturę, która różni się od skrzepów fizjologicznych. Wykazano w sposób powtarzalny, że obecność ścinania podczas tworzenia skrzepów wpływa na wynikające z tego cechy skrzepu, takie jak aktywacja płytek krwi i sieciowanie fibryny. Skrzepy powstające pod wpływem przepływu ścinającego wykazują złożoną niejednorodność od czubka do ogona, której nie ma w statycznie utworzonych skrzepach7,8. Takie odstępstwa od fizjologicznej architektury skrzepów mogą mieć wpływ na ważną charakterystykę rozwoju leku, która obejmuje penetrację leku w skrzeplinie i późniejszą skuteczność lizy9. 
Aby rozwiązać niektóre z tych ograniczeń związanych z użyciem modeli statycznego krzepnięcia/lizy skrzepów, zastosowanie pętli Chandlera zarówno do tworzenia skrzepów, jak i lizy skrzepów w obecności ścinania spowodowało odrodzenie10. Chociaż takie systemy pozwalają na lepsze odwzorowanie dynamiki przepływu i generują skrzepy o bardziej fizjologicznie istotnej architekturze w porównaniu ze stosunkowo statycznymi testami, ich uproszczone warunki przepływu nadal stanowią odchylenie od warunków fizjologicznych. Wreszcie, podjęto również podejścia mikroprzepływowe ze względu na łatwość obrazowania i jednolite wzorce przepływu; Pozostają one jednak znaczącym odejściem od warunków fizjologicznych oczekiwanych w obrębie większych naczyń dotkniętych głównie w większości klinicznie istotnych zaburzeń zakrzepowo-zatorowych<klasa SUP='xref'>11,<klasa SUP='xref'>12. 
Mając na uwadze powyższą dyskusję, opracowaliśmy model trombolizy in vitro o wysokiej wierności do przedklinicznych badań przesiewowych leków trombolitycznych. Model ma na celu rozwiązanie niektórych z obecnych pułapek opisanych powyżej w dziedzinie nowych badań przesiewowych terapii trombolitycznej i został zwalidowany pod kątem odtwarzalności i czułości przy różnych stężeniach tkankowego aktywatora plazminogenu (tPA). Opisany tutaj system oferuje fizjologiczne przepływy ścinające wykorzystujące pompę perystaltyczną, tłumik ciśnienia, podgrzewany zbiornik, dwa czujniki ciśnienia, fluorometr liniowy i fluorescencyjnie oznakowany analog skrzepu formowanego przy ścinaniu pętli Chandlera, aby ułatwić śledzenie fibrynolizy w czasie rzeczywistym13. Podsumowując, cały system nazywa się Real-Time Fluorometric Flowing Fibrinolysis Assay (RT-FluFF Assay)14, a ten manuskrypt omówi zawiłości pomyślnego ustawiania i uruchamiania testów w tym modelu trombolizy in vitro o wysokiej wierności.

<table><tbody><tr><td>30 G&nbsp; Jednorazowe igły podskórne</td><td>Exel International&nbsp;</td><td>26439</td><td>Inne materiały eksploatacyjne</td></tr><tr><td>6 mm HSS Tokarka Narzędzie 150 mm Długi</td><td>uxcell</td><td>B07SXGSQ82</td><td>Pętla Chandlera,&nbsp;</td></tr><tr><td>96-dołkowa, przezroczysta, płaska, przezroczysta mikropłytka UV</td><td>Corning</td><td>3635</td><td>Inne materiały eksploatacyjne, nieobrobiony kopolimer akrylowy, niesterylne</td></tr><tr><td>niesterylne strzykawki Air-Tite Luer-lock 60 ml</td> Aparat <td>Air-Tite</td><td>MLB3</td><td>RT-FluFF, tłumiki</td></tr><tr><td>Arium Mini Plus Ultrapure Water System</td><td>Sartorius</td><td>NA</td><td>DI źródło wody</td></tr><tr><td>Chlorek wapnia</td><td>Millipore Sigma</td><td>C5670</td><td>Inne materiały eksploatacyjne</td></tr><tr><td>Jednorazowe przetworniki ciśnienia krwi</td><td>Instrumenty AD</td><td>MLT0670</td><td>Aparatura RT-FluFF</td></tr><tr><td>Drager Siemans HemoMed Pod</td><td>Drager</td><td>5588822</td><td>Aparat RT-FluFF</td></tr><tr><td>Drager Monitor pacjenta Siemans</td><td>Drager</td><td>SC 7000</td><td>Aparatura RT-FluFF</td></tr><tr><td>Bęben (cylinder, średnica 120 mm, szerokość 85 mm)</td><td></td><td></td><td>Pętla Chandlera,Osłona</td></tr> <tr><td>twarzy</td><td>Moxe SHIELDS10</td><td></td><td>Pętla Chandlera,&nbsp;</td></tr><tr><td>Fibrynogen z ludzkiego osocza, Alexa Fluor 488 sprzężony</td><td>Thermo Scientific</td><td>F13191</td><td>Inne materiały eksploatacyjne</td></tr><tr><td>Złączka, poliwęglan, Czterokierunkowy kran odcinający, męski Luer Lock, niesterylny</td><td>Masterflex</td><td>30600-04</td><td>Aparat RT-FluFF</td></tr><tr><td>Fluoresceina (FITC)</td><td>Thermo Scientific</td><td>119245000</td><td>Inne materiały eksploatacyjne</td></tr><tr><td>Kąpiel wodna ogólnego przeznaczenia</td><td>Thermo Scientific</td><td>2839</td><td>Pętla Chandlera,&nbsp;</td></tr><tr><td>Płyta grzejna 4 i razy; 4</td><td>Fisher Scientific</td><td>1152016H</td><td>Aparat RT-FluFF</td></tr><tr><td>Osocze ludzkie Świeżo mrożone</td><td>Zen-Bio</td><td>SER-SPL</td><td>Inne materiały eksploatacyjne, antykoagulant CPDA-1</td></tr><tr><td>Ludzka krew pełna&nbsp;</td><td>Zen-Bio</td><td>SER-WB-SDS&nbsp;</td><td>Inne materiały eksploatacyjne, antykoagulant CPDA-1</td></tr><tr><td>Głowica pompy L/S Easy-Load II do wysokowydajnych przewodów precyzyjnych, obudowa PPS, wirnik SS</td><td>Aparatura Masterflex</td><td>77200-62</td><td>RT-FluFF, głowica pompy</td></tr><tr><td>L/S Cyfrowa pompa napędowa o zmiennej prędkości ze zdalnym wejściem/wyjściem, od 6 do 600 obr./min; 90 do 260 VAC</td> Aparatura <td>Masterflex</td><td>7528-10</td><td>RT-FluFF,</td></tr><tr><td>regulator prędkości silnika</td> pompy <td>CoCocina</td><td>ZK-MG</td><td>Pętla Chandlera,&nbsp;</td></tr><tr><td>Rurki Nalgene Złącza typu T</td><td>Thermo Scientific</td><td>6151-0312</td><td>Aparat RT-FluFF</td></tr><tr><td>Przewody pompy perystaltycznej&nbsp;</td><td>Masterflex</td><td>06424-15&nbsp;</td><td>Inne materiały eksploatacyjne</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>Millipore Sigma</td><td>P3813</td><td>Inne materiały eksploatacyjne, Proszek, pH 7,4, do przygotowania roztworów 1 L</td></tr><tr><td>Zasilacz impulsowy</td><td>SoulBay</td><td>UC03U</td><td>Pętla Chandlera,&nbsp;</td></tr><tr><td>Thermo Scientific National Target Jednorazowe strzykawki z tworzywa sztucznego 10 ml</td><td>Thermo Scientific</td><td>S751010</td><td>Inne materiały eksploatacyjne</td></tr><tr><td>Tkankowy aktywator plazminogenu, ludzki</td><td>Millipore Sigma</td><td>T0831</td><td>Inne materiały eksploatacyjne</td></tr><tr><td>ID rurki ID 1/4 '', OD 3/8''</td> <td>Fisher Scientific</td><td>AGL00017</td><td>Inne materiały eksploatacyjne, pocięte na odcinki 1,5 cm służą do łączenia rurek ze złączami</td></tr> <tr><td>typu TŚrednica wewnętrzna przewodu 5/32", średnica zewnętrzna 7/32"</td><td>Tygon</td><td>ND-100-65, ADF 00009&nbsp;</td><td>Inne materiały eksploatacyjne</td></tr><tr><td>V3 365 nm Mini - latarka UV z czarnym światłem</td><td>uvBeast</td><td>uvB-V3-365-MINI</td><td>Pętla Chandlera, służąca do sprawdzania zakończonych skrzepów</td></tr><tr><td>ZGA37RG ZYTD520 Silnik prądu stałego, 12 V, 100 obr./min</td><td>Pętla Pangyoo</td><td>ZGA37RG</td><td>Chandlera,&nbsp;</td></tr></tbody></table>

Śledzenie fibrynolizy skrzepów krwi pełnej uformowanych w pętli chandlera pod wpływem przepływu ścinającego w modelu trombolizy in vitro

Tracking Fibrinolysis of Chandler Loop-Formed Whole Blood Clots Under Shear Flow in An In-Vitro Thrombolysis Model

Choroba zakrzepowo-zatorowa i związane z nią powikłania są główną przyczyną zachorowalności i śmiertelności na całym świecie, a różne testy zostały opracowane w celu sprawdzenia skuteczności leków trombolitycznych zarówno in vitro, jak i in vivo. Rośnie zapotrzebowanie na bardziej fizjologicznie istotne modele skrzepów in vitro do opracowywania leków ze względu na złożoność i koszty związane z modelami zwierzęcymi, a także często brak ich przekładalności na ludzką fizjologię. Przepływ, ciśnienie i szybkość ścinania są ważnymi cechami układu krążenia, przy czym skrzepy powstające pod wpływem przepływu wykazują inną morfologię i charakterystykę trawienia niż skrzepy powstające statycznie. Czynniki te są często niereprezentowane w konwencjonalnych testach trawienia skrzepów in vitro, co może mieć implikacje farmakologiczne, które wpływają na wskaźniki powodzenia translacji leków.
Test Real-T ime Orometric Flulowing Fibrinolysis (RT-FluFF) został opracowany jako platforma do testowania trombolizy o wysokiej wierności, która wykorzystuje fluorescencyjnie znakowane skrzepy powstałe pod wpływem przepływu ścinającego, które są następnie trawione za pomocą krążącego osocza w obecności lub bez fibrynolitycznych środków farmaceutycznych. Modyfikacja natężenia przepływu zarówno na etapie tworzenia skrzepów, jak i trawienia skrzepów pozwala systemowi naśladować warunki tętnicze, płucne i żylne w bardzo zróżnicowanych konfiguracjach eksperymentalnych. Pomiary mogą być wykonywane w sposób ciągły za pomocą fluorometru in-line lub poprzez pobieranie dyskretnych punktów czasowych, a także konwencjonalny pomiar masy skrzepu w punkcie końcowym. Test RT-FluFF to elastyczny system, który pozwala na śledzenie trawienia skrzepów w czasie rzeczywistym w warunkach przepływu, które dokładniej odwzorowują warunki fizjologiczne in vivo, przy jednoczesnym zachowaniu kontroli i odtwarzalności systemu badań in vitro.

Tworzenie skrzepów w pętli Chandlera 
Podczas tworzenia skrzepów zazwyczaj dążyliśmy do uzyskania czterech powtórzeń, aby upewnić się, że w przypadku wystąpienia jakichkolwiek wartości odstających wśród skrzepów (na podstawie morfologii makroskopowej i masy), wciąż mieliśmy możliwość przeprowadzenia testów trombolizy w trzech powtórzeniach. Przy założeniu optymalnych warunków załadunku, wszystkie skrzepy powinny być dość jednolite pod względem długości (~3.3 cm), masy (~100 mg) i wyglądu, co przedstawiono na Rysunku 3. Przy zastosowaniu FITC-Fg dążyliśmy również do zbadania skrzepów w świetle UV, aby zapewnić względnie jednorodne rozproszenie fluorescencji, w przeciwieństwie do nieregularnych obszarów hiperfluorescencyjnego znakowania wewnątrz skrzepu. Zmiana stopnia stężenia FITC-Fg w krwi pełnej nie powinna zmieniać masy ani wyglądu skrzepów w badanych przez nas stężeniach; jednakże architektura mikro-skrzepów została zaburzona przy najwyższych stężeniach FITC-Fg (stosunek 1:5 FITC-Fg do niemodyfikowanego Fg). Wcześniejsze prace przeprowadzone przez Zeng i wsp. opisują szeroki zakres fenotypów skrzepów spodziewanych w pętli Chandlera w zależności od wybranego poziomu ścinania16.
Czasami może dojść do nieprawidłowego krzepnięcia. Najczęstsze problemy z tworzeniem się skrzepów dzielą się na dwie kategorie: (i) przedwczesne krzepnięcie oraz (ii) upośledzone krzepnięcie. W przypadku przedwczesnego krzepnięcia cała objętość krwi krzepnie wewnątrz rurek pętli Chandlera. Staje się to widoczne po uruchomieniu obrotu bębna, gdy krew nie „przepływa”, lecz przylega do ścianek rurek i obraca się wraz z nimi. W takich okolicznościach skrzepy te nie nadają się do użytku i muszą zostać odrzucone. Aby tego uniknąć, należy upewnić się, że po aktywacji krzepnięcia poprzez dodanie chlorku wapnia pętla zostanie niezwłocznie zamknięta i umieszczona na obracającym się bębnie w celu zainicjowania procesu krzepnięcia. Druga sytuacja, czyli upośledzone krzepnięcie, występuje, gdy próbki nie zostały odpowiednio wymieszane lub gdy krew zaczęła krzepnąć przed rozpoczęciem obrotu, ale w stopniu mniej znacznym niż w przypadku (i). Skrzepy z powyższymi problemami mają tendencję do bycia włóknistymi i wiotkimi podczas manipulacji oraz często wykazują znacznie zwiększoną masę skrzepu. Fenotypowo przypominają one skrzepy obserwowane przy bardzo niskim ścinaniu żylnym, ponieważ reprezentuje to w istocie krzepnięcie w warunkach zastoju. Należy spodziewać się sporadycznego występowania nieregularnych skrzepów, które powinny zostać odrzucone.
Kalibracja fluorometru RT-FluFF 
Ważnym elementem systemu RT-FluFF jest fluorometr lub spektrofotometr, służący do monitorowania trombolizy w czasie trawienia skrzepu. Przed przeprowadzeniem jakichkolwiek eksperymentów krytyczne jest upewnienie się, że fluorometr lub spektrofotometr działa prawidłowo. Na potrzeby naszych badań, ponieważ zaprojektowaliśmy fluorometr specjalnie dla aparatury RT-FluFF, musieliśmy upewnić się, że wykazuje on wysoką korelację ze spektrofotometrem w obecności znanych stężeń rozcieńczeń FITC-Fg w roztworze statycznym (Rysunek 4A). Po pewnym określeniu zakresu liniowego naszego fluorometru, dążyliśmy następnie do sprawdzenia, jak urządzenie to zachowuje się w warunkach przepływu. Zweryfikowaliśmy funkcjonalność poprzez stopniowe wstrzykiwanie fluoresceiny do przepływającego roztworu, aby monitorować skokowy wzrost fluorescencji, co pozwoliło lepiej zrozumieć powtarzalność odczytów fluorometru oraz określić, jak szybko fluorescencja osiąga równowagę w układzie przepływowym (Rysunek 4B). Kolejne eksperymenty przeprowadzono poprzez stałe, ciągłe wstrzykiwanie fluoresceiny oraz FITC-Fg do roztworu, aby lepiej odwzorować ciągłe uwalnianie fluorescencji oczekiwane w eksperymentach z fibrynolizy (Rysunek 4C). Przyjmuje się, że różnice w nachyleniu krzywych przedstawione dla FITC-Fg i FITC wynikają z efektów wygaszania, które występują, gdy cząsteczki FITC są sprzężone w bliskim sąsiedztwie, na przykład gdy wiele cząsteczek FITC jest sprzężonych z jednym białkiem (w tym przypadku z fibrynogenem). Naturalnie skokowe wzrosty i nachylenia będą się różnić nie tylko w zależności od zastosowanych stężeń FITC/FITC-Fg, ale także od liczby cząsteczek FITC przypadających na jeden fibrynogen. W związku z tym kluczowe staje się kontrolowanie stopnia sprzężenia FITC z fibrynogenem podczas przeprowadzania eksperymentów z użyciem RT-FluFF, jeśli celem jest porównanie danych z wielu partii skrzepów. Poprzez szeroko zakrojone badania ustaliliśmy, że około 14 sprzężeń FITC na fibrynogen zapewnia wystarczająco silny sygnał fluorescencyjny do śledzenia trawienia skrzepu, pozostając jednocześnie stabilnym w roztworze (ograniczona przedwczesna agregacja) i wywierając minimalny wpływ na strukturę mikrostrukturalną powstałego skrzepu. Należy zauważyć, że za każdym razem, gdy czysty, nieskrzepły FITC-Fg przepływa przez aparaturę RT-FluFF, narażenie FITC-Fg na wysokie naprężenia ścinające może promować jego agregację. Zjawisko to obserwuje się najczęściej na złączach rurek oraz wewnątrz rurek głowicy pompy i z czasem może ono wpływać na dostępną fluorescencję w roztworze.
Podczas pobierania próbek z pętli przepływowej w określonych punktach czasowych w celu pomiaru fluorescencji za pomocą spektrofotometru, wiele rozważań związanych z kalibracją fluorometru nie jest koniecznych. Należy jednak wciąż zbadać zakres dynamiczny wykorzystywanego spektrofotometru, aby upewnić się, że znakowanie FITC-Fg, ilość FITC-Fg w skrzepie utworzonym w pętli Chandlera oraz wielkość skrzepu są zoptymalizowane w danym systemie. Zaleca się, aby próbki były odczytywane natychmiast po wyizolowaniu z systemu lub umieszczone na płytce 96-dołkowej w celu przeprowadzenia pomiarów wielokanałowych po zakończeniu eksperymentu. W razie potrzeby próbki można zakwasić bezpośrednio po pobraniu, aby wyeliminować dalszą aktywność enzymatyczną przed analizą.
Lizis skrzepu w systemie RT-FluFF 
Aby zwalidować system RT-FluFF z wykorzystaniem skrzepów powstałych w warunkach ścinania tętniczego w pętli Chandlera, zastosowano ludzką osocze jako fazę ruchomą w aparaturze, z tPA (alteplazą) jako czynnikiem fibrynolitycznym. Badano stężenia tPA w zakresie od 0 do 1 000 ng/mL. Aby odwzorować warunki przepływu w ludzkich płucach, temperaturę zbiornika z osoczem utrzymywano na poziomie 37 °C i wyniesiono go fizycznie na wysokość 8 cm powyżej poziomu skrzepu, aby uzyskać średnie ciśnienie przepływu 12 mmHg, przy czym prędkość pompy dostosowano tak, aby w przypadku braku skrzepu generować przepływ ścinający o wartości ~500 s-1. Do układu dodano tłumiki przepływu pulsacyjnego, aby zapewnić minimalne różnice między ciśnieniem szczytowym a najniższym generowanym przez pompę perystaltyczną, co pozwoliło na uzyskanie niemal stałej szybkości ścinania (Rysunek 4D). W przypadku braku tłumika ciśnienia, ciśnienie wyjściowe pompy perystaltycznej ulega znacznym wahaniom ze względu na sposób generowania przepływu poprzez tłoczenie małych porcji cieczy przez system podczas obrotu głowicy pompy. Lizę skrzepu obserwowano przez 60 minut. Zgodnie z oczekiwaniami, wzrost stężeń tPA prowadził do zwiększenia szybkości lizy skrzepu (RFU/minuta) oraz większej utraty masy w porównaniu z warunkami przy mniejszej ilości tPA lub jego braku. Przy stężeniu tPA wynoszącym 1 000 ng/mL osiągnięto ~85% lizy skrzepu w ciągu 60-minutowego okresu trawienia. Analiza obrazów makroskopowych skrzepów poddawanych lizie pozwala zauważyć, że liza zachodzi głównie w obszarach ogonowych skrzepu, zanim wpłynie na bardziej gęsto ustrukturyzowaną głowę, co objawia się zarówno fizyczną degradacją architektury skrzepu, jak i utratą fluorescencji powierzchniowej. Przewidywane rozciąganie skrzepów będzie również występować w wyniku utraty integralności mechanicznej w czasie w sposób zależny od szybkości ścinania.
Chociaż można zaobserwować znaczne różnice w szybkości lizy skrzepów, zarówno w badaniu makroskopowym, jak i na podstawie uwalniania fluorescencji, nie istnieje idealna liniowa korelacja między uwalnianiem fluorescencji a ilością obecnego czynnika fibrynolitycznego. Najlepiej obrazuje to Rycina 5. Fibrynoliza w skrzepach opartych na pełnej krwi (WB) naturalnie prowadzi do uwalniania nie tylko fragmentów FITC-Fg, ale także erytrocytów (RBCs), które zostają uwięzione w sieciach fibrynowych podczas tworzenia skrzepu. W rezultacie uwalnianie tych erytrocytów do krążenia w aparaturze RT-FluFF zacznie wyraźnie zabarwiać krążącą osocze na czerwono. Ta kolorymetryczna zmiana w krążącej plazmie może negatywnie wpływać na emisję fluorescencji krążącego FITC-Fg odczytywaną przez czujnik fluorometru. Gdy stężenia czynników fibrynolitycznych osiągają górne granice, stopień uwalniania FITC-Fg do roztworu dominuje nad wpływem erytrocytów na emisję fluorescencji.
<img alt="Eksperyment z reometrem rotacyjnym; schemat i układ do analizy tworzenia skrzeplin krwi." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66524/66524fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Schematyczna reprezentacja układu pętli Chandlera (Chandler Loop). Wypełnione krwią probówki umieszczone na bębnie pętli Chandlera są zanurzone w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C przez cały proces tworzenia skrzeplin przy przyciemnionym świetle. Bęben obraca się ze stałą prędkością obrotową za pomocą silnika DC, wału napędowego i płyty sterującej. Rysunek ten został zmodyfikowany na podstawie pracy Zeng et al14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66524/66524fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat statycznego układu płynów; regulacja przepływu za pomocą pompy i czujników; detekcja fluorescencji, dioda laserowa." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66524/66524fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Schematyczny przedstawienie systemu RT-FluFF. Na obrazku zidentyfikowano ważne komponenty systemu. Przedstawiono pojedynczy tłumik o dużej objętości, który służy do minimalizacji pulsacji przepływu związanych z użyciem pompy perystaltycznej. W przypadku braku fluorometru przepływowego, dwie dodatkowe opcje okresnego pobierania próbek obejmują: 1) pobieranie próbek bezpośrednio z rezerwuaru; lub 2) zastosowanie portu pobierania próbek w linii w celu ekstrakcji fazy ruchomej. Rysunek zmodyfikowano na podstawie pracy Zeng et al14. Skrót: RT-FluFF = Real-Time Fluorometric Flowing Fibrinolysis Assay. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66524/66524fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Równowaga statyczna; fluorescencja skrzepu, analiza stosunku, diagram, wyniki na wykresie słupkowym, światło UV a światło pokojowe." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66524/66524fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Ogólna charakterystyka skrzepów WB znakowanych FITC-Fg w pętli Chandlera, w tym masa i wygląd fizyczny w świetle otoczenia i UV. (A) Spójne tworzenie skrzepów w różnych warunkach krzepnięcia jest możliwe dzięki precyzyjnemu dostrojeniu protokołu tworzenia skrzepów w pętli Chandlera. Należy zauważyć, że masy i wygląd skrzepów będą się znacznie różnić w zależności od średnicy rurki, prędkości obrotowej oraz czasu tworzenia skrzepu. Przedstawione skrzepy zostały utworzone w temperaturze 37 °C przez 1 h przy szybkości ścinania 506 s-1. Paski skali = 20 mm. (B) Masy skrzepów utworzonych w pętli Chandlera z wykorzystaniem odpowiednich stosunków FITC-Fg. Dane przedstawiają średnią ± odchylenie standardowe dla co najmniej trzech powtórzeń. Rysunek został zmodyfikowany na podstawie pracy Zeng i wsp.14. Skróty: FITC-Fg = fibrynogen znakowany izotiocyjanianem fluoresceiny; WB = krew pełna. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66524/66524fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wyniki testu fluorescencyjnego: RFU względem czasu dla fluoresceiny, FITC-Fg; układ tłumika strzykawki do testów ciśnienia." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66524/66524fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Charakterystyka fluorometru. (A) Porównanie fluorometru przepływowego RT-FluFF ze spektrofotometrem w odniesieniu do znanych stężeń rozcieńczeń FITC-Fg. (B) Stopniowe wprowadzanie fluoresceiny do systemu RT-FluFF w celu określenia powtarzalności fluorometru i czasu wyrównywania fluorescencji w płynącej ludzkiej osoczu. (C) Ciągłe infuzje porównujące fluoresceinę i FITC-Fg na platformie RT-FluFF. Różnice w nachyleniu prawdopodobnie wynikają z wygaszania fluorescencji w grupie FITC-Fg. (D) Kształty fal czujnika ciśnienia wylotowego (za skrzepem) powiązane z użyciem tłumików o różnych rozmiarach przy tych samych warunkach natężenia przepływu objętościowego. Rycina ta została zmodyfikowana na podstawie pracy Zeng et al14. Skróty: FITC-Fg = fibrynogen znakowany izotiocyjanianem fluoresceiny; RT-FluFF = Real-Time Fluorometric Flowing Fibrinolysis Assay. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66524/66524fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza efektu tPA; wykresy przedstawiają RFU w funkcji czasu, utratę masy w funkcji stężenia tPA; zdjęcie z eksperymentu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66524/66524fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Tromboliza w platformie RT-FluFF. (A) Reprezentatywne nachylenia wzrostu fluorescencji w ciągu 60 min trawienia skrzepu w obecności krążącego tPA. Zauważalny jest początkowy czas opóźnienia trombolizy, ponieważ aktywacja plazminogenu przez tPA i trawienie skrzepu nie zachodzą natychmiastowo. (B) Procent utraconej masy skrzepu przy różnych stężeniach tPA i różnych modalnościach trombolizy, obejmujących: system RT-FluFF, trawienie skrzepu w pętli Chandlera przy stałym ścinaniu oraz statyczne trawienie skrzepu (bez ścinania). Dane przedstawiają średnią ± odchylenie standardowe dla co najmniej trzech powtórzeń; dwa asteryski oznaczają p-value &lt; 0,01, a trzy asteryski p-value &lt; 0,001. (C) Ogólna charakterystyka trombolizy przy stężeniu 200 ng/mL tPA. Rycina ta została zmodyfikowana na podstawie pracy Zeng et al.14. Skróty: RT-FluFF = Real-Time Fluorometric Flowing Fibrinolysis Assay; tPA = tkankowy aktywator plazminogenu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66524/66524fig05large.jpg" target="_blank">Aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.</a>

Testy trombolizy in vitro często miały trudności z odtworzeniem warunków in vivo, czy to w trawionej skrzeplinie, czy w środowisku, w którym tromboliza zachodzi. W tym artykule badamy, w jaki sposób sprzężenie pętli Chandlera i testu fluorometrycznej fibrynolizy przepływowej w czasie rzeczywistym (RT-FluFF) jest wykorzystywane do monitorowania lizy skrzepów ex vivo o wysokiej wierności.

Śledzenie fibrynolizy skrzepów krwi pełnej uformowanych w pętli Chandlera pod wpływem przepływu ścinającego w modelu trombolizy in vitro

Thromboembolism and related complications are a leading cause of morbidity and mortality worldwide and various assays have been developed to test ...

Zakrzepica wiąże się z wieloma schorzeniami, a obecne leczenie grozi ciężkim krwawieniem. Przepływ w układzie krążenia znacząco wpływa na strukturę skrzepów krwi. Włączenie przepływu do modeli in vitro może poprawić ich znaczenie fizjologiczne, zwiększając wybór lepszych kandydatów do badań in vivo.Testy do badania fibrynolitycznego wykorzystują głównie statyczne układy skrzepowe lub mikroprzepływowe do oceny właściwości, takich jak czas lizy, struktura skrzepu lub lepkosprężystość. Statyczne testy lizy skrzepów zazwyczaj opierają się na pomiarach spektrofotometrycznych lub określeniu masy skrzepu jako punktach końcowych w celu oceny skuteczności fibrynolizy. Obecne badania trombolityczne to statycznie uformowane skrzepy, które różnią się strukturalnie od tych powstających w warunkach przepływu.Systemy mikroprzepływowe uwzględniają dynamikę przepływu, ale ich mniejsze skale tworzą unikalną hemodynamikę i struktury skrzepów. Obecnie opracowany esej RT-FluFF zapewnia łatwość monitorowania lizy w czasie rzeczywistym w fizjologicznych warunkach przepływu. Oznacza to, że mamy teraz platformę, która pozwala na kontrolę nad wieloma parametrami, aby naśladować stan bliższy modelom badawczym w celu lepszej translacji podczas badań przesiewowych nowych trombolityków.Na początek dodaj fluorescencyjnie znakowany fibrynogen do trzech mililitrów cytrynowanej ludzkiej krwi pełnej, aby osiągnąć końcowe stężenie 60 mikrogramów na mililitr. Ustaw pętlę Chandlera z bębnem o średnicy 120 milimetrów w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Wytnij standardową probówkę PCR o pojemności 200 mikrolitrów i podłącz końce rurki.Aby zainicjować krzepnięcie krwi, dodaj 176 mikrolitrów 200-milimolowego chlorku wapnia do trzech mililitrów krwi pełnej. Po prawidłowym wymieszaniu z delikatną inwersją, za pomocą trzymililitrowej strzykawki, załaduj krew do rurki, natychmiast umieść rurkę na bębnie pętlowym Chandlera, łącząc końce. W warunkach słabego oświetlenia obracaj bęben częściowo zanurzony w łaźni wodnej z prędkością 40 obr./min.Po 40 do 60 minutach usuń skrzepy z rurki. Charakterystyka krwi pełnej znakowanej fibrynogenem w pętli Grossa Chandlera FITC wykazała równomierne rozproszenie fluorescencji w świetle ultrafioletowym. Co więcej, zmiana stopnia fibrynogenu FITC we krwi pełnej nie zmienia masy skrzepów.Aby rozpocząć, podłącz urządzenie do pętli przepływu i upewnij się, że wszystkie połączenia są bezpieczne. Włącz monitor ciśnienia. Upewnij się, że monitor odczytuje zero milimetrów rtęci zarówno dla czujników wlotowych, jak i wylotowych.Włącz łaźnię wodną i dostosuj temperaturę do 37 stopni Celsjusza, aby naśladować fizjologiczną temperaturę ludzkiego ciała. Uruchom pompę z żądanym natężeniem przepływu, aby sprawdzić, czy nie ma wycieków, i potwierdź prawidłowe działanie czujników ciśnienia. Wyłącz pompę, aby ułatwić fazę ruchomą plazmy i ładowanie skrzepu.Aby zmierzyć wcześniej przygotowaną masę skrzepu krwi pełnej ludzkiej, delikatnie osusz skrzepy na chusteczkach laboratoryjnych, aż nie zostanie uwolniona znacząca ilość płynu. Zanurz skrzep w dopasowanym do typu wyciągniętym osoczu w krążku wagowym. Usuń środkową część rurki pętli przepływu między czujnikami wlotowymi i wylotowymi i podłącz 10-mililitrową strzykawkę do jednego końca rurki.Przez wolny koniec zalać rurkę niewielką ilością plazmy. Po zidentyfikowaniu głowy i ogona skrzepu ustaw głowicę w kierunku czujnika ciśnienia wlotowego. Umieścić rurkę na końcu końcowego skrzepu i zassać do rurki za pomocą strzykawki.Podłącz rurkę do aparatu pętli przepływu, ustawiając skrzep najbliżej czujnika ciśnienia wylotowego z głowicą skierowaną na zewnątrz. Aby zabezpieczyć skrzep na miejscu, przebij rurkę i główkę skrzepu dwiema igłami o rozmiarze 30 w kształcie litery X. Przenieś pozostały roztwór fazy ruchomej do 50-mililitrowej probówki jako zbiornika.Umieść zbiornik w łaźni wodnej. Następnie włóż rurkę doprowadzającą i wylotową do zbiornika. Włącz fluorometr i sprawdź, czy wartość początkowa jest odpowiednia, porównując ją z linią bazową systemu tylko z ruchomą fazą.Dodaj 500 mikrolitrów tkankowego aktywatora plazminogenu bezpośrednio do zbiornika. Uruchom pompę i dostosuj natężenie przepływu do 160 mililitrów na minutę. Następnie system napełnia się płynem i pęcherzykami.Gdy bąbelki znikną, wyłącz światło i rozpocznij akwizycję danych. Nagrywaj, aż skrzep ulegnie znacznemu zniszczeniu. Podczas przepływu osocza należy monitorować ciśnienie w układzie przed i po zakrzepie, które będzie się zmieniać w trakcie procesu trawienia skrzepu wraz ze zmniejszaniem się masy skrzepu.Po wytrawieniu skrzepu zmniejsz objętościowe natężenie przepływu i wyjmij rurkę wlotową, gdy pompa nadal pracuje, aby wepchnąć większość płynu do zbiornika. Odłącz sekcję rurki zawierającą skrzep po stronie czujnika ciśnienia wylotowego i opuść ją do łodzi wagowej. Usuń igły, aby zebrać pozostały płyn i fragmenty skrzepu.Zważyć pozostały skrzep. Pomiędzy próbkami załaduj ciepłą wodę do zbiornika i przepuść przez system przez dwie minuty z prędkością 150 obr./min. Po przeprowadzeniu wszystkich próbek na dany dzień należy wyjąć i wyrzucić rurkę.Wyszoruj skrzyżowania T gorącą wodą i szczotką z włosia, aż będą czyste i pozostaw je do wyschnięcia. Wypłukać strzykawki dampers gorącą wodą i przetrzeć 70% etanolem, aby zachować sterylność.

tracking-fibrinolysis-chandler-loop-formed-whole-blood-clots-under

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Model zakrzepicy indukowanej FeCl3 u myszy jest opisany tutaj. Przedstawiono metodę monitorowania wzrostu skrzepliny za pomocą obserwacji mikroskopowej przyżyciowej naczynia krezkowego oraz pomiaru przepływu krwi w tętnicy szyjnej.

Mysi model zakrzepicy wywołanej chlorkiem żelaza na tętnicy szyjnej i naczyniu krezkowym

Opisujemy udoskonaloną procedurę modeli zakrzepicy indukowanej chlorkiem żelaza (FeCl3) na tętnicy szyjnej i krezkowej oraz żyle, scharakteryzowaną efektywnie za pomocą mikroskopii przyżyciowej do monitorowania czasu do powstania skrzeplin okluzyjnych.

Modele zakrzepicy myszy indukowanej chlorkiem żelaza

Ten artykuł opisuje eksperymentalny model hemostazy, który jednocześnie mierzy funkcję płytek krwi i krzepnięcie. Fluorescencja płytek krwi i fibryny jest mierzona w czasie rzeczywistym i określa się szybkość adhezji płytek krwi, szybkość krzepnięcia i początek krzepnięcia. Model służy do określania właściwości prokoagulantów płytek krwi pod wpływem przepływu w koncentratach do transfuzji.

Model mikroprzepływowej komory przepływowej do transfuzji płytek krwi i hemostazy mierzy odkładanie się płytek krwi i tworzenie fibryny w czasie rzeczywistym

Prezentujemy model choroby naczyniowej in vitro do zbadania interakcji krwi pełnej ze śródbłonkiem pochodzącym od pacjenta. System ten pozwala na badanie właściwości trombogennych pierwotnych komórek śródbłonka w różnych okolicznościach. Metoda ta jest szczególnie przydatna do oceny trombogenności in situ i terapii przeciwzakrzepowej w różnych fazach krzepnięcia.

Model choroby mikroprzepływowej in vitro do badania interakcji krew pełna - śródbłonek i dynamiki zakrzepów krwi w czasie rzeczywistym

Fibryna jest odpowiedzialna za tworzenie skrzepów podczas hemostazy i zakrzepicy. Testy zmętnienia i małozakrzepowości (TEG) mogą być wykorzystywane jako narzędzia synergiczne, które zapewniają komplementarną ocenę skrzepu. Te dwie techniki razem mogą dać lepszy wgląd w to, jak warunki krzepnięcia wpływają na tworzenie skrzepów fibryny.

Wykorzystanie zmętnienia i tromboelastografii do charakterystyki skrzepów komplementarnych

Prezentowany tutaj jest protokół dla ustandaryzowanego modelu pętli hemodynamicznej in vitro. Model ten pozwala na przetestowanie hemokompatybilności probówek perfuzyjnych lub stentów naczyniowych zgodnie z normą ISO (Międzynarodowa Organizacja Normalizacyjna) 10993-4.

Model pętli hemodynamicznej in vitro do badania kompatybilności hemocytologicznej i aktywacji komórek gospodarza naczyniowych wyrobów medycznych

Tradycyjne modele udaru fotozakrzepowego (PTS) głównie indukują gęste agregaty płytek krwi o wysokiej odporności na tkankowe leczenie aktywatorem plazminogenu (tPA)-litycznym. Tutaj zmodyfikowany mysi model PTS jest wprowadzany przez jednoczesne wstrzykiwanie trombiny i barwnika światłoczułego w celu fotoaktywacji. Model PTS wzmocniony trombiną wytwarza mieszane skrzepy płytkowo-fibrynowe i jest bardzo wrażliwy na trombolizę tPA.

Wzbogacony fibryną i wrażliwy na tPA model udaru fototrombotycznego

Wspomagane przez Histotripsy'ego dostarczanie lityczne lub lizotrypsja są w trakcie opracowywania do leczenia zakrzepicy żył głębokich. Przedstawiono procedurę in vitro mającą na celu ocenę skuteczności tej terapii skojarzonej. Omówiono kluczowe protokoły dotyczące modelu skrzepu, wskazówek obrazowych i oceny skuteczności leczenia.

System in vitro do oceny skuteczności trombolitycznej hestotrypsji i leku litycznego

Obecny protokół opisuje, jak wykorzystać uraz za pośrednictwemFeCl 3 do wywołania zakrzepicy tętniczej, oraz jak zbierać i przygotowywać próbki uszkodzeń tętnic na różnych etapach zakrzepicy do analizy mikroskopowej elektronowej.

Zakrzepica tętnicza wywołana chlorkiem żelaza i pobieranie próbek do analizy pod mikroskopem elektronowym 3D

Praca ta opisuje test mikrofluidyczny, który wykorzystuje naprężenie ścinające do wywołania powstawania zakrzepów we krwi i charakteryzuje zakrzep za pomocą wielu wymiarów odczytu. Test pozwala mierzyć tendencję protrombotyczną próbek krwi, dzięki czemu jest przydatny w diagnozowaniu chorób, odkrywaniu leków oraz podstawowych badaniach mechanistycznych związanych z zakrzepicą.

Testy profilowania zakrzepów: platforma oparta na mikrofluidyce do kompleksowej charakterystyki trombogenezy biomechanicznej

Poznaj metodę RT-FluFF do monitorowania fibrynolizy skrzepów krwi w warunkach przepływu przy użyciu pętli Chandlera. To podejście poprawia fizjologiczną relewantność badań trombolitycznych in vitro.

Śledzenie fibrynolizy skrzepów krwi pełnej uformowanych w pętli Chandlera pod wpływem przepływu ścinającego w modelu trombolizy in vitro (Wideo) | JoVE Journal

Śledzenie fibrynolizy skrzepów krwi pełnej uformowanych w pętli Chandlera pod wpływem przepływu ścinającego w modelu trombolizy in vitro

Przeglądaj więcej filmów