19 kwietnia 2024
Testy trombolizy in vitro często miały trudności z odtworzeniem warunków in vivo, czy to w trawionej skrzeplinie, czy w środowisku, w którym tromboliza zachodzi. W tym artykule badamy, w jaki sposób sprzężenie pętli Chandlera i testu fluorometrycznej fibrynolizy przepływowej w czasie rzeczywistym (RT-FluFF) jest wykorzystywane do monitorowania lizy skrzepów ex vivo o wysokiej wierności.
Zakrzepica wiąże się z wieloma schorzeniami, a obecne leczenie grozi ciężkim krwawieniem. Przepływ w układzie krążenia znacząco wpływa na strukturę skrzepów krwi. Włączenie przepływu do modeli in vitro może poprawić ich znaczenie fizjologiczne, zwiększając wybór lepszych kandydatów do badań in vivo.
Testy do badania fibrynolitycznego wykorzystują głównie statyczne układy skrzepowe lub mikroprzepływowe do oceny właściwości, takich jak czas lizy, struktura skrzepu lub lepkosprężystość. Statyczne testy lizy skrzepów zazwyczaj opierają się na pomiarach spektrofotometrycznych lub określeniu masy skrzepu jako punktach końcowych w celu oceny skuteczności fibrynolizy. Obecne badania trombolityczne to statycznie uformowane skrzepy, które różnią się strukturalnie od tych powstających w warunkach przepływu.
Systemy mikroprzepływowe uwzględniają dynamikę przepływu, ale ich mniejsze skale tworzą unikalną hemodynamikę i struktury skrzepów. Obecnie opracowany esej RT-FluFF zapewnia łatwość monitorowania lizy w czasie rzeczywistym w fizjologicznych warunkach przepływu. Oznacza to, że mamy teraz platformę, która pozwala na kontrolę nad wieloma parametrami, aby naśladować stan bliższy modelom badawczym w celu lepszej translacji podczas badań przesiewowych nowych trombolityków.
Na początek dodaj fluorescencyjnie znakowany fibrynogen do trzech mililitrów cytrynowanej ludzkiej krwi pełnej, aby osiągnąć końcowe stężenie 60 mikrogramów na mililitr. Ustaw pętlę Chandlera z bębnem o średnicy 120 milimetrów w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Wytnij standardową probówkę PCR o pojemności 200 mikrolitrów i podłącz końce rurki.
Aby zainicjować krzepnięcie krwi, dodaj 176 mikrolitrów 200-milimolowego chlorku wapnia do trzech mililitrów krwi pełnej. Po prawidłowym wymieszaniu z delikatną inwersją, za pomocą trzymililitrowej strzykawki, załaduj krew do rurki, natychmiast umieść rurkę na bębnie pętlowym Chandlera, łącząc końce. W warunkach słabego oświetlenia obracaj bęben częściowo zanurzony w łaźni wodnej z prędkością 40 obr./min.
Po 40 do 60 minutach usuń skrzepy z rurki. Charakterystyka krwi pełnej znakowanej fibrynogenem w pętli Grossa Chandlera FITC wykazała równomierne rozproszenie fluorescencji w świetle ultrafioletowym. Co więcej, zmiana stopnia fibrynogenu FITC we krwi pełnej nie zmienia masy skrzepów.
Aby rozpocząć, podłącz urządzenie do pętli przepływu i upewnij się, że wszystkie połączenia są bezpieczne. Włącz monitor ciśnienia. Upewnij się, że monitor odczytuje zero milimetrów rtęci zarówno dla czujników wlotowych, jak i wylotowych.
Włącz łaźnię wodną i dostosuj temperaturę do 37 stopni Celsjusza, aby naśladować fizjologiczną temperaturę ludzkiego ciała. Uruchom pompę z żądanym natężeniem przepływu, aby sprawdzić, czy nie ma wycieków, i potwierdź prawidłowe działanie czujników ciśnienia. Wyłącz pompę, aby ułatwić fazę ruchomą plazmy i ładowanie skrzepu.
Aby zmierzyć wcześniej przygotowaną masę skrzepu krwi pełnej ludzkiej, delikatnie osusz skrzepy na chusteczkach laboratoryjnych, aż nie zostanie uwolniona znacząca ilość płynu. Zanurz skrzep w dopasowanym do typu wyciągniętym osoczu w krążku wagowym. Usuń środkową część rurki pętli przepływu między czujnikami wlotowymi i wylotowymi i podłącz 10-mililitrową strzykawkę do jednego końca rurki.
Przez wolny koniec zalać rurkę niewielką ilością plazmy. Po zidentyfikowaniu głowy i ogona skrzepu ustaw głowicę w kierunku czujnika ciśnienia wlotowego. Umieścić rurkę na końcu końcowego skrzepu i zassać do rurki za pomocą strzykawki.
Podłącz rurkę do aparatu pętli przepływu, ustawiając skrzep najbliżej czujnika ciśnienia wylotowego z głowicą skierowaną na zewnątrz. Aby zabezpieczyć skrzep na miejscu, przebij rurkę i główkę skrzepu dwiema igłami o rozmiarze 30 w kształcie litery X. Przenieś pozostały roztwór fazy ruchomej do 50-mililitrowej probówki jako zbiornika.
Umieść zbiornik w łaźni wodnej. Następnie włóż rurkę doprowadzającą i wylotową do zbiornika. Włącz fluorometr i sprawdź, czy wartość początkowa jest odpowiednia, porównując ją z linią bazową systemu tylko z ruchomą fazą.
Dodaj 500 mikrolitrów tkankowego aktywatora plazminogenu bezpośrednio do zbiornika. Uruchom pompę i dostosuj natężenie przepływu do 160 mililitrów na minutę. Następnie system napełnia się płynem i pęcherzykami.
Gdy bąbelki znikną, wyłącz światło i rozpocznij akwizycję danych. Nagrywaj, aż skrzep ulegnie znacznemu zniszczeniu. Podczas przepływu osocza należy monitorować ciśnienie w układzie przed i po zakrzepie, które będzie się zmieniać w trakcie procesu trawienia skrzepu wraz ze zmniejszaniem się masy skrzepu.
Po wytrawieniu skrzepu zmniejsz objętościowe natężenie przepływu i wyjmij rurkę wlotową, gdy pompa nadal pracuje, aby wepchnąć większość płynu do zbiornika. Odłącz sekcję rurki zawierającą skrzep po stronie czujnika ciśnienia wylotowego i opuść ją do łodzi wagowej. Usuń igły, aby zebrać pozostały płyn i fragmenty skrzepu.
Zważyć pozostały skrzep. Pomiędzy próbkami załaduj ciepłą wodę do zbiornika i przepuść przez system przez dwie minuty z prędkością 150 obr./min. Po przeprowadzeniu wszystkich próbek na dany dzień należy wyjąć i wyrzucić rurkę.
Wyszoruj skrzyżowania T gorącą wodą i szczotką z włosia, aż będą czyste i pozostaw je do wyschnięcia. Wypłukać strzykawki dampers gorącą wodą i przetrzeć 70% etanolem, aby zachować sterylność.
To badanie bada ograniczenia metod trombolizy in-vitro w replikacji warunków in-vivo. Łącząc pętlę Chandlera z metodą Real-Time Fluorometric Flowing Fibrinolysis Assay (RT-FluFF), badania mają na celu poprawę wierności monitorowania lizy skrzeplin in-vivo.
Physiologically relevant in-vitro thrombolysis models are critical for improving predictive confidence in thrombolytic drug discovery and reducing translational failure rates. The RT-FluFF assay enables real-time, quantitative assessment of clot lysis under controlled shear flow, directly addressing the limitations of static assays. This platform supports more informed candidate triage and de-risking at the preclinical stage, enhancing portfolio decision-making.
The RT-FluFF assay bridges early discovery and preclinical evaluation by providing a high-fidelity, quantitative platform for thrombolytic candidate assessment under controlled flow conditions.